Прививка в 1: Прививки детям

Kasper Nørskov Kragh

^a Университет Копенгагена, кафедра иммунологии и микробиологии, Копенгаген, Дания

Maria Alhede

^{Кафедра иммунологии и микробиологии, Копенгаген, Дания}

Камилла Ставнсберг

^a Университет Копенгагена, кафедра иммунологии и микробиологии, Копенгаген, Дания

Peter Ø.Jensen

^A Университет Копенгагена , Кафедра иммунологии и микробиологии Иммунологии и микробиологии, Копенгаген, Дания

Marvin Whiteley

^c Департамент молекулярных биологических наук, Центр инфекционных заболеваний LaMontagne, Медицинская школа Dell, Техасский университет в Остине, Остин, Техас, США

Thomas Bjarnsholt

1 a Копенгагенский университет, кафедра иммунологии и микробиологии, Копенгаген, Дания

^b Rigshospitalet, кафедра клинической микробиологии, Копенгаген, Дания

Shuang-Jiang Liu, Китайская академия наук;

^a Копенгагенский университет, кафедра иммунологии и микробиологии, Копенгаген, Дания

^b Rigshospitalet, кафедра клинической микробиологии, Копенгаген, Дания Медицинская школа Техасского университета в Остине, Остин, Техас, США

Поступила в редакцию 13 окт. 2017 г.; Принято 9 декабря 2017 г.

Дополнительные материалы

Дополнительный материал

GUID: DA3428D8-7FFC-4A96-8069-4A683F695EE8

GUID: D3E2B661-FF8B-474C-9FF2-25D070620979

АННОТАЦИЯ

В течение последних 150 лет бактерии изучались в основном в жидких периодических культурах.Вопреки большинству ожиданий, эти культуры не являются гомогенными смесями одноклеточных бактерий, поскольку в большинстве жидких периодических культур в конечном итоге развиваются свободно плавающие бактериальные агрегаты. Эти агрегаты имеют общие характеристики с биопленками, такие как повышенная устойчивость к антибиотикам. Мы исследовали, как развиваются агрегаты и что влияет на это развитие в жидких периодических культурах Pseudomonas aeruginosa . Мы сосредоточились на том, как метод инокуляции влияет на агрегацию, оценивая частоту и размер агрегации с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.Было исследовано несколько традиционных методов инициации ночной бактериальной культуры, т. е. инокуляция непосредственно из замороженных культур, инокуляция с использованием клеток, выращенных на агаре, или инокуляция с использованием клеток, выращенных в жидких культурах. Мы обнаружили прямую связь между методом инокуляции и размером и частотой агрегатов биопленки в жидких периодических культурах, причем инокуляция непосредственно из чашки приводит к наиболее многочисленным и крупным агрегатам. Эти крупные агрегаты оказывали общее влияние на последующую толерантность культур к тобрамицину, указывая на то, что метод инокуляции оказывает сильное влияние на устойчивость к антибиотикам.Мы также наблюдали механизм, при котором предварительно сформированные агрегаты рекрутировали отдельные клетки из окружающей культуры в «эффекте снежного кома», накапливая агрегированную биомассу в культуре. Было обнаружено, что это рекрутирование в значительной степени зависит от экзополисахарида Psl. Кроме того, мы обнаружили, что как Escherichia coli , так и Staphylococcus aureus продуцируют агрегаты в жидких периодических культурах. Наши результаты подчеркивают важность постоянства инокуляции на протяжении всех экспериментов, а также существенное влияние агрегатного развития в жидких периодических культурах на результаты микробиологических экспериментов.

ВАЖНОСТЬ Чистые жидкие культуры имеют основополагающее значение для микробиологических исследований. Эти культуры обычно рассматриваются как гомогенные смеси одноклеточных бактерий; настоящее исследование показывает, что это не всегда так. Бактерии могут агрегировать в этих жидких культурах. Агрегацию можно вызвать методом, выбранным для инокуляции. Наличие агрегатов может существенно изменить результаты экспериментов, изменив фенотип культур. Исследование обнаружило механизм, посредством которого предварительно сформированные агрегаты способны рекрутировать окружающие отдельные клетки в форме эффекта снежного кома, создавая в культурах все больше и больше агрегатов. После образования эти агрегаты трудно удалить. Агрегаты в жидких культурах могут быть огромной невидимой проблемой для микробиологов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: агрегация, Pseudomonas aeruginosa , биопленки

ВВЕДЕНИЕ

Со времен Роберта Коха и Вальтера Гессе культивирование в чистых жидких культурах было основой изучения бактерий (1). При работе с бактериальной жидкой периодической культурой часто предполагают, что культура состоит из фенотипически однородной популяции одиночных бактериальных клеток.Это предположение основано на том факте, что обычно считается, что жидкие культуры инициируются из клонов одной бактериальной клетки (1,–3). Используя традиционный метод посева замороженных или жидких культур штрихами на твердую среду, исследователи могут отобрать колонии, теоретически происходящие от одной бактерии определенного генотипа или морфологии, и исследовать культуры на наличие контаминации (3, 4). Впоследствии колонии могут быть отобраны и использованы для инокуляции жидких культур для изучения бактерий в свободно плавающем (планктонном) состоянии (1, 4, 5).

Большинство студентов бакалавриата-биолога знакомо с моделью роста бактериальных жидких периодических культур, описываемой отдельными фазами роста (6,–9). Когда клетки инокулируют в свежую культуральную среду, они первоначально вступают в лаг-фазу. Во время лаг-фазы клетки приспосабливаются к свежей среде путем синтеза белков, подготавливающих клетки к росту (9,–14). Эта фаза различается по продолжительности в зависимости от состояния роста инокулированных клеток, и вся популяция культуры состоит из инокулята.Когда клетки приспособились к новой среде, их число начинает увеличиваться за счет экспоненциального роста (14,–16). Во время этой экспоненциальной фазы быстрый рост приводит к быстрому уменьшению доли исходной инокулированной популяции. После экспоненциального роста скорость роста снижается, и в конечном итоге популяция переходит в стационарную фазу. В стационарной фазе клетки либо не делятся, либо делятся с той же скоростью, что и умирают, тем самым поддерживая стабильную численность популяции (17). В конечном итоге популяция вступает в «фазу смерти», в которой численность популяции уменьшается (18). Основное предположение периодического роста бактерий заключается в том, что уменьшение доли инокулированной популяции устраняет все остатки фенотипического состояния исходного инокулята.

В последнее время все больше внимания уделяется исследованию степени однородности жидких периодических культур. Шлехек и его коллеги показали, как неприкрепленные агрегаты условно-патогенного микроорганизма Pseudomonas aeruginosa спонтанно образуются в жидких периодических культурах (19).Через 6 ч роста биомасса культур на 90% состояла из бактерий, агрегированных в сферы диаметром от 5 до 600 мкм. При сверхэкспрессии экзополисахарида Psl P. aeruginosa проявлял повышенную агрегацию в жидких культурах (20). Для P. aeruginosa эти исследования имеют клиническое значение, поскольку предполагается, что неприкрепленные агрегаты биопленки играют центральную роль в истории жизни бактерий как в окружающей среде, так и во время инфекции (21,–25). Неприкрепленные агрегаты обладают теми же фенотипическими характеристиками, что и биопленки, прикрепленные к поверхности, включая повышенную устойчивость к антибиотикам и устойчивость к иммунному ответу по сравнению с одиночными клетками (25). Таким образом, частота неприкрепленных агрегатов в жидких лабораторных культурах оказывает значительное влияние не только на фенотипы на уровне популяции, такие как устойчивость к антибиотикам, но и на воспроизводимость экспериментов внутри и между лабораториями (25,-27).

Возможность последовательного проведения in vitro микробиологических экспериментов всегда была фундаментальным аспектом микробиологических исследований.Среди многих других преимуществ предположение об относительной однородности бактериальных жидких периодических культур стимулировало использование микробов в качестве экспериментальных систем во многих других областях науки, включая физику, инженерию и эволюцию. Однако различия в практике между лабораториями часто могут приводить к различным результатам, основанным на одном и том же протоколе. Мы исследовали, как метод, используемый для инокуляции периодических культур, влияет на развитие неприкрепленных агрегатов биопленки и впоследствии на результаты эксперимента.Мы обнаружили, что совокупная биомасса жидкой культуры P. aeruginosa зависит от метода инокуляции, при этом прямая инокуляция с использованием выращенных на агаре колоний приводит к наивысшему уровню совокупной биомассы. Уровень агрегации оказал глубокое наследуемое влияние на фенотип последующих бактериальных популяций, включая устойчивость к антибиотикам. Представленные здесь данные подчеркивают важность согласованности в экспериментальном рабочем процессе для контроля эффектов непреднамеренных неприкрепленных агрегатов в экспериментах.Изменения в методе инокуляции, преднамеренные или нет, могут иметь последующие последствия, влияющие на экспериментальные выводы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Рост и агрегация в культурах, инокулированных различными методами.

Чтобы изучить влияние метода инокуляции на совокупный рост и численность в жидкой культуре, четыре различных метода инокуляции оценивали через 4 и 18 часов роста, повторно инокулировали, а затем снова оценивали через дополнительные 4 и 18 часов (). Культуры, инокулированные лизогенным бульоном (LB) в течение ночи из одной колонии (метод 1), или непосредственно из одной колонии с чашки (метод 2), или из ночной культуры LB, начиная с замороженного запаса (метод 3), росли с сопоставимым ростом кинетика ( P = 0.49). Культура, инокулированная непосредственно из замороженного сырья (метод 4), демонстрировала повышенную лаг-фазу по сравнению с другими культурами в течение первых 7 часов ( P = 0,003) (см. рис. S2 в дополнительном материале). Через 24 часа роста все четыре культуры достигли одинаковой плотности клеток ( P = 0,75).

Схематическое изображение четырех способов инокуляции жидких периодических культур. Метод 1, замороженный исходный материал на чашке, колония собрана и добавлена ​​к LB для ночного культивирования в пробирке, а затем инокуляция для эксперимента; метод 2, замороженный материал на чашке, а затем прямая инокуляция колонии; метод 3, замороженный исходный материал в LB для ночного культивирования в пробирке с последующим посевом; метод 4, прямая инокуляция из замороженного сырья.

