Бцж прививка у новорожденных как протекает: что это такое, противопоказания, побочные эффекты

Прививка от туберкулеза | Областное бюджетное учреждение здравоохранения «Курская городская клиническая больница № 4»

Прививка от туберкулеза

Туберкулез еще 100 лет назад косил без разбора как миллионеров, так и бедняков. Но если вы думаете, что эта напасть осталась в далеком прошлом, то глубоко ошибаетесь. Туберкулез не только медицинская, но и социальная проблема.

 

С 1989 года в России отмечается ежегодный подъем заболеваемости туберкулезом, причем в первую очередь болезнь поражает детей. Защититься от нее можно одним-единственным способом – с помощью прививки. Более того – Всемирная организация здравоохранения включила Россию в число стран, где рекомендована обязательная вакцинация против туберкулеза.

Туберкулез – хроническое инфекционное заболевание, возбудителем которого является микобактерия туберкулеза, или палочка Коха. Чаще всего инфекция поражает легкие, но не исключено и поражение глаз, костей, кожи, мочеполовой системы, кишечника и т.д. Передается инфекция воздушно-капельным путем, причем заразиться можно где угодно и для этого совсем не обязательно находиться в тесном контакте с заболевшим человеком.

Микобактерии очень устойчивы к влаге, теплу, свету, в уличной пыли они сохраняют жизнеспособность в течение 10 дней, на книжных страницах – целых 3 месяца, в воде – до 150 дней. При активной форме туберкулеза они быстро размножаются в легких больного и разрушают пораженный орган, отравляют организм человека продуктами своей жизнедеятельности – токсинами. Если болезнь не лечить, есть два варианта развития событий: летальный исход через 1-2 года или хронический туберкулез. Самые тяжелые формы туберкулеза возникают у новорожденных детей. Вместе с легкими поражается головной мозг, что приводит к развитию туберкулезного менингита – воспаления оболочек головного мозга.

Лечить туберкулез сложно, так как микобактерии мутируют и появляются формы, устойчивые даже к очень сильным антибиотикам.

Защита от туберкулеза

Надежным средством профилактики болезни является вакцинация. Вакцина против туберкулеза была создана в 1923 году французскими учеными – Кальметтом и Гереном. Отсюда и ее название — Bacillum CalmetteGuerin, BCG; в русской транскрипции — БЦЖ. Она способна предотвратить до 80% случаев тяжелой инфекции и надежно защищает от первичных форм туберкулеза, особенно от тяжелых – таких, как менингит, поражение костей, диагностировать которые и лечить труднее всего. Отказ от прививки чреват высоким риском заражения туберкулезом. Чтобы его избежать, придется раз и навсегда исключить любые контакты ребенка с больными туберкулезом, что практически невозможно сделать, живя в большом городе.

Первую прививку делают прямо в роддоме – она проходит на 3-7 сутки после рождения малыша. С 1 января 2008 года в соответствии с Приложением к приказу Минздравсоцразвития (так тогда называлось Министерство здравоохранения) от 30 октября 2007 года №673 новорожденным делают прививку от туберкулеза вакциной БЦЖ-М. Если в окружении малыша есть больные, вакцинация проводится вакциной БЦЖ.

Эти вакцины содержат живые ослабленные бычьи микобактерии. Вводятся они внутрикожно. В месте укола развивается местный туберкулезный процесс, совершенно неопасный для здоровья крохи.

Через 1,5-2 месяца после введения вакцины в месте прокола возникает небольшое уплотнение, напоминающее комариный укус. Оно может быть красноватым, синеватым, фиолетовым или даже почти черным. Это нормальная реакция организма на прививку БЦЖ, поэтому пугаться ее не нужно. Затем в центре уплотнения (внутри которого находится инфильтрат) формируется маленький прыщик с жидким содержимым. Главное – не трогать этот гнойник. Если из него течет сукровица или гной – следует промокать его ватным диском. Не давайте ребенку расчесывать это место и сдирать образовывающуюся там корочку. Старайтесь не мочить его и не трите мочалкой во время купания. Ранка должна зажить сама. Процесс заживления может длиться несколько месяцев, и в итоге на месте инъекции формируется небольшой, но заметный рубчик диаметром от 0,2 до 1 см. Появление рубца на плече – это следствие перенесенного туберкулезного процесса. Если рубец отсутствует, значит, основная цель вакцинации не достигнута – иммунитет к туберкулезу не сформировался.

В результате успешно прошедшей вакцинации организм вырабатывает защитные антитела против палочки Коха. Полноценный противотуберкулезный иммунитет формируется в течение года.

Другие прививки после введения вакцины БЦЖ можно делать только через месяц. Исключение – прививка против гепатита В, которую новорожденному делают за 3-4 дня до БЦЖ.

 

Противопоказания

Вакцинацию против туберкулеза не делают детям, в семьях которых есть случаи врожденного или приобретенного иммунодефицита, если у братьев или сестер отмечались осложнения после аналогичной прививки, и детям с тяжелыми наследственными заболеваниями или поражениями центральной нервной системы, например, при детском церебральном параличе или синдроме Дауна.

Прививка откладывается до выздоровления при любых ОРЗ и ОРВИ, инфекционных заболеваниях, при гемолитической болезни новорожденных (она развивается из-за несовместимости крови матери и малыша по резус-фактору или группе крови) и при глубокой степени недоношенности.

Осложнения после прививки БЦЖ

Вакцина БЦЖ – хоть и ослабленная, но все-таки живая. Потому возможные осложнения делятся на 2 большие группы: связанные с распространением инфекции и местные. Первые вызывают «неправильное» развитие туберкулезного процесса. Это обычно бывает в тех случаях, когда доктор не увидел существующих противопоказаний к прививке или его о них не проинформировали.

В одном случае из 200 тысяч привитых фиксируется такое осложнение как остеит, или туберкулез костей.

Вторые возникают, когда нарушается техника введения вакцины. В таких случаях месте инъекции может образоваться уплотнение более 1 мм в диаметре, инфильтрат образуется под кожей (должен на коже) и прощупывается под ней как «шарик». Это говорит о том, что вакцину ввели слишком глубоко. Нужно как можно быстрее обратиться к фтизиатру, чтобы содержимое «шарика» не прорвалось внутрь и не попало в кровь. После прививки могут увеличиться также подмышечные лимфоузлы, но при этом они остаются безболезненными. Мама чаще всего замечает это осложнение при купании малыша. В таком случае опять-таки нужна консультация фтизиатра.

Ревакцинация

Иммунитет, приобретенный после прививки БЦЖ, сохраняется в среднем 5 лет. Чтобы поддержать его на должном уровне, рекомендуется пройти ревакцинацию в возрасте 7 и 14 лет. Но проводится она только туберкулиноотрицательным детям, организм которых даже несмотря на вакцинацию БЦЖ, не знаком с палочками Коха или успел уже о них забыть.

Выявить таких детей помогает проба Манту, которую проводят ежегодно. Ее принцип – введение в организм человека малых доз туберкулина – аллергена, полученного от палочки Коха, и наблюдении за реакцией. Если организм с инфекцией встречался, реакция будет бурной, проба – положительной. Через 72 часа после инъекции измеряют диаметр образовавшейся «пуговки» (папулы). В зависимости от его размера и делаются соответствующие выводы. Но надо учитывать, что возможны ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Более совершенной пробой является диаскинтест.

Первая проба Манту предстоит ребенку в 1 год, далее – ежегодно. При отрицательной пробе вакцинацию проводят не позднее, чем через 2 недели после проведения пробы. С рождения до 2 месяцев прививку против туберкулеза делают без предварительной пробы Манту.

Важно помнить, что проба Манту не прививка. Если ребенок по каким-то показаниям освобожден от профилактических прививок, это не значит, что ему нельзя делать пробу Манту. Если же у вас есть опасения по этому поводу, доктор может рекомендовать диаскинтест.

 

Спасительная бацилла

COVID-2019 продолжает свое шествие по планете, а врачи по всему миру пытаются ухватиться за любое оружие против нового вируса. В мире уже развернулась гонка за создание вакцины – над этим работают десятки научных организаций и фармкомпаний. Но, как известно, разработка любой вакцины – дело не одного месяца. Поэтому сейчас в борьбе против COVID-2019 врачи используют все возможное. В ход пошли уже препараты для лечения малярии, а недавно ученые объявили о новой сенсации – прививка БЦЖ от туберкулеза может защитить от коронавируса. Эта гипотеза родилась в США, которые на сегодняшний день лидируют по числу подтвержденных случаев новой коронавирусной инфекции (400 тыс.).

Согласно данным исследователей, смертность от COVID-2019 в десятки раз выше в тех странах, где нет массовой вакцинации от туберкулеза. Может быть, именно этим объясняется обнадеживающая статистика по заболеваемости коронавирусной инфекцией в России – всего около 8 тыс. заболевших на 146 млн жителей? Напомним, что Советский Союз стал первой страной, где прививка от туберкулеза получила обязательный статус. Сегодня в России вакцина БЦЖ входит в Национальный календарь прививок, а более половины объема этих препаратов производит НПО «Микроген» (под управлением «Нацимбио» Госкорпорации Ростех). 

О столетней истории вакцины БЦЖ и ее возможных перспективах в борьбе с новой коронавирусной инфекцией – в нашем материале.

История одной вакцины

«Я прививки не боюсь: если надо – уколюсь! Ну, подумаешь, укол! Укололи и – пошел…». Эти строчки Сергея Михалкова в Советском Союзе знал каждый школьник. Вакцинация считалась обязательной и проводилась повсеместно в школах, поликлиниках, детских садах. Как ни странно, в наши дни около трети россиян боятся прививок. Существует движение антипрививочников, которые почему-то забыли о том, что имуннопрофилактика входит в список величайших достижений медицины. Согласно оценкам ВОЗ, вакцинация каждый год спасает 2–3 млн человеческих жизней. Благодаря вакцинам была полностью искоренена натуральная оспа, а другие смертоносные болезни – полиомиелит, дифтерия, вирусные гепатиты, корь, коклюш, холера, столбняк, сибирская язва – взяты под контроль. К этому перечню опасных заболеваний можно добавить и туберкулез.

Ежегодно 130 млн людей по всему миру делают прививку БЦЖ – это единственная на сегодняшний день сертифицированная вакцина от туберкулеза. В свое время такой укол смог бы спасти Антона Чехова, Франца Кафку и Эмилию Бронте. Появление в прошлом веке вакцины БЦЖ хоть и не избавило человечество от чахотки полностью, но намного сократило случаи ее проявления. Такая прививка не гарантирует абсолютный иммунитет, но предоставляет защиту до 80% вакцинированных.

