Курс лечения определяет лечащий врач, переносимость и совместимость процедур под контролем врача!
Лечебный комплекс назначается индивидуально с учетом формы и стадии болезни, особенностей клинической картины, наличия сопутствующих заболеваний, возраста больного, механизма действия физических факторов и их совместимости.
Комплексную терапию нельзя сводить к полипрагмазии (применение одновременно многих препаратов для процедур), потому что назначение большого количества процедур может стать чрезмерной нагрузкой для организма и обусловить усиление патологических нарушений, вызвать срыв адаптационных систем и даже привести к физиобальнеотравмам.
Многие физиобальнеопроцедуры вызывают значительную и длительную реакцию у больного, поэтому не следует назначать в один день несколько интенсивно действующих процедур. При суммации воздействия сильных раздражителей могут возникнуть различные функциональные нарушения со стороны нервной, сердечно-сосудистой и других систем организма.
В один день (при курсе 21 день) целесообразно ограничиться одной из следующих процедур: электрофорез, индуктотермия, УВЧ, КВЧ, ультразвук, парафино-озокеритовые аппликации, радоновые ванны. Можно сочетать УЗС с радоновыми ваннами с интервалом 4 часа, массаж с бальнеопроцедурами.
Процедуры на одну рефлексогенную зону, через которую осуществляется общее воздействие на организм (воротниковая, синокаротидна, поясничная зоны, слизистая оболочка носа), несовместимы в один день. В один день назначается одна общая процедура, здоровым — две с перерывом 4-6 часов (при курсе лечения 21-24 дня).
На одну локальную зону возможно назначение 1-2 лечебных процедур с оптимальным взаимодействием. Теплогрязелечение — парафино-озокеритовые аппликации при назначении их на рефлексогенные зоны или большие участки не совместимые с водными процедурами (ванны, души).
При планировании комплексной терапии особое значение имеет совместимость и несовместимость физиопроцедур, соблюдение последовательности и интервалов между процедурами: 20-30 мин. между местными процедурами, 1-2 часа между местной и общей процедурой, 4-6 часов между общими процедурами.
Радоновые ванны — комбинируются в один день с импульсными токами (диадинамотерапия, СМТ-терапия, интерференцтерапия, электростимуляция).
Радоновые ванны комбинируются в разные дни с гальванизацией, электрофорезом, УВЧ, КВЧ, индуктотермия, дарсонвализация, магнитотерапия, ультразвук, лазерным облучением, бальнеотерапией.
В правильно подобранном физиобальнотерапевтическом комплексе суммируются положительные эффекты нескольких физических факторов, которые действуют в одном направлении. Ослабляется отрицательное влияние отдельных компонентов, осуществляется воздействие на различные системы организма и стороны патологического процесса, увеличивается период последействия применяемых вместе процедур.
Главный врач А. С. Костриков
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ МИРАМИСТИНА В ФИЗИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
При всем разнообразии физических факторов лечения и реабилитации, не утратили своей актуальности традиционные методы физиолечения, такие как электрофорез и ингаляции лекарственных средств. Но с расширением спектра фармакологических препаратов, появляются новые возможности лечебного воздействия известных физиотерапевтических методов на организм. Так с недавних пор в практику вошли методики физиолечения с применением препарата мирамистин. Мирамистин — это антисептик нового поколения обладающий бактерицидным, противогрибковым, противовирусным действием, стимулирующий местные защитные реакции в месте применения. Разработки препарата начались в 80-е годы XX века, когда в рамках программы «Космические биотехнологии» начались масштабные научные исследования по созданию антисептического препарата для космонавтов орбитальных станций. Задача оказалась невероятно сложной.
Новый препарат, учитывая замкнутое пространство и высокую температуру в отсеках орбитальной станции, должен был эффективно бороться с различными видами бактерий, вирусов и грибков и при этом оставаться безопасным для человека при длительном многократном применении. Таким препаратом оказался мирамистин.
В Центре «Родник» в этом году для реабилитации и лечения детей с бронхолегочной патологией и часто и длительно болеющих детей стали применяться электрофорез и ингаляции с мирамистином. Метод лекарственного электрофореза известен более 200 лет и продолжает применяться в настоящее время. Фармакотерапевтическая активность лекарства, введенного методом электрофореза, может усиливаться вследствие поступления его в ионизированном состоянии и одновременном влиянии гальванического тока. Возможность концентрировать лекарство в зоне патологического процесса, снижает побочные реакции общего действия этого лекарства, а повторные процедуры создают не только депонирование средства, но и пролонгирование фармакологических свойств препарата.
При ингалировании лекарственного вещества возникает прямое местное влияние в зоне контакта на флору, секретирующие клетки слизистой оболочки, на нервные рецепторы, а также общее воздействие через кровеносную и лимфатическую систему на организм.
Анализ применения мирамистина в физиолечении позволил сделать следующие выводы:
уменьшилось количество острых заболеваний респираторной системы среди детей, находящихся на реабилитации в «Роднике»;
повысилась эффективность реабилитации часто болеющих детей, страдающих хронической патологией ЛОР-органов;
при возникновении катаральных явлений, применение ингаляций с мирамистином сокращает срок купирования симптомов.
Фото «Ингаляция с мирамистином» (автор фото Вагнер Е.В., 12.10.2015)
Для справки
Заезд № 12:
Количество детей – 129 человек
Количество родителей – 88 человек
Сообщила, Ламанова Елена Петровна, заместитель руководителя по лечебно-оздоровительной работе «ОРЦ «Родник», 77-20-63, Rodnik97-ОМС@yаndex. ru
Рабочий процесс электрофореза
нуклеиновых кислот — 5 основных этапов | Thermo Fisher Scientific
Гель-электрофорез является частью многих экспериментов по молекулярной биологии. Настройка электрофореза нуклеиновых кислот включает ряд шагов для достижения оптимального разделения и анализа образцов нуклеиновых кислот. Как показано на Рисунок 1 , ключевые этапы рабочего процесса гель-электрофореза нуклеиновых кислот:
Рисунок 1. Пять ключевых этапов гель-электрофореза нуклеиновых кислот.
1.Выбор и приготовление гелей
Агароза и полиакриламид являются двумя наиболее распространенными гелевыми матрицами, используемыми для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Оба материала образуют трехмерные матрицы с размерами пор, подходящими для разделения нуклеиновых кислот, и не вступают в реакцию с образцами. Размеры пор можно регулировать, варьируя процентное содержание матрицы, чтобы эффективно разделять нуклеиновые кислоты разного размера.
Выбор между агарозой и полиакриламидом зависит главным образом от диапазона размеров и желаемого разрешения разделения образцов нуклеиновых кислот, хотя можно рассмотреть методы заливки геля и извлечения образца ( Таблица 1 ).Агароза образует матрицы с идеальным размером пор для разделения молекул нуклеиновых кислот в диапазоне 0,1–25 т.п.о. Полиакриламид, с другой стороны, образует поры меньшего размера, которые разрешают молекулы нуклеиновых кислот размером менее 1 т.п.н. В некоторых случаях одноосновное разрешение между фрагментами <100 п.н. может быть получено с помощью полиакриламидных гелей [1].
Таблица 1. Различия между агарозным и полиакриламидным гелями.
агарозном
полиакриламида
Источник
полисахаридного полимера из морских водорослей
Сшитый акриламид и бис-акриламид
Гель литья подход
расплава и затвердеть
Инициировать химической РЕАКЦИИ
нуклеиновая кислота
расплав и экстракт
атрибут
диапазон разделения ДНК
50-50 000 BP
5-3000 BP
мощность
5–10 нуклеотидов
Одиночные нуклеотиды
а.
Агарозные гели
Для приготовления геля агароза обычно доступна в виде порошка, хотя в последние годы также стали доступны удобные предварительно взвешенные таблетки. Чтобы упростить рабочий процесс и сэкономить время, можно рассмотреть готовые агарозные гели, которые можно запускать, визуализировать и анализировать как интегрированный блок в некоторых коммерчески доступных системах.
Более быстрый, простой и эффективный электрофорез
В этом видеоролике представлены советы по ускорению, упрощению и повышению эффективности электрофореза путем выбора правильных инструментов исследования.
Встроенная платформа для работы с гелем и визуализации
В этом видеоролике показана полная система для электрофореза, которая полностью объединяет электрофорез ДНК и захват изображений для ваших открытий.
Чтобы приготовить собственные агарозные гели, процент геля рассчитывается следующим образом: % геля (масса/объем) = (граммы агарозы / миллилитры буфера) x 100%
Если используется флуоресцентное окрашивание нуклеиновой кислоты, следует включать в рекомендуемой концентрации (например, 0,5 мкг/мл бромистого этидия) при заливке геля (подробнее: Визуализация геля).
В таблице 2 приведены рекомендуемые процентные содержания агарозного геля для разделения фрагментов ДНК различной длины [2]. Как правило, гели с более высоким процентным содержанием обеспечивают лучшее разделение и разрешение более мелких фрагментов (, рис. 2, ). Обратите внимание, что гели с низким процентным содержанием могут быть хрупкими и трудными в обращении, в то время как гели с высоким процентным содержанием могут быть мутными и мешать визуализации.
Таблица 2. Рекомендуемое процентное содержание агарозных гелей для разделения фрагментов ДНК.
Гель процент
Диапазон эффективного разделения (п.н.)
0,5
2,000-50,000
0,6
1,000-20,000
0,7
800-12 000
0,8
800-10 000
600-10 000
1,0
400-8000
400-8000
1. 2
300-7 000
1,5
900-3000
2,0-2000
3.0
25-1000
4,0 Рис. 2. Одна и та же цепочка ДНК была разделена на 1%, 2% и 3% агарозных гелях в тех же условиях (включая время анализа).Фрагмент размером 1 т.п.н. отмечен красными звездочками для сравнения.
Основы агарозы
Агароза представляет собой очищенную форму агара, углеводного структурного компонента клеточной стенки морских красных водорослей. Агароза представляет собой неразветвленный (линейный) полимер с молекулярной массой ~ 120 000, состоящий из 800–1000 моносахаридов. Цепочки агарозы состоят из повторяющегося гетеродисахарида, а именно D-галактозы и 3,6-ангидро-α-L-галактозы, связанных β-1,4-гликозидной связью. Дисахаридная единица, также известная как агаробиоза, образует цепь, соединенную а-1,3-связями (, рисунок 3, ).
Рисунок 3. Структурная единица агарозы. Цепь агарозы состоит из 400–500 единиц агаробиозы.
При нагревании и охлаждении раствора агарозы образуется гелевая матрица с диаметром пор от 50 до 200 нм в зависимости от концентрации геля. При температуре выше 90°С агароза плавится и превращается в случайные клубки. При охлаждении две цепи агарозы образуют спиральные волокна, связанные водородными связями. Дальнейшее охлаждение ниже точки гелеобразования (обычно <40°C) приводит к образованию сети спиральных пучков, удерживаемых вместе большим количеством водородных связей, образуя гель с трехмерными ячейками (, рис. 4, ) [3,4].Из-за водородных связей гелеобразование агарозы обратимо при нагревании. Следовательно, нуклеиновые кислоты, разделенные электрофорезом, могут быть извлечены путем плавления срезов геля, содержащих интересующие фрагменты.
Рисунок 4. Структура агарозы в растворе, измененная при нагревании и охлаждении.
Для выделения ДНК >10 т.п.н. лучше использовать агарозу с низкой температурой плавления (LMP) . Агароза LMP плавится при температуре около 65°C (для 1% геля), что является относительно низкой температурой, позволяющей осторожно извлекать очень большие молекулы нуклеиновых кислот из геля.Низкая температура гелеобразования агарозы LMP (~25 °C) также делает ее идеальной для ферментативных реакций в геле (например, лигирования), когда ферменты активны в полутвердом растворе агарозы.
б. Полиакриламидные гели
Компоненты полиакриламида — акриламид и сшивающий агент, бисакриламид (также известный как «бис») — доступны в виде порошка, но для удобного приготовления гелей обычно используются готовые исходные растворы. Порошок и жидкие формы являются известными нейротоксинами, и с ними следует обращаться осторожно, используя защитную лабораторную одежду.Общая концентрация акриламида плюс бисакриламида (выраженная в %T) в геле определяет размер пор, который обычно составляет 20–150 нм в диаметре [5]. Чем выше процент, тем меньше размер пор, что позволяет разделять более мелкие молекулы. В таблице 3 показаны обычно используемые проценты геля [2].
Таблица 3. Рекомендуемое процентное содержание полиакриламидных гелей для разделения фрагментов нуклеиновых кислот. Денатурирующие гели используются для разделения одноцепочечных нуклеиновых кислот в их линейной форме (размеры указаны в основаниях), а неденатурирующие гели в основном используются для двухцепочечных нуклеиновых кислот (п.н. = пары оснований).
полиакриламидный гель (с бис, в 19:1),%
диапазон эффективных отделения
3 денатурируя гели
4,0
100-500 баз
5.0
70-400 баз
6.0
40-300 баз
8.0
30-200 баз
10,0
20-100 баз
15. 0
10-50 баз
20.0
5-30 баз
30,0
1-10 баз
3.5
100 -100 BP
5.0
80-500 BP
90-400 BP
60-400 BP
12,0
50-200 BP
15.0
25-150 BP
20,094
20.0
5-1004
В дополнение к %T весовое процентное соотношение бисакриламида (сшивающего агента) к общему количеству акриламида (%C) имеет решающее значение для размера пор полиакриламидных гелей и разделения образцов (, таблица 4, ).