Агрегацию оценивали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) через 4 и 18 часов в культурах первого поколения (определяемых как культуры, изначально инокулированные различными методами) (). Значительно большая агрегированная биомасса наблюдалась через 4 ч в культурах, инокулированных из одной колонии с чашки (метод 2), по сравнению с культурами из одной колонии, выращенной в LB в течение ночи перед инокуляцией (метод 1) ( P = 0,02) и культуры, инокулированные из замороженного сырья, выращенного в LB в течение ночи перед инокуляцией (метод 3) ( P = 0.04). Культуры, инокулированные непосредственно из замороженного запаса, сильно различались по степени агрегации, но демонстрировали значительно большую агрегацию, чем для методов 1 и 3 ( P = 0,001 и P = 0,02 соответственно) (). Через 18 ч роста культуры, инокулированные из чашки (метод 2), показали больше агрегатов, чем все другие протестированные методы (1).

Репрезентативные изображения жидких культур P. aeruginosa первого поколения после 18-часового роста при инокуляции четырьмя методами испытаний.(A) Метод 1. (B) Метод 2. (C) Метод 3. (D) Метод 4. Показаны собранные изображения z-stack Easy 3D. Увеличение, ×630.

Фракции общей биомассы P. aeruginosa в агрегатах для культур, инокулированных четырьмя различными методами. (A) Агрегация в культурах через 4 часа в культурах первого поколения. (B) Агрегация в культурах через 18 часов в культурах первого поколения. (C) Агрегация в культурах через 4 часа в культурах второго поколения. (D) Агрегация в культурах через 18 часов в культурах второго поколения.Агрегаты были определены как кластеры клеток с биомассой, содержащей минимальный объем 250 мкм ³ . Биомассу нормализовали к значениям OD ₆₀₀ культур. Столбцы представляют собой средние значения со стандартными ошибками средних значений (SEM). ВКЛ, на ночь.

Культуры первого поколения разводили до оптической плотности при 600 нм (ОП ₆₀₀ ) 0,005 в свежей среде и выращивали в течение дополнительных 4 часов для создания культуры второго поколения. Через 4 часа культуры второго поколения, первоначально инокулированные из чашки (метод 2), содержали значительно больше агрегированной биомассы, чем культуры, инокулированные методом 1 ( P = 0.02), но не значительно больше, чем культуры, инокулированные методом 3 или 4 ( P = 0,14 и P = 0,59 соответственно) (). Через 18 ч роста второго поколения культуры, инокулированные методом 2, имели значительно большую агрегированную биомассу, чем культуры, инокулированные методами 1 и 3 ( P = 0,002 и P = 0,002 соответственно). Культуры, инокулированные методом 4, проявляли ту же тенденцию к большей агрегации, чем культуры, инокулированные методами 1 и 3 ( P = 0.02 и P = 0,02 соответственно) (). Таким образом, инокуляция непосредственно из чашки с агаром приводила к большей агрегации в жидких культурах, чем инокуляция из жидкой ночной культуры LB.

Толерантность к тобрамицину.

Чтобы проверить, влияет ли метод инокуляции на толерантность к антибиотикам, культуры подвергали воздействию тобрамицина в течение 24 часов в концентрации, в 10 раз превышающей стандартную МИК, определенную Etest для P. aeruginosa (25, 28). Через 4 и 18 часов роста в культурах первого и второго поколения образцы подвергали контрольному заражению 10 мкг мл ^-1 тобрамицина в течение 24 часов.Культуры, обработанные через 4 часа роста в культурах первого поколения, инокулированных из чашек (метод 2), имели значительно более высокие показатели выживаемости, чем культуры, инокулированные из ночных культур LB (метод 1 или 3) ( P = 0,048 и P ). = 0,03 соответственно). Не наблюдалось повышенной выживаемости в культурах, инициированных из замороженного запаса (метод 4), по сравнению с культурами, инициированными из ночных культур LB (метод 1 или 3) (1). Через 18 часов сохранялась та же зависимость; Культуры, инокулированные на чашках (метод 2), имели значительно более высокие показатели выживаемости, чем культуры, инокулированные LB-культивированием в течение ночи (методы 1 и 3) ( P = 0.014 и P = 0,029 соответственно). Культуры, инокулированные из замороженного сырья, инокулированного (метод 4), имели такую ​​же выживаемость, как и культуры, инокулированные из LB (метод 1 и 3) (1).

Выживаемость культур P. aeruginosa , обработанных 10 мкг мл ^-1 тобрамицина в течение 24 часов. (A) Выживание в образцах, взятых через 4 часа в культурах первого поколения. (B) Выживание в образцах, взятых через 18 часов в культурах первого поколения. (C) Выживание в образцах, взятых через 4 часа в культурах второго поколения.(D) Выживание в образцах, взятых через 18 часов в культурах второго поколения. Процент выживания был основан на КОЕ в обработанных и необработанных культурах. Столбцы представляют собой средние значения с SEM. ВКЛ, на ночь.

В культуре второго поколения аналогичные результаты наблюдались через 4 часа роста. Культура из чашек (метод 2) имела повышенную выживаемость по сравнению с культурами из LB в течение ночи (метод 1 и 3) ( P = 0,041 и P = 0,042 соответственно). Однако культуры, инокулированные замороженным запасом (метод 4), не показали повышенной выживаемости по сравнению с культурами, инокулированными LB в течение ночи (метод 1 и 3) (1). После 18 часов роста в культурах второго поколения не было существенной разницы в выживаемости для любого метода инокуляции (1).

Разрушение агрегатов ультразвуком.

Чтобы проверить, может ли разрушение предварительно сформированных агрегатов перед инокуляцией устранить различия в агрегации, наблюдаемые в культурах, инокулят был обработан ультразвуком непосредственно перед инокуляцией в соответствии с рекомендациями Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (ESCMID) для диагностики биопленки. (29).Обработка ультразвуком не разрушала предварительно сформированные агрегаты, обнаруженные в инокуляте из выращенных на агаре колоний (метод 2), в какой-либо значительной степени ( P = 0,54) (рис. S3). Инокулированные культуры росли в течение 18 ч и снова оценивались. Через 18 часов культуры, инокулированные с чашки (метод 2), имели большие видимые агрегаты, наблюдаемые с помощью CLSM, как это видно в культурах, инокулированных не обработанным ультразвуком инокулятом. Культуры, инокулированные из замороженного сырья (метод 4), также имели некоторую степень агрегации.В инокуляте из ночных культур LB (методы 1 и 3) не было обнаружено заранее сформированных агрегатов (рис. S4). Эти данные показывают, что обработка ультразвуком не может разрушить предварительно сформированные агрегаты.

Агрегаты смешанных культур.

Для выяснения механизма образования агрегатов в культурах второго поколения культуру первого поколения, экспрессирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP) PAO1, содержащую агрегаты, разводили и смешивали в соотношении 1:1 с экспрессирующей PAO1 mCherry культурой преимущественно планктонных одиночные клетки.С помощью CLSM мы смогли наблюдать агрегаты, образующиеся в культуре второго поколения после 4 ч роста. В нескольких агрегатах было видно четкое ядро, состоящее исключительно из клеток, меченных GFP, окруженных слоем смешанных клеток, меченных GFP и mCherry; ядер, состоящих из mCherry-маркированных клеток, не наблюдалось (). Это открытие позволяет предположить, что агрегаты формировались либо в процессе инокуляции, либо в культуре первого поколения, и что при переносе в культуру второго поколения агрегаты рекрутировали планктонные клетки из окружающей культуры.

Представление CLSM агрегатов P. aeruginosa в культуре второго поколения после 4 часов роста. Культуру первого поколения инокулировали только GFP-экспрессирующим штаммом P. aeruginosa по методу 2. При реинокуляции в культуру второго поколения культуру первого поколения разводили и смешивали 1:1 с преимущественно одноклеточной культурой. из P. aeruginosa , экспрессирующих mCherry. Бирюзовые стрелки отмечают центральное ядро ​​клеток, экспрессирующих GFP.Это ядро ​​​​окружено смешанными клетками, экспрессирующими GFP и mCherry. (A) Виды сверху вниз и сбоку. (B) Скомпилированное изображение Easy 3D всех слайдов в z-стеке. Увеличение, ×630.

Участие компонентов матрикса биопленки в образовании агрегатов.

Чтобы исследовать механизм, лежащий в основе наблюдаемого рекрутирования одиночных клеток вокруг агрегатов, мы проверили способность нескольких штаммов P. aeruginosa с различным дефицитом продукции внеклеточного матрикса агрегировать в жидкой культуре.Штамм PAO1 с дефицитом продукции экзополисахарида Psl показал значительное снижение агрегации по сравнению с PAO1 дикого типа и штаммом PAO1 с дефицитом продукции экзополисахарида Pel ( P = 0,0105 и P = 0,0049 соответственно). Делеция поверхностного адгезина CdrA, который, как было показано, ассоциирован с экзополисахаридом Psl (30), не влияла на способность к агрегации по сравнению со штаммом дикого типа. Снижение агрегации, аналогичное мутанту PAO1 psl , наблюдалось и для P.aeruginosa , штамм PA14, штамм, не способный продуцировать Psl (31), что указывает на то, что фенотип не был специфичным для штамма PAO1 ( P = 0,0094) ().

Фракция биомассы P. aeruginosa , представленная в виде агрегатов для штаммов с различными нарушениями продукции внеклеточного матрикса. Культуры инокулировали по способу 2 и исследовали через 18 ч роста в культуре первого поколения. Тестировались штаммы PAO1 дикого типа (WT), PAO1 pel , PAO1 psl , PAO1 cdrA , PAO1 psl cdrA и PA14 дикого типа.Столбцы представляют собой средние значения с SEM.

Для дальнейшего изучения участия экзополисахарида Psl в агрегации отдельных клеток в жидких культурах был создан штамм с индуцируемой продукцией Psl и дефицитом Pel (Δ pel P _BAD — psl ). Агрегация psl -индуцированных или неиндуцированных культур была одинаковой через 4 часа роста; однако через 18 ч роста в культурах, в которых была индуцирована продукция Psl, наблюдалось значительно больше агрегированной биомассы по сравнению с неиндуцированными культурами ( P = 0.037). Использование этих индуцированных и неиндуцированных культур в качестве инокулята показало, что совокупный фенотип сохранялся в культурах второго поколения ( P = 0,0039), указывая на то, что совокупный фенотип наследуется, по крайней мере, в течение нескольких поколений (1).