Вакцинация от туберкулеза обязательна более чем в 60 странах мира, в которых риск заражения этой болезнью считается высоким, в частности, в Бразилии, России, Индии, Китае, Южной Африке. В других странах эта прививка просто рекомендована: где-то вакцину БЦЖ делают частично, например, только для детей из группы риска, а некоторые страны и вовсе отказались от вакцинации из-за низкого процента больных туберкулезом. К примеру, США никогда не использовали туберкулезную вакцину массово. Кстати, именно этот факт и стал основополагающим в теории о связи прививки БЦЖ и коронавирусной инфекции. Но об аргументах ученых чуть позже, а сначала вспомним историю возникновения вакцины, благодаря которой туберкулез перестал считаться смертельно опасным для человечества.

Вид бактерии, вызывающий болезнь, был открыт немецким микробиологом Робертом Кохом еще в 1882 году. Вакцинный же штамм микобактерии туберкулеза появился в начале XX века благодаря многолетней работе и смекалке двух французов – микробиолога Альбера Кальметта и ветеринара Камиля Герена.

Камиль Герен (слева) с Альбером Кальметтом (справа). / © MaxPPP

Для разработки вакцины решено было использовать возбудитель бычьего туберкулеза – Mycobacterium bovis. Но эта бактерия опасна для людей, поэтому Кальметт и Герен решили вырастить ее ослабленный штамм. Для этого они высеяли возбудителя бычьего туберкулеза на среду, состоящую из смеси глицерина и картофельного крахмала. Для туберкулезной палочки эта питательная среда считается просто идеальной. Чем больше времени эти бактерии проводили на таком «курорте», тем они становились более безобидными – действовал вполне естественный закон эволюции. В общей сложности Кальметт и Герен растянули «спокойную жизнь» для туберкулезной палочки на 13 лет! Ученые более 200 раз пересеивали бактерии этого вида на новую среду и продолжали культивирование до тех пор, пока Mycobacterium bovis не потеряла свою вирулентность – способность вызывать у людей заболевание.

Сегодня эта бактерия известна как BCG (Bacillus Calmette-Guirine) или бацилла Кальметта-Герена. В русскоязычной литературе господина Герена переводчики переименовали в Жюрена, и вакцина получила название БЦЖ.

В 1919 году Кальметт и Герен перешли в Институт Пастера в Париже, где в 1921 году создали вакцину БЦЖ для применения на людях. Спустя четыре года Альбер Кальметт передал в Москву штамм бактерий, который в нашей стране был зарегистрирован как БЦЖ-1. Советские ученые несколько лет потратили на экспериментальное и клиническое изучение вакцинного штамма, в результате чего его эффективность была полностью научно доказана. В 1928 году началась вакцинация БЦЖ новорожденных из очагов туберкулезной инфекции.

Старшая сестра одного из родильных домов И. Елизарова вводит противотуберкулезную вакцину грудному ребенку. Автор М. Селимханов. 1967 год. Главархив Москвы

Повсеместная вакцинация новорожденных у нас в стране стартовала в 1962 году и практикуется до сих пор. В наши дни массовая вакцинация против туберкулеза проводится двумя препаратами: вакциной туберкулезной (БЦЖ) и вакциной туберкулезной для щадящей первичной иммунизации (БЦЖ-М). Выпуск вакцины БЦЖ в стране составляет более 2 млн доз, а вакцины БЦЖ-М – порядка 7,7 млн доз. Более половины объема этих препаратов производит ставропольский филиал НПО «Микроген» (входит в «Нацимбио» Госкорпорации Ростех).

Эффективная защита от туберкулеза

В России вакцинация здоровым новорожденным проводится вакциной БЦЖ в возрасте 3-7 дней. Обычно повторные прививки делают уже в 7 лет и в 14 лет.

Кстати, отечественный субштамм БЦЖ (BCG-1 Russia) занимает при высокой иммуногенности среднее положение по патогенности среди других субштаммов. Другими словами – вакцина, приготовленная из российского субштамма, обладает высокими защитными свойствами и при этом почти не вызывает осложнений и постпрививочных реакций.

С 2015 по 2017 год Федеральный научно-клинический центр физико-химический медицины провел анализ структуры генома и стабильности генетических свойств субштамма BCG-1 Russia, применяемого «Микрогеном» для производства вакцин БЦЖ и БЦЖ-М. В ходе исследования ученые выявили полную идентичность всех производственных образцов субштамма M.bovis BCG-1 Russia и его генетическую стабильность в процессе производства обеих вакцин. Это говорит и о стабильности производственных условий культивирования и качестве самого производственного процесса.

Была также проведена оценка профилактической эффективности отечественного субштамма в ретроспективном исследовании с участием более 3 тыс. детей и подростков до 18 лет. В результате была выявлена сильная обратная связь между заболеваемостью туберкулезом и объемом проведенных профилактических прививок. Заболеваемость среди привитых составила 52,2, среди непривитых – 125,1. Таким образом индекс эпидемиологической эффективности (показывает, во сколько раз заболеваемость лиц, получивших препарат, ниже заболеваемости лиц, не получивших препарат) составил 2,4. Это в очередной раз наглядно свидетельствует о том, что прививки против туберкулеза в современных условиях являются эффективной мерой, сдерживающей распространение этого заболевания.

БЦЖ vs Коронавирус

Вакцина БЦЖ оказалась эффективна не только для предотвращения туберкулеза, но также и некоторых других заболеваний: проказы, язвы Бурули и других нетуберкулезных микобактериозов. Кроме того, она используется при лечении рака мочевого пузыря и рака кишечника. Механизм действия не установлен. Предположительно, местный иммунный ответ, вызванный БЦЖ, помогает организму бороться с раковыми клетками. Наверное, поэтому к идее о связи между вакцинацией БЦЖ и устойчивостью к коронавирусной инфекции, выдвинутой в марте американскими эпидемиологами, отнеслись с вниманием во всем мире.

Изучая COVID-19, было замечено, что в странах, по которым вирус ударил больше, население не прививается вакциной БЦЖ. Кроме США, в списке стран, в которых вакцинация БЦЖ носит лишь рекомендательный характер, – Италия, Нидерланды и Бельгия. В страдающей от COVID-19 Италии даже выборочная вакцинация от туберкулеза проводилась только с 1970 по 2001 годы.

В некоторых европейских странах прививка БЦЖ когда-то была обязательна, но позже от нее отказались. Например, в Испании, Германии, Франции, Великобритании. Кстати, ситуация в Германии – одно из явных доказательств данной гипотезы. ГДР по примеру Советского Союза практиковала всеобщую вакцинацию БЦЖ. Сейчас уровень заболеваемости и смертности от COVID-19 на этой территории в несколько раз ниже, чем в западной части Германии.

Карта распространения коронавируса (COVID-19) на 8 апреля 2020 года. Инфографика: Google

То же самое показывает сравнение между Португалией и Испанией. Португалия остановила программу обязательной вакцинации населения в 2017 году, а Испания – еще в 1981 году. В Португалии сейчас число жертв коронавирусной инфекции составляет 35 случаев на 1 млн жителей, а в Испании – более 300 случаев на миллион.

Теория связи вакцины БЦЖ и коронавирусной инфекции подвергается и сомнению. По мнению критиков гипотеза не объясняет большого числа зараженных в Китае, несмотря на обязательную вакцинацию в стране. Сторонники теории отмечают, что в период «культурной революции» 1966-1976 годов вакцинация была прекращена, поэтому могла появиться уязвимая прослойка населения. Кроме того, если оценивать число умерших на 1 млн человек, в Китае этот показатель составляет 2,4 случая, в то время как в Италии – 285 случаев, Испании – 308, а в США – 39. Если сравнить с Россией и Восточной Европой, то разница еще существеннее. Так, в нашей стране смертность составляет всего лишь 0,4 случая на миллион человек, в Белоруссии – 1,4, на Украине – 1,2.

Вакцина как спасение

Как возможно научно объяснить данную зависимость статистики по коронавирусной инфекции и туберкулезной вакцине? Ведь туберкулез вызывает бактерия, а возбудитель COVID-19 – вирус. Как и в иммунотерапии рака точного ответа нет. Некоторые врачи считают, что вакцина БЦЖ как бы тренирует иммунную систему, усиливает естественный иммунитет человека к вирусным заболеваниям дыхательных путей. 

«Гипотеза о том, что широкая вакцинация БЦЖ снижает смертность от COVID-2019 требует научного подтверждения. В настоящее время наука не располагает базовой информацией, которая бы подтвердила антигенное родство между микобактериями туберкулеза и возбудителем COVID-2019», – комментирует ситуацию доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора Центра разработки и внедрения НПО «Микроген» Александр Сергеев.

«Во-первых, требуется более полное изучение статистических данных вспышки коронавирусной инфекции. В частности, на эпидемическую статистику влияет масса факторов, которые должны быть учтены: методики подсчета инфицированных и умерших в разных странах, подходы и возможности диагностики и т.д. Во-вторых, требуется анализ антигенного родства между бактериями туберкулеза и возбудителем COVID-2019. Если таковое будет обнаружено, то можно будет делать дальнейшие выводы о том, что иммунный ответ организма на вакцинацию БЦЖ помогает справляться коронавирусной инфекцией», – считает он.

Ученые продолжают изучать данный механизм. К примеру, в Австралии сейчас проходит исследование, в котором участвуют 4 тыс. врачей. Половине делают прививку БЦЖ, остальным вводят препарат плацебо. Гипотеза, которую нужно подтвердить, заключается в том, что люди, привитые вакциной, скорее не заболеют коронавирусной инфекцией или болезнь будет протекать в легкой форме. Если это будет научно доказано, то прививку БЦЖ можно будет использовать, пока на рынке не появится специальная вакцина от COVID-2019. Над ней сейчас работают десятки лабораторий по всему миру. В России испытание отечественной вакцины из новосибирского центра «Вектор» на добровольцах начнутся не позже июня.

Каждую минуту количество зараженных коронавирусом в мире продолжает расти. На момент написания этого материала всего подтверждено более 1,44 млн случаев заражения COVID-19. В России выявлены 8 672 случая, вылечились 580 пациентов, умерли – 63 человека. На данный момент самое действенное, что мы можем предпринять для своей безопасности, это карантин и соблюдение всех правил гигиены.