%T и %C могут быть выражены как: %T (вес/объем) = [граммы (акриламид + бисакриламид) / миллилитры буфера] x 100% %C (вес/вес) = [граммы бисакриламида / грамм (акриламид + бисакриламид)] x 100%
Полиакриламид представляет собой полимер акриламидных мономеров, часто сшитых бисакриламидом или N,N’-метиленбисакриламидом.Сшивающий агент, бисакриламид, содержит две единицы акриламида, соединенные метиленовым мостиком. Их полимеризация происходит в результате свободнорадикальных реакций, обычно инициируемых персульфатом аммония (APS), которые могут катализироваться TEMED (N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин) (, рис. 5, ). Таким образом, концентрация APS и/или TEMED определяет скорость полимеризации при данной температуре.
Рисунок 5. Образование полиакриламида с показанными структурами акриламида и бисакриламида. Бисакриламид представляет собой две единицы акриламида, соединенные метиленовым мостиком (красный).
в. Выбор буфера при приготовлении геля
Агарозные и полиакриламидные гели готовят с использованием ионного раствора с электропроводностью, обеспечивающей подвижность нуклеиновых кислот во время электрофореза. Один и тот же тип буфера обычно используется как для геля, так и для рабочего буфера во время электрофоретического цикла, чтобы поддерживать одинаковый рН и ионную силу. Двумя наиболее распространенными буферами для электрофореза нуклеиновых кислот являются Трис-ацетатный буфер с ЭДТА (ТАЭ) и Трис-боратный буфер с ЭДТА (ТВЕ). бегать).
Для анализа одноцепочечной ДНК или РНК часто готовят агарозные и полиакриламидные гели и анализируют в денатурирующих условиях . Денатурирующие условия разрушают водородные связи, которые могут образовываться между нуклеиновыми кислотами, и, таким образом, уменьшают образование вторичных структур, таких как шпильки. Поэтому денатурирующий электрофорез является более рутинным для разделения и анализа РНК. Общие денатурирующие буферы, используемые с агарозными и полиакриламидными гелями при электрофорезе нуклеиновых кислот, включают:
Агароза: глиоксаль и ДМСО в натрий-фосфатном буфере, буфер NaOH-ЭДТА и формальдегид или формамид в буфере MOPS
Полиакриламид: мочевина в буфере TBE
2.Подготовка стандартов и образцов
а. Выбор стандарта нуклеиновой кислоты
При тестировании геля эталонный образец, содержащий нуклеиновые кислоты известных размеров, часто называемый стандартом или маркером или лестницей , включается для оценки размера представляющих интерес образцов. Факторы, которые необходимо учитывать при выборе подходящей лестницы для данного образца, включают:
Тип лестницы (т. е. ДНК или РНК), структуру фрагмента (т. е. одноцепочечную или двухцепочечную) и конформацию (т.например, суперскрученный, открыто-кольцевой или линейный), чтобы обеспечить надлежащее сравнение миграции (дополнительная информация: Влияние структуры и конформации на подвижность образца)
Количество фрагментов и схемы их разделения для правильной оценки размера
например, предназначена ли лестница для качественного анализа или для точных количественных измерений
Пригодность лестницы для типа используемого геля (например, для некоторых сборных гелей рекомендуются специальные лестницы, разработанные для оптимальных прогонов)
Характер наносимых красителей, чтобы избежать затемнения интересующие полосы ( Рисунок 6 )
Совместимость загрузочного буфера с используемым гелем (например,например, концентрация соли в буфере может повлиять на миграцию образца)
Раньше стандарты размера ДНК в основном получали из рестрикционных фрагментов вирусных геномов (например, лямбда φX174) и бактериальных плазмид (например, pUC19) . Эти стандарты часто имели проблемы с воспроизводимостью расщепления, чистотой образца и характером полос при электрофорезе. Позже лестничные схемы с фрагментами, полученными в результате реакций лигирования и/или ПЦР, стали предпочтительными из-за их воспроизводимости и получения желаемых размеров фрагментов.Сегодня хроматографически очищенные фрагменты считаются золотым стандартом для цепочек, поскольку эта технология обеспечивает более высокий контроль над качеством, характером полос, интенсивностью и количеством (, рис. 6, ).
Сегодня лестницы также предназначены для обеспечения устойчивости при комнатной температуре, как для транспортировки, так и для хранения, а также для удобства и снижения воздействия на окружающую среду. Также доступны предварительно смешанные, готовые к использованию лейдеры, где лейдеры были подготовлены с оптимальной концентрацией красителя для нанесения непосредственно на гели.
Обратите внимание, что ладдеры разных производителей с одинаковым описанием (например, 1 т. п.н. или 100 п.н.) могут , а не содержать одинаковое количество, размер и интенсивность фрагментов ДНК ( Рисунок 7 ). Перед использованием ознакомьтесь с сопроводительным руководством и протоколом от производителя, чтобы получить точную информацию о составе лестницы и ее правильном использовании.
В отличие от ДНК-лестниц, РНК-лестницы обычно поставляются с загрузочным буфером, содержащим денатурант. Денатуранты помогают поддерживать РНК в одноцепочечной форме, обеспечивая более предсказуемую миграцию образца и результаты разделения.При проведении РНК-гель-электрофореза следует избегать использования ДНК-лестниц, поскольку их использование в денатурирующих условиях может привести к нетипичным схемам разделения из-за разделения двойных цепей.
Рисунок 6. Различия в ДНК-лестницах. Лестница № 2 состоит из хроматографически очищенных фрагментов ДНК в буфере с оптимальной загрузкой, в результате чего получаются полосы одинаковой или желаемой интенсивности, отсутствие смазывания полос и отсутствие теней красителя. Напротив, лестница № 1 была изготовлена по более старой технологии и загружена буфером с неоптимальным составом.
Рисунок 7. Различия в составе фрагментов ДНК-лестниц одного и того же описания от двух разных поставщиков, A и B.
б. Подготовка образцов и стандартов
Количество ДНК, которое должно быть загружено в гель, необходимо рассчитать, чтобы убедиться, что интересующие полосы хорошо разделены для визуализации и обнаружения. Хотя для обнаружения с помощью флуоресцентного красителя обычно достаточно 1–100 нг/полосу ДНК, минимальное обнаруживаемое количество зависит от используемого красителя (подробнее: Свойства красителей нуклеиновых кислот) [6].Обратите внимание, что перегрузка образца или стандарта может привести к размытию полос и маскированию соседних полос, что приведет к ухудшению разрешения, особенно когда фрагменты имеют одинаковый размер (, рис. 8A, ).
Рис. 8. Субоптимальное разделение проб. (A) Загруженное количество влияет на разрешение полосы. (B) Небольшой объем загруженного образца может привести к искажению полос.
Образцы и лестницы готовятся в красителе для нанесения в буфере таким образом, чтобы конечный объем обычно занимал не менее 30% объема лунки.Использование меньшего объема может привести к искажению полос из-за плохого распределения в лунке (, рис. 8B, ). Для образцов, содержащих ДНК-связывающие белки или когезивные концы, может потребоваться нагрев смеси в красителе с SDS до загрузки геля, поскольку связывание белков и взаимодействие между фрагментами ДНК могут привести к плохому разделению (, рис. 10B, ).
в. Загрузка красителя и выбор буфера
Буферы для загрузки геля (обычно готовятся в виде маточных растворов 6X или 10X) добавляют к образцам (и стандарту, если необходимо) при подготовке к гель-электрофорезу.Компоненты загрузочных буферов включают следующее:
Ингредиент плотности , такой как глицерин или сахароза, повышает вязкость образцов, обеспечивая погружение образцов в лунки.
Соли , такие как Tris-HCl, создают для образцов среду с благоприятной ионной силой и рН. Загрузка буферов с высокой концентрацией солей может привести к более широким или искаженным полосам и мазкам.
Хелатор металла , такой как ЭДТА, предотвращает разрушение нуклеиновых кислот присутствующими в образце нуклеазами.
Красители обеспечивает цвет для легкого контроля загрузки образца, хода электрофореза и частых изменений pH. Некоторые загрузочные буферы могут содержать более одного красителя, чтобы более эффективно отслеживать миграцию молекул разного размера в образце.
Как правило, загрузочные красители представляют собой небольшие отрицательно заряженные молекулы, поэтому они мигрируют в том же направлении, что и нуклеиновые кислоты. Некоторые из них отображают цвета, зависящие от pH, которые служат индикаторами pH для образцов во время загрузки и анализа (, рис. 9A, ).Обычно используемые красители включают бромфеноловый синий, ксиленцианол, феноловый красный и оранжевый G. При выборе загрузочного буфера обращайте внимание на кажущуюся миграцию красителей (, рис. 9B, , , таблицы 5 и 6, ), чтобы избежать маскируя интересующие полосы нуклеиновых кислот, особенно если они имеют сходные молекулярные размеры (, рис. 9C, ). Маскировка красителем делает анализ и количественный анализ желаемых полос проблематичным и менее надежным.
Рис. 9. (A) Цвета красителей при нейтральном pH.(B) Миграция красителя в различных процентах агарозы и в буферах TAE и TBE. (C) Полосы маскировки теней красителя во время визуализации.
Иногда загрузочный буфер включает детергенты или восстановители, такие как SDS, мочевина и формамид, для денатурации. Эти добавки могут нарушать молекулярные взаимодействия между молекулами нуклеиновых кислот и внутри них, способствуя линейности или одноцепочечной конформации молекул. Образцы следует нагревать с денатурантами в красителе для получения оптимальных результатов разделения (, рис. 10A, ).Для электрофореза двухцепочечной ДНК из ферментативных реакций SDS может быть добавлен к загрузочному буферу, чтобы разрушить взаимодействие между белками и нуклеиновыми кислотами, чтобы предотвратить изменение подвижности образца ( Рисунок 10B ).
Рис. 10. Влияние тепла и ДСН на электрофорез образцов. (A) РНК-лестницы в денатурирующем буфере загружали на гель без термообработки. (B) Образцы ДНК из рестрикционного гидролизата и реакции лигирования готовили в загрузочном буфере с SDS или без него.Образцы в SDS нагревали перед нанесением геля.
Таблица 5. Видимые размеры молекул бромфенолового синего и ксиленцианолового ФФ в агарозном и полиакриламидном гелях [2].
(А) агарозном геле в КЭ и TAE буферы
бромфеноловый синий
ксиленцианол FF
Гель%
КЭ
ТАЕ
КЭ
ТАЕ
0,5
750 п. н.
1 150 п.н.
13 000 п.н.
16 700 п.н.6
540 п.н.
850 п.н.
8820 п.н.
11600 п.н.
0,7
410 п.н.
660 п.н.
6400 п.н.
8500 п.н.
0,8
320 BP
530 BP
4830 BP
4,830 BP
6 500 BP
0,9
260 BP
440 BP
3770 BP
5,1440 BP
1.0
220 п.н.
370 п.н.
3030 п.н.
4160 п.н.
1,2
160 п.н.
275 п.н.
2070 п.н.
2890 п.н.
1,5
110 bp
190 bp
190 bp
1300 bp
1,300 bp
1,840 bp
2,0
65 bp
120 bp
0
30 п. н.
60 п.н.
300 п.н.
460 п.н.
4,0
18 п.н.
40 п.н.
170 п.н.
260 п.н.
5,0
12 BP
27 BP
27 bp
105 bp
Ксилолцианол FF
Денатурирующие гели
4.0
50 оснований
230 оснований
5,0
35 основы
130 оснований
6,0
26 основы
105 оснований
8,0
19 Основы
75 баз
95 баз
10,0
12 баз
55 баз
15,0
10 баз
40 баз
20.0
8 оснований
28 основы
30,0
6 основы
20 оснований
неденатурирующих гели
3,5
100 п. н.
460 п.н.
5.0
65
65 BP
260 BP
45 BP
45 BP
160 BP
12,0
12,0 BP
700 BP
15.0
15 BP
60 BP
20.0
12 BP
45 BP
9003
(а) Agarose Gel в буферах TBE и TAE
Bromaphenol Blue
ксиленцианол FF
Гель%
КЭ
ТАЕ
КЭ
ТАЕ
0,5
750 п.н.
+1150 п.н.
13000 п.н.
16700 п.н.
0.6
540 п.н.
850 п.н.
8820 п.н.
11600 п.н.
0,7
410 п. н.
660 п.н.
6400 п.н.
8500 п.н.
0,8
320 BP
530 BP
4830 BP
4,830 BP
6 500 BP
0,9
260 BP
440 BP
3770 BP
5,1440 BP
1.0
220 п.н.
370 п.н.
3030 п.н.
4160 п.н.
1,2
160 п.н.
275 п.н.
2070 п.н.
2890 п.н.
1,5
110 bp
190 bp
190 bp
1300 bp
1,300 bp
1,840 bp
2,0
65 bp
120 bp
0
30 п.н.
60 п.н.
300 п.н.
460 п.н.
4,0
18 п.н.
40 п.н.
170 п.н.
260 п.н.
5,0
12 BP
27 BP
27 bp
105 bp
Ксилолцианол FF
Денатурирующие гели
4. 0
50 оснований
230 оснований
5,0
35 основы
130 оснований
6,0
26 основы
105 оснований
8,0
19 Основы
75 баз
95 баз
10,0
12 баз
55 баз
15,0
10 баз
40 баз
20.0
8 оснований
28 основы
30,0
6 основы
20 оснований
неденатурирующих гели
3,5
100 п.н.