Фракция агрегированной биомассы штамма PAO1 Δ pel P _BAD — psl в культурах, инокулированных по методу 2, в LB с добавлением или без добавления 2% арабинозы (для индукции psl ). Через 24 часа роста культуры повторно засевали в свежую среду LB с 2% арабинозой или без нее, создавая четыре культуры второго поколения.(Вверху) Культуры первого поколения, отобранные через 4 и 18 часов. (Внизу слева) Повторно инокулированные культуры из исходных неиндуцированных (без арабинозы) культур. (Внизу справа) Повторно инокулированные культуры из исходных индуцированных (2% арабинозы) культур. Столбцы представляют собой средние значения с SEM.

Для проверки участия внеклеточной ДНК (вДНК) в рекрутировании отдельных клеток и в структурной целостности агрегатов культуры, инокулированные непосредственно из чашки, обрабатывали ДНКазой. Через 4 ч обработки не наблюдалось различий в степени агрегации между обработанными ДНКазой и необработанными культурами ( P = 0. 38). Через 18 ч культуры, обработанные ДНКазой, имели значительно ( P = 0,0019) меньшую агрегированную биомассу по сравнению с необработанными культурами (рис. S5).

Стабильность агрегированной популяции в непрерывной культуре.

Как долго может сохраняться совокупный фенотип? Чтобы ответить на этот вопрос, был проведен длительный эксперимент с хемостатом со смесью 1:1 клеток, меченных GFP и mCherry, и скоростью разведения 0,2 в час (время удвоения бактерий 5 часов). Популяции, меченные GFP и mCherry, инокулировали с использованием колоний, выращенных на агаре (метод 2), чтобы вызвать максимальную начальную агрегацию.В течение всего времени эксперимента (13 сут) агрегаты присутствовали в степени, сравнимой с 18-часовой периодической культурой. Однако к концу 13-дневного периода численность агрегированной популяции уменьшилась. Это может быть результатом постоянного обмена средой с медленным разбавлением агрегатной популяции, потому что образование агрегатов не успевало за разбавлением (). При визуальном осмотре образовавшихся в культуре агрегатов выявилась четкая закономерность.Большинство агрегатов имели четкие зоны одноцветных бактерий в первые 2-3 дня (), но по мере развития эксперимента агрегаты между штаммами, меченными GFP и mCherry, становились более однородными и смешивались между собой (). Таким образом, агрегаты оставались стабильной частью популяции не менее 7–9 дней после инокуляции.

Результаты хемостатных культур, выращенных в течение 13 дней. (A) Фракция агрегированной биомассы в образцах, взятых на 0, 1, 2, 5, 7, 9 и 13 день после инокуляции. Столбцы представляют собой средние значения с SEM.(B) Трехмерная проекция агрегата в культуре хемостата через 2 дня роста. Красные и зеленые стрелки указывают на однотонные участки агрегата. (C) Трехмерная проекция агрегата в культуре хемостата после 9 дней роста. Агрегат состоит из смешанной популяции красных и зеленых клеток, первоначально инокулированных непосредственно из чашки, чтобы отличить исходные агрегаты (одноцветные) от агрегатов, созданных в культуре хемостата (смешанные цвета). Увеличение, ×630.

Агрегация других распространенных видов патогенных бактерий в жидкой культуре.

Чтобы проверить, является ли наблюдаемая связь между методом инокуляции и степенью агрегации общим явлением, Escherichia coli и Staphylococcus aureus были протестированы в анализе агрегации. Инокуляция из колоний, выращенных на агаре, и ночных культур LB (способы 2 и 3 соответственно) применялись как две крайности индукции агрегатов, согласно результатам P.aeruginosa экспериментов. E. coli показал повышенную агрегацию по сравнению с PAO1 со средней долей агрегированной популяции примерно 0,7 через 4 часа в культурах первого поколения и примерно 0,2 в 18-часовых культурах первого поколения. Для E. coli значимой корреляции между способом посева и степенью агрегации не наблюдалось. S. aureus продемонстрировал ту же связь между инокуляцией непосредственно из чашки и повышенной агрегацией во время раннего роста (4 часа), что и для P. aeruginosa культур ( P <0,0001) (). Таким образом, агрегация в жидких культурах не ограничивается P. aeruginosa .

Фракции агрегированной биомассы для культур E. coli и S. aureus , инокулированных методом 2 или методом 3. Культуры оценивали на агрегацию через 4 и 18 ч роста. (слева) кишечная палочка . (справа) S. aureus . Столбцы представляют собой средние значения с SEM. ВКЛ, на ночь.

Чтобы оценить, может ли рекрутирование отдельных клеток в агрегаты происходить между разными видами, помеченными P.aeruginosa и E.coli смешивали, как описано выше. Предварительно агрегированные клетки E. coli смешивали с преимущественно одноклеточными P. aeruginosa . После 18 ч комбинированного роста можно было обнаружить несколько агрегатов с одноцветным центром E. coli со смесью P. aeruginosa и E. coli , окружающей центр ().

Два примера трехмерных проекций многовидовых агрегатов. GFP-тег E.coli из богатых агрегатами культур смешивали с преимущественно одноклеточными культурами P. aeruginosa . Через 18 ч роста смешанные культуры содержали большое количество агрегатов с центральным ядром E. coli , меченных зеленым GFP (отмечены синими стрелками), окруженными смесью зеленых E. coli и красных клеток mCherry- меченые клеток P. aeruginosa .

ОБСУЖДЕНИЕ

Микробиология пережила возрождение, поскольку эволюционные биологи, физики и инженеры приняли системы микробных моделей для проверки теорий, производства и тестирования продуктов.Традиционная микробиологическая точка зрения состоит в том, что популяции, выращенные в пробирке, относительно однородны и отличаются от бактерий, выращенных в биопленке. В результате часто предполагается, что фенотипические различия, в том числе повышенная толерантность к антибиотикам и защита хозяина, отличают планктонные клетки, выращенные в пробирке, от биопленок (32,–34). Здесь мы показываем, что метод инокуляции планктонных культур оказывает глубокое влияние на наблюдаемые фенотипы, включая устойчивость к антибиотикам.

Устойчивость планктонных культур к антибиотикам зависит от агрегации бактерий, которая зависит от метода инокуляции.Действительно, повышенная выживаемость, наблюдаемая для культур P. aeruginosa , инокулированных непосредственно из колоний на чашках, согласуется с выводами о том, что эти культуры имели более высокую агрегированную биомассу и что тобрамицин, антибиотик, известный своей способностью убивать активно растущие клетки (35), не для уничтожения частей неприкрепленных агрегатов (25). Следовательно, вполне вероятно, что повышенная толерантность к тобрамицину культур, инокулированных методом 2, является результатом защиты клеток либо из-за снижения метаболической активности в частях более крупной агрегированной популяции, либо в результате того, что Psl обеспечивает экранирующий эффект против тобрамицина (36). , 37). Это скрытое различие в переносимости антибиотиков между макроскопически идентичными культурами может иметь серьезные последствия для результатов различных исследований; например, это может иметь место при тестировании чувствительности противомикробных агентов, когда агрегация в культурах может индуцировать различные фракции толерантных клеток.

Интересно, что более высокая распространенность агрегированной биомассы в культурах второго поколения, первоначально инокулированных из колонии или непосредственно из замороженного запаса, сохранялась даже после ~1000-кратного разведения в свежей среде.Это свидетельствует о том, что культуры, впервые засеянные агрегатами, наследуют частоту агрегации родительской культуры и сохраняют ее на протяжении нескольких поколений. Мы предполагаем, что поддержание частоты агрегатов в культурах второго поколения опосредовано привлечением планктонных клеток к предварительно сформированным агрегатам, что приводит к более крупным агрегатам, которые в конечном итоге засеивают более мелкие агрегаты, которые снова привлекают планктонные клетки, что приводит к эффекту снежного кома при формировании агрегатов. Наше предположение подтверждается тем фактом, что мы смогли найти ядро ​​​​предкового агрегата в агрегатах, продуцируемых в культурах второго поколения, что указывает на то, что эти основные части были унаследованы от культуры первого поколения и рекрутированных клеток.Тот факт, что наши хемостатные культуры сохраняли высокую частоту агрегатов в течение 7 дней (33 поколения), указывает на то, что игнорирование возможного введения предварительно сформированных агрегатов может иметь важные последствия как для краткосрочных, так и для долгосрочных экспериментов. Неоднократно было показано, что

Psl играет решающую роль в формировании прикрепленных к поверхности P. aeruginosa биопленок (30, 38, 39). Наши результаты указывают на аналогичную зависимость образования неприкрепленных агрегатов в жидкой фазе.Адгезин CdrA, ассоциированный с Psl, не требовался для агрегации, что указывает на то, что Psl не нуждается в этом адгезине для агрегации. В отличие от Psl, экзополисахарид Pel, который вызывает большой интерес из-за его участия в биопленках P. aeruginosa (40, 41), не участвовал в формировании агрегатов в нашей системе. Таким образом, экзополисахарид Psl, по-видимому, является центральным медиатором для рекрутирования одиночных клеток вокруг предварительно сформированных агрегатов, введенных в жидкую культуру.Ранее сообщалось, что эДНК имеет решающее значение для целостности агрегатов биопленки (25). При удалении кДНК из культур добавлением ДНКазы мы не наблюдали каких-либо изменений в агрегации в первые часы роста (4 часа) по сравнению с необработанными культурами. В отличие от этого все агрегаты удалялись из культур на поздних стадиях роста (18 ч). Это открытие указывает на то, что эДНК участвует в качестве адгезива, который поддерживает когезионную структуру агрегатов, а также Psl, но может быть не таким существенным для рекрутирования одиночных клеток в молодых культурах.

Способность E. coli агрегировать в жидких культурах была замечательной, но метод инокуляции не зависел от нее. Стоит отметить, что даже при использовании метода, вызывающего наименьшую агрегацию для P. aeruginosa , культуры E. coli могут содержать около 70% биомассы в агрегированном состоянии. В связи с этим возникает вопрос, когда культура E. coli представляет собой полностью гомогенную смесь отдельных клеток, если вообще когда-либо. Одним из возможных посредников этой высокой склонности к агрегации могут быть curli, которые, как было показано, играют важную роль в способности E.coli для образования агрегатов и прикрепления к поверхностям (42, 43). Хотя известно, что экспрессия curli у большинства штаммов E. coli достигает максимума при росте при температуре ниже 30°C, штамм K-12, использованный в этом исследовании, производит curli при 37°C (43). Интересно, что мы обнаружили, что предварительно сформированные агрегаты E. coli были способны рекрутировать смесь отдельных клеток E. coli и P. aeruginosa , создавая многовидовые агрегаты. Это открытие открывает совершенно новую область возможных взаимодействий между видами агрегированных бактерий и приводит к представлениям о многовидовых агрегированных биопленках.