Туберкулез у детей и подростков

 

  Проблемы противотуберкулезной помощи детям тесно связаны со сложившейся эпидемической ситуацией, которая в России с 1991 г. остается напряженной, несмотря на стабилизацию в последние годы. Анализ причин этой ситуации убедительно продемонстрировал, что борьба с туберкулезом – это не только медицинская проблема, во многом она определяется социальными условиями жизни общества, семьи. Семья как часть общества не может быть в стороне от этих проблем. Это обусловлено, с одной стороны, тем, что ответственность  за здоровье ребенка несут родители, с другой стороны, наиболее частым источником заражения детей являются члены семьи.

  Туберкулез известен со времен египетских пирамид, эта болезнь сопровождала человечество всегда. Впервые симптоматику описал Али Ибн Сина. Но ошибся, считая, что это наследственное заболевание. Туберкулез- это инфекция, от которой нельзя застраховаться никому.

  Возбудитель заболевания —  микобактерия туберкулеза – был открыт Робертом Кохом в 1882 году. Ее назвали “палочкой Коха”, но сейчас можно встретить сокращенное название: МБТ или БК. Микобактерии широко распространены в природе. Это полиморфные палочки устойчивые к кислотам, щелочам и спирту. Они сохраняют жизнеспособность при воздействии различных физических и химических агентов. В невысохшей мокроте (при определенных условиях) МБТ могут оставаться жизнеспособными до полугода. А в высохшей мокроте на различных предметах ( мебель, книги, посуда, постельное белье, полотенца, пол, стены и т.д.) они могут сохранять свои свойства в течении нескольких месяцев. В комнате, где больной туберкулезом, например чихнул, микобактерии часами могут находиться в воздухе.

  Особенность  туберкулеза у детей и подростков в том, что они заражаются от взрослых. Поэтому хочется сказать о том, как предупредить развитие заболевания. В профилактической работе выделяется 2 направления: специфическая профилактика            ( иммунизация вакциной БЦЖ, превентивная химиотерапия) и неспецифическая профилактика ( санитарно- просветительная работа). Иммунизация вакциной БЦЖ проводится в род. доме, первая прививка делается новорожденным на 3-7 сутки. Ревакцинация БЦЖ (повторная прививка) проводится в 7 и 14 лет по показаниям. Противопоказаниями к прививке против туберкулеза являются только те состояния ребенка, при которых повышается риск развития осложнений. Их не много: вес ребенка менее 2000 г, острые проявления любых заболеваний и обострения хронических; врожденный первичный иммунодефицит, злокачественные новообразования, прием препаратов снижающих иммунитет и лучевой терапии. Если ребенок инфицирован, то ревакцинацию в 7 лет ему не проводят. Иммунизация вакциной БЦЖ проводится, во-первых, для формирования иммунитета, во-вторых, создают резистентность по отношению к возбудителю. Приобретенный в результате вакцинации иммунитет не постоянен. Искусственный иммунитет со временем ослабевает, и поэтому имеется необходимость в периодической ревакцинации.  Микобактерии штамма БЦЖ удовлетворяют требованиям, предъявляемым к вакцинному туберкулезному штамму, они безвредны, специфичны, аллергогенны, и иммуногены. Вакцина БЦЖ признана во всем мире. Таким образом, основное профилактическое средство от туберкулеза – прививка вакциной БЦЖ. Дети, привитые от туберкулеза, болеют в 15 раз реже и значительно легче, чем не привитые. Прививка защищает, прежде всего,  от туберкулезного менингита и тяжелых распространенных форм болезни. 

  Если ребенок не был привит в роддоме, прививка проводится в поликлинике после снятия противопоказаний. До прививки и на период выработки иммунитета (2 мес.) необходимо ограничить круг взрослых, общающихся с ребенком и провести их обследование на туберкулез (флюорография). Если ребенок не привит до 6 мес. возраста, то важно в 6 мес. Провести ему туберкулиновую пробу Манту и если она будет положительная проконсультировать у фтизиатра. Так же хотелось бы сказать о том,  что многих родителей пугает “язвочка” на месте прививки. Не пугайтесь!!! На месте введения вакцины постепенно (в течение 4-6 недель) возникают воспалительные изменения, иногда образуется небольшая язвочка. Это нормальное течение вакцинного процесса, не требующее никаких вмешательств.

  Отдельно хочется сказать о том, что дети  с хроническими заболеваниями нуждаются в вакцинации больше, чем здоровые, т. к.  вакцинный процесс протекает, как правило, легко, незаметно для организма, а течение туберкулеза у таких детей. чаще всего, тяжелое и требует значительных усилий медицинских работников и самого больного на пути к выздоровлению. При решении вопроса о выборе прививки о проведении прививки этим детям важно правильно выбрать период, обеспечивающий безопасную вакцинацию (отсутствие обострения хронического заболевания)

   К сожалению, родители определяют свое отношение к профилактическим противотуберкулезным мероприятиям на основании материалов в средствах массой информации, которые представлены не специалистами в области фтизиатрии.  У иммунизированных вакциной БЦЖ детей даже в случаях заболевания туберкулезом течение болезни значительно легче.

  К сожалению, родители отказываются не только от вакцинации, но и от проведения туберкулинодиагностики. Туберкулиновая проба Манту, в простонародии “пуговка” – это специфический диагностический тест, применяемый при массовом обследовании населения на туберкулез. Хотелось бы обратить внимание, что проба Манту-  это не прививка, как считают многие родители, она не содержит живых или убитых микобактерий туберкулеза. Первоочередной задачей массовой туберкулинодиагностики является выделение из общего числа обследованных лиц наиболее угрожаемых по развитию туберкулеза и нуждающихся в рентгелогическом обследовании.  К таким лицам относятся дети и подростки в раннем периоде первичной туберкулезной инфекции (впервые положительная реакция на пробу Манту с 2 ТЕ, не связанная с иммунизацией против туберкулеза). Требуют внимания пациенты с усиливающейся реакцией на туберкулин (увеличение инфильтрата на 6 мм и более за последний год или постепенное в течение нескольких лет), гиперергической чувствительностью к туберкулину (наличие инфильтрата размером 17 мм и более или любого размера с везикуло-некротической реакцией, регионарным лимфоаденитом или лимфангоита). Таким образом проведение пробы Манту необходимо для: выявления больных туберкулезом; выявления лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза; отбор детей для ревакцинации против туберкулеза.

 От заболевания туберкулезом не застрахован никто!!!  Чем раньше поставлен диагноз, тем лучше прогноз. Поэтому, чтобы обезопасить своего ребенка от этого заболевания, которое может протекать в хронической форме, необходимо, в первую очередь проводить вакцинацию БЦЖ, а  с целью раннего выявления туберкулеза необходимо ежегодное проведение туберкулиновых проб (реакции Манту 2 ТЕ).

   Уважаемые родители! Здоровье ваших детей в ваших руках!

Медицинские новости — БУЗ РА «Перинатальный центр»

Вторник,  16  Март  2021

БЦЖ и вакцинация новорождённых детей

С 10 марта по 10 апреля в Республике Алтай проходит месячник по борьбе с туберкулёзом.

Туберкулёз — грозное заболевание, которому в первую очередь подвержены люди со слабым иммунитетом. Наиболее восприимчивы к туберкулезу грудные дети и дети младшего возраста, защитные силы которых (неспецифический и специфический иммунитет) еще не развиты. Эффективным методом защиты от опасного заболевания является вакцинация детей на 3-4 день после появления на свет прививкой   БЦЖ.

Почему так важна эта прививка? Сегодня в России носителями туберкулёзной палочки является две трети взрослого населения. По определению ВОЗ, наша страна входит в число государств с высоким бременем туберкулёза. Поэтому детей, рождённых в Российской Федерации, прививают сразу же после рождения, чтобы организм успел научиться бороться с палочкой Коха ещё до первой встречи с ней. Риск же такой встречи остаётся высоким.

Больной открытой формой туберкулёза может случайно оказаться где-то рядом – в общественном транспорте, магазине, на улице… Специалисты отмечают, что сегодня растёт число случаев туберкулёза с множественной лекарственной устойчивостью, а потому вопрос вакцинации новорождённых малышей встаёт особенно остро.

Если иммунная система взрослого человека способна дать заслон болезнетворным бактериям, то ребёнок, иммунитет которого ещё не совершенен, может легко заразиться. Дети очень тяжело болеют, проходят длительное лечение антибиотиками, дающее серьёзную нагрузку на все органы. К сожалению, не являются редкостью летальные случаи среди непривитых детей.

На сегодняшний день лучшего способа защитить малыша от туберкулёза кроме прививки БЦЖ не существует. Врачи предупреждают, заражение туберкулёзом привитого ребёнка тоже возможно, но течение заболевания будет проходить легче, а выздоровление наступит быстрее и без последствий. У детей, не получивших прививку от туберкулёза, в 90% случаев развиваются тяжелые и осложнённые формы болезни с вовлечением в патологический процесс не одного органа, а нескольких.

 

Вакцинация защищает от тяжелых форм туберкулёзной инфекции, угрожающей жизни ребёнка.

До появления вакцины смертность от туберкулёза среди детей в России была очень высокой. Сегодня ситуация изменилась, туберкулёз удалось взять под контроль, но не до конца… Случаи детской смертности продолжают регистрироваться, пусть и намного реже. Особенно обидно, что дети умирают при наличии реальной защиты от коварного заболевания. В 80% случаев умершие от детского туберкулёза не были привитыми от этой болезни, что является серьёзным поводом для размышления тем родителям, которые являются ярыми противниками вакцинации.

Специалисты напоминают, что прививка БЦЖ является одной из самых первых, которую получает новорождённый ребенок ещё в родильном учреждении. Это живая вакцина, которая не может вызвать заболевание настоящим туберкулёзом, но помогает выработать иммунитет против него.

В первые месяц-полтора на место укола будет указывать красное пятнышко. Чуть позже, примерно в три месяца, формируется небольшой гнойничок. Иногда он больше похож на маленький пузырёк. В норме размеры такого гнойничка, или пузырька – не больше 1 сантиметра. На месте введения может образоваться небольшой келоидный рубец.

Осложнения у детей после БЦЖ — явление крайне редкое, в Республиканском перинатальном центре таких случаев отмечено не было. Обычно новорождённые хорошо переносят прививку. Медотводов бывает не много, основная их причина – вес ребёнка менее двух килограммов, а также тяжёлые заболевания.

После прививки ребёнок каждый год проходит туберкулинодиагностику, ему ставят реакцию Манту. При необходимости делается ревакцинация в возрасте 7 — 14 лет.