460 п.н.
5.0
65
65 BP
260 BP
45 BP
45 BP
160 BP
12,0
12,0 BP
700 BP
15. 0
15 пн
60 пн
20.0
12 пн
45 пн
6
3. Запуск электрофореза
Электрофорез проводят после приготовления гелей, стандартов и образцов. Гель должен полностью затвердеть перед удалением гребенки и добавлением рабочего буфера. Гребень с гелем следует поднимать вверх плавно и устойчиво, чтобы не порвать гель и не деформировать лунки.После добавления буфера и удаления гребенки следует позаботиться об удалении пузырьков воздуха, которые могут попасть в лунки. Для полиакриламидных гелей лунки следует тщательно промыть буфером для удаления остаточного неполимеризованного акриламида.
Горизонтальные гели должны быть ориентированы в контейнере для геля таким образом, чтобы лунки для образцов находились на стороне отрицательного электрода, чтобы при начале электрофореза образцы перемещались к положительному электроду ( рис. 11A ). Эту ориентацию можно запомнить как «бег к красному», поскольку положительный электрод обычно кодируется красным. Вертикальные гелевые боксы имеют лунки, расположенные вверху (, рис. 11B, ).
Рис. 11. Гелевые установки в горизонтальных и вертикальных системах электрофореза. Стрелки указывают направление миграции нуклеиновых кислот при электрофорезе.
а. Выбор рабочего буфера
Текучий буфер, который представляет собой ионный раствор с буферной способностью, обычно используется в анализах геля, чтобы обеспечить протекание тока и предотвратить возможные изменения pH.Во время электрофореза отрицательный электрод становится более щелочным, а положительный электрод более кислым из-за потока электронов, что приводит к электролизу воды и сдвигу pH (, таблица 6, ). Выделение газообразного водорода и кислорода вызывает появление пузырьков на электродах, явный признак текучего геля. В идеале рабочий буфер и буфер для приготовления геля должны быть одинаковыми, чтобы обеспечить эффективную проводимость.
Таблица 6. Химические реакции и изменения pH на двух электродах. 9002
Electrode
отрицательный (-)
положительный (+)
электрон поток
в
химическая реакция
4 ч 2 o 2 o 2 o 2 o + 4 e – → 2 H 2 (газ) + 4 OH –
2 H 2 O → O 2 (газ) + 4 H 7 –03 3 8 4 e 3
Изменения pH
Основной
Кислый
Выбор буфера для электрофореза зависит от размера пробы, времени выполнения и пост-электрофоретических процессов, с трис-ацетатом (трис-ацетат) и ЭДТА ЭДТА (ТВЕ) является двумя наиболее распространенными буферами ( Таблица 7 ) [2,7].
TAE лучше подходит для фрагментов >1500 п.н., которые в этом буфере имеют тенденцию к меньшему смазыванию. Из-за меньшей буферной способности ТАЕ больше подходит для более коротких циклов электрофореза (например, <2 часов). Более длительные циклы геля в ТАЭ могут привести к перегреву, денатурации и/или диффузии образца и, возможно, плавлению геля из-за низкой буферной емкости.
TBE обладает более высокой буферной емкостью, что снижает вероятность его перегрева и, таким образом, лучше подходит для более длительных циклов.TBE лучше работает для разделения более коротких фрагментов, но dsDNA может мигрировать медленнее при TBE. TBE может ингибировать ферменты и, следовательно, может не подходить для последующих применений, включающих ферментативные стадии, такие как рестрикционное расщепление, клонирование и ПЦР.
Использование буфера с ионной силой выше 1X TAE или 0,5–1X TBE может привести к более быстрому перемещению образцов, но, вероятно, приведет к выделению большого количества тепла из-за высокой проводимости, что приведет к денатурации образца и повреждению геля.
Таблица 7. Руководство по выбору буфера.
Буфер Преимущества
Недостатки разрешения Нуклеиновые кислоты
ДНК РНК
TAE
Лучше разделение крупных фрагментов
низкой буферной емкости; Лучше для более коротких прогонов
Хорошо для дальних постриганий ферментативные приложения
> 1000 BP
> 1 000 баз
> 1,500 баз
TBE
лучше для более коротких фрагментов (линейный дцДНК мигрирует примерно на 10% медленнее при КЭ)
Высокая ионная сила и буферная способность; подходит для более длительных циклов
Менее склонен к перегреву
Ингибирует ферменты, что делает его непригодным для последующих ферментативных стадий (например,г. , клонирование)
<5000 п.н.
<1500 п.н.
Гели должны быть полностью погружены в буфер, чтобы обеспечить поток ионов и предотвратить высыхание геля ( рис. 12А ). Однако при работе с горизонтальным гелем, таким как агарозный гель, глубина буфера над гелем не должна превышать 3–5 мм. Избыток буфера над гелем (> 5 мм) может привести к снижению подвижности нуклеиновых кислот, усилению деформации полос и перегреву.
Рисунок 12.Влияние рабочего буфера на электрофорез. (A) Верхняя часть геля не была погружена во время электрофореза. (B) Гель запускали в буфере с более низкой концентрацией соли, чем рекомендуется, который отличался от буфера, используемого при приготовлении геля.
Обратите внимание, что рабочий буфер денатурирующих агарозных гелей не может быть ни TAE, ни TBE, поскольку эти гели могут быть приготовлены в другом буфере, таком как фосфат натрия и MOPS (подробнее: Приготовление денатурирующего геля). Важно выбрать рабочий буфер, совместимый с используемым гелем (, рис. 12B, ).
б. Напряжение
Чтобы запустить гель, к гелю прикладывают электрический потенциал с постоянным напряжением, током или мощностью (узнайте больше: их влияние на электрофоретические циклы). В электрофорезе нуклеиновых кислот обычно используется постоянное напряжение, при этом напряжение обычно устанавливается на уровне 5–10 В/см.
Прикладываемое напряжение (В) = расстояние между электродами (см) x рекомендуемое значение В/см
Напряжение можно регулировать в зависимости от размера фрагментов ДНК, подлежащих разделению, а также от типа рабочего буфера б/у ( Таблица 8 ).Рекомендуемые напряжения обычно поставляются с коммерчески доступными лестницами нуклеиновых кислот для оптимального разделения фрагментов в каждом продукте. Обратите внимание, что очень низкое напряжение замедляет миграцию нуклеиновых кислот, что может привести к диффузии малых молекул и низкому разрешению (, рис. 13А, ). С другой стороны, при слишком высоком напряжении может произойти плохое разделение и смазывание образцов; в некоторых случаях может наблюдаться перегрев буфера, «полосы улыбки» и даже денатурация образцов (, рис. 13В, ).
Рисунок 13. Влияние напряжения на электрофорез ДНК. (A) Низкое напряжение приводит к плохому разрешению полос и диффузии. (B) Высокое напряжение может вызвать «улыбку».
Таблица 8. Условия выполнения в зависимости от размера фрагмента [2]. 9002
Размер ДНК
Напряжение
Оптимальный рабочий буфер
<1 KB
5-10 V / см
TBE
1-5 Kb
4 -10 В / см
TAE или TBE TAE или TBE
> 5 Kb
1-3 V / CM
TAE
до 10 КБ
до 23 В / см
TAE
В некоторых случаях к гелевому аппарату может быть подключен датчик температуры, чтобы контролировать охлаждение и нагрев буфера. Для электрофоретических циклов > 2 часов охлаждение и рециркуляция буфера могут улучшить разделение образцов. Для денатурирующих гелей нагревание буфера до 55°C может улучшить результаты за счет улучшения одноцепочечных форм нуклеиновых кислот.
в. Время работы
Длина геля, используемое напряжение и размеры молекул в образце определяют количество времени, необходимое для электрофореза. Обычно электрофорез проводят до тех пор, пока интересующая полоса не переместится на 40–60% длины геля.В определенные промежутки времени во время работы с гелем можно наблюдать относительное положение наносимых красителей до тех пор, пока краситель бромфеноловый синий не мигрирует примерно на 60% длины геля и/или краситель оранжевый G не мигрирует на 80% длины геля. Самое главное, следует контролировать время работы, чтобы мельчайшие молекулы в образцах или стандартах не мигрировали за пределы геля. Обратите внимание, что времени выполнения меньше, чем необходимо, будет недостаточно для полного разрешения полос ( Рисунок 14 ). Лестницы ДНК, содержащие отслеживающие красители, которые двигаются позади и впереди образцов, доступны, чтобы помочь отслеживать движения геля, а также гарантировать, что интересующие полосы не маскируются красителями.
Рис. 14. Влияние времени анализа на разделение проб.
4. Визуализация образцов в геле
После завершения цикла с гелем образцы необходимо визуализировать. Поскольку нуклеиновые кислоты не видны при обычном окружающем освещении, для визуализации требуется метод обнаружения.Как описано в таблице 9 , доступные методы предлагают различные диапазоны чувствительности и преимущества при обнаружении образцов [6].
Таблица 9. Окрашивание геля нуклеиновой кислоты и методы обнаружения.
Stain
Преимущества и соображение
чувствительности для обнаружения (приблизительные дц размеров)
колориметрического
Метиленовых синего
Кристалла фиолетового
не требуют специального оборудование
Требуется этап обесцвечивания
Низкая чувствительность
0. 5-1 мкг
4
5
4
требуется возбуждение УФ и / или синий свет
часто мутагенный
может потребовать специальные утилизации отходов
предлагает более короткие рабочие процессы с высокой чувствительностью
образцы пятен во время или после электрофореза
25 пг-1 нг
RadioActive
Требуется подготовка и меры предосторожности для радиационной безопасности
Обнаруживает или этикетки образцов радиоактивными зондами или нуклеотиды
Общий для обнаружение олигонуклеотидов
Считается наиболее чувствительным
10 фг–1 нг
а.Флуоресцентные пятна
Среди доступных красителей флуоресцентные красители наиболее широко используются для обнаружения образцов ( Рисунок 15 ) из-за их простоты использования и высокой чувствительности. При возбуждении соответствующей длиной волны красители излучают видимый свет (т. е. флуоресцируют) (подробнее: Основы флуоресценции). Интенсивность флуоресценции коррелирует с количеством связанной нуклеиновой кислоты, что является основой для обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот при электрофорезе.
Бромид этидия (EtBr) представляет собой флуоресцентный краситель, широко используемый в электрофорезе нуклеиновых кислот из-за его короткого времени окрашивания (~30 мин) и высокой чувствительности (обнаруживает ~1 нг двухцепочечной ДНК на полосу).Тем не менее, альтернативный краситель может быть рассмотрен по следующим причинам:
Рисунок 15. Различные типы красителей, связывающих нуклеиновые кислоты.
Мутагенность и утилизация: Бромид этидия обладает высокой мутагенностью, поэтому менее опасные флуоресцентные красители, не требующие специальной утилизации, обеспечивают более безопасный рабочий процесс при электрофорезе нуклеиновых кислот ( Рисунок 16 ).
Чувствительность: Флуоресцентные красители с более высокой чувствительностью, чем EtBr, лучше подходят для обнаружения небольшого количества образцов ( Рисунок 16 ).Одноцепочечные нуклеиновые кислоты часто требуют большего количества образцов и/или интеркалирующего красителя для визуализации, потому что стекинг оснований меньше. Таким образом, красители, которые предпочтительно связываются с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, являются хорошей альтернативой для обнаружения образцов при электрофорезе РНК.
УФ-повреждение: Флуоресцентные красители, которые могут возбуждаться низкоэнергетическим синим светом вместо УФ-света, вызывают меньше структурных повреждений нуклеиновых кислот, но обнаруживают с такой же или более высокой чувствительностью ( рис. 17A ).Таким образом, возбуждение синим светом при электрофорезе может повысить эффективность последующих приложений, таких как клонирование и секвенирование (, рис. 17B, ).
Рисунок 16. Альтернативы бромистому этидию с улучшенными характеристиками.
Щелкните изображение, чтобы увеличить его. Пятна наиболее эффективно возбуждаются на определенной длине волны, называемой максимумом возбуждения.Красители SYBR Safe и SYBR Gold максимально возбуждаются синим светом и в меньшей степени УФ-светом. (B) Эффективность клонирования после указанного времени экспозиции с использованием синего света (для красителя SYBR Safe) или ультрафиолетового света (для бромистого этидия) для визуализации клонирующей вставки во время электрофореза. Эффективность клонирования гель-очищенного фрагмента lacZ измеряли по количеству синих колоний, образовавшихся на чашках с X-Gal, что указывает на вставку функционального (немутированного) гена в вектор.
б. УФ-затенение
Вместо окрашивания красителем нуклеиновые кислоты можно визуализировать косвенно с помощью метода под названием УФ-затенение , использующего поглощение УФ-излучения нуклеиновыми кислотами [8]. Он обычно используется для разделения и очистки олигонуклеотидов и РНК с помощью электрофореза, когда достаточно простого обнаружения и / или использование интеркалирующих красителей может повлиять на последующие приложения. Для обнаружения с помощью УФ-затенения необходимы образцы от нанограммов до микрограммов, и следует использовать тонкий и прозрачный гель, такой как полиакриламид, для обеспечения поглощения и пропускания УФ-излучения.В протоколе УФ-затенения гель удаляют из кассеты после электрофореза для максимального обнаружения, заворачивают в прозрачную пластиковую пленку для защиты, а затем помещают на пластину для УФ-флуоресцентной тонкослойной хроматографии (ТСХ). Когда гель подвергается воздействию УФ-излучения, поглощение полосами нуклеиновых кислот отбрасывает тени на пластину для ТСХ (, рисунок 18, ). Затемненные участки геля нужных размеров вырезаются для дальнейшей обработки.