Агрегация S. aureus через 4 часа роста была выше при инокуляции культур с чашки, чем при инокуляции из ночной культуры LB, как было обнаружено с P. aeruginosa . Однако, в отличие от того, что наблюдалось с P. aeruginosa , в 18-часовых культурах S. aureus практически не было обнаружено агрегатов. Растворение агрегатов в более старых культурах S. aureus можно объяснить способностью S.aureus секретировать протеазы в поздней стационарной фазе, что позволяет клеткам переходить из агрегированного состояния в одноклеточное. Секреция протеазы К, например, регулируется системой определения кворума (QS) agr у S. aureus (44). Несмотря на это возможное распространение в поздней стационарной фазе, наши результаты указывают на влияние метода инокуляции на S. aureus в культурах ранней экспоненциальной фазы, аналогичное наблюдаемому для P. aeruginosa .Интересно, что Хаабер и др. ранее описали, как агрегаты S. aureus рекрутируют отдельные клетки из окружающей жидкой фазы во время экспоненциальной фазы и поздней экспоненциальной фазы роста, подобно тому, как мы наблюдали с P. aeruginosa (45). Таким образом, наши результаты исследований E. coli и S. aureus показывают, что агрегация в жидкой культуре не ограничивается P. aeruginosa .

Таким образом, мы обнаружили связь между методом посева бактериальных жидких культур и степенью агрегации этих культур.Это изменение в агрегации P. aeruginosa было связано с изменением толерантности к антибиотику тобрамицину. Эти различия в агрегации и переносимости тобрамицина были унаследованы культурами следующего поколения, когда они были инициированы разведением культур первого поколения. Наши результаты подчеркивают важность согласованности всех экспериментальных процедур, начиная с инокуляции, и указывают на то, что различия в процедурах инокуляции могут иметь фенотипические последствия для > 30 поколений бактериального роста и, таким образом, могут влиять на результаты экспериментов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы.

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в . Штаммы P. aeruginosa , использованные в этом исследовании, принадлежали к фоновому штамму PAO1 из Вашингтонского университета (Сиэтл, Вашингтон) (46). Штамм P. aeruginosa Pao1 δ PELA P _{PALA — PSL — PSL был создан из P. Aeruginosa PAO1 P BAD 6 — PELA (47) по введению PELA Allelic Exchange Vector pMPELA (20), по существу, как описано в ссылке 48.Используемый штамм E. coli представлял собой K-12 MG1655 (АТСС 47076). Был использован штамм S. aureus RN4220, конститутивно экспрессирующий GFP из pAh23 (49). Чтобы обеспечить визуализацию с помощью CLSM, штамм PAO1 дикого типа был создан для экспрессии GFP или mCherry путем трансформации Tn 7 (50). Остальные штаммы окрашивали с помощью Syto9 (Molecular Probes, США).}

Штаммы и плазмиды, используемые в этом исследовании

Штамм или плазмиды		Описание Ссылка
синегнойной
	PAO1 дикого штамма	53
PAO1 Δ PEL	Пели-дефицитный нокаут мутант	30
PAO1 Δ PSL	PSL-дефицитного нокаута мутант	54
PAO1 Δ CDRA	CDRA-Deficated Knockout Mutant	30 8
1
PSL- и CDRA Deficate Knockout Mutant	30
PAO1 Δ Pela P Bad — psl	Пел-дефицитный нокаутный мутант с арабинозой — Инструкция PSL 5 Это исследование
PA14
PA14
PA14	Dired-Tych
Escherichia Coli MG1655	Штамм дикого типа, полученные из E. палочка K-12	55
золотистый стафилококк Ah23	Штамм, полученный из S. стафилококк RN4220 с конститутивной экспрессии GFP	49
	Плазмиды
PMPELA	PMPELA	PELA Allelic Exchange Vector	20	20
PAH23	PAH23	PAH23	PLASMID для выражения GFP в S. aureus	49

Условия роста.

Все эксперименты по выращиванию проводились при 37°C. Эксперименты проводили в чашках LB (BD, США), а для обычных культур использовали чашки с агаром LB (2% [масса/объем]). Замороженные запасы (-80 ° C) состояли из 80% ночных культур в LB и 20% глицерина (Sigma, США). Жидкие культуры встряхивали при 180 об/мин.

Эксперименты по выращиванию и совокупная оценка.

Колбы Эрленмейера инокулировали четырьмя способами (), следующим образом. В методе 1 замороженный материал наносили штрихами на чашки LB и оставляли для роста на ночь.Затем одну колонию инокулировали в LB, выращивали в течение ночи и использовали для инокуляции колбы Эрленмейера. В методе 2 замороженный материал наносили штрихами на чашки LB и оставляли для роста на ночь. Отбирали одну колонию, суспендировали в 1 мл LB и использовали для посева в колбу Эрленмейера. В способе 3 LB инокулировали непосредственно из замороженного сырья, оставляли для роста на ночь и использовали для инокуляции колбы Эрленмейера. В методе 4 замороженный исходный материал непосредственно суспендировали в 1 мл LB перед посевом в колбу Эрленмейера.

Все четыре типа инокулята P. aeruginosa были добавлены для получения конечной OD ₆₀₀ 0,005 в колбе Эрленмейера. Каждая колба Эрленмейера объемом 250 мл содержала 100 мл среды LB. Четыре культуры контролировали по измерениям OD ₆₀₀ на спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония) каждые 30 мин в течение первых 7 ч роста. Через 4 и 18 ч образцы брали для микроскопического исследования. Эти культуры называются культурами первого поколения. Точки времени были выбраны для представления культур экспоненциальной фазы (4 часа) и культур стационарной фазы (18 часов).Для микроскопической оценки 50 мкл культуры вносили в счетную камеру (μ-слайд VI Flat; Ibidi, Германия). Камеры сканировали стопками по оси z при мозаичном сканировании (5 на 5 полей зрения; 674,56 мкм на 674,56 мкм на 40 мкм) с помощью микроскопа Zeiss Imager Z2 с системой LSM 880 CLSM и сопутствующего программного обеспечения Zen 2010 версии 6. 0 (Zeiss , Германия). Программное обеспечение для анализа изображений Imaris (Bitplane, Швейцария) использовали для измерения размера и частоты агрегированной биомассы с использованием пакета Measuring Pro.Агрегатами считали плотные скопления клеток объемом не менее 250 мкм ³ . Этот порог был выбран, чтобы обеспечить достаточное различение нескольких одиночных клеток, связанных на поверхности, и плотных трехмерных структурных агрегатов (см. рис. S1 в дополнительном материале). Средний объем одной бактерии, измеренный таким образом, составляет ~4 мкм ³ ; следовательно, агрегаты ³ размером 250 мкм содержат ~62 клетки.

Культуры первого поколения были повторно высеяны в свежую среду после 24 часов роста в колбах Эрленмейера.24-часовые культуры разводили в свежем LB до конечной OD ₆₀₀ 0,005 (примерно 1000-кратное разведение) и выращивали в течение дополнительных 18 часов, при этом образцы брали через 4 и 18 часов для микроскопической оценки образования агрегатов. . Эти культуры называют культурами второго поколения.

Агрегация штаммов, дефицитных по экспрессии Psl, Pel и CdrA.

штаммов PAO1, дефицитных по продукции экзополисахаридов Psl (Δ psl ) и Pel (Δ pel ) и поверхностного адгезина CdrA (Δ cdrA ), а также Psl-дефицитных P.aeruginosa , штамм PA14. На основании результатов предыдущих экспериментов для инокуляции был выбран метод 2 (замороженный бульон, затем чашка с агаром, затем инокуляция) для достижения максимально возможной начальной агрегированной популяции. Штаммы выращивали в течение 24 часов в культурах первого поколения и повторно инокулировали в свежую среду в культурах второго поколения перед оценкой агрегации через 18 часов роста.

Штамм с дефицитом PAO1 Pel с индуцируемой продукцией Psl (Δ pel P _BAD — psl ) также тестировали на агрегацию.Культуры, инокулированные из чашек по способу 2, выращивали в LB с добавлением или без добавления 2% арабинозы. Через 24 ч культуры пересевали в свежие LB с добавлением или без добавления 2% арабинозы. Образцы оценивали на агрегацию через 4 и 18 ч роста как в культурах первого, так и во втором поколении.

Для оценки участия эДНК в агрегации добавляли ДНКазу (Pulmozyme [dornase alpha]; Genentech, США) через 0 ч после посева культур непосредственно из чашки по методу 2.ДНКазу разбавляли до конечной концентрации 90 ед. мл ^-1 , которая, как сообщалось ранее, разрушает агрегатов биопленки P. aeruginosa (25).

Для оценки способности E. coli и S. aureus агрегировать в жидких периодических культурах колбы Эрленмейера инокулировали в соответствии со способами 2 и 3 непосредственно из чашек с агаром или LB ночных культур. Агрегацию оценивали в образцах, взятых через 4 и 18 ч из культур первого поколения, как описано выше.

Разрушение агрегатов инокулята ультразвуком.

Для разрушения предварительно сформированных агрегатов перед введением в культуры инокуляты обрабатывали ультразвуком непосредственно перед посевом. Инокуляты были созданы на основе четырех ранее описанных методов и впоследствии были обработаны в ультразвуковой ванне Branson 2510 (Branson, США) по программе, состоящей из 5 минут дегазации с последующим 5 минутным воздействием ультразвука при 42 кГц (±6%) и 100 W. Уровень агрегации оценивали микроскопически в инокуляте до и после обработки ультразвуком, а также в полученной культуре через 18 ч роста.

Обработка инокулированных культур антибиотиками.