Специалисты напоминают, что вакцинация в нашей стране проводится добровольно. Родители вправе отказаться от БЦЖ, но они должны знать, что риски заболеть тяжёлым недугом со всеми вытекающими последствиями у ребёнка возрастают. Мамы и папы, хорошо подумайте, прежде чем ставить под угрозу жизнь и здоровье своего малыша!

 

 

Подготовлено совместно со специалистами Республиканского перинатального центра

Родителям о прививках

Острый гепатит «В» — тяжелое инфекционное заболевание, характеризующееся воспалительным поражением печени. Перенесенный в раннем возрасте вирусный гепатит «В» в 50–90% случаев переходит в хроническую форму, приводящую в дальнейшем к циррозу печени и первичному раку печени. Чем младше возраст, в котором происходит инфицирование, тем выше вероятность стать хроническим носителем.

Туберкулез — заболевание поражает легкие и бронхи, однако возможно поражение и других органов. При туберкулезе возможно развитие генерализованных форм, в том числе и туберкулезного менингита, устойчивых к противотуберкулезным препаратам.

Коклюш -инфекционное заболевание дыхательных путей. опасным является поражение легких, особенно в грудном возрасте. Серьезным осложнением является энцефалопатия, которая вследствие судорог, может привести к смерти или оставить после себя стойкие повреждения, глухоту или эпилептические приступы.

Дифтерия — острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением организма, преимущественно сердечно-сосудистой и нервной систем, а также местным воспалительным процессом с образованием фибринного налета. Возможны такие осложнения как инф.-токсический шок, миокардиты, полиневриты, включая поражение черепных и перифических нервов, поражение надпочечников, токсический невроз.

Столбняк — поражает нервную систему и сопровождается высокой летальностью вследствие паралича дыхания и сердечной мышцы.

Корь — заболевание может вызвать развитие отита, пневмонии, не поддающей антибиотикотерапии, энцефалит. Риск тяжелых осложнений и смерти особенно велик у маленьких детей.

Эпидемический паротит — заболевание может осложняться серозным менингитом, в отдельных случаях воспалением поджелудочной железы. Свинка является одной из причин развития мужского и женского бесплодия.

РОДИТЕЛИ! ПОМНИТЕ! Прививая ребенка, Вы защищаете его от инфекционных заболеваний! Отказываясь от прививок, Вы рискуете здоровьем и жизнью Вашего ребенка! Помогите Вашему ребенку! Защитите его от инфекционных заболеваний, и от вызываемых ими тяжелых осложнений и последствий! Дайте ребенку возможность бесплатно получить необходимую прививку! Как предупредить болезнь ребёнка? Некоторые болезни можно предотвратить. В этом нет ничего сложного. Все меры 6 предупреждения болезней просты и доступны каждой семье. Соблюдение гигиенических правил, режима, полноценное питание, разумное закаливание, систематические физические упражнения, занятия спортом, своевременные профилактические прививки и ограничение возможного контакта с инфекционными больными — вот почти полный арсенал средств, обеспечивающих здоровье и правильное развитие ребёнка. При малейшем подозрении на инфекционную болезнь в семье до прихода врача надо отделить больного от здоровых детей, предупредить окружающих о заболевании и как можно быстрее сообщить о болезни ребёнка в ясли, детский сад, школу, если заболевший посещал их. Всем этим можно оградить от заражения других детей и предупредить появление бациллоносительства и распространение болезни.

В целях профилактики заболеваний, предлагаем выполнять следующие правила: • Сообщать медсестре детского сада о малейших признаках нездоровья ребенка накануне посещения детского сада.

• Если ребенок отсутствует в детском саду по болезни, либо по какой-то другой причине более 3-х дней, то родители обязаны предоставить справку от врача-педиатра.

Если ребенок, пришедший в группу, проявляет признаки болезни, педагог имеет право не допустить данного ребенка в группу без осмотра медсестры. Если ребенок заболел в детском саду, врач или медсестра изолируют его, и он находится в изоляторе до приезда родителей. Время нахождения ребенка в изоляторе не должно превышать 2-х часов. Все прививки, необходимые по возрасту, должны быть сделаны. Без прививок ребенок в группу не допускается.

• При проведении плановой вакцинации, родители должны дать письменное согласие на проведение прививки в детском саду. Если ребенок прививается в другом учреждении, родители обязаны сделать прививки в течение недели. В случае медицинского отвода от прививок, необходимо предоставить справку от лечащего педиатра.

При направлении ребенка медработниками детского сада на какие-либо бактериологические исследования родители обязаны осуществить его в течение 7 дней.

• Родители должны выполнять все мероприятия (оздоровительные, профилактические, восстановительные — после болезни), назначенные врачом-педиатром.

• С целью ранней диагностики туберкулеза, ежегодно (1 раз в год) в учреждении детям ставится вк проба Манту. Отсутствующим детям необходимо ее сделать в поликлинике по месту жительства.

• После летнего отдыха предоставляется справка от педиатра о состоянии здоровья ребенка, и результаты анализа на энтеробиоз.

«Зачем нужны прививки?»

Прививки или вакцины получили свое название по противооспенному препарату, приготовленному из содержимого коровьих оспинок английский врачом Дженнером в 1798 году. Он заметил, что если ввести содержимое оспины коровы, в котором присутствуют болезнетворные бактерии, в кожный надрез человеку, то он не заболеет натуральной оспой. Прививки (вакцины) — это препараты, способствующие созданию активного специфического иммунитета, приобретенного в процессе прививания и необходимого для защиты организма от конкретного возбудителя болезни. Также прививки могут быть использованы для лечения некоторых инфекционных заболеваний. Прививки (вакцины) изготавливают путем сложных биохимических процессов из микроорганизмов, продуктов их жизнедеятельности или отдельных компонентов микробной клетки. Вакцинный препарат, содержащий определенные дозы возбудителя болезни, оказавшись в организме человека, сталкивается с клетками крови — лимфоцитами, в результате чего образуются антитела — особые защитные белки. Организм в определенный период времени — год, пять лет и т. п. — «помнит» о прививке. С этим связана необходимость повторных 7 вакцинаций — ревакцинации, после чего формируется стойкий длительный иммунитет. При последующей «встрече» с болезнетворным микрорганизмом антитела его узнают и нейтрализуют, и человек не заболевает.

Календарь плановых прививок

Каждая страна мира имеет свой календарь профилактических прививок. В нашей стране до недавнего времени в него входило семь инфекций: туберкулез, дифтерия, столбняк, коклюш, корь, эпидемический паротит (свинка) и полиомиелит. С 1997 года в календарь обязательных прививок внесены еще две прививки — против гепатита В и краснухи.

Прививка гепатита В. В первые 12 часов жизни малышу делают прививку против вирусного гепатита В. Вирусный гепатит В — инфекционное заболевание печени, вызываемое одноименным вирусом, характеризующееся тяжелым воспалительным поражением печени. Болезнь имеет различные формы — от носительства вируса до острой печеночной недостаточности, цирроза печени и рака печени. У новорожденных вирусный гепатит в большинстве случаев протекает бессимптомно, без классической желтухи, что затрудняет своевременную диагностику и затягивает начало лечения. Если не прививать новорожденных, то у 90% детей, инфицировавшихся вирусным гепатитом В в первом полугодии, и у 50% детей, инфицировавшихся во втором полугодии жизни, разовьется хроническое течение этой тяжелой болезни. Прививку повторяют в 1 и 6 месяцев. В случае, если ребенок родился от матери, носительницы антигена гепатита В или заболевшей гепатитом в третьем триместре беременности, прививку повторяют в 1, 2 и 12 месяцев. Иммунитет сохраняется до 12 лет и более.

Прививка против туберкулеза. В возрасте трех-семи дней ребенку делают прививку против туберкулеза вакциной БЦЖ (BCG — Bacillus Calmette Guerin, дословно — бацилла Кальметта, Герена — создатели противотуберкулезной вакцины). Туберкулез — хроническая, широко распространенная и тяжело протекающая инфекция, возбудителем которой является микобактерия туберкулеза (палочка Коха). Первоначально поражаются легкие, однако инфекции могут быть подвержены и другие органы. Известно, что микобактерией туберкулеза инфицировано около 2/3 населения планеты. Ежегодно активным туберкулезом заболевает около 8 миллионов человек, около 3 миллионов заболевших погибает. На современном этапе лечение этой инфекции чрезвычайно затруднено из-за высокой устойчивости бациллы к сильнейшим антибиотикам. Положение усугубляется еще и тем, что, в отличие от других вакцин, БЦЖ не является стопроцентно эффективной в предотвращении туберкулеза и абсолютным средством контроля этой инфекции. В то же время доказано, что БЦЖ защищает 85% привитых детей от тяжелых форм туберкулеза. Поэтому Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) эту прививку рекомендовано делать новорожденным тех стран, где туберкулез сильно распространен, в том числе и в нашей стране. Иммунитет после прививки развивается через 8 недель. Для того чтобы не пропустить момент возможного инфицирования туберкулезом, ребенку ежегодно проводится проба Манту. При отрицательной пробе Манту (т. е. отсутствии противотуберкулезного иммунитета) проводится ревакцинация (повторная вакцинация) БЦЖ в 7 и/или 14 лет. Прививки против коклюша, дифтерии, столбняка и полиомиелита. С трехмесячного возраста начинают делать прививку против коклюша, дифтерии, столбняка (АКДС — адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина) и полиомиелита (ОПВ — оральная (введенная через рот) полиомиелитная вакцина). Обе прививки можно заменить французской вакциной Тетракок — комбинированная вакцина, содержащая АКДС и ОПВ.

Коклюш — инфекционное заболевание, вызываемое коклюшной палочкой. Наиболее характерным признаком коклюша является затяжной, приступообразный спастический кашель. Болезнь наиболее тяжело протекает у детей первых месяцев жизни, сопровождается высокой смертностью, у каждого четвертого заболевшего вызывает патологию легких. Вакцинация состоит из 3 прививок в 3, 4,5 и 6 месяцев, повторная вакцинация проводится в 18 месяцев. Прививают против коклюша детей до 4 лет, в 7 и 14 лет проводят вакцинацию и 8 ревакцинацию только против дифтерии и столбняка, у взрослых это делают — каждые 10 лет.