Рис. 18. УФ-затенение для визуализации отдельных фрагментов.
5.
Документирующие гели
а. Флуоресцентная визуализация
После визуализации гели нуклеиновых кислот обычно документируются для регистрации и анализа результатов электрофореза. Если образцы окрашены флуоресцентным красителем, требуется специальное оборудование для возбуждения красителя соответствующим источником света, чтобы как визуализировать, так и получить изображение геля. Источник возбуждающего света может располагаться над гелем, называемым эпииллюминатором (похожим на портативную УФ-лампу), или под гелем, называемым трансиллюминатором ( рис. 19 ).Поскольку источник света находится дальше в настройках эпи-иллюминатора, образцы подвергаются меньшему воздействию энергии. Это может уменьшить УФ-повреждение нуклеиновых кислот, но также может снизить сигнал полос геля. Трансиллюминатор, с другой стороны, обеспечивает более высокий сигнал для полос, но может увеличить повреждение, вызванное УФ-излучением, из-за близости излучения к гелю.
Рисунок 19. Эпи- и трансиллюминация.
б. Авторадиография
Для электрофореза радиоактивно меченых нуклеиновых кислот гель подвергается воздействию рентгеновской пленки после электрофореза для документации, процесс называется ауторадиография .Интенсивность полос с радиоактивной меткой можно измерить с помощью денситометрии для количественного определения.
Top
В заключение, рабочие процессы электрофореза нуклеиновых кислот используют ряд этапов и реагентов для разделения и анализа образцов. Выбор правильных инструментов для ваших образцов, а также признание преимуществ и недостатков рабочего процесса могут значительно улучшить результаты электрофореза в приложениях молекулярной биологии.
Green MR, Sambrook J (2012) Анализ ДНК. В: Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство (4-е изд.). Колд-Спринг-Харбор: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. стр. 81–156.
Yilmaz M, Ozic C, Gok I (2012) Принципы разделения нуклеиновых кислот с помощью электрофореза в агарозном геле. В: Magdeldin S (редактор), Гель-электрофорез: принципы и основы .Риека: InTech. стр. 33–40.
Ли С.В., Бахаман А.Р. (2012) Дискриминационная способность электрофореза в агарозном геле при анализе фрагментов ДНК. В: Magdeldin S (редактор), Гель-электрофорез: принципы и основы . Риека: InTech. стр. 41–56.
Barril P, Nates Silivia (2012) Введение в матрицы для электрофореза в агарозном и полиакриламидном геле с точки зрения их чувствительности обнаружения. В: Magdeldin S (редактор), Гель-электрофорез: принципы и основы .Риека: InTech. стр. 3–14.
Thermo Fisher Scientific Inc (2010) Обнаружение и анализ нуклеиновых кислот. В: Справочник по молекулярным зондам: Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки . стр. 349–360.
Brody JR, Kern SE (2004) История и принципы использования проводящих сред для стандартного электрофореза ДНК. Anal Biochem 333(1):1–13.
Hassur SM, Whitlock HW Jr (1974) УФ-затенение — новый и удобный метод определения местоположения поглощающих ультрафиолетовое излучение веществ в полиакриламидных гелях. Anal Biochem 59(1):162–164.
Верх
Электрофорез | Биомедицинские приборы и технологии
Все началось с глины
В 1807 году немецкий врач Фердинанд Фридрих Ройсс зафиксировал первое известное наблюдение частиц глины, рассеянных в воде, движущихся под действием пространственно однородного электрического поля, создаваемого вольтова столб (грубая батарея). С помощью этих экспериментов Ройсс определил существование «барьеров» в виде песка и глины между полюсами батареи.Хотя Ройсс был доктором как медицины, так и хирургии, он был скорее ученым общего профиля, проводил более спорадические эксперименты и опубликовал несколько статей по этому и связанным с ним наблюдениям до 1821 года. пожар уничтожил большую часть его исследовательских работ, поэтому его работа получила мало внимания. (Есть также некоторые исторические предположения, что, хотя это было интересное явление, Ройсс не нашел для него практического применения, поэтому он обратил свое внимание на другое.)
Наблюдения Ройсса практически не проводились, за исключением нескольких экспериментов других ученых той эпохи, таких как Иоганн Вильгельм Хитторф и Вальтер Нернст, которые измеряли поведение малых ионов, движущихся через жидкие растворы под воздействием электрического поля.
В 1930 году Арне Тиселиус заново открыл это явление и написал об этом в своей докторской диссертации «Метод подвижных границ в изучении электрофореза белков». Тизелиус продолжил свои эксперименты по применению физики и физических методов к общим биохимическим проблемам, получив в 1948 году Нобелевскую премию по химии.Основным результатом его экспериментов стала разработка в 1937 году «аппарата Тизелиуса», U-образного набора стеклянных трубок, составляющего первое настоящее устройство для электрофореза. Это устройство не только открыло новые возможности применения этой развивающейся технологии для анализа химических смесей, но и побудило некоторые крупные химические исследовательские центры приобрести собственные приборы Тизелиуса и проводить собственные эксперименты.
Тиселиус и его аппарат оказали глубокое влияние как на биологию, так и на биохимию.Но он был не один. С 1940-х по 1960-е годы другие ученые разработали методы использования фильтровальной бумаги и различных гелей в качестве вспомогательных сред для электрофореза. Эти более сложные гели позволили разделить биологическое вещество на основе небольших химических и физических различий, что привело к возникновению области молекулярной биологии и легло в основу сложных тестов электрофореза, включая снятие отпечатков белков, Саузерн, Вестерн и аналогичные процедуры блоттинга, а также анализ ДНК. последовательность действий.
%PDF-1.4
%
1141 0 объект >
эндообъект
внешняя ссылка
1141 281
0000000016 00000 н
0000008833 00000 н
0000008960 00000 н
0000009005 00000 н
0000009226 00000 н
0000009426 00000 н
0000010609 00000 н
0000012004 00000 н
0000012074 00000 н
0000036587 00000 н
0000036786 00000 н
0000037156 00000 н
0000037491 00000 н
0000062349 00000 н
0000062555 00000 н
0000062915 00000 н
0000063122 00000 н
0000063212 00000 н
0000063300 00000 н
0000064144 00000 н
0000064756 00000 н
0000065414 00000 н
0000066030 00000 н
0000066821 00000 н
0000067602 00000 н
0000068494 00000 н
0000077075 00000 н
0000081348 00000 н
0000115909 00000 н
0000116631 00000 н
0000117325 00000 н
0000117385 00000 н
0000117499 00000 н
0000117608 00000 н
0000117653 00000 н
0000117737 00000 н
0000117850 00000 н
0000117963 00000 н
0000118097 00000 н
0000118200 00000 н
0000118342 00000 н
0000118422 00000 н
0000118563 00000 н
0000118680 00000 н
0000118807 00000 н
0000118949 00000 н
0000119080 00000 н
0000119167 00000 н
0000119310 00000 н
0000119427 00000 н
0000119553 00000 н
0000119695 00000 н
0000119882 00000 н
0000120024 00000 н
0000120112 00000 н
0000120218 00000 н
0000120330 00000 н
0000120526 00000 н
0000120618 00000 н
0000120726 00000 н
0000120895 00000 н
0000121057 00000 н
0000121211 00000 н
0000121435 00000 н
0000121526 00000 н
0000121714 00000 н
0000121916 00000 н
0000122008 00000 н
0000122107 00000 н
0000122286 00000 н
0000122377 00000 н
0000122553 00000 н
0000122706 00000 н
0000122842 00000 н
0000122937 00000 н
0000123081 00000 н
0000123189 00000 н
0000123341 00000 н
0000123487 00000 н
0000123590 00000 н
0000123737 00000 н
0000123839 00000 н
0000123953 00000 н
0000124062 00000 н
0000124190 00000 н
0000124375 00000 н
0000124559 00000 н
0000124728 00000 н
0000124996 00000 н
0000125119 00000 н
0000125268 00000 н
0000125472 00000 н
0000125702 00000 н
0000125934 00000 н
0000126154 00000 н
0000126319 00000 н
0000126481 00000 н
0000126630 00000 н
0000126806 00000 н
0000126933 00000 н
0000127058 00000 н
0000127231 00000 н
0000127394 00000 н
0000127595 00000 н
0000127753 00000 н
0000127917 00000 н
0000128024 00000 н
0000128153 00000 н
0000128318 00000 н
0000128474 00000 н
0000128634 00000 н
0000128739 00000 н
0000128874 00000 н
0000129075 00000 н
0000129169 00000 н
0000129295 00000 н
0000129392 00000 н
0000129497 00000 н
0000129683 00000 н
0000129935 00000 н
0000130037 00000 н
0000130239 00000 н
0000130326 00000 н
0000130432 00000 н
0000130528 00000 н
0000130616 00000 н
0000130760 00000 н
0000130882 00000 н
0000131021 00000 н
0000131171 00000 н
0000131319 00000 н
0000131418 00000 н
0000131606 00000 н
0000131737 00000 н
0000131848 00000 н
0000132028 00000 н
0000132148 00000 н
0000132276 00000 н
0000132398 00000 н
0000132568 00000 н
0000132674 00000 н
0000132781 00000 н
0000132986 00000 н
0000133106 00000 н
0000133209 00000 н
0000133368 00000 н
0000133474 00000 н
0000133589 00000 н
0000133720 00000 н
0000133842 00000 н
0000133965 00000 н
0000134090 00000 н
0000134206 00000 н
0000134337 00000 н
0000134452 00000 н
0000134624 00000 н
0000134742 00000 н
0000134847 00000 н
0000135007 00000 н
0000135137 00000 н
0000135263 00000 н
0000135378 00000 н
0000135526 00000 н
0000135662 00000 н
0000135858 00000 н
0000136075 00000 н
0000136187 00000 н
0000136394 00000 н
0000136514 00000 н
0000136615 00000 н
0000136735 00000 н
0000136908 00000 н
0000137027 00000 н
0000137188 00000 н
0000137261 00000 н
0000137406 00000 н
0000137567 00000 н
0000137717 00000 н
0000137874 00000 н
0000138093 00000 н
0000138213 00000 н
0000138336 00000 н
0000138496 00000 н
0000138676 00000 н
0000138763 00000 н
0000138951 00000 н
0000139140 00000 н
0000139262 00000 н
0000139387 00000 н
0000139582 00000 н
0000139655 00000 н
0000139794 00000 н
0000139985 00000 н
0000140058 00000 н
0000140261 00000 н
0000140373 00000 н
0000140488 00000 н
0000140624 00000 н
0000140743 00000 н
0000140850 00000 н
0000140953 00000 н
0000141149 00000 н
0000141244 00000 н
0000141351 00000 н
0000141521 00000 н
0000141594 00000 н
0000141732 00000 н
0000141901 00000 н
0000142120 00000 н
0000142310 00000 н
0000142397 00000 н
0000142513 00000 н
0000142586 00000 н
0000142729 00000 н
0000142830 00000 н
0000143056 00000 н
0000143250 00000 н
0000143351 00000 н
0000143499 00000 н
0000143630 00000 н
0000143747 00000 н
0000143901 00000 н
0000144021 00000 н
0000144191 00000 н
0000144264 00000 н
0000144418 00000 н
0000144535 00000 н
0000144645 00000 н
0000144765 00000 н
0000144838 00000 н
0000144964 00000 н
0000145147 00000 н
0000145220 00000 н
0000145293 00000 н
0000145400 00000 н
0000145513 00000 н
0000145632 00000 н
0000145748 00000 н
0000145854 00000 н
0000146010 00000 н
0000146126 00000 н
0000146288 00000 н
0000146465 00000 н
0000146584 00000 н
0000146783 00000 н
0000146939 00000 н
0000147054 00000 н
0000147202 00000 н
0000147364 00000 н
0000147471 00000 н
0000147647 00000 н
0000147829 00000 н
0000147916 00000 н
0000148041 00000 н
0000148246 00000 н
0000148393 00000 н
0000148534 00000 н
0000148724 00000 н
0000148906 00000 н
0000149016 00000 н
0000149125 00000 н
0000149263 00000 н
0000149394 00000 н
0000149538 00000 н
0000149676 00000 н
0000149759 00000 н
0000149935 00000 н
0000150051 00000 н
0000150179 00000 н
0000150291 00000 н
0000150418 00000 н
0000150584 00000 н
0000150716 00000 н
0000150894 00000 н
0000151023 00000 н
0000151154 00000 н
0000151281 00000 н
0000151456 00000 н
0000151617 00000 н
0000151759 00000 н
0000005916 00000 н
трейлер
]>>
startxref
0
%%EOF
1421 0 объект > поток
xX{TW3 !-1P-X(ϱ
Этидий бромид | Охрана окружающей среды и безопасность
Назначение и область применения
Бромид этидия обычно используется в качестве нерадиоактивного маркера для идентификации и визуализации полос нуклеиновых кислот при электрофорезе. Он легко флуоресцирует красновато-коричневым цветом при воздействии ультрафиолетового света , усиливаясь почти в 20 раз после связывания с ДНК. В этом общем руководстве по безопасности химических веществ описываются основные меры безопасности при обращении с этим химическим веществом в исследовательских лабораториях. Главный исследователь (PI) или руководитель лаборатории отвечает за разработку и внедрение стандартных операционных процедур (SOP) для покупки, хранения и безопасного обращения с этим химическим веществом, характерных для исследований PI.