Жидкость P. aeruginosa периодические культуры, инокулированные в соответствии с четырьмя описанными методами, выращивали в течение 24 часов при постоянном встряхивании (культуры первого поколения). Затем культуры пересевали в культуры второго поколения и выращивали в течение 18 часов. Через 4 и 18 ч две 15-мл аликвоты культур (как первой, так и второй генерации) переносили в две новые колбы Эрленмейера. Одну колбу обрабатывали 10 мкг мл ^-1 тобрамицина (Sigma), а одну оставляли необработанной в качестве контроля.Культуры выращивали еще 24 часа. Один миллилитр культуры промывали три раза, дегазировали в течение 5 минут и обрабатывали ультразвуком перед серийными разведениями и посевом для подсчета КОЕ.

Набор и смешанные культуры.

Культуры штамма P. aeruginosa , продуцирующего GFP, инокулировали согласно методу 2 и выращивали в течение 24 часов. Одновременно инокулировали ночные культуры mCherry-маркированного штамма в соответствии со способом 3. Ночную культуру, продуцирующую mCherry, разводили до OD ₆₀₀ , равной 0.005, повторно выращивали в LB до OD ₆₀₀ 0,1, разбавляли и снова выращивали в течение 3 ч в свежей среде, чтобы свести к минимуму образование агрегатов. Культуру, продуцирующую GFP первого поколения, и культуру, продуцирующую преимущественно одиночные клетки mCherry, разбавляли до OD ₆₀₀ 0,005 и смешивали в соотношении 1:1. Смешанные культуры выращивали в течение 4 часов. Впоследствии образцы были взяты для исследования с помощью CLSM.

Межвидовую агрегацию тестировали путем смешивания в соотношении 1:1 преимущественно одноклеточного P, меченного mCherry.aeruginosa с культурой E. coli , меченной GFP и инокулированной в соответствии со способом 2. Последующие инкубационные образцы брали для исследования с помощью CLSM.

Агрегация в клетках, выращенных на хемостате.

Хемостат был сконструирован на основе конструкции Whiteley et al. (51). Использовали среду на основе среды с минимальным содержанием микроэлементов с 10% (об./об.) фосфатного буфера A10 (52) и 10% (об./об.) LB. Эта среда привела к ОП ₄₅₀ , равной ~0.5. Хемостат содержал 200 мл культуры при скорости потока 40 мл ч ^-1 , что дало степень разбавления 0,2. Культуру аэрировали, непрерывно пропуская через нее атмосферный воздух. Культуру непрерывно перемешивали магнитной мешалкой со скоростью ~200 об/мин. Хемостат инокулировали меченными GFP и mCherry клетками в соотношении 1:1, взятыми непосредственно из чашек с агаром в соответствии со способом 2. Культуру доводили до конечной исходной оптической плотности ₄₅₀ , равной 0,005. Хемостат работал в течение 13 дней, при этом образцы оценивали на агрегацию на 0, 1, 2, 5, 7, 9 и 13 день.

Статистический анализ.

Статистическую значимость оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с множественными сравнениями количественных параметрических данных. Количественную оценку площади под кривой использовали для оценки закономерностей роста. P значения <0,05 считались значимыми. Все тесты проводились в программе GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, США). Все количественные эксперименты проводились как минимум с тремя биологическими повторами. Лечение антибиотиками оценивали с использованием трех технических повторов для каждого биологического образца.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа финансировалась Научной программой Human Frontiers (грант RGY0081/201 для TB), Фондом Лундбека (TB), Датским советом по независимым исследованиям (грант DFF-1323-00177 для TT-N.) . Национальные институты здравоохранения (грант R01GM116547-01A1 для M.W.) и Фонд муковисцидоза (грант WHITEL16G0 для M.W.).

Мы заявляем об отсутствии конфликта интересов.

ССЫЛКИ

Inoculation Definition and Examples — Biology Online Dictionary

Inoculation
сущ., множественное число: inoculations
[ɪˌnɑkjəˈleɪʃən]
Определение: Процесс введения антигенного вещества (иммунология) ) или микроорганизма (микробиология)

Определение прививки

В иммунологии прививка определяется как процесс введения антигенного вещества или вакцины в организм для запуска иммунного ответа против определенного заболевания.В настоящее время процесс прививки также известен как вакцинация или иммунизация (рис. 1). Вакцинация вводит мертвые или модифицированные части болезнетворных микробов (известных как антигены) в организм, вызывая иммунный ответ, который редко причиняет вред человеку. Это приводит к выработке антител иммунной системой, которые обеспечивают будущую защиту от болезни.

Слово «прививка» использовалось в начале 18 века для описания процесса иммунизации людей.Первой болезнью, против которой были привиты люди, была оспа. Он включал введение инфекционного материала через иглу или нож в руку или ногу человека, чтобы вызвать более слабую форму болезни. Этот процесс также назывался вариоляция , так как натуральной оспой называют вирус, вызывающий оспу.

Термин «вакцина» был введен Эдвардом Дженнером в конце 1700-х годов, когда он привил ребенку коровью оспу. Он исследовал, почему доярки, переболевшие коровьей оспой, никогда не болели оспой.Сегодня слова вакцинация и прививка используются как синонимы для описания одного и того же процесса.
В микробиологии инокуляция относится к акту введения микроорганизмов или суспензий микроорганизмов (например, бактерий в культуральную среду).

Бактерии можно инокулировать как в жидкую, так и в твердую среду (рис. 2). Стерильную инокуляционную петлю или пипетку помещают в бактериальную культуру, а затем либо распределяют на чашке с агаром, либо смешивают с жидкой средой/бульоном. Затем среду инкубируют для роста бактерий.Он используется в микробиологических методах, таких как клеточная культура. Это также полезный метод для выделения бактериальных штаммов или установления их присутствия в образце, примерами которого являются образцы мочи или стула. Могут быть назначены антибиотики, соответствующие конкретным бактериям, обнаруженным в образце.

Этимология прививки

Слово прививка происходит от латинского слова ‘inoculare’ , что имеет значение ‘прививать’ .В среднеанглийском языке прививка означала «вставить почку в растение» . Бутон растения напоминает глаз (лат. oculus ), поэтому инокулят использовался для описания прививки или имплантации в садоводстве. Этот термин для прививки или имплантации был затем применен к процессу «прививки» человека от болезни, первоначально в отношении оспы, затем, после 1799 года, термин был расширен для прививки посредством вакцинации против многих различных болезней.

Сегодня слово вакцинация чаще используется, чем прививка.Слово вакцинация происходит от латинских слов vacca (корова) и vaccinia (коровья оспа). Слово вакцинация было введено Эдвардом Дженнером в 1978 году, когда он начал прививать людей от коровьей оспы в качестве метода обеспечения иммунитета против оспы.

История прививок

Оспа была разрушительной болезнью, убивающей около 400 000 человек в год и оставляющей многих других с ужасными шрамами или даже слепотой. Он очень заразен, и до введения прививок смертность от него составляла около 20-30%.Люди — единственный известный хозяин вирусов.

Существует два штамма вируса оспы; это большая и малая оспа. У инфицированных вирусом натуральной оспы наблюдалась наиболее тяжелая форма заболевания с уровнем смертности около 20-30%. Описаны четыре типа оспы натуральной оспы. Это (1) обычные, (2) видоизмененные, (3) плоские и (4) геморрагические. Плоская и геморрагическая оспа были более тесно связаны со смертью.

Симптомы оспы начинались с лихорадки, головной боли и утомляемости, за которыми следовала сыпь, а затем образование пустул (рис. 3).Оспа была также известна как «пятнистый монстр» из-за ее внешнего вида у инфицированных людей. К счастью, с 1977 года не было выявлено ни одного случая оспы, и болезнь была ликвидирована.

Считается, что оспа поражала людей с 10 000 г. до н.э. Доказательства оспы были обнаружены на лицах египетских мумий с 1500-х по 1000-е годы до нашей эры.В то время это заболевание также встречалось в Китае и Индии. Он вызывал различные эпидемии по всему земному шару, пока не был искоренен.

Считается, что прививка возникла в Китае или Индии. Исследования показывают, что прививка (вариоляция) была проведена в Китае еще в 1567 году против оспы. В Китае в 17 веке документированные тексты описывают, как проводить прививку. Это было выполнено путем вдувания небольших частиц инфекционного материала оспы в нос человека, которого нужно было привить.Это было известно как инсуффляция . Инфекционный материал либо растирали в порошок, либо собирали гной из пустул и закапывали в нос. Методы гласят, что инфекционный материал следует либо выдержать при температуре тела в течение месяца, либо подвергнуть воздействию тепла и трав перед использованием. Благодаря этому вирулентность материала резко снизилась. Есть один задокументированный случай использования китайского метода в Лондоне, однако он никогда не повторялся, потому что у человека после процедуры были сильные головные боли.

Некоторые считают, что прививки проводились в Китае еще в 1000 году нашей эры. Есть предположения, что это практиковалось монахом или монахиней и передавалось устно, но нет никаких доказательств этого, кроме того, что это возможная традиция.

Было также высказано предположение, что родиной прививки может быть Индия. В отчетах англичан, живших в Индии в 18 веке, есть описания прививок. Эти прививки заключались в том, что острую иглу погружали в инфекционные пустулы, а затем одну и ту же иглу много раз вводили в кожу реципиента, обычно на руке.Эта процедура использовалась в Бенгалии (ныне Западная Бенгалия и Бангладеш). По рассказам англичан, живших здесь, предполагалось, что прививки делались в этом регионе на протяжении сотен лет.
Прививка от оспы в Европе первоначально проводилась в 18 веке с помощью хирургического ножа (ланцета) с участком пустулы или заразной кожи. Затем этот зараженный нож вводили в тело (обычно руки или ноги) человека подкожно (под кожу). В то время использовались термины «прививка» и «изменение».Торговцы из Черкесии В 1670 году привезли вариоляцию в Турецкую «Османскую» империю.

Вариация была завезена в Англию леди Мэри Уортли Монтегю, которая сама страдала от оспы, оставившей на ней шрамы. Болезнь также убила ее брата. Она услышала о вариациях в 1717 году, когда они с мужем отправились в Стамбул. Она настояла, чтобы ее дети были привиты. Вскоре после этого спрос на прививку от оспы увеличился. Риск умереть от вариации был намного ниже, чем риск умереть от самой болезни.Однако риски, связанные с процедурой, все же были. Вероятность смерти по-прежнему составляла 2%, а также существовал риск заражения другим заболеванием, таким как туберкулез или сифилис, от инфицированного донора. Также существовала вероятность того, что прививка может стать причиной начала новой эпидемии.