Дифтерия — заболевание, вызываемое коронебактерией дифтерии. Инфекция протекает тяжело, с образованием характерных пленок на слизистых оболочках верхних дыхательных путей, с поражением нервной и сердечно-сосудистой систем. Возбудитель дифтерии выделяет сильнейший токсин, обладающий способностью разрушать оболочку нервов, повреждать эритроциты (клетки крови). Осложнениями дифтерии могут быть: миокардит (воспаление сердечной мышцы), полиневрит (множественное поражение нервов), параличи, снижение зрения, поражение почек. Всемирной Организацией Здравоохранения прививка рекомендована для всех без исключения стран мира.

Столбняк — смертельно опасное заболевание, вызываемое столбнячной палочкой. Возбудители заболевания обитают в почве в виде спор. Они проникают в организм через мельчайшие царапины кожи, слизистых оболочек и токсинами (одними из самых сильных) поражают нервную систему. Возникают спазмы, судороги всех мышц тела, настолько выраженные, что приводят к переломам костей и отрывом мышц от костей. Особенно опасными являются продолжительные судороги дыхательной мускулатуры. Прогноз начавшегося заболевания неблагоприятный. Смертность составляет 40–80%. Наступает спазм дыхательной мускулатуры, паралич сердечной мышцы — это приводит к летальному исходу. Единственным средством профилактики является прививка.

Полиомиелит — острая вирусная инфекция, поражающая нервную систему (серое вещество спинного мозга). Характеризуется повышением температуры, головными, мышечными болями с последующим развитием параличей нижних конечностей (слабость, боль в мышцах, невозможность или нарушение ходьбы). В наиболее тяжелых случаях поражение спинного мозга приводит к остановке дыхания и смерти. Осложнения полиомиелита: атрофия, т. е. нарушение структуры и функций мышц, в результате чего они становятся слабее, в легких случаях возникает хромота, в тяжелых — параличи. В качестве профилактики используется прививка. Прививки против кори, краснухи и эпидемического паротита. В 1 год ребенку делают прививку против кори, краснухи и эпидемического паротита, повторная вакцинация производится в 6 лет.

Корь — это тяжело протекающая вирусная инфекция, с высокой смертностью (в некоторых странах до 10%), осложняющаяся пневмонией (воспаление легких), энцефалитом (воспаление вещества мозга).

Краснуха — острозаразное вирусное заболевание, проявляющееся сыпью на коже, увеличением лимфоузлов. Опасность этого заболевания в первую очередь состоит в том, что вирус краснухи поражает плод не болевшей краснухой и не привитой беременной женщины, вызывая пороки сердца, мозга и других органов и систем. Поэтому существует три принципиальных подхода к борьбе с краснухой: прививание детей, прививание девушекподростков и прививание женщин детородного возраста, планирующих иметь детей. ВОЗ рекомендует сочетать по мере возможности все три стратегии.

В России в части регионов сочетается вакцинация детей и подростков. Вирус эпидемического паротита поражает не только слюнную железу, но и другие железистые органы: яичники, яички (это может быть причиной бесплодия), поджелудочную железу, возможно воспаление вещества мозга (энцефалит).

О прививках, не входящих в календарь плановых прививок.

Прививка против гриппа. Из-за риска возможных тяжелых осложнений, она показана детям с 6-месячного возраста, страдающих хроническими заболеваниями бронхо-легочной системы, почек, сердца. Необходимо прививаться вакцинами, состав которых меняется ежегодно и соответствует спектру тех вирусов, которые распространены именно в этом году (мониторинг проводит ВОЗ). Делать прививку против гриппа надо еще и потому, что в присутствии вирусов гриппа очень многие слабые вирусы и бактерии становятся более агрессивными и могут вызывать обострения хронических заболеваний или провоцировать возникновение другой инфекции.

Менингит (бактериальный) — воспаление оболочек головного или спинного мозга, вызываемое менингококком, который «обитает» в горле. Заражение происходит от больного человека или внешне здорового носителя этого микроба. Болезнь передается воздушнокапельным путем. Кроме того, при ослабленном иммунитете возбудитель болезни может через кровь попасть в центральную нервную систему, вызывая воспаление оболочек головного и спинного мозга. Повышается температура (свыше 38,0 С), беспокоит сильная головная боль, скованность шейных мышц, тошнота, рвота, сыпь в виде кровоподтеков. Возможны внутренние кровотечения, сепсис, а также потеря сознания, кома, судороги из-за отека головного мозга. Выделение токсинов менингококка приводят к нарушению сердечнососудистой деятельности, дыхания и смерти больного. Менингококковая инфекция наиболее тяжело протекает у детей первого года жизни. По эпидемическим показаниям прививают детей с 6 месяцев, с повторным введение вакцины через 3 месяца, в случае, когда вакцина отечественная прививают с 1 года. В обычных случаях прививают детей старше 2 лет однократно, иммунитет развивается не менее чем на 3 года, у взрослых — на 10 лет. В заключение скажем, что прививки делаются добровольно, по желанию родителей ребенка.

ПАМЯТКА ДЛЯ РОДИТЕЛЕЙ О РИСКАХ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ДЕТЕЙ ПРИ ОТКАЗЕ ОТ ВАКЦИНАЦИИ

Что такое вакцинация? До изобретения прививок инфекции и вирусы являлись главной причиной высокой смертности населения Земли и малой продолжительности жизни человека. Уже 200 с лишним лет в мире существует эффективный способ защиты человека и животных от целого ряда инфекционных и некоторых вирусных заболеваний. Вакцинация (от лат. vaccus корова) — это введение медикамента с целью предотвратить заражение или ослабить его проявления и негативные последствия. В качестве материала (антигена) могут быть использованы: • живые, но ослабленные штаммы микробов; • убитые (инактивированные) микробы; • части микробов, например, белки; • синтетические компоненты. При введении вакцины происходит выработка иммунитета на её компоненты, в результате образуются антитела, которые живут в организме. Антитела строго индивидуальны для каждого возбудителя, при встрече с ним очень быстро подавляют его и не дают болезни развиться. Справившись с задачей, защитники не исчезают: они еще долго — несколько лет, а то и всю жизнь готовы противостоять вредителям. Так в чем же плюсы прививок? По статистике, за последнее столетие продолжительность жизни человека увеличилась, в том числе, благодаря вакцинации. Однако, многие отказываются от прививок, более того, отказываются прививать своих детей, тем самым, подвергая их большому риску. Если бы не было прививок, нам бы угрожали: • корь — вероятность смертельного исхода 1 случай из 100, инвалидности 5 случаев из 100; • коклюш — очень высок риск осложнений со стороны дыхательной и нервной систем; • дифтерия — вероятность смертельного исхода 10 случаев из 100; • полиомиелит — риск тяжелой инвалидности; • туберкулез — длительное лечение, тяжелые осложнения; • эпидемический паротит — возможно развитие бесплодия; • краснуха — у не болевших в детстве или непривитых женщин, заболевших во время беременности, может родиться ребенок-инвалид или нежизнеспособный ребенок; • гепатит В — высокий риск возникновения тяжелого поражения печени (включая рак). Когда сделать вакцинацию максимально безопасной? Многие дети получают временный отвод от прививок на основе относительных противопоказаний, например: острое заболевание (ОРЗ, грипп, бронхит), обострение хронической патологии (аллергия, дерматит, почечная недостаточность) и предстоящее путешествие. В каждом из названных случаев процедуру переносят до подходящего момента выздоровления, снятия обострения или возвращения из поездки. Все прочие поводы отказа от 11 прививки, включая дисбактериоз, недоношенность, эпилепсию и прочие состояния, считаются ложными. Важно помнить, что к каждому ребёнку применяется индивидуальный подход. Перед любой прививкой врач осматривает ребёнка и решает вопрос о возможности её проведения. Прививки назначаются в соответствии с календарём прививок. Однако, некоторые дети, например, недоношенные или с определёнными отклонениями в состоянии здоровья, к данной вакцине могут иметь медицинские противопоказания. Прививки не проводят в период острого или обострения хронического заболевания, их откладывают до выздоровления или ремиссии. Однако, если риск инфекции велик (например, после контакта с больным), то некоторые вакцины можно ввести на фоне незначительных симптомов острого или хронического заболевания. Проведение в один день нескольких вакцин не опасно, если эти вакцины сочетаются между собой, и их назначение совпадает с календарём прививок, в результате вырабатывается иммунитет сразу к нескольким заболеваниям. Важно: По статистике, до 60% родителей, не прививающих своих детей, ссылаются не на болезни или обострения, а на собственные умозаключения, советы родных, религиозные аспекты и прочие сомнительные обстоятельства. Последствия отказа от прививок Если родители все же решили не вакцинировать ребенка, то они должны понимать, что означает для него статус непривитого. Когда в мир, заполненный микробами и вирусами, выходит совершенно незащищенный кроха, его мама и папа обязаны предпринять дополнительные меры для укрепления иммунной системы и жестко следовать санитарногигиеническим правилам, так как любое нарушение может привести к заражению.

ПАМЯТКА ДЛЯ РОДИТЕЛЕЙ «О ПОЛЬЗЕ ВАКЦИНАЦИИ»

Одним из важнейших мероприятий, предпринимаемых для сохранения и укрепления здоровья детей, является организация и проведение профилактических прививок. Защиту организма от возбудителей инфекционных заболеваний осуществляет иммунная система. Она способна защитить ребёнка от постоянно окружающих нас микроорганизмов (кишечной палочки, стрептококков и других), но не всегда в силах справиться с возбудителями дифтерии, вирусного гепатита «А» и «В», столбняка, коклюша, кори и других инфекционных заболеваний. Важно отметить, что прививки, полученные в детстве, в большинстве случаев, создают основу иммунитета против отдельных инфекций на всю жизнь. При введении вакцины происходит выработка иммунитета на её компоненты, в результате образуются антитела, которые живут в организме. Они строго индивидуальны для каждого возбудителя, при встрече с ним очень быстро подавляют его и не дают болезни развиться. Однако ни одна вакцина не может дать 100% гарантии, что ребёнок не заболеет. Хотя, привитые дети болеют крайне редко, между тем большинство вакцин требуют подкрепляющих прививок через определенные промежутки времени, т. к. со временем иммунитет слабеет и защита будет недостаточной. Например, от дифтерии и столбняка прививки повторяют через 5- 10 лет до шестидесятилетнего возраста.