Контактную информацию и области знаний можно найти на странице Контакты
Опасности
Поскольку бромид этидия может связываться с ДНК, он очень токсичен как мутаген. Он потенциально может вызывать канцерогенные или тератогенные эффекты, хотя научных доказательств того, что они влияют на здоровье, обнаружено не было. Пути воздействия бромистого этидия: вдыхание, проглатывание и всасывание через кожу. Острое воздействие бромида этидия вызывает раздражение рта, верхних дыхательных путей, кожи и глаз.
Обращение
При использовании чистого бромистого этидия работа с ним должна выполняться в вытяжном шкафу в полной защитной одежде, включая лабораторный халат, обувь с закрытыми носками, химически стойкие перчатки и химические защитные очки.
Для защиты рук защитные перчатки из нитрильного каучука; латексные перчатки хирургического типа не рекомендуются. При работе с высокими концентрациями или в течение длительного периода времени использование двойных перчаток может дополнительно снизить риск воздействия, особенно если внешняя перчатка заменяется при загрязнении.Пользователи должны мыть руки после снятия перчаток, даже если перчатки не порваны и не проколоты, чтобы удалить остатки, которые могли попасть на кожу.
Поблизости должны быть доступны аварийная промывка глаз и душ. При использовании УФ-излучения для визуализации бромида этидия пользователь должен носить очки, блокирующие УФ-излучение, или работать в УФ-камере с установленным защитным стеклом.
Процедуры разлива/воздействия
В случае воздействия и/или разлива выполните следующие действия:
При случайном вдыхании вынести на свежий воздух и обратиться за медицинской помощью.
При проглатывании немедленно обратитесь к врачу.
При попадании на кожу снимите загрязненную одежду и промойте кожу большим количеством воды с мылом в течение не менее 15 минут; получить медицинскую помощь.
При попадании в глаза промойте глаза большим количеством воды в течение не менее 15 минут, время от времени поднимая верхние и нижние веки, затем обратитесь к врачу.
Удаление отходов
Хотя бромид этидия не считается опасным отходом, считается, что отходы, содержащие это химическое вещество, представляют мутагенную опасность.Отходы должны храниться в герметичных контейнерах между использованием и утилизацией.
EHS рекомендует следующие специальные процедуры утилизации бромистого этидия:
Угольная фильтрация/абсорбция
Фильтрация водных растворов отходов бромистого этидия, не содержащих других загрязнителей, через слой активированного угля является относительно простым и эффективным методом удаления бромида этидия. Фильтрат можно сливать в канализацию (использованные фильтры утилизируются аналогично гелю; см. ниже).Доступны два простых комплекта для угольной фильтрации:
.
Комплект воронки
Whatman поставляет имеющийся в продаже комплект фильтрующих воронок, в котором используется упакованный угольный диск с градуировкой для легкого отслеживания количества водного раствора, рассчитанного для фиксированного количества остатка бромистого этидия. Это особенно полезно для лабораторий, которые одновременно генерируют большое количество решений. Набор доступен в магазинах биохимии (4-403 BSB, 335-7927, артикул № 108450) или у других поставщиков.В отношении процедур следуйте инструкциям производителя.
Пакеты для удаления красок Amresco
Пакеты для удаления пятен Amresco. Один пакет способен удалить из растворов 5 мг бромида этидия. Растворы обрабатывают в течение ночи; специальная абсорбирующая смесь задерживает молекулы бромистого этидия и другие биологические пятна в пакете. Этот продукт также доступен в магазинах биохимии (#108455).
Гели для электрофореза и использованные фильтры для растворов
Гели, использованные фильтры для растворов и другие твердые материалы, загрязненные бромистым этидием, собираются EHS для утилизации.EHS распределяет контейнер для сбора этих отходов. Контейнеры можно получить, заполнив форму запроса на вывоз химических отходов .
Растворы бромистого этидия
Водные растворы бромистого этидия, не содержащие других опасных химических веществ, должны фильтроваться или собираться EHS. Растворы бромистого этидия, которые также содержат спирты или другие растворители, тяжелые металлы, цианиды, сульфиды или другие опасные химические вещества, должны утилизироваться как опасные отходы.
Перчатки, оборудование и мусор
Перчатки, пробирки, бумажные полотенца и т. д., минимально загрязненные бромистым этидием, следует помещать в контейнер для биологически опасных отходов.
Альтернативы
В качестве альтернативы бромид этидия можно заменить менее токсичными и мутагенными веществами, такими как SYBR Green I/II или Sybr®Safe. Эти продукты широко используются в качестве альтернативы бромистому этидию и не требуют специальной обработки при утилизации. Sybr®Safe доступен в магазинах биохимии (артикул № 022495).
Обучение
PI отвечает за СОП, относящиеся к использованию этого химического вещества в их лаборатории. PI/Lab Manager отвечает за конкретное и практическое обучение использованию этого химического вещества в своей лаборатории. Обучение должно быть непосредственно задокументировано в лабораторной тетради исследователя. Каждый день обучения и тренер, и стажер должны расписываться в лабораторной тетради.
Первоначально исследователи должны проводить реакции в присутствии PI или старшего научного сотрудника, чтобы наблюдать за безопасным обращением с этим химическим веществом.Ознакомьтесь с паспортами безопасности конкретных реагентов (SDS). Оцените опасности, связанные с химической реакцией и экспериментальной установкой.
Ресурс:
Внешние ссылки:
Капиллярный электрофорез: привлекательный метод для хирального разделения — 06 июня 2013 г. — Кари Э. Сенгер — ван де Гринд 1,2, Илва Хеделанд 2, Курт Петтерссон 2 — Хроматография сегодня Статьи
Капиллярный электрофорез (КЭ) разделяет соединения, различающиеся отношением заряда к гидродинамическому размеру, и является превосходным методом анализа полярных соединений.Этот метод особенно применим к хиральным разделениям. Хиральное разделение КЭ достигается добавлением хирального селектора в так называемый фоновый электролит. Затем энантиомеры быстро образуют обратимое равновесие с селектором. В этой статье представлена простая стратегия разработки метода для основных, кислых и нейтральных соединений, которая проиллюстрирована примерами и распространенными ошибками. Некоторые важные передовые методы работы (рецепты фонового электролитного буфера, температура, скорректированная площадь пика, инъекция, удаление полиимидного покрытия с концов капилляров) выделены, так что хорошее хиральное разделение может быть превращено в надежный аналитический метод.
Введение
Капиллярный электрофорез используется в фармацевтической промышленности с тех пор, как в конце 1980-х годов на рынке появились первые коммерчески доступные инструменты. После спада в использовании в течение первого десятилетия этого века наблюдается недавнее возрождение [1], не в последнюю очередь из-за растущего распространения больших биологических молекул в качестве лекарств. Электрофорез традиционно применялся в основном к белкам и нуклеиновым кислотам (ДНК, РНК), но КЭ применим к широкому спектру аналитов, и все, от небольших неорганических ионов до клеточных органелл, и даже целые клетки и вирусы были проанализированы с помощью КЭ.Он используется для дополнения или замены традиционных методов гель-электрофореза и хроматографии. Типичные успешные приложения
для малых молекул являются хиральными, а также ахиральными определениями чистоты лекарственного вещества и продуктов, а также определением противоионов лекарства или малых ионов, таких как ионы металлов, органические кислоты и т. д. Поскольку КЭ достаточно хорошо работает для анализа белков, в последнее время он получил широкое распространение. повышенный интерес к биотехнологической отрасли. Терапевтические белки, которые являются кандидатами в лекарства, нуждаются в дополнительной характеристике во время открытия и разработки лекарств по сравнению с традиционными малыми молекулами.Кроме того, методы КЭ используются для анализа контроля качества одобренных биотехнологических препаратов. Тот факт, что КЭ успешно завоевал положение в фармацевтической и биотехнологической промышленности, подтверждается общими главами и монографиями в фармакопеях, например, в Европейской фармакопее (Ph.Eur.) [[2], [1]] и Фармакопее США ( USP) [[3], [1]].
Поскольку электрофорез разделяет аналиты, которые различаются по своему заряду и соотношению их гидродинамических размеров в приложенном электрическом поле, заряд аналита является необходимым условием для электрофоретической подвижности.Либо аналит должен иметь одну или несколько заряженных функциональных групп, либо должен образовывать ковалентную связь или обратимые комплексы либо с любым из компонентов фонового электролита (BGE), либо с добавкой (например, хиральным селектором или мицеллой). . Использование добавок привело к появлению нескольких подметодов, таких как хиральный CE. Именно в области хирального разделения КЭ оказал большое влияние на анализ малых молекул. Преимущество Chiral CE заключается в обеспечении высокоэффективного разделения по разумной цене.Для сравнения, хиральная газовая хроматография показывает эффективное энантиоразделение, но часто может включать трудоемкую стадию дериватизации. Кроме того, ГХ подходит только для летучих и термостабильных соединений и, следовательно, сегодня используется реже. Несмотря на то, что жидкостная хроматография (ЖХ) и сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) имеют в целом высокий уровень успеха для хирального разделения, хиральная КЭ часто лучше подходит для быстрого скрининга оптимальных условий, поскольку энантиомерное разделение обычно быстрее в КЭ и нет необходимости в течение длительного времени уравновешивания при переключении на другой киральный БГЭ.Более того, КЭ применялся для скрининга селекторов, которые впоследствии успешно применялись в качестве хиральных стационарных фаз в ЖК [4]. С помощью КЭ можно проводить скрининг нескольких хиральных селекторов с гораздо меньшими затратами по сравнению со стоимостью покупки одной или нескольких хиральных колонок, что снижает затраты на разработку метода, особенно для новых соединений. Кроме того, низкое потребление растворителей и растворенных веществ делает КЭ более экологически чистым, а также относительно дешевым методом.Наконец, высокая эффективность в КЭ означает, что для их разделения может быть достаточно небольшой разницы в подвижности между энантиомерами. Таким образом, хиральный селектор в CE часто более широко применим, т.е. разделяет энантиомеры большего количества соединений, чем в LC [c.f. [5], [6]].
Хиральный CE
Хиральное разделение CE достигается добавлением хирального селектора к BGE. Энантиомеры быстро образуют обратимое равновесие с селектором. Это означает, что часть времени энантиомер мигрирует свободно в BGE, а часть времени он мигрирует в виде комплекса энантиомер-селектор.Кажущаяся подвижность энантиомеров будет меняться в зависимости от силы комплекса (т.е. констант равновесия) и подвижности комплекса энантиомер-селектор. Чтобы разделить энантиомеры, необходимо выполнить несколько требований. Во-первых, либо энантиомеры, либо селектор должны быть заряжены. Кроме того, энантиомеры хиральной молекулы должны иметь различное сродство к хиральному селектору, и/или комплексы энантиомер-селектор должны различаться по подвижности [[7]-[9]].Типичный пример хирального разделения показан на рисунке 1. Верхняя кривая показывает ахиральное КЭ-разделение пяти молекул местного анестетика (МА). В нижней дорожке 10 мМ диметил-β-циклодекстрина добавляют в качестве хирального селектора к BGE, и энантиомеры всех LA эффективно разделяются [[10], [27]]. Для местного анестетика ропивакаина, отмеченного цифрой 3, эта система была далее развита в метод контроля качества [[11], [12]], и этот метод был принят в Ph.Eur. и USP [[13], [14]].
Циклодекстрины (ЦД) обычно используются в качестве хиральных селекторов, поскольку существует большое количество доступных ЦД, и они мало поглощают УФ-свет в обычных диапазонах обнаружения. Это делает компакт-диски довольно популярными, хотя их недостатки заключаются в том, что они плохо охарактеризованы и существуют только в одной абсолютной конфигурации. Последнее означает, что нельзя изменить порядок миграции энантиомеров в системе, поменяв хиральный селектор с одной конфигурации на его .
зеркальное отражение.Плохая характеристика может привести к проблемам с воспроизводимостью поставщика или партии к партии [например, [11], [15], [18]]. Другими используемыми хиральными селекторами являются, например, хиральные краун-эфиры, оптически активные мицеллы, соли желчных кислот, макроциклические антибиотики, белки и селекторы ионных пар.
Разработка метода
В CE аналит должен нести заряд либо сам по себе, либо в результате комплексообразования, например, с хиральный селектор. В хиральном КЭ применяются разные исходные точки для энантиомерного разделения основных, кислых или нейтральных аналитов.На рис. 2 показан наш опыт для типичной исходной ситуации. Стратегия выбора отправной точки для основного аналита обычно относительно проста. При низком pH, по крайней мере на две единицы pH ниже pKa основного аналита, он в основном (≥ 99%) заряжен, а при низком pH (т.е. ниже pH 4) также низок электроосмотический поток (EOF). Это означает, что можно использовать как заряженные, так и незаряженные хиральные селекторы. Преимущество использования незаряженного селектора состоит в том, что он не влияет на ионную силу электролита и, следовательно, не увеличивает ток и джоулев нагрев.Незаряженный селектор мигрирует с электроосмотическим потоком, а окно разделения для энантиомеров находится между миграцией незатронутого аналита, т.е. скорость миграции
энантиомерных аналитов без селектора и EOF (рис. 3). Для основных аналитов с BGE при низком pH и медленном EOF окно разделения довольно велико. Преимущество отрицательно заряженного селектора заключается в том, что он мигрирует медленнее, чем EOF, или в обратном направлении, что еще больше увеличивает окно разделения.Недостатком заряженного селектора является то, что он может значительно увеличить ионную силу системы, что приводит (часто слишком) к высоким токам.