К 1721 году вариоляция пришла в Америку. Это становилось все более и более распространенным, и к 1777 году все солдаты были вариолированы перед тем, как приступить к своим обязанностям.
Вернувшись в Англию, Эдвард Дженнер, родившийся в 1749 году, предпринял следующие шаги (рис. 4).В возрасте 13 лет он был заинтригован связью между коровьей оспой и оспой, когда работал подмастерьем у сельского хирурга недалеко от Бристоля. Он слышал, как молочница заявила, что она никогда не заболеет оспой, потому что уже переболела коровьей оспой. Эдвард Дженнер получил образование в области хирургии и медицины, а затем переехал в Лондон, чтобы работать в больнице Святого Георгия под руководством Джона Хантера, известного английского хирурга.

Эдвард Дженнер продолжал интересоваться связью между коровьей оспой и соответствующей защитой от оспы у доярок. В 1796 году он обнаружил у доярки коровью оспу на руках. Взяв часть ткани из этих поражений, он привил маленькому мальчику 8 лет. Ему стало немного плохо с лихорадкой, но он выздоровел. Позже, в 1796 году, он снова сделал мальчику прививку, используя ткани из очагов оспы. У мальчика никогда не было никаких заболеваний. Здесь у него было доказательство того, что прививка защитила мальчика от развития оспы.

К 1798 году он добавил еще несколько случаев прививки от коровьей оспы, чтобы подтвердить свою теорию. В своей задокументированной работе он написал о Variolae Vaccinia (коровья оспа) и решил назвать новую процедуру «вакцинацией», взятой из Vaccinia, латинского vaccinia для коровьей оспы. Отсюда и пошла передача от слова прививка к прививке. Эдвард Дженнер передал некоторые из своих прививок другому хирургу, Генри Клайну, и позже в том же 1799 году другие врачи начали поддерживать идею вакцинации.После этого вакцинация распространилась по всей Англии и Европе.

В последующие годы вариоляцию заменили вакцинацией, а в 1840 году вариоляция стала незаконной в Англии. Вакцинация была гораздо более безопасным и эффективным методом обеспечения иммунитета против оспы. На рис. 5 представлены рисунки, иллюстрирующие разницу между вариоляцией и вакцинацией. На фотографиях показано, как вакцинация вызывает гораздо менее серьезную реакцию, но все же обеспечивает эффективный иммунитет.

Эдвард Дженнер получил много похвал, но также и много скептицизма и насмешек, поскольку его документы не содержали столько доказательств, сколько необходимо, и у него было меньше тематических исследований, чем требовалось. однако к 1807 году правительство наградило его наградами и деньгами за открытие того, что защита от оспы, обеспечиваемая вакцинацией, может передаваться от одного человека к другому без потери ее эффективности.Он также сыграл жизненно важную роль в производстве вакцины и передал ее другим врачам.

Прививка против вакцинации

Оба термина – прививка и вакцинация – использовались для описания процесса выработки иммунитета против оспы, но мы можем уточнить разделение этих двух терминов. Прививка описывает процесс преднамеренного заражения не подвергавшегося воздействию человека легким штаммом оспы (например, малой натуральной оспой) для создания легкой формы заболевания.После прививки у человека оставался иммунитет против оспы. Однако у этого метода были свои риски, поскольку он по-прежнему убивал около 2-3% привитых людей.

Вакцинация, с другой стороны, может быть описана как , индуцирующая прямой иммунитет у индивидуума, использующего более легкую форму аналогичного заболевания , первоначально взятого из гноя пустул коровьей оспы. Вакцины против оспы в наши дни, пока они не были остановлены в 1970-х годах, использовали вирус оспы.

В 1977 году оспа была ликвидирована в мире огромными усилиями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), организовавшей массовую всемирную вакцинацию от этой болезни.8 мая 1980 года ВОЗ опубликовала заявление: Мир и все его народы добились свободы от оспы. Медицинским работникам всего мира понадобилось 10 лет усилий, чтобы сделать миллионы прививок, что привело к его устранению.

Успех вакцинации против оспы на глобальном уровне вселяет оптимизм при рассмотрении вопроса о вакцинации против других серьезных заболеваний человека. Особенно в настоящее время, когда пандемия COVID-19 стала угрозой и влияет на нашу жизнь во всем мире.

Попробуйте ответить на приведенный ниже тест, чтобы проверить, что вы уже узнали о вакцинации.

Начальное соотношение инокуляций регулирует взаимодействие бактерий и метаболическую способность кокультуры

Прививки от COVID-19 для лиц с определенными заболеваниями

Люди с ослабленным иммунитетом средней или тяжелой степени особенно уязвимы к COVID-19, и им может потребоваться больше доз вакцины для их защиты. Если у вас умеренный или тяжелый иммунодефицит, CDC рекомендует первичную серию, которая включает дополнительную дозу вакцины. Вы можете думать об этом как о необходимости получить дополнительную бустерную дозу.

Если вы попадаете в эту категорию, ваша основная серия будет состоять из:

• Moderna: 3 дозы
• Pfizer: 3 дозы
• Johnson & Johnson: 1 доза Johnson & Johnson, а затем 1 дополнительная доза Moderna или Pfizer

Если у вас умеренный или тяжелый иммунодефицит, вы имеете право на получение дополнительной дозы вакцины, когда:

• Moderna: прошло не менее 28 дней с момента второй дозы
• Pfizer: прошло не менее 28 дней с момента второй дозы
• Johnson & Johnson: прошло не менее 28 дней с момента приема дозы J&J (вашей дополнительной дозой будет либо Pfizer, либо Moderna)

Обратите внимание, что лица в возрасте от 5 до 17 лет могут получать только услуги Pfizer.

Вы также можете получить бустерную дозу немного раньше, чем другие люди. Вы имеете право на получение бустера после получения основной серии, если:

• Moderna : Прошло не менее 3 месяцев после вашей третьей дозы
• Pfizer : Прошло не менее 3 месяцев после вашей третьей дозы
• Johnson & Johnson: Прошло не менее 2 месяцев после получения дополнительной дозы Pfizer или Moderna.

Вы можете смешивать и подбирать вакцины.Вам не нужно получать вакцину той же марки для ревакцинации, что и исходная вакцина против COVID-19. Если вам от 12 до 17 лет, вы можете получить только бустер Pfizer.

Используйте VaxFinder, чтобы найти аптеку или другое место, где можно получить бустер.

Оценка эффективности 1 дозы вакцины BNT162b2 против инфекции SARS-CoV-2 через 13–24 дня после иммунизации | Инфекционные болезни | Открытие сети JAMA

Вопрос Связана ли 1 доза мРНК-вакцины BNT162b2 COVID-19 с защитой от инфекции SARS-CoV-2 и симптоматического COVID-19 в реальных условиях?

Выводы В этом сравнительном исследовании эффективности 503 875 человек, получивших 1 дозу вакцины BNT162b2, первая доза вакцины была связана со снижением риска заражения SARS-CoV-2 примерно на 51% через 13–24 дня после иммунизации по сравнению с с 1 по 12 день после вакцинации.Первая доза была связана с эффективностью 54% против симптоматического COVID-19.

Значение Результаты этого исследования согласуются с эффективностью вакцины, о которой сообщалось в рандомизированном клиническом испытании фазы III после введения 1 дозы.

Важность Вакцина BNT162b2 показала высокую эффективность против COVID-19 в рандомизированном клиническом исследовании фазы III. Необходима оценка эффективности вакцины в реальных условиях.

Объектив Оценить краткосрочную эффективность первой дозы вакцины BNT162b2 против инфекции SARS-CoV-2 через 13–24 дня после иммунизации в реальных условиях.

Дизайн, настройка и участники В этом сравнительном исследовании эффективности использовались данные государственной системы здравоохранения Израиля, насчитывающей 2,6 миллиона человек. В число участников вошли все лица в возрасте 16 лет и старше, получившие 1 дозу вакцины BNT162b2 в период с 19 декабря 2020 г. по 15 января 2021 г.Данные были проанализированы в марте 2021 года.

Воздействие Получение 1 дозы вакцины BNT162b2.

Основные результаты и показатели Информация об истории болезни и положительном тесте полимеразной цепной реакции на SARS-CoV-2 и симптомах COVID-19 была собрана с 1 дня после первой вакцины до 17 января 2021 года. 12 после первой дозы с использованием анализа выживаемости Каплана-Мейера и обобщенных линейных моделей.

Результаты Были проанализированы данные для 503875 человек (средний [SD] возраст, 59,7 [14,7] года; 263228 [52,4%] женщин), из которых 351897 имели данные последующего наблюдения с 13 по 24 день. Заражение CoV-2 составило 2484 человека (0,57%) в период с 1 по 12 день и 614 человек (0,27%) в период с 13 по 24 день. 43,41 (12,07) инфекций на 100 000 населения и 21,08 (6,08).16) инфекции на 100 000 населения в дни с 13 по 24, снижение относительного риска (СОР) 51,4% (95% ДИ, 16,3%-71,8%). Снижение заболеваемости стало очевидным с 18-го дня после первой дозы. Аналогичные RRR были рассчитаны для лиц в возрасте 60 лет и старше (44,5%; 95% ДИ, 4,1–67,9%), моложе 60 лет (50,2%; 95% ДИ, 14,1–71,2%), женщин (50,0%). ; 95% ДИ, 13,5%-71,0%), и мужчины (52,1%; 95% ДИ, 17,3%-72,2%). Результаты были сходными в субпопуляциях (например, ультраортодоксальные евреи: RRR, 53,5% [95% ДИ, 19.2%-73,2%]) и пациентов с различными сопутствующими заболеваниями (например, сердечно-сосудистые заболевания: RRR, 47,2% [95% ДИ, 7,8%-69,8%]). Эффективность вакцины против симптоматического COVID-19 составила 54,4% (95% ДИ, 21,4%-73,6%).

Выводы и актуальность В этом сравнительном исследовании эффективности однократной дозы вакцины BNT162b2 результаты были сопоставимы с результатами рандомизированного клинического исследования фазы III.