• Зачастую родители боятся делать прививки детям, страдающими хроническими заболеваниями, тем не менее, риск от инфекции во много раз больше возможных последствий от вакцинации. Например, ребёнок с пороком сердца намного хуже перенесёт тот же коклюш, чем здоровый. • После прививки у некоторых детей может наблюдаться постпрививочная реакция, такая как: повышение температуры, покраснение или уплотнение в месте введения вакцины. Это закономерная реакция, которая говорит о начале формирования защиты от инфекции. Как правило, такая реакция носит кратковременный характер (1–3 дня). При повышении температуры до 38 градусов не требуется никакого лечения. Если температура повысится выше 38 градусов, необходимо использовать жаропонижающие средства, их назначения сделает участковый педиатр, в соответствии с возрастом вашего ребёнка. В случае покраснения или уплотнения в месте введения вакцины, необходимо поставить в известность медработника, проводившего прививку. Рекомендуется сделать содовую примочку (на стакан кипяченной теплой воды 1 чайная ложка соды) или йодовую сеточку. Эти процедуры можно делать только через сутки после введения вакцины. Содовую примочку оставляют до 13 высыхания марлевой повязки, при необходимости процедуру повторяют 2–3 раза в день. Для детей, у которых наблюдалась постпрививочная реакция, рекомендуются подготовительные мероприятия, которые назначит врач перед следующей прививкой. Это поможет ослабить постпрививочную реакцию или полностью её избежать. О них вам расскажет ваш участковый педиатр или врач, назначающий прививку ребёнку.

• Важно помнить, что к каждому ребёнку применяется индивидуальный подход. Перед любой прививкой врач осматривает ребёнка и решает вопрос о возможности её проведения. Прививки назначаются в соответствии с календарём прививок. Однако, некоторые дети, например, недоношенные или с определёнными отклонениями в состоянии здоровья, к данной вакцине могут иметь медицинские противопоказания. Прививки не проводят в период острого или обострения хронического заболевания, их откладывают до выздоровления или ремиссии. Однако, если риск инфекции велик (например, после контакта с больным), то некоторые вакцины можно ввести на фоне незначительных симптомов острого или хронического заболевания. Ответственность за назначение вакцины и её последствия, в данном случае, несёт врач, назначивший прививку.

• Хочется добавить, что проведение в один день нескольких вакцин не опасно, если эти вакцины сочетаются между собой, и их назначение совпадает с календарём прививок, в результате вырабатывается иммунитет сразу от нескольких заболеваний. При этом вакцины необходимо вводить в разные части тела.

Перед прививкой ребенка нужно оберегать от контактов с больными. При наличии пищевой аллергии необходимо строго соблюдать диету, не вводить в рацион новые продукты. Такой же тактики нужно придерживаться в течение 5 — 7 дней после прививки. В день проведения прививки сокращаются прогулки на улице, ограничиваются контакты с другими детьми, рекомендуется не купать ребёнка в течение суток. • После прививки ребёнок нуждается во внимательном отношении к нему со стороны родителей и наблюдении медперсонала поликлиники в установленные сроки. Для обеспечения медицинского наблюдения за ребёнком в случае возникновения немедленной реакции непосредственно после проведения прививки, родителям следует находиться с ребёнком возле прививочного кабинета в течение 30 минут.

• Каждый человек имеет право сделать свой выбор — прививаться или нет, но родители должны знать, что отказываясь от прививок, они лишают своих детей права на здоровье. Кроме того, если в детском учреждении карантин по какой — то инфекции, а у вашего ребёнка отсутствует прививка, то его могут не принять в детский коллектив.

• Важно подчеркнуть, что современная медицина не имеет пока более эффективного средства профилактики инфекционных заболеваний, чем вакцинация.

Родители! Отказываясь от прививок, вы не только лишаете защиты своего ребёнка, но и подвергаете опасности других детей, а также способствуете распространению инфекционных заболеваний в обществе.

Рекомендации населению по проведению вакцинации и основам безопасности иммунопрофилактики.

Вы должны это знать! Проведение нижеуказанных мероприятий направлено на обеспечение безопасности иммунизации с целью предупреждения возникновения нежелательных реакций на введение вакцины. Профилактические прививки гражданам проводятся в целях создания специфической невосприимчивости к инфекционным болезням. При проведении прививок медицинскими организациями проводятся мероприятия, направленные на обеспечение безопасности иммунизации, в том числе пациента, которому вводят вакцину. В этой связи профилактические прививки проводятся в организациях (медицинских кабинетах) при наличии у них лицензий на медицинскую деятельность. В определенных случаях по согласованию с органами, осуществляющими санитарно-эпидемиологический надзор в субъекте, может быть принято решение о проведении профилактических прививок гражданам на дому или по месту работы с привлечением прививочных бригад. Профилактические прививки проводят медицинские работники, обученные правилам организации и техники проведения иммунизации, а также приемам неотложной помощи в случае возникновения поствакцинальных осложнений. К проведению прививок допускается только здоровый медицинский персонал. Иммунизацию в лечебно-профилактических организациях проводят в специально оборудованных прививочных кабинетах. При отсутствии здравпунктов в организациях для проведения иммунизации с привлечением прививочных бригад выделяют помещения, где должна быть проведена влажная уборка, дезинфекция, проветривание, есть мебель для осмотра пациента и проведения профилактических прививок (стол, стулья, кушетка). Решение о возможности работы прививочной бригады в выделенном помещении принимает врач (в сельской местности — фельдшер) прививочной бригады. С целью выявления противопоказаний к проведению прививок все лица, которым должны проводиться профилактические прививки, предварительно должны быть осмотрены врачом или фельдшером. Перед иммунизацией врач должен тщательно собрать анамнез у пациента с целью выявления предшествующих заболеваний, в том числе хронических, наличия реакций или осложнений на предыдущее введение препарата, аллергических реакций на лекарственные препараты, продукты, выявить индивидуальные особенности организма (недоношенность, родовая травма, 16 судороги), уточнить, имеются ли контакты с инфекционными больными, а также сроки предшествующих прививок, для женщин — наличие беременности. Лица с хроническими заболеваниями, аллергическими состояниями и др. при необходимости подвергаются медицинскому обследованию с использованием лабораторных и инструментальных методов исследования. Непосредственно перед проведением профилактической прививки должна быть проведена термометрия. Убедитесь, что на момент прививки нет повышения температуры. Это является единственным универсальным противопоказанием к проведению прививки. Иммунизация проводится вакцинами отечественного и зарубежного производства, зарегистрированными и разрешенными к применению в установленном порядке. На всех этапах использования вакцин (транспортирование, хранение) должна соблюдаться «холодовая цепь». Оптимальный режим хранения для вакцин +20 С — +80 С. Все профилактические прививки проводят стерильными шприцами и иглами однократного применения. В случае одновременного проведения одному пациенту нескольких профилактических прививок каждую вакцину вводят отдельным шприцем и иглой в разные участки тела в соответствии с инструкцией по применению препарата. Для введения вакцины используется только тот метод, который указан в инструкции по ее применению. Внутримышечные инъекции детям первых лет жизни проводят только в верхненаружную поверхность средней части бедра. Медицинский работник должен предупредить пациента, родителей (или опекуна) ребенка о возможности возникновения местных реакций и клинических проявлениях поствакцинальных реакций и осложнений, дать рекомендации в каких случаях обращаться за медицинской помощью. В первые 30 минут после прививки, не торопитесь покинуть поликлинику или медицинский центр. Посидите в течение 20–30 минут неподалеку от кабинета. Это позволит быстро оказать помощь в случае возникновения немедленных аллергических реакций на прививку. При проведении профилактических прививок детям первого года жизни должно быть обеспечено активное медицинское наблюдение (патронаж) в следующие сроки: — на следующий день после иммунизации против гепатита В, дифтерии, коклюша, столбняка, гемофильной инфекции; — на 2-й и 7-й дни после иммунизации против полиомиелита; — через 1, 3, 6, 9 и 12 мес. после иммунизации против туберкулеза.

Плюсы и минусы прививок для детей — Детский медицинский центр

СТРАШНО ДЕЛАТЬ ПРИВИВКИ РЕБЕНКУ?

ПЛЮСЫ И МИНУСЫ ПРИВИВОК ДЛЯ ДЕТЕЙ

Каждый родитель уже с первых дней рождения малыша сталкивается с вопросом вакцинации. Вакцинация детей необходима, ведь указанный способ профилактики позволяет защитить организм от целого ряда опасных инфекционных заболеваний.
Итак, что же делать родителям, которые боится делать прививки своему малышу? Разумеется, указанную манипуляцию выполняет медицинский работник, но ведь родителям приходится переживать за результат. Да и современное законодательство предусматривает возможность родителям отказаться от вакцинопрофилактики, поэтому перед ними возникает вопрос: прививать или не прививать малыша?

Какие действия предпринять родителю, который боится прививок?

В первую очередь необходимо успокоиться и проанализировать все моменты, связанные с проведением вакцинации или отказом от нее. Родитель, который говорит себе и окружающим: «Боюсь делать прививки ребенку», должен ответить на следующие вопросы:

• Является ли заболевание, от которого врач рекомендуется привиться, смертельно опасным? Каким является риск заражения у ребенка, с одной стороны, и риск появления серьезных осложнений от прививки – с другой;
• Здоров ли ребенок в данный момент, готов ли его организм справиться с нагрузкой, связанной с введением вакцины;
• Качественным ли является препарат? Где он был закуплен? Эту информацию можно получить в медицинском учреждении у специалиста;
• Примут ли ребенка в дошкольное детское учреждение без документа о прививках? Не возникнет ли впоследствии необходимость купить справку для этой цели?

Положительные и отрицательные стороны прививок

Плюсы прививок – общеизвестны. К ним относят:

• Вакцинация является единственной возможностью защититься от таких серьезных заболеваний, как столбняк или полиомиелит;
• Даже если привитый ребенок заболеет, к примеру, краснухой, болезнь у него будет протекать в более легкой форме;
• Современные вакцины являются менее токсичными, чем препараты предыдущих поколений. Антибиотики, которыми пришлось бы лечить, например, коклюш, имеют намного больше побочных эффектов;
• Массовый отказ от прививок может спровоцировать возникновение эпидемий тех болезней, о которых все уже давно забыли;
• Риск осложнений от прививок гораздо меньше, чем риск осложнений болезней, от которых они защищают.

Минусы у прививок тоже есть. К ним можно отнести:

• Вакцинация в некоторой степени снижает естественный иммунитет малыша;
• Препарат не дает стопроцентной гарантии того, что человек никогда не заболеет в будущем.