Для кислых соединений стратегия разделения энантиомеров обычно требует большего внимания. При высоком pH, превышающем pKa на 2 единицы pH, аналит заряжается, но высокий pH (т.е. pH ≥ 8) также дает быстрый EOF. Высокий EOF уменьшает время, необходимое анализируемому веществу для достижения детектора. Окно разделения для аналита становится довольно маленьким в случае незаряженного селектора, мигрирующего с EOF (рис. 4).Одной из возможностей улучшить окно разделения является использование заряженного селектора. Хотя существуют альтернативные решения для улучшения окна разделения, когда под рукой нет подходящего заряженного селектора для энантиомеров. Увеличение окна разделения может быть получено в случае незаряженного хирального селектора, например, с помощью капилляра с покрытием или влияния на миграцию свободного энантиомера, например, с CD MEKC (объяснено на рисунке 4) или с двойным CD системы (пояснение в [[16], [17]]).Взаимодействие или разделение с ахиральной мицеллой или с заряженным CD, которые не обязательно проявляют стереоселективное взаимодействие с аналитом, будет способствовать миграции энантиомеров, задержанных из EOF. Эта задержка увеличивает окно разделения.
Для разделения нейтральных аналитов селектор должен быть заряжен или заряд должен быть индуцирован на энантиомерах с помощью CD-MEKC или двойной системы CD, аналогичной упомянутой выше для кислотных энантиомеров.
Как только найден селектор, обеспечивающий энантиоселективное взаимодействие с хиральными аналитами, можно оптимизировать разделение.Важным фактором, влияющим на разделение, является концентрация хирального селектора, поскольку концентрация будет определять равновесие между селектором и энантиомерами. Часто pH, температура, состав буфера или величина EOF также могут влиять на разделение энантиомеров, поэтому эти параметры также следует исследовать, предпочтительно в многофакторном дизайне. В литературе есть много примеров как для оптимизации метода, так и для проверки устойчивости с применением хемометрии [например,грамм. [12], [19] — [25]]. Дополнительным фактором, который требует внимания во время тестирования устойчивости, является чистота хирального селектора. Часто изменчивость от партии к партии приводит к изменению хирального разрешения. Тест на надежность должен включать в себя тестирование селекторов от разных поставщиков и партий и завершаться тестом на пригодность системы (SST) с соответствующими требованиями, такими как разрешение.
Подводные камни и примеры
Важно найти правильный хиральный селектор. Здесь самое главное – не быть предвзятым.Из-за высокой эффективности в CE вам нужна очень небольшая разница в селекторном взаимодействии между энантиомерами порядка .
для получения кирального разрешения. Например, хотя часто утверждается, что для разделения энантиомеров с циклодекстрином в качестве хиральных селекторов необходима ароматическая группа, было продемонстрировано, что некоторые неароматические дипептиды можно разделить с помощью нескольких разных незаряженных CD [[18][13],[26]. ]].
Распространенная ошибка заключается в том, что на начальном этапе проверки проверяется слишком мало селекторов.Как показано на рисунке 5, очень трудно предсказать разделение. 16 различных форм тетрапептида, отсортированных как восемь энантиомерных пар, очень по-разному разрешались в одной и той же системе. Скрининг различных ЦД для разделения этих тетрапептидных энантиомеров дал разные результаты для каждого ЦД (таблица 1).
Однако иногда самое высокое разрешение начального теста не обязательно приводит к оптимальному разделению. Для энантиомерного разделения адреналина, который может присутствовать в растворах местных анестетиков (МА), был проведен отбор подходящих селекторов.Цель состояла в том, чтобы получить энантиомерное разделение адреналина, предпочтительно не нарушаемое присутствием любого из LA, которые могут присутствовать в растворе для инъекций (рис. 6), чтобы исследовать рацемизацию адреналина в течение срока годности. Самое высокое разрешение для адреналина было получено с HDAS-β-CD, но наилучшее разделение было с DM-β-CD. В последней системе рац-адреналин хорошо отделялся и мигрировал перед МА. МА присутствуют в 1000-кратно более высоких концентрациях, чем L-адреналин в растворах для инъекций, и при порядке миграции в системе с использованием DM-β-CD нарушение адреналина МА было минимальным.Пример также демонстрирует важность работы с реальными образцами при разработке и проверке методов.
Надлежащая рабочая практика
Чтобы перейти от хорошего разделения к надежному и чувствительному методу, нам необходимо внедрить передовые методы работы в дополнение к фундаментальным знаниям и пониманию метода и способов его работы. Хотя здесь невозможно обсудить все аспекты надлежащей рабочей практики CE, есть несколько важных моментов, на которые стоит обратить внимание.
Электролитная система
Для всех методов КЭ, хиральных или ахиральных, первостепенное значение имеет однозначное описание электролитной системы.Лучше всего это сделать, описав точные концентрации компонентов электролита. Например, «приготовьте раствор, содержащий 100 мМ фосфорной кислоты и 88 мМ триэтаноламина. Проверьте значение pH, которое должно составлять 3,0 ± 0,1, и оно должно быть предпочтительнее, чем «100 мМ фосфорной кислоты, доведенной до pH 3,0 с помощью триэтаноламина». Пока электролит является буферным (что и должно быть), одна капля больше или меньше триэтаноламина не очень сильно меняет pH, но влияет на ионную силу системы.Лучшая воспроизводимость достигается при контроле ионной силы. Следовательно, следует использовать соответствующую мерную посуду.
Хотя упомянутый выше фосфатно-триэтаноламиновый электролит все еще обладает некоторой буферной способностью при рН 3,0, этого иногда недостаточно [[18]]. Когда значения pKa аналитов близки к pH буфера, и когда буферная емкость низка, могут возникнуть проблемы. Инъекция дипептида в фосфатный буфер с рН 3,0 давала энантиомерное разделение, которое исчезало при повторных инъекциях.Эту проблему легко решить, заменив фосфорную кислоту (pKa 2,15) на малоновую кислоту (pKa 2,85) в качестве буферного компонента. Изменение pH в результате электролиза воды в буферах фосфорная кислота — NaOH после подачи напряжения показано в таблице 2. Наилучшая буферная емкость достигается при максимально возможной концентрации буфера и при pH в пределах одной единицы pH от pKa [ [28], [29]] буферного протолита. Буферная способность резко снижается при большем отклонении pH от значения pKa слабой кислоты в
буфер.
Температура
Контроль температуры капилляра CE важен. Температура влияет на такие параметры, как вязкость BGE и значения pH и pKa буферов и аналитов, которые влияют на хиральное, а также ахиральное равновесие в BGE. Поэтому для хорошей повторяемости и воспроизводимости необходимо тщательно контролировать температуру. В хиральных системах температура также может влиять на степень комплексообразования энантиомеров с хиральным селектором. Снижение температуры может как увеличить, так и уменьшить разрешение [[30]].
Скорректированные площади пиков
Altria [33] продемонстрировал разделением рацемической смеси пикумерола, что важно корректировать площади пиков отдельных энантиомеров на разницу скоростей их миграции через окно обнаружения. Ранние мигрирующие аналиты перемещаются через окно обнаружения быстрее, чем более поздние мигрирующие аналиты, и поэтому проявляются в виде меньших пиков. Поэтому площади пиков корректируются путем деления либо на время миграции, либо на скорость миграции (таблица 3).
Впрыск
Для хорошей точности хирального КЭ требуется такое же внимание к деталям, как и для других методов КЭ [[31]]. То есть постоянная температура на образцах и БГЭ. Следует использовать как можно более короткое время впрыска, превышающее 3 с. Это связано с тем, что в некоторых инструментах CE изменчивость гидродинамического объема впрыска снижается за счет строгого контроля времени впрыска x давления впрыска. Чтобы этот механизм функционировал должным образом, требуется время впрыска не менее 3 с.Флаконы должны быть выровнены, чтобы предотвратить сифонирование. Излишки образца, прилипшие к внешней стороне капилляра после инъекции, можно удалить, погрузив входное отверстие капилляра после инъекции во флакон, наполненный водой или BGE. Точность может быть дополнительно повышена путем введения BGE или водяной пробки после введения образца [[31]]. По возможности с входного отверстия капилляра следует удалить около двух миллиметров полиимидного покрытия и, конечно же, прямые концы капилляра [[32]]. Для определения энантиомерной чистоты часто требуется обнаружение до 0.05 % энантиомерной примеси. Чтобы получить эти уровни чувствительности, часто необходимо использовать суммирование образцов. Самый простой подход заключается в растворении/разбавлении образца в менее проводящем растворителе по сравнению с BGE. При приложении напряжения зона образца с низкой проводимостью будет иметь более высокую напряженность электрического поля, чем BGE. Следовательно, аналиты мигрируют быстрее в зоне инъекционного раствора, пока не достигнут границы зоны BGE. В более проводящем БГЭ напряженность поля ниже, и аналиты складываются, т.е.е. замедлиться и сконцентрироваться, что уменьшает начальную ширину полосы. Однако также доступны многие другие методы укладки образцов, см., например, [[34]].
Заключительные замечания
Капиллярный электрофорез превратился в высокоэффективный метод разделения и в настоящее время применяется в нескольких различных областях анализа, таких как хиральное разделение. Дальнейшее внедрение CE и хирального CE в промышленности зависит от обмена и обучения передовым методам работы CE и доступа к сети промышленных экспертов, а также от постоянного развития приборов [[1]].
Капиллярный электрофорез внес значительный вклад в проект «Геном человека» и становится важным аналитическим инструментом в области метаболомики и других исследований.
«-омика». В этих областях цель состоит в одновременном анализе большого количества гидрофильных соединений, таких как аминокислоты, пептиды и другие аналиты, которые могут присутствовать в виде энантиомеров. Хиральный КЭ демонстрирует высокую эффективность разделения и подходит для гидрофильных аналитов и, таким образом, может быть предпочтительным методом.Ключевым фактором успеха является CE-MS. К сожалению, комбинация КЭ и МС еще не полностью установлена для рутинного использования в лаборатории. Когда CE-MS/MS с дефисом станет таким же обычным аналитическим инструментом, каким сегодня является LC MS/MS, это, безусловно, сделает CE еще более привлекательным методом разделения в нескольких областях. В хиральном КЭ было бы предпочтительнее применять метод частичного заполнения, чтобы избежать попадания селектора в инструмент МС [[35]] и, таким образом, свести к минимуму трудоемкую очистку интерфейса МС.
Автоматизация и миниатюризация аналитических систем были и остаются общими направлениями аналитической химии. Было доказано, что использование мультикапиллярной системы КЭ значительно улучшает пропускную способность образца [например, [36][37]]. Были опубликованы интересные исследования по применению электрофоретических микрожидкостных устройств для быстрого хирального разделения [[38], [39]], и в будущем будут опубликованы дополнительные исследования.
Ссылки
[1] C.E. Sänger – van de Griend, R.E. Majors, LC-GC North America 30 (2012) 954
[2] Общая глава 2.2.47 Капиллярный электрофорез, Европейская фармакопея .
[3] Общая информация <1053> Капиллярный электрофорез, Фармакопея США
[4] V. Piette, M. Lammerhofer, W. Lindner, J. Crommen, J Chromatogr A 987 (2003) 421
[5] Y. Carlsson, M Hedeland, U. Bondesson, C. Pettersson, Chromatogr. А 922 (2001) 303
[6] C. Petterson, C. Gioeli, Chirality 5 (1993) 241
[7] С.А.К. Рен, Р.К. Роу, Дж. Хроматогр. 603 (1992) 235
[8] С.A.C. Wren, J. Chromatogr. 636 (1993) 57
[9] Б. Чанкветадзе, Капиллярный электрофорез в хиральном анализе, John Wiley & Sons, 1997, ISBN 0 471 97415 3
[10] C.E. Sänger – van de Griend, K. Gröningsson, D. Westerlund, Chromatographia 42 (1996) 263
[11] C.E. Sänger – van de Griend, K. Gröningsson, J. Pharm. Биомед. Анальный. 14 (1996) 295
[12] C.E. Sänger – van de Griend, H. Wahlström, K. Gröningsson, M. Widahl-Nasman, J Pharm. Биомед. Анальный.15 (1997) 1051
[13] 2335 Ропивакаина гидрохлорида моногидрат, Европейская фармакопея .
[14] Монография ропивакаина гидрохлорида моногидрата, Фармакопея США .
[15] A. Amini, T. Rundlöf, M.B. Грён-Ридберг, Т. Арвидссон, J. Sep. Sci. 27 (2004) 1102
[16] G. Gübitz, M.G. Шмид, Хиральное разделение, опосредованное циклодекстрином, в книге «Хиральное разделение с помощью капиллярного электрофореза», изд. А. Ван Экхаут, Ю. Мишотт, CRC Press, 2009, ISBN 978-1-4200-6933-4
[17] А.C. Servais, J. Crommen, M. Fillet, Факторы, влияющие на циклодекстрин-опосредованное хиральное разделение, в разделе «Хиральное разделение с помощью капиллярного электрофореза», под ред. А. Ван Экхаут, Ю. Мишотт, CRC Press, 2009, ISBN 978-1-4200-6933-4
[18] C.E. Sänger – van de Griend, Electrophoresis 20 (1999) 3417
[19] П.К. Owens, A.F. Fell, M.W. Coleman, and J.C. Berridge, Chirality 9 (1997) 184-190.