Недавно одобренная вакцина против COVID-19 BNT162b2 (BioNTech, Pfizer) продемонстрировала 95% эффективность в предотвращении COVID-19 при двухдозовой схеме в плацебо-контролируемом рандомизированном клиническом исследовании III фазы (РКИ), ¹ со второй дозу вводят через 21 день после введения первой дозы вакцины.Европейское агентство по лекарственным средствам одобрило вакцину BNT162b2 в виде 2 доз, разделенных не менее чем на 21 день, для экстренного применения. ²

В связи с пиковой вспышкой COVID-19 власти Великобритании решили вакцинировать большое количество людей с высоким риском в кратчайшие сроки, отложив вторую дозу до максимально рекомендуемого графика дозирования вакцины (12 недель). ³ Такой же подход к иммунизации также рассматривается в других странах и Всемирной организацией здравоохранения ввиду ограниченных доз вакцины, доступных в настоящее время для массовой вакцинации. ⁴ Соответственно, существует глобальная потребность в понимании реальной краткосрочной эффективности вакцины после первой дозы.

РКИ BNT162b2 ¹ продемонстрировало эффективность вакцины 52 % (95 % ДИ, 29,5–68,4 %) между первой и второй дозами, при этом снижение риска по сравнению с плацебо начиналось уже через 12 дней после первой дозы. доза. Это сравнимо с минимально приемлемым уровнем эффективности 50% для предотвращения COVID-19, как указано Всемирной организацией здравоохранения ⁵ и Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США ⁶ в качестве одного из основных критериев для предоставления разрешения на использование в экстренных случаях. к вакцинам-кандидатам COVID-19.Однако эффективность новой вакцины в защите от инфекции трудно оценить в ходе III фазы РКИ. Вместо этого требуются крупные исследования фазы IV в реальных условиях, где вакцина широко применяется. ⁵ Кроме того, необходима оценка эффективности вакцины в реальной жизни вне условий клинических испытаний, особенно с учетом сложных и необычных требований к хранению и обращению с вакциной BNT162b2.

В Израиле вакцинация против SARS-CoV-2 с использованием мРНК-вакцины BNT162b2 началась 19 декабря 2020 г., причем приоритет отдается лицам в возрасте 60 лет и старше, медицинским работникам и лицам с высоким риском.15 января 2021 года Израиль занял первое место по дозам вакцинации с 25,3 дозами на 100 человек населения. ⁷ Целью этого исследования является оценка краткосрочной эффективности 1 дозы BNT162b2 в снижении заражения SARS-CoV-2 в реальных условиях. В свете результатов РКИ наша гипотеза заключалась в том, что кумулятивная заболеваемость инфекцией SARS-CoV-2 среди лиц, получивших вакцину BNT162b2, будет снижаться через 12 дней после иммунизации по сравнению с заболеваемостью в течение предшествующих 12 дней.

Это сравнительное исследование эффективности получило этическое одобрение Комитета по этике медицинских услуг Maccabi и отказ от информированного согласия на анализ деидентифицированных данных. Это исследование проводилось в соответствии с руководством по отчетности Международного общества фармакоэкономики и исследований результатов (ISPOR).

Дизайн исследования и источники данных

Это сравнительное исследование эффективности было проведено с использованием данных одной системы здравоохранения для оценки краткосрочной эффективности, связанной с первой дозой вакцины BNT162b2 против инфекции SARS-2-CoV-2 в реальных условиях.Источниками данных были центральные базы данных Maccabi Healthcare Services (MHS), государственной некоммерческой организации по поддержанию здоровья (HMO) в Израиле, насчитывающей 2,6 миллиона членов, что составляет четверть населения Израиля. Членство в больничных кассах является обязательным в Израиле, и в соответствии с Законом о национальном медицинском страховании от 1994 года все граждане должны свободно выбирать 1 из 4 национальных больничных касс, которым по закону запрещено отказывать в членстве любому жителю Израиля. Набор данных включал обширные демографические данные, антропометрические измерения, клинические и больничные диагнозы, выданные лекарства и комплексные лабораторные данные из одной центральной лаборатории.В Израиле каждому присваивается индивидуальный буквенно-цифровой идентификатор, называемый Национальным номером индекса здоровья, который используется во всех системах здравоохранения, в том числе в этих наборах данных, что позволяет увязывать данные.

Мы использовали увязку данных для определения воздействия вакцины, сбора информации об истории болезни и положительных результатах теста полимеразной цепной реакции (ПЦР) на SARS-CoV-2. ⁸ ПЦР-тесты на SARS-CoV-2 получают из мазков из носоглотки. ПЦР-тестирование предлагается всем гражданам бесплатно, независимо от симптомов, в основном без необходимости направления, и ПЦР-тесты широко доступны для населения (например, в больницах, общественных клиниках, а также на выездных и мобильных станциях тестирования). ).

Исследуемая популяция и конечная точка

Наша исследуемая популяция состояла из всех участников MHS в возрасте 16 лет и старше, которые были вакцинированы в рамках программы массовой иммунизации с 19 декабря 2020 г. по 15 января 2021 г. Мы использовали в качестве эталона результаты РКИ фазы III ¹ , которые предоставили экспериментальные доказательства того, что вакцина BNT162b2 не обеспечивала или обеспечивала лишь небольшую защиту от инфекции SARS-CoV-2 в течение 12 дней после вакцинации первой дозой.Поэтому мы рассчитали кумулятивную заболеваемость инфекцией в течение 12-дневного периода (13-24 дни после первой дозы) по сравнению с 1-12 днями после вакцинации первой дозой. Индексный день, таким образом, определяли как день 1 после первой дозы для периода с 1 по 12 день и день 13 для периода с 13 по 24 день. Последующее наблюдение за инфекцией началось с индексной даты и продолжалось до даты первого положительного результата ПЦР на SARS-CoV-2, смерти, выбытия MHS, 17 января 2021 г. или 12 дней после индексной даты, в зависимости от того, что произошло раньше.Инфекция SARS-CoV-2 определялась как наличие как минимум 1 записи о первично положительном результате ПЦР-теста на SARS-CoV-2 в базах данных MHS. Данные о симптомах среди лиц, инфицированных SARS-CoV-2, были собраны из электронных медицинских карт, задокументированных врачами первичной медико-санитарной помощи во время направления на ПЦР-тест в реальном времени.

Анализы исключили 2022 человека, у которых были задокументированы положительные результаты на SARS-CoV-2 в ПЦР-тестировании до даты индексации, и 6389 человек, которые присоединились к MHS после февраля 2020 года и, следовательно, имели неполную историю болезни.

Клинические и демографические данные на индивидуальном уровне были собраны из центральных наборов данных MHS. Данные включали возраст на дату индексации, пол и индекс массы тела, а также информацию об основных заболеваниях из компьютеризированных реестров, включая рак, состояния с ослабленным иммунитетом, диабет, ⁹ сердечно-сосудистые заболевания, ¹⁰ и гипертонию. ¹¹ Индекс социально-экономического положения (СЭС) каждого переписного участка основывался на нескольких параметрах, включая доход домохозяйства, уровень образования, скученность домохозяйства, материальные условия и наличие автомобиля.Была собрана дополнительная информация о жилых районах участников, включая характеристику ультраортодоксальных еврейских или арабских общин. Эти переменные были выбраны на основе местных эпидемиологических характеристик COVID-19 в Израиле, демонстрирующих более высокую заболеваемость в ультраортодоксальных еврейских и арабских общинах по сравнению с населением в целом, а также в общинах с низким и высоким СЭС.

Непрерывные переменные были выражены как средние с SD и медианы с диапазонами.Категориальные переменные были суммированы как количество и проценты. Совокупные графики заболеваемости инфекцией SARS-Cov-2 были созданы с использованием анализа выживаемости Каплана-Мейера и сопоставлены с логарифмическим ранговым тестом. Сравнение частоты ПЦР-подтвержденной инфекции SARS-CoV-2 между днями 1-12 и днями 13-24 после иммунизации 1 дозой вакцины BNT162b2 было сначала оценено с использованием обобщенных линейных моделей с применением отрицательно-биномиального распределения с лог-ссылка и лог-время-в-риске в качестве смещения.Смещение использовалось для масштабирования количества инфекций SARS-CoV-2 до ежедневной заболеваемости, выраженной в количестве случаев на 100 000 населения. Зависимой переменной было количество случаев SARS-CoV-2 в день в течение 12 дней наблюдения для каждой группы. Независимыми переменными были пол и возрастная категория. Эффективность вакцины (VE) определяли как снижение относительного риска инфекции (RRR) и рассчитывали как (1 –  относительных рисков ) × 100. Мы также рассчитали VE против инфекций с симптомами COVID-19. Анализы были стратифицированы по возрасту, полу, ультраортодоксальному еврейскому сектору или статусу общины, а также сопутствующим заболеваниям.

Заболеваемость COVID-19 в Израиле изменилась за исследуемый период. Несмотря на то, что в течение периода исследования Израиль находился на карантине, согласно данным Министерства здравоохранения Израиля, ¹² , число лабораторно подтвержденных инфекций SARS-CoV-2 среди взрослых увеличилось на 33,7% с 52-й по 53-ю неделю 2020 года. 2020 г. и увеличение на 35,7% между 53-й неделей 2020 г. и 1-й неделей 2021 г. Поскольку исследовательские группы были распределены по-разному в календарном времени, это могло смягчить наши оценки эффективности вакцины.Таким образом, анализ чувствительности включал исключение первой и последней календарной недели и цензурирование второй дозы вакцины. Людям с положительным результатом теста на SARS-CoV-2 после первой дозы рекомендуется отложить прием второй дозы. Поэтому, чтобы избежать потенциальной ошибки отбора, мы не подвергали цензуре период последующего наблюдения на дату введения второй дозы. Все анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения SPSS версии 27 (IBM) и R-пакетов magrittr, readtext, dplyr, ggplot2, tidyverse, выживания и survminer (R Project for Statistical Computing).Значения P были двусторонними, и статистическая значимость была установлена ​​на уровне P  < .05. Данные проанализированы в марте 2021 года.

Были проанализированы данные 503875 человек (средний [SD] возраст, 59,7 [14,7] лет; 264228 [52,4%] женщин), из которых 351897 человек имели данные последующего наблюдения от 13 до 24 дней после первой дозы (таблица ). Исследуемая популяция составляет 26% членов MHS в возрасте 16 лет и старше. За период наблюдения 49814 человек (9.9%) прошли тестирование на SARS-CoV-2.