Современная медицина использует совершенно новые вакцины, в которых опасные компоненты либо сокращены до минимума, либо полностью исключены. Часто болеющие дети больше всего нуждаются в иммунопрофилактике. Они наиболее подвержены инфекциям, и заболевания у них нередко протекают с осложнениями. Для ослабленных детей предусмотрены «добавочные» прививки по показаниям. Например, возбудитель пневмококка – причина 70% инфекций респираторной системы. Поэтому и разработана специальная вакцина для детей, подверженных респираторным заболеваниям. Даже частичная защита – это лучше, чем вообще никакой. У привитых детей, если даже они заболевают, болезнь протекает в более легкой форме и дает меньше осложнений. В современных вакцинах концентрация токсичных веществ сведена к минимуму. Антибиотики, которые придется принимать, если непривитый ребенок заболеет, могут нанести детскому организму больший вред.

Стоит ли отказываться от вакцинации из страха перед осложнениями

«Прививки губят иммунитет ребенка», «вакцины содержат живые вирусы, которые вредят организму», «ребенок может умереть от побочных эффектов вакцины» — такие аргументы можно услышать от родителей, которые отказываются от вакцинации своих детей. Отдел науки «Газеты.Ru» разбирался, так ли опасны прививки и стоит ли отказываться от них из-за риска осложнений.

Немного истории

Первая вакцина в истории человечества была создана английским врачом Эдвардом Дженнером, который 14 мая 1796 года привил мальчику коровью оспу — болезнь, неопасную для человека. Коровья оспа оставляла на коже рук человека лишь едва заметные следы пузырьков, однако, как показывали наблюдения, «человеческой» оспой этот человек уже не заболевал.

Спустя полтора месяца после вакцинации Дженнер ввел мальчику вирус натуральной оспы — и ребенок действительно остался здоров.

Однако в этом случае успех врача стал возможен лишь потому, что оспа существует в двух формах, одна из которых действительно безопасна для человека. Создать полноценную вакцину путем ослабления других вирусов и приготовить из них препараты для прививок удалось лишь спустя сто лет. Сделал это Луи Пастер, который в 1881 году создал прививку против сибирской язвы, а в 1885 году — против бешенства.

Как прививают сейчас

В настоящее время в России вакцинация проводится в рамках Национального календаря профилактических прививок. В течение первых нескольких недель или даже дней родителям родившегося в России ребенка предлагается сделать младенцу несколько так называемых детских прививок. Первая — от гепатита В — делается, когда новорожденному исполняется 12 часов, а повторяется она в возрасте одного месяца и полугода. С третьего по седьмой день жизни ребенка прививают вакциной БЦЖ (бацилла Кальметта — Герена), которая защищает от туберкулеза. В три месяца ребенок получает либо одну прививку (под названием «тетракок»), либо две: вакцину АКДС (против коклюша, дифтерии и столбняка), а также вакцину от полиомиелита. Эти прививки также повторяются в более позднем возрасте. В возрасте одного года наступает время делать одну комбинированную прививку от кори, краснухи и паротита (известного также под названием «свинка»).

Иногда возникают случаи, когда вакцинация несет за собой негативные, а иногда даже трагические последствия, вплоть до гибели ребенка. Обычно такие ситуации широко освещаются в СМИ и влекут за собой проверки в больницах и наказание виновных врачей, однако вопрос о том, насколько прививки безопасны, остается открытым.

Выступающие против прививок родители обычно руководствуются следующими аргументами:

прививки убивают «врожденный иммунитет» ребенка, они создаются на основе живых вирусов, а значит, могут повредить организму. Противники вакцины БЦЖ утверждают, что риск заболеть туберкулезом во многом зависит от условий жизни ребенка:

так, развитые европейские страны (Франция, Германия, Бельгия, Австрия, Италия, Испания и другие) отказались от обязательной вакцинации против туберкулеза, прививая лишь детей из низших социальных слоев — групп риска. Впрочем, не стоит забывать, что Национальные календари прививок в этих странах тоже существуют: так, в Великобритании и США календарь предполагает вакцинацию от 14 заболеваний, во Франции и Германии — от 12. От стольких же болезней прививают и в России: в наш календарь включены вакцины против 12 инфекционных заболеваний (туберкулез, гепатит В, пневмококковая инфекция, дифтерия, коклюш, столбняк, полиомиелит, гемофильная инфекция, корь, краснуха, паротит, грипп).

Какие могут быть осложнения?

Неблагоприятные состояния, возникающие после вакцинации, могут быть разными по тяжести: от непродолжительной лихорадки, головной боли, тошноты или покраснения в месте инъекции до вакциноассоциированного полиомиелита после применения живой полиовирусной вакцины. «Побочные реакции и осложнения у вакцинированных возникали от момента появления вакцинопрофилактики и до наших дней, — комментирует Айдар Ишмухаметов, директор ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН».

— Эти эпизоды возникают из-за проблем с созданием вакцинных препаратов, связанных с недостаточным развитием биомедицинских технологий производства и контроля, недостаточными знаниями о природе возбудителя. Кроме того, осложнения могут возникать из-за индивидуальных особенностей организма вакцинируемого, о которых не знали прежде».

Впрочем, серьезные последствия, такие как вакциноассоциированный полиомиелит или осложнения после прививки БЦЖ от туберкулеза, чрезвычайно редки. Так, в случае с БЦЖ причинами осложнений являются биологические свойства самого штамма, а также нарушения техники введения вакцины и неправильный отбор детей на вакцинацию. По словам Айдара Ишмухаметова, «анализ причин осложнений, которые возникали при использовании вакцины БЦЖ в России, показал, что у детей с осложнениями после вакцинации в 77,3% случаев сопутствующая патология была еще до прививки.

У детей с осложнениями, развившимися после ревакцинации, в 67% случаев выявлено нарушение техники внутрикожного введения вакцины. Использование вакцины БЦЖ-М снизило риск возникновения осложнений в два раза.

Число осложнений на 100 тыс. привитых в настоящее время колеблется от 0,028% при первичной вакцинации до 0,004% после второй вакцинации. Все осложнения носили в основном местный характер: так, генерализованная БЦЖ-инфекция встречалась лишь в 0,2 случая из 100 тыс».

Несмотря на то что туберкулез действительно распространен в основном в странах с неблагоприятными условиями жизни, не стоит забывать, что Россия, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), все же находится в группе риска:

close

100%

Если говорить о вакциноассоциированном полиомиелите, то, по данным ВОЗ, частота его возникновения составляет примерно один случай на 2,7 млн первых доз вакцины. Обзор данных разных стран мира о случаях этого заболевания позволил оценить

риск его возникновения как 4,7 случая на 1 млн новорожденных, вследствие чего в мире ежегодно должно возникать примерно 498 случаев вакциноассоциированного полиомиелита. В России в период с 1998 по 2005 год этот показатель составил один случай на 1,6 млн доз вакцин.

Успешно снижать частоту возникновения этого осложнения помогает использование инактивированной полиомиелитной вакцины (ИПВ). Она отличается от живой вакцины тем, что содержит не ослабленный живой вирус, а убитый. При этом в организме привитого ИПВ ребенка формируются соответствующие антитела, однако сам вирус не размножается. В США после перехода на вакцинацию только с помощью инактивированной вакцины в 2000 году не было зарегистрировано ни одного случая вакциноассоциированного полиомиелита.

В России после введения первичной вакцинации с помощью ИПВ в 2008 году ежегодное количество случаев подобных осложнений снизилось в 5,9 раза. Впрочем, в 2011 году Минздрав вновь вернул живую вакцину в Национальный календарь прививок — используется она теперь на третьем этапе вакцинации детей. Эксперты ВОЗ отмечали, что это нецелесообразно, так как устойчивый иммунитет формируется уже после первых двух (инактивированных) прививок от полиомиелита.

Может ли прививка быть безопасной?

«Современная вакцинопрофилактика опирается на концепцию безопасной иммунизации.

Безопасная иммунизация — это интегрированный показатель, который свидетельствует о применении качественных, эффективных, безопасных вакцин и безопасного инструментария для их введения, а также о правильной организации системы вакцинопрофилактики.

Она включает в себя обеспечение сохранности и качества вакцин при транспортировке, хранении и применении, порядок и условия проведения иммунизации (место проведения иммунизации, отбор пациентов с учетом медицинских противопоказаний, подготовку вакцинного препарата для введения) с учетом действующих нормативных документов, а также обеспечение безопасности медицинского работника и населения при проведении иммунизации и даже порядок расследования поствакцинальных осложнений» — так ответил Айдар Ишмухаметов на вопрос о том, как можно сделать прививку более безопасной.

Кроме того, несмотря на существующий риск осложнений, вакцинация по-прежнему остается самым эффективным способом борьбы с инфекционными заболеваниями. Так, согласно опубликованному ВОЗ в 2011 году Плану глобальных действий по иммунизации на 2011–2020 годы, прививки способны эффективно контролировать распространение 25% инфекций.

По данным «Краткого отчета об иммунизации» ВОЗ и Детского фонда Организации Объединенных Наций (ЮНИСЕФ) за 2007 год, благодаря вакцинации против четырех болезней — коклюша, дифтерии, столбняка (КДС) и кори — за год было предотвращено более 2,5 млн случаев смерти во всех возрастных группах.

close

100%

Вероятность заболеть или получить осложнения после заболевания в случае с вакцинированными и невакцинированными людьми.

А. Ишмухаметов

В настоящее время ведутся разработки вакцин от таких заболеваний, как лихорадка Эбола и ближневосточный респираторный синдром (вызываемый вирусом MERS). Кроме того, ученые ведут разработку вакцин, помогающих организму бороться с вирусом иммунодефицита человека и даже некоторыми видами рака. Статьи об этом были опубликованы в престижных научных журналах PNAS и Science.

Ответ противникам прививок

«Антипривовочное лобби, действующее во всем мире, опирается на ряд мифов об опасности вакцинации, — комментирует Айрат Ишмухаметов. — Один из них —

миф о высокой частоте и тяжести поствакцинальных осложнений. Миф опровергается реальными данными о частоте осложнений после вакцинации и частоте осложнений после перенесенного заболевания.

Второй миф — это наличие высокотоксичных веществ в вакцинах (фенол, формальдегид, гидроксид алюминия, твин-80, мертиолят). На самом деле современные вакцины содержат эти вещества или в крайне низких концентрациях, которые не могут причинить вред ребенку, или же доказано, что они не оказывают негативного воздействия на здоровье человека. Наличие связи между вакцинацией и синдромом внезапной детской смертности научно не подтверждено.

Есть еще миф о влиянии содержащихся в живых вакцинах иных возбудителей, например вируса SV-40 в живой полиовирусной вакцине, полученной на культуре клеток почек обезьян. Но современные вакцины производятся на перевиваемых культурах клеток, свободных от этого вируса. Кроме того, наблюдения за привитыми в конце 1950-х годов также не выявили этой связи.