[20] С. Бункерд, М. Р. Детавернье, Ю. Вандер Хейден, Дж. Виндевогель и Ю. Мишотт, Дж.Хроматогр. 736 (1996) 281
[21] С. Фанали, С. Фурланетто, З. Атурки и С. Пинцаути, Chromatographia 48 (1998) 395
[22] М.М. Роган, К.Д. Альтриа и Д.М. Гудолл, Хроматография 38 (1994) 723
[23] М.И. Джимидар, Т. Веннекенс, В. Ван Аэль, Д. Редлих, М. Де Смет, Электрофорез 25 (2004) 2876
[24] В. Харанг, М. Тиск, Д. Вестерлунд, Р. Исакссон, Г. Йоханссон, Электрофорез 23 (2002) 2306
[25] X. Денг, Б. Де Кок, Р. Вервоорт, Д.Памперин, Э. Адамс, А. Ван Шепдал Хиральность 24 (2012) 276
[26] C.E. Sänger – van de Griend, Electrophoresis 21 (2000) 2397
[27] Разделение энантиомеров с помощью капиллярного электрофореза в фармацевтическом анализе, C.E. Sänger – van de Griend, Университетская библиотека Упсалы, 1999, ISBN 91-554-4561-6
[28] Р.Дж. Бейнон, Дж.С. Истерби, Буферные растворы, Oxford University Press, 1996, ISBN 0-19-963442-4
[29] Б.М. Томсон, М. А. Кессик, J Chem Educ 58 (1981) 743
[30] A Westall, T Malmström, P Petersson, Electrophoresis 27 (2006) 859
[31] Точность и чувствительность инъекции, CE Solutions, выпуск 5, http://www.sepscience.com/Техники/CE
[32] Капилляр CE, CE Solutions, выпуск 3, http://www.sepscience.com/Techniques/CE .
[33] К.Д. Альтриа, Хроматография 35 (1993) 177
[34] М.С. Бредмор, А.И. Шаллан, Х. Р. Рабанес, Д. Гстоеттенмайр, А. Сиазвани, Абдул Кейон, А. Гаспар, М. Давод, Дж. П. Кирино, Электрофорез 34 (2013) 29
[35] H. Lodén, Y. Hedeland, M. Hedeland, U. Bondesson, C. Pettersson, J. Chromatogr. 986 (2003) 143
[36] С. Бер, М.Метциг, А. Левин, Х. Эйкхофф, К. Хеллер, Электрофорез 20 (1999) 1492
[37] M. Herrero, C. Simó, V. García-Cañas, S. Fanali, A. Cifuentes, Electrophoresis 31 (2010) 2106
[38] М. Людвиг, Ф. Колер, Д. Белдер, ”Высокоскоростное хиральное разделение на микрочипе с УФ-детектированием”. Электрофорез 24 (2003) 3233
[39] С. Нагл, П. Шульце, М. Людвиг, Д. Белдер «Прогресс в энантиоразделении микрочипов» Электрофорез 30 (2009) 2765
[40] C.E. Sänger – van de Griend, K.Gröningsson, T. Arvidsson, J. Chromatogr. А 782 (1997) 271
[41] C.E. Sänger – van de Griend, A.G. Ek, M.E. Widahl-Nasman, E.K.M. Андерссон, Дж. Фарм. Биомед. Анальный. 41 (2006) 77
Объяснение гель-электрофореза — Modern Biology Inc
Гель-электрофорез — это просто идентификация. Благодаря своей универсальности он стал одним из важнейших инструментов исследования места преступления и анализа белков. Судмедэксперты используют этот инструмент генотипирования образцов ДНК, чтобы отличить одного человека от другого.Гель-электрофорез широко используется во всем мире не только для исследования мест преступлений, но и для идентификации пропавших без вести, присвоения имен телам во время массовых бедствий, присвоения имен жертвам нарушений прав человека и при тестировании на отцовство.
Гель-электрофорез является важным инструментом в других лабораторных исследованиях ДНК, а также белков.
Что такое гель-электрофорез?
Гель-электрофорез — это процесс, при котором образец, обычно белок или ДНК, в растворе разделяется на части или разделяется внутри формы с помощью электрических зарядов.
Предположим, вы хотите провести полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для изучения одного гена. Когда вы проводите ПЦР, вы делаете много копий ДНК, чтобы компенсировать ограничения методов секвенирования при проведении геномного анализа. Большинство методов геномного секвенирования пропускают несколько сегментов или имеют проблемы с сегментами ДНК с определенными признаками. Создание копий ДНК облегчает исправление аномальных результатов.
Или предположим, что вы вставляете ген, который хотите изучить, в кольцевой фрагмент ДНК, называемый плазмидой, для клонирования.Возможно, этот конкретный ген имеет терапевтическое или академическое значение. После использования ферментов для вырезания и вставки ДНК в нужную плазмиду вы хотите убедиться, что ваша рекомбинантная ДНК содержит нужный ген. Полная плазмида будет иметь очень специфический размер и распознаваться после электрофореза.
В обоих этих процессах, а также во многих других анализах белков используется гель-электрофорез для разделения молекул-мишеней для дальнейшего анализа. Процесс кажется очень сложным, но его нетрудно понять шаг за шагом.
Ключевые моменты этого урока: Гель-электрофорез — это метод разделения фрагментов ДНК по размеру или белков по электрическому заряду. Он не выполняет секвенирование генома — он подготавливает образец для секвенирования генома.
Образцы загружаются в углубления, называемые лунками в центре или на отрицательно заряженном конце листа геля, а затем подается электрический ток для протягивания образцов через материал.
Все фрагменты ДНК имеют одинаковый отрицательный заряд на единицу массы, поэтому более мелкие фрагменты будут двигаться через гель быстрее, а более крупные — медленнее.
Белки несут разные электрические заряды и будут двигаться в любом направлении, определяемом током в камере. Более сильно заряженные белки будут мигрировать дальше, чем менее сильно заряженные.
Расстояние, которое преодолевают белки, является линейной функцией электрического заряда белка.
Расстояние, которое проходит ДНК, является не линейной функцией, а логарифмической функцией размера молекулы. Молекула, размер которой составляет 1/10 размера другой молекулы, пройдет в два раза большее расстояние, молекула, размер которой составляет 1/1000 размера другой молекулы, пройдет расстояние в три раза больше и так далее.
ДНК и некоторые белки, такие как альбумины, прозрачны, поэтому в образец необходимо добавить краситель, чтобы его можно было увидеть позже в геле.
Как проводится гель-электрофорез
Мы рассмотрим некоторые из основных концепций гель-электрофореза по ходу дела, чтобы прояснить причины каждого шага.
Этот метод представляет собой лабораторный метод разделения и анализа больших молекул, таких как белки, ДНК и РНК. Клинические химики используют его для разделения белков по заряду и размеру, а молекулярные биологи используют его для разделения образцов фрагментов ДНК и РНК по длине.
Электрофорез ДНК и белков можно проводить с помощью одного и того же оборудования и одним и тем же способом. В горизонтальном гель-электрофорезе используется гель агарозы, который под микроскопом имеет сетчатую структуру. При вертикальном электрофорезе используется полиакриламидный гель. Полиакриламидные гели имеют более жидкую консистенцию, что может облегчить наблюдение за процессом электрофореза. Этот метод основан на движении заряженных молекул под действием электрического поля. Это движение происходит поперек листа геля, или, иначе говоря, в гелевой среде.Но какое отношение электричество имеет к ДНК или белкам?
ДНК заряжена отрицательно. Это связано с наличием фосфатных групп. Спираль ДНК состоит не только из четырех оснований аденозина (А), гуанина (G), цитозина (С) и тимина (Т). Его остов содержит миллиарды фосфатных групп, каждая из которых имеет крошечный отрицательный электрический заряд. Наличие фосфатных групп придает ДНК спиральную форму.
В спирали РНК и других типах белков также есть фосфатные группы.Белки вообще имеют отрицательные заряды. Меньшие белки имеют меньшие заряды, а более крупные белки имеют большие электрические заряды. Приготовить агарозный гель очень просто.
Агарозные гели готовят в горизонтальном литейном лотке. Для лотка потребуется либо лента, либо съемные резиновые бамперы, закрывающие два открытых конца, чтобы сформировать форму для листа. Литейные лотки будут иметь углубления для гребенки для электрофореза. Гребни бывают всех размеров и цветов, они могут быть с зубьями с одной стороны или быть двусторонними.Именно эти зубы будут создавать лунки для вводимых образцов.
Агароза, получаемая из морских водорослей, сначала представляет собой порошок. Порошок растворяют в pH-специфическом буфере для электрофореза. Какой буфер использовать, зависит от того, будут ли использоваться образцы ДНК или белков. Простое кипячение агарозы и буфера для электрофореза растворяет агарозу. Затем осторожно вылейте раствор агарозы в лоток для литья, как заливая форму для желе. Пока агароза все еще дымится и становится жидкой, вставьте расческу в агарозу, где есть углубление для литейного лотка.Затем агарозе нужно будет остыть и затвердеть. Как только гель будет готов, он станет твердым с твердой консистенцией, похожей на желе. Очень осторожно снимите гребенку, чтобы открыть лунки, затем снимите ленту или бамперы, чтобы обнажить оба конца твердого агарозного материала. Традиционная камера для электрофореза будет иметь отрицательный и положительный электроды с пространством между ними для размещения материала. Электроды подключатся к съемной верхней части и подключатся к источнику питания.
Установите литейный лоток с агарозой в камеру для электрофореза.Если лунки ближе к одному концу геля, поместите лунки ближе к отрицательному электроду. Используя тот же pH-специфический буфер для электрофореза, налейте буфер в камеру, пока он не покроет верхнюю часть геля.
Осторожно внесите по одному подготовленному образцу в каждую лунку с помощью микропипетки. Во многих случаях образцы будут прозрачными, поэтому окрашенный маркер или краситель будут загружены в специальную лунку. Как только все образцы загружены, замените крышку камеры и включите источник питания, чтобы начать электрофоретический запуск.
Источники питания могут быть настроены на различное напряжение. Важно следить за ходом электрофореза. Слишком высокий ток (или напряжение) может расплавить гель. Когда окрашенный маркер окажется на расстоянии около одного сантиметра от края геля, отключите питание и снимите крышку камеры.
Когда вы смотрите на материал через микроскоп, вы видите сетчатую структуру. Размер пор в материале практически постоянный. Когда фрагменты разного размера подвергаются воздействию электрического заряда через материал, более мелкие фрагменты быстрее покидают поры, а более крупным фрагментам требуется больше времени для прохождения через поры.
В этот момент может быть трудно увидеть образцы, так как они были четкими с самого начала. Существует множество красителей, позволяющих сделать образцы видимыми, что зависит от того, использовались ли образцы ДНК или белков. Пятно связывается с образцом, делая его видимым на световом коробе или в ультрафиолетовом свете. Для образцов ДНК хорошим выбором является метиленовый синий или бромистый этидий. В то время как белки обычно используют кумасси синий или буфер для проявления цвета. Поскольку ДНК и белки используют один и тот же процесс для электрофореза, они также используют один и тот же процесс для окрашивания.
Чтобы окрасить гель, просто погрузите его в выбранный краситель на несколько минут. Затем промойте, погрузив в воду. Гели, окрашенные метиленовым синим, кумасси синим или буфером для проявления цвета, можно поместить непосредственно на световой короб и увидеть невооруженным глазом. Образцы будут синевато-фиолетового цвета. Для просмотра гелей, окрашенных бромистым этидием, требуется ультрафиолетовое излучение и очки янтарного цвета, блокирующие УФ-излучение.
Как определить размер фрагментов или образцов на геле? Просто сравните с известными размерами полос или красителей, загруженными в специальную лунку для маркеров.Для ДНК будет использоваться лестница ДНК с полосами определенного размера. Для белков для создания эффекта лестницы будут использоваться несколько белков или красителей с известной молекулярной массой или зарядом.
Элюирование можно использовать для последующего извлечения фрагмента образца из материала, который будет использоваться для дальнейшего использования в будущем. Процесс элюирования очень прост: просто вырезают фрагмент из геля и пропускают его через сито в центрифуге, чтобы удалить агарозу, но оставить все внутри пор. После этого процесса у вас остается раствор ДНК или белка, растворенный в буфере для электрофореза.Элюирование осуществляется таким образом, чтобы отдельные фрагменты ДНК можно было использовать для дальнейшей последующей обработки, такой как секвенирование генома.
Получить наборы для гель-электрофореза и эксперименты
Все это звучит невероятно сложно? Это не! Работая пошагово, можно сделать электрофорез. Современная биология продает белки и эксперименты с ДНК, а также пакеты для электрофореза, которые нужны вашим студентам, чтобы начать обучение с гель-электрофореза.
ДНК-гель-электрофорез: концепция, процедура и применение | Основные методы клеточной и молекулярной биологии
ДНК-гель-электрофорез — это метод, используемый для разделения и идентификации фрагментов ДНК по размеру.