Всего было выявлено 3098 случаев инфицирования SARS-CoV-2, подтвержденного ПЦР, с кумулятивным риском 0,84%, при этом 2484 случая заражения (0,57%) произошли в течение первого периода наблюдения (1-12 дни) и 614 инфекций (0,27%), произошедших в течение 13-24 дней (рис. 1). Значительное снижение заболеваемости стало очевидным с 18-го дня после введения первой дозы. С использованием обобщенных линейных моделей был рассчитан RRR 51,4% (95% ДИ, 16,3–71,8%) со средневзвешенной (SE) ежедневной заболеваемостью инфекцией SARS-CoV-2, снижающейся с 43.41 (12,07) инфекций на 100 000 населения в дни с 1 по 12 до 21,08 (6,16) инфекций на 100 000 населения в дни с 13 по 24 после иммунизации.

Аналогичные результаты были получены при стратифицированном анализе по возрастным группам (возраст ≥60 лет: RRR, 44,5%; 95% ДИ, 4,1–67,9%; по сравнению с возрастом <60 лет: RRR, 50,2%; 95% ДИ, 14,1%- 71,2%), пол (женщины: RRR, 50,0%; 95% ДИ, 13,5%-71,0%; по сравнению с мужчинами: RRR, 52,1%; 95% ДИ, 17,3%-72,2%), ультраортодоксальные еврейские общины (RRR, 53,5% ; 95% ДИ, 19,1%-73,2%), и сопутствующие заболевания (например, сердечно-сосудистые заболевания: RRR, 47.2% [95% ДИ, 7,8%-69,8%]) (рис. 2).

Ограничив анализ инфекциями с документально подтвержденными симптомами COVID-19, в общей сложности было зарегистрировано 1692 случая заболевания с 1 по 12 день с кумулятивным риском 0,39%, что составляет 68% инфекций SARS-CoV-2 по сравнению с 406 случаями. появление симптоматических случаев COVID-19 в течение дней с 13 по 24, кумулятивный риск 0,17% и 66% инфекций SARS-CoV-2. Рассчитанная ВЭ против симптоматических случаев составила 54,4% (95% ДИ, 21,4%-73,0%). Сопоставимые ВЭ были обнаружены в разных возрастных и половых группах, а также среди лиц с хроническими заболеваниями (рис. 2), например, у пациентов с диабетом (45.0%; 95% ДИ, 4,15–68,4%), иммуносупрессия (49,7%, 95% ДИ, 9,2–72,1%) и рак (55%, 95% ДИ, 22,7–74,8%).

В этом сравнительном исследовании эффективности с использованием реальных данных мы обнаружили, что мРНК-вакцина BNT162b2 была связана со снижением риска инфицирования SARS-CoV-2, подтвержденного ПЦР, и симптоматического COVID-19 на 51% в течение 13-24 дней после иммунизации вакциной. первая доза по сравнению с предшествующими от 1 до 12 дней. Хотя наша оценка эффективности была сопоставима с эффективностью 52% в предотвращении COVID-19, рассчитанной в РКИ фазы III BNT162b2, ¹ , существуют серьезные различия в интерпретации этих результатов.Во-первых, в отличие от РКИ, наша оценка эффективности вакцины оценивалась через 13-24 дня после иммунизации, тогда как инфекции SARS-CoV-2 в РКИ фазы III происходили раньше. Фактически, в РКИ между 14-м и 21-м днями в группе вакцинации было диагностировано только 2 случая инфекции по сравнению с 18 случаями инфекции в группе плацебо, ¹ , что указывает на эффективность 89%

Интересно, что вакцина BNT162b2 (30 мкг, та же доза, что и в исследовании эффективности ¹ ) индуцировала лишь умеренный уровень нейтрализующих антител у участников в возрасте от 18 до 55 лет и даже ниже у участников в возрасте от 65 до 85 лет, как измеряли на 21-й день после первой инъекции исследования безопасности и иммуногенности. ¹³ Это может объяснить нашу реальную оценку 50% защиты от всех инфекций SARS-CoV-2 в течение 12–21 дня после иммунизации первой дозой вакцины BNT162b2. Аналогичным образом, очень хороший ответ нейтрализующих антител после 21-дневной бустерной вакцинации, как показано в исследовании иммуногенности ¹³ , обнадеживает, предполагая очень хорошие шансы на высокий уровень защиты от инфекции SARS-CoV-2 после иммунизации второй дозой. Возможно, что этот устойчивый системный функциональный ответ через 7 дней после второй внутримышечной инъекции BNT162b2 (но не после однократной инъекции) сопровождается значительным локальным иммунным ответом, включающим как иммуноглобин G системного происхождения, так и секреторный иммуноглобин A, с потенциальным положительным результатом. влияние на профилактику передачи вируса.Продолжающаяся оценка эффективности параллельно с серологическими и вирусологическими данными в наших условиях может подтвердить или опровергнуть это предположение и поддержать оценку нейтрализующих антител, поскольку они коррелируют с защитой от бессимптомной инфекции COVID-19 и SARS-CoV-2.

Наша оценка 51% эффективности вакцины против инфекции SARS-CoV-2, подтвержденной методом ПЦР, и 54% эффективности вакцины против симптоматической инфекции через 13–24 дня после иммунизации первой дозой BNT162b2 обеспечивает критически необходимые доказательства ранней эффективности вакцины BNT162b2 в реальных условиях. жизни и имеет ряд важных последствий для принятия решений по предотвращению передачи SARS-CoV-2 и борьбе с пандемией.Хотя эти результаты обнадеживают, вакцину BNT162b2 следует вводить в виде 2 доз с интервалом в 21 день, как это разрешено для использования в экстренных случаях, для достижения максимальной защиты и воздействия на снижение бремени COVID-19 и, возможно, передачи SARS. КоВ-2.

У нашего исследования есть несколько сильных сторон. Автоматизированный сбор данных о прививочном статусе и результатах лабораторных исследований, которые бесплатно предлагаются всем гражданам, позволил нам всесторонне изучить эффективность вакцин с минимальной угрозой информационной систематической ошибки, которая характерна для исследований, основанных на самооценке диагноза.Сравнивая только вакцинированных лиц в разные промежутки времени после иммунизации, мы свели к минимуму потенциальную погрешность отбора и показаний, которая может быть связана со сравнением вакцинированных и непривитых ¹⁴ или с отрицательными результатами исследований. ¹⁵

Это исследование имеет некоторые ограничения. Как и в любом обсервационном исследовании, на наше исследование могли повлиять незарегистрированные прививки; однако общее количество привитых к 15 января 2021 г. в нашем анализе составляет примерно 25% ¹⁶ от общего числа привитых в Израиле на эту дату, что сравнимо с долей рынка MHS, оставляя мало место для значительных пробелов в данных.Несмотря на относительно большую исследуемую популяцию, наше исследование также было ограничено числом лиц с хроническими заболеваниями, которые были инфицированы в течение короткого периода исследования, что дало широкие 95% ДИ рассчитанного VE. Дополнительными ограничениями являются изменение поведения, связанного с обращением за медицинской помощью, и снижение частоты тестов через 2 недели после первой дозы, что могло привести к тому, что большее количество бессимптомных инфекций осталось незарегистрированным. Тем не менее, это потенциальное искажение информации, вероятно, незначительно, поскольку VE, рассчитанный для всех инфекций, был аналогичен или ниже, чем рассчитанный для симптоматических случаев.

Наш период наблюдения для оценки VE закончился на 24-й день после первой дозы, через 3 дня после 21-го дня, после чего можно было ввести вторую дозу. Это могло потенциально усилить индуцированный вакциной иммунный ответ в исследуемой группе в последние дни наблюдения. Тем не менее, это предубеждение, вероятно, имело лишь ограниченный эффект. Во-первых, согласно РКИ II фазы, ¹³ , самые высокие титры нейтрализации достигаются только на 35-й день после введения первой дозы. Во-вторых, наши оценки VE согласуются с результатами большого анализа реальных данных, проведенного Dagan et al. ¹⁷ из второй больничной кассы в Израиле, в которой VE с 14 по 20 день после первой дозы против подтвержденной инфекции составил 46%. (95% ДИ, 40%-51%), а против симптоматического COVID-19 — 46% (95% ДИ, 40%-51%) и 57% (95% ДИ, 50%-63%).Dagan et al. ¹⁷ сравнивали вакцинированных и невакцинированных лиц, которым требовалось строгое соответствие, и значительное число несовместимых лиц было исключено.

В этом сравнительном исследовании эффективности однократная доза вакцины BNT162b2 против COVID-19 была связана со снижением заболеваемости SARS-CoV-2 на 51% в течение 13–24 дней после иммунизации по сравнению с предыдущими 12 днями. Эта оценка была последовательной по возрасту, полу, сектору и сопутствующим заболеваниям.Эти результаты имеют глобальное значение для общественного здравоохранения и открывают новые горизонты для борьбы с пандемией COVID-19 и снижения передачи SARS-CoV-2. Необходимо предпринять глобальные усилия для ускорения развертывания вакцины против COVID-19.

Принято к публикации: 3 мая 2021 г.

Опубликовано: 7 июня 2021 г. -BY Лицензия.© 2021 Chodick G et al. Открытие сети JAMA .

Автор, ответственный за переписку: Габриэль Ходик, доктор философии, Институт исследований и инноваций Маккаби, Служба здравоохранения Маккаби, ул. Йехезкель Кауфманн, 4, Тель-Авив, Израиль 68125 ([email protected]).

Вклад авторов: Г-жа Тенн имела полный доступ ко всем данным исследования и берет на себя ответственность за целостность данных и точность анализа данных. Д-р Чодик и г-жа Тене внесли одинаковый вклад в это исследование.Доктора Коэн и Мухсен внесли равный вклад в это исследование.

Концепция и дизайн: Все авторы.

Сбор, анализ или интерпретация данных: Tene, Patalon, Cohen, Muhsen.

Составление рукописи: Ходик, Коэн, Мухсен.

Критическая проверка рукописи на наличие важного интеллектуального содержания: Тене, Паталон, Газит, Бен-Тов, Коэн, Мухсен.

Статистический анализ: Тене, Коэн.

Административная, техническая или материальная поддержка: Tene, Patalon, Gazit, Muhsen.

Надзор: Ходик, Тене, Паталон, Газит, Мухсен.

Раскрытие информации о конфликте интересов: Не сообщалось

Дополнительные материалы: Эсма Херцель, Массачусетс, и Гилель Алапи, Бакалавр наук (Институт исследований и инноваций Маккаби), получили компьютеризированные данные для этого исследования. Никакой компенсации за их участие в исследовании получено не было.

Вакцины против вируса папилломы человека (ВПЧ) — Национальный институт рака