Лозунг «Врожденный иммунитет против инфекционных заболеваний» — тоже антинаучный миф. Ребенок защищен материнскими антителами, но очень короткое время — несколько месяцев после рождения. Затем нужна стимуляция его собственной «наивной» иммунной системы, что и достигается путем вакцинации. Проверить наличие так называемого врожденного иммунитета можно только лабораторными методами с помощью определения уровня антител к тому или иному возбудителю или эмпирическим путем — послать ребенка в очаг инфекционного заболевания и посмотреть, что с ним будет, — этого, разумеется, никто не делает.

Незаболевшие непривитые дети обязаны своим благополучием тем детям и их родителям, которые прививают своих детей и обеспечивают тем самым коллективное эпидемиологическое благополучие. Но стоит попасть в такую популяцию инфекционному агенту, как он непременно находит свою жертву — непривитого ребенка.

Существует масса примеров таких ситуаций. Даже в хорошо вакцинированной против полиомиелита популяции России нашлось 14 человек, которые заболели паралитическим полиомиелитом во время заноса дикого вируса во время «таджикской вспышки» в 2010 году. В благополучнейшей и чистейшей Голландии в 1992–1993 годах возникла вспышка (71 случай) полиомиелита в невакцинированной по религиозным причинам группе, в результате которой два человека умерли, 59 — были парализованы».

Впрочем, ничто не мешает опасающимся некоторых вакцин родителям делать прививки своему ребенку по индивидуальной схеме: так, можно заменить живую вакцину от полиомиелита на инактивированную или отказаться от вакцинации против, например, свинки или краснухи до определенного возраста.

Отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель может привести к усилению ответа Т-лимфоцитов CD4

Резюме

Общие сведения

В большинстве эндемичных по туберкулезу стран бацилла Кальметта Герена (БЦЖ) обычно вводится при рождении. предотвратить тяжелую форму туберкулеза у младенцев. Иммунная система новорожденного еще не сформировалась. Наша гипотеза заключалась в том, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до 10-недельного возраста усилит иммунный ответ, индуцированный вакциной.

Методы

В рандомизированном клиническом исследовании БЦЖ вводили внутрикожно либо при рождении (n = 25), либо в возрасте 10 недель (n = 21).Через десять недель после вакцинации и в возрасте 1 года были измерены вакцино-специфические Т-клеточные ответы CD4 и CD8 с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови.

Результаты

Младенцы, получившие отсроченную вакцинацию БЦЖ, демонстрировали более высокую частоту БЦЖ-специфических Т-лимфоцитов CD4, особенно полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, и наиболее заметно в возрасте 1 года.

Выводы

Отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель усиливает количественный и качественный БЦЖ-специфический Т-клеточный ответ при измерении в возрасте одного года.

Ключевые слова: БЦЖ, вакцинация, рождение, отсроченное, полифункциональные Т-лимфоциты CD4

Введение

Бацилла Кальметта Герена (БЦЖ), единственная современная вакцина против туберкулеза (ТБ), представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Ежегодно более 100 миллионов детей во всем мире получают вакцину БЦЖ [1]. Вакцинация БЦЖ обеспечивает защиту от тяжелых форм детского туберкулеза, т. Е. Туберкулезного менингита и милиарного туберкулеза [1, 2]. Защита, обеспечиваемая вакцинацией БЦЖ от легочного туберкулеза, наиболее распространенной формы туберкулеза, неодинакова и в основном низка [3].Факторы, которые участвуют в различной защите БЦЖ от туберкулеза, включают штамм БЦЖ, дозу БЦЖ, предшествующее воздействие нетуберкулезных микобактерий (NTM) из окружающей среды, генетические вариации хозяина, штамм Mycobacterium tuberculosis ( M.tb ) и способ вакцинации. [3–7].

CD4 Т-клетки, которые продуцируют Т-хелперные цитокины типа 1 (Th2) IFN-γ, TNF-α и IL-2, считаются критическими для защиты от туберкулеза [8, 9]. Такой ответ Th2 характерен для вакцинации БЦЖ [10, 11].В регионах, где широко распространен туберкулез, вакцинация БЦЖ широко проводится при рождении или вскоре после него из-за риска раннего контакта с M.tb [12]. Существуют доказательства того, что ответ Th2 при рождении является «незрелым», например, прогрессивное повышение специфического опосредованного клетками Th2 иммунитета было показано, когда вакцина против кори вводилась в возрасте 6, 9 и 12 месяцев соответственно [13]. Мы предположили, что созревание иммунной системы новорожденных до 10-недельного возраста до вакцинации БЦЖ повысит индуцированный вакцинацией Т-клеточный иммунитет.Эффект оптимизации времени вакцинации может иметь важные последствия для улучшения защиты от туберкулеза с помощью вакцинации БЦЖ.

Марчант, и др. сообщил, что изменение возраста вакцинации БЦЖ не влияет на иммуногенность БЦЖ при оценке продукции интерферона гамма (IFN-γ) мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC), стимулированными микобактериальными антигенами [10]. В небольшом исследовании Hussey, et al. также сообщил, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель не влияет на секрецию IFN-γ, пролиферативные ответы или цитотоксический потенциал БЦЖ-специфических Т-клеток после инкубации PBMC с микобактериальными антигенами [14].С тех пор как появились эти результаты, мы показали, что измерение одного IFN-γ недооценивает сложность Th2-ответа, индуцированного БЦЖ. Вакцинация БЦЖ у младенцев индуцирует несколько подмножеств Th2, что определяется экспрессией различных комбинаций IFN-γ, TNF-α и IL-2 специфическими клетками [11]. Мы хотели всесторонне изучить влияние возраста на величину и качество Th2-иммунитета, индуцируемого БЦЖ у младенцев.

Материалы и методы

Набор участников и последующее наблюдение

Участники были зарегистрированы в период с апреля 2006 г. по март 2008 г. в Хайелитше, пригороде Кейптауна с чрезвычайно высокой заболеваемостью туберкулезом, составившей 1614 на 100000 в первом квартале 2008 г. (Уровень уведомления о случаях, город Кейптаун).

Это было частью более крупного исследования, посвященного изучению клинических и иммунологических характеристик новорожденных, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию ВИЧ. Короче говоря, в государственную женскую консультацию к беременным женщинам обращались с просьбой принять их младенцев. Для исследования, представленного здесь, младенцы, которые родились от ВИЧ-инфицированных женщин или женщин с неизвестным ВИЧ-статусом, подвергались активному туберкулезу в домашнем хозяйстве, родились преждевременно (гестационный возраст ≤36 недель) или имели низкую массу тела при рождении (≤2,5 кг), или те, у кого были значительные перинатальные осложнения, были исключены.Кроме того, были исключены все младенцы с положительным ответом IFN-γ на ESAT-6 / CFP-10 в возрасте 10 недель (подробности анализа см. Ниже). Младенцы были случайным образом распределены во время дородового набора для получения вакцины БЦЖ (внутрикожный датский штамм 1331, Statens Serum Institute) в первый день жизни («вакцинация при рождении») или аналогичной вакцинации БЦЖ в возрасте 10 недель («отложенная вакцинация»). Младенцы наблюдались в возрасте 10, 20 и 50 недель. Был разрешен период окна от -2 до +4 недель вокруг посещения 10-й недели (например,г. От 8 до 14 недель). Период времени для 20-недельного посещения составлял от 18 до 28 недель и от 41 до 54 недель для 50-недельного посещения.

Разрешение регулирующих органов было получено от комитетов по этике исследований Стелленбошского и Кейптаунского университетов. Письменное информированное согласие было получено от всех матерей на их родном языке. Все тесты на ВИЧ проводились в сочетании с информированным согласием и консультированием до и после тестирования.

Сбор крови и анализ внутриклеточных цитокинов

Один мл крови собирали в возрасте 10, 20 и 50 недель в гепаринизированные шприцы.Цельную кровь обрабатывали в течение 2 часов после сбора, как описано ранее [15]. Вкратце, 250 мкл цельной крови инкубировали в течение 12 часов при 37 ° C с жизнеспособной БЦЖ (восстановленной из флакона с вакциной, датский штамм, Staten Serum Institute, 1,2 × 10 ⁶ КОЕ / мл) и костимулирующими антителами анти-CD28. и анти-CD49d (BD Biosciences, 0,5 мкг / мл каждый). 250 мкл крови, инкубированной со стафилококковым энтеротоксином B (SEB, Sigma, 10 мкг / мл), и 250 мкл крови, инкубированной только с костимулирующими антителами (нестимулированными), служили в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно.Брефельдин A (Sigma, 10 мкг / мл) добавляли в течение последних 5 часов инкубации. После инкубации эритроциты лизировали и лейкоциты фиксировали лизирующим раствором BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences), а клетки криоконсервировали.

Криоконсервированные клетки позже оттаивали и промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (PBS, BioWhittaker) и повышали проницаемость, используя раствор Perm / Wash Solution (BD Biosciences). Затем клетки окрашивали следующими антителами: анти-CD3 Pacific Blue (клон UCHT1), анти-CD4 PerCPCy5.5 (SK3), анти-CD45RA PECy7 (L48), анти-IFN-γ AlexaFluor700 (B27), анти-IL-2 FITC (5344.111), анти-TNF-α PE (MAb11; все от BD Biosciences), анти- CD8 Qdot605 (3B5, Invitrogen) и анти-CCR7 APC (150503, R&D Systems). После промывок клетки собирали на проточном цитометре LSR II (BD Biosciences), для этого эксперимента использовали 3 лазера и 10 детекторов с использованием программного обеспечения FACS Diva 6.1. Параметры компенсации были установлены с использованием каппа-шариков антимышиных (BD Biosciences), меченных соответствующими антителами, конъюгированными с флуорохромом.Flowjo 8.7.1 (Treestar) использовался для компенсации и анализа данных проточной цитометрии. Для создания комбинаций цитокинов, экспрессирующих субнаборы Т-клеток CD4 и CD8, применяли логическое стробирование ().

Стратегия гейтинга, используемая для анализа Т-клеточных цитокиновых ответов CD4 и CD8

Цельную кровь инкубировали с БЦЖ для завершения проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов, как описано в Методиках.

( A ) Дублетные клетки были исключены путем стробирования по площади прямого рассеяния (FSC-A) против высоты прямого рассеяния (FSC-H), а затем лимфоциты были отобраны в FSC-A против площади бокового