фрагмента ДНК разного размера загружаются в пористый гель, изготовленный из агарозы — углевода, содержащегося в красных водорослях.
При приложении электрического поля фрагменты будут мигрировать через гель благодаря отрицательно заряженным фосфатным группам в нуклеотидах ДНК.
Меньшие фрагменты ДНК легче мигрируют через гель, чем более крупные фрагменты, которым труднее перемещаться по гелевой матрице.
Когда анализ геля завершен, расположение образцов ДНК можно сравнить с серией фрагментов или полос известного размера, называемой лестницей ДНК.
Присутствие интересующего вас фрагмента может быть затем подтверждено на основе его размера, который определяется путем сравнения относительного положения вашего тестового образца с фрагментами лестницы.
Агарозные гели готовят с использованием раствора в процентном соотношении по массе к объему. Таким образом, из 1 грамма агарозы в 100 мл буфера получится 1% гель. Гели с более низким процентным содержанием лучше разрешают более крупные фрагменты, а гели с более высоким процентным содержанием облегчают идентификацию более мелких фрагментов. Чтобы начать процедуру изготовления геля, отвесьте соответствующую массу агарозы в колбу Эрленмейера.
Добавить рабочий буфер в колбу, чтобы объем буфера не превышал 1/3 емкости колбы.Затем встряхните, чтобы перемешать.
Растопите смесь агарозы/буфера, нагревая ее в микроволновой печи на максимальной мощности. Каждые тридцать секунд вынимайте колбу и взбалтывайте содержимое, чтобы хорошо перемешать. Повторяйте до тех пор, пока агароза полностью не растворится.
Далее добавляют бромид этидия до концентрации 0,5 мг/мл. Бромид этидия представляет собой ароматическое соединение, которое помещается между отдельными парами оснований ДНК или интеркалирует и заставляет ДНК излучать интенсивную оранжевую флуоресценцию в ультрафиолетовом свете. Важно отметить, что бромид этидия является канцерогеном, поэтому при работе с гелями, содержащими это соединение, всегда следует надевать перчатки.
Чтобы предотвратить деформацию лотка для геля, дайте агарозе остыть, поместив ее на водяную баню при температуре 65ºC.
Пока агароза охлаждается, подготовьте форму для геля, поместив лоток для геля в устройство для литья. В качестве альтернативы вы можете использовать ленту, чтобы запечатать открытые края лотка для геля, чтобы создать форму. Помещение гребенки в гель создает лунки, в которые загружается ДНК. Убедитесь, что гребенка создаст лунку соответствующего размера для вашего образца ДНК.
Залейте расплавленную агарозу в форму для геля и дайте ей затвердеть при комнатной температуре.
После того, как агароза затвердеет, выньте расческу. Если гель не будет использоваться сразу, заверните его в пищевую пленку и храните при температуре 4ºC до использования.
Если гель будет использоваться немедленно, поместите его в коробку с гелем.
Чтобы начать эту процедуру, добавьте краситель для загрузки геля в образцы ДНК, которые необходимо разделить. Загрузка красителя обычно производится в 6-кратной концентрации. Загрузка красителя помогает визуализировать и загружать образцы в лунки, а также помогает определить, насколько далеко образцы мигрировали во время анализа.
Установите источник питания на желаемое напряжение.
Теперь добавьте в коробку с гелем достаточное количество рабочего буфера, чтобы покрыть поверхность геля. Обязательно используйте тот же рабочий буфер, что и для приготовления геля.
Подключите провода гелевой коробки к источнику питания и включите его. Помните, что ДНК заряжена отрицательно и будет двигаться к положительному аноду, обычно красного цвета. Убедитесь, что черный провод или катод не подсоединены к нижней части коробки с гелем.Так что вы не забывайте, имейте в виду, что черные кошки — это невезение, или негатив, и черный CAThode, следовательно, негативен. Доведите гель до красного цвета или до анода. Убедиться, что коробка с гелем и блок питания работают; появление пузырьков на электродах свидетельствует о протекании тока.
Снимите крышку коробки с гелем. Медленно и осторожно загружайте образцы ДНК в гель. Опять же, загрузочный краситель в образце позволяет образцу погрузиться в гель и поможет отследить, как далеко прошел образец.Маркер размера ДНК или лестница всегда должны быть загружены вместе с экспериментальными образцами.
Замените крышку. Дважды проверьте, что электроды вставлены в правильные разъемы на блоке питания.
Включите питание. Запустите гель, пока краситель не переместится на соответствующее расстояние.
По завершении электрофореза отключите питание и снимите крышку коробки с гелем.
Извлеките гель из коробки и слейте лишний буфер с поверхности геля.Поместите лоток с гелем на бумажные полотенца, чтобы поглотить оставшийся рабочий буфер.
Для визуализации фрагментов ДНК удалите гель из лотка для геля и подвергните гель воздействию ультрафиолетового света.
Фрагмент ДНК
должен проявляться в виде оранжевых флуоресцентных полос. Сфотографируйте гель.
По окончании эксперимента утилизируйте гель и рабочий буфер надлежащим образом в соответствии с правилами учреждения. Опять же, не забывайте всегда обращаться с гелем и рабочими буферами в перчатках, чтобы избежать воздействия бромистого этидия.
Теперь, когда вы узнали, как проводить гель-электрофорез ДНК. Давайте посмотрим на некоторые последующие приложения и варианты этого очень полезного метода.
Здесь вы видите результат электрофореза в агарозном геле после разделения продуктов ПЦР. Фрагменты ДНК, загруженные в гель, видны в виде четко очерченных полос. Стандарт или лестница ДНК должны быть разделены до такой степени, чтобы можно было с пользой определить размеры полос образца. В этом примере фрагменты ДНК из 765 пар оснований, 880 пар оснований и 1022 пар оснований разделены на 1.5% агарозный гель с 2-логарифмической лестницей ДНК.
Помимо подтверждения наличия интересующего фрагмента ДНК, электрофорез ДНК в геле можно сочетать с процедурами очистки геля. Обычно лезвие бритвы используется для вырезания интересующего фрагмента ДНК, чтобы его можно было собрать и восстановить образец ДНК внутри него.
Электрофезия в агарозном геле также может сочетаться с переносом блоттинга, при котором ДНК или РНК переносятся на целлюлозную мембрану, где можно использовать радиоактивные зонды для идентификации определенных последовательностей ДНК или РНК в образце, разделенном электрофоретически.
Стандартный гель-электрофорез ДНК не идеален для разделения высокомолекулярных ДНК размером более 15-20 т.п.н., таких как геномная ДНК. Для разделения больших образцов ДНК используется гель-электрофорез в импульсном поле, который включает воздействие на гель изменяющегося или пульсирующего электрического поля в разных направлениях. Этот метод включает в себя специальный аппарат для подачи геля, который имеет пары электродов, расположенных в разных ориентациях вокруг геля. Это можно использовать для обнаружения различий в размерах геномов между популяциями организмов, например, объединенные образцы ДНК из разных микробных сообществ, взятые из разных озерных сред, которые вы видите здесь.
92 к. 
Теплогрязелечение — парафино-озокеритовые аппликации при назначении их на рефлексогенные зоны или большие участки не совместимые с водными процедурами (ванны, души).
ru
Агарозные гели
2 
Чем выше процент, тем меньше размер пор, что позволяет разделять более мелкие молекулы. В таблице 3 показаны обычно используемые проценты геля [2]. 
0 
Распространенные составы полиакриламидных гелей [5]. 
5, ). Таким образом, концентрация APS и/или TEMED определяет скорость полимеризации при данной температуре. 
Денатурирующие условия разрушают водородные связи, которые могут образовываться между нуклеиновыми кислотами, и, таким образом, уменьшают образование вторичных структур, таких как шпильки. Поэтому денатурирующий электрофорез является более рутинным для разделения и анализа РНК. Общие денатурирующие буферы, используемые с агарозными и полиакриламидными гелями при электрофорезе нуклеиновых кислот, включают: 
е. ДНК или РНК), структуру фрагмента (т. е. одноцепочечную или двухцепочечную) и конформацию (т.например, суперскрученный, открыто-кольцевой или линейный), чтобы обеспечить надлежащее сравнение миграции (дополнительная информация: Влияние структуры и конформации на подвижность образца) 
Эти стандарты часто имели проблемы с воспроизводимостью расщепления, чистотой образца и характером полос при электрофорезе. Позже лестничные схемы с фрагментами, полученными в результате реакций лигирования и/или ПЦР, стали предпочтительными из-за их воспроизводимости и получения желаемых размеров фрагментов.Сегодня хроматографически очищенные фрагменты считаются золотым стандартом для цепочек, поскольку эта технология обеспечивает более высокий контроль над качеством, характером полос, интенсивностью и количеством (, рис. 6, ). 
п.н. или 100 п.н.) могут , а не содержать одинаковое количество, размер и интенсивность фрагментов ДНК ( Рисунок 7 ). Перед использованием ознакомьтесь с сопроводительным руководством и протоколом от производителя, чтобы получить точную информацию о составе лестницы и ее правильном использовании. 
Напротив, лестница № 1 была изготовлена по более старой технологии и загружена буфером с неоптимальным составом. 
(A) Загруженное количество влияет на разрешение полосы. (B) Небольшой объем загруженного образца может привести к искажению полос. 
При выборе загрузочного буфера обращайте внимание на кажущуюся миграцию красителей (, рис. 9B, , , таблицы 5 и 6, ), чтобы избежать маскируя интересующие полосы нуклеиновых кислот, особенно если они имеют сходные молекулярные размеры (, рис. 9C, ). Маскировка красителем делает анализ и количественный анализ желаемых полос проблематичным и менее надежным. 
10A, ).Для электрофореза двухцепочечной ДНК из ферментативных реакций SDS может быть добавлен к загрузочному буферу, чтобы разрушить взаимодействие между белками и нуклеиновыми кислотами, чтобы предотвратить изменение подвижности образца ( Рисунок 10B ). 
н. 
н. 
н. 
н. 
0 
0 
Вертикальные гелевые боксы имеют лунки, расположенные вверху (, рис. 11B, ). 
9002 
Из-за меньшей буферной способности ТАЕ больше подходит для более коротких циклов электрофореза (например, <2 часов). Более длительные циклы геля в ТАЭ могут привести к перегреву, денатурации и/или диффузии образца и, возможно, плавлению геля из-за низкой буферной емкости. 
, клонирование) 
Важно выбрать рабочий буфер, совместимый с используемым гелем (, рис. 12B, ). 
13А, ). С другой стороны, при слишком высоком напряжении может произойти плохое разделение и смазывание образцов; в некоторых случаях может наблюдаться перегрев буфера, «полосы улыбки» и даже денатурация образцов (, рис. 13В, ).
Для электрофоретических циклов > 2 часов охлаждение и рециркуляция буфера могут улучшить разделение образцов. Для денатурирующих гелей нагревание буфера до 55°C может улучшить результаты за счет улучшения одноцепочечных форм нуклеиновых кислот. 
Лестницы ДНК, содержащие отслеживающие красители, которые двигаются позади и впереди образцов, доступны, чтобы помочь отслеживать движения геля, а также гарантировать, что интересующие полосы не маскируются красителями. 
5-1 мкг 
При возбуждении соответствующей длиной волны красители излучают видимый свет (т. е. флуоресцируют) (подробнее: Основы флуоресценции). Интенсивность флуоресценции коррелирует с количеством связанной нуклеиновой кислоты, что является основой для обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот при электрофорезе. 
Альтернативы бромистому этидию с улучшенными характеристиками. 
Он обычно используется для разделения и очистки олигонуклеотидов и РНК с помощью электрофореза, когда достаточно простого обнаружения и / или использование интеркалирующих красителей может повлиять на последующие приложения. Для обнаружения с помощью УФ-затенения необходимы образцы от нанограммов до микрограммов, и следует использовать тонкий и прозрачный гель, такой как полиакриламид, для обеспечения поглощения и пропускания УФ-излучения.В протоколе УФ-затенения гель удаляют из кассеты после электрофореза для максимального обнаружения, заворачивают в прозрачную пластиковую пленку для защиты, а затем помещают на пластину для УФ-флуоресцентной тонкослойной хроматографии (ТСХ). Когда гель подвергается воздействию УФ-излучения, поглощение полосами нуклеиновых кислот отбрасывает тени на пластину для ТСХ (, рисунок 18, ). Затемненные участки геля нужных размеров вырезаются для дальнейшей обработки. 
Документирующие гели
стр. 1–53. 
В: Справочник по молекулярным зондам: Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки . стр. 349–360. 
пожар уничтожил большую часть его исследовательских работ, поэтому его работа получила мало внимания. (Есть также некоторые исторические предположения, что, хотя это было интересное явление, Ройсс не нашел для него практического применения, поэтому он обратил свое внимание на другое.) 
Это устройство не только открыло новые возможности применения этой развивающейся технологии для анализа химических смесей, но и побудило некоторые крупные химические исследовательские центры приобрести собственные приборы Тизелиуса и проводить собственные эксперименты. 
Он легко флуоресцирует красновато-коричневым цветом при воздействии ультрафиолетового света 
Острое воздействие бромида этидия вызывает раздражение рта, верхних дыхательных путей, кожи и глаз.
Фильтрат можно сливать в канализацию (использованные фильтры утилизируются аналогично гелю; см. ниже).Доступны два простых комплекта для угольной фильтрации: 
Этот продукт также доступен в магазинах биохимии (#108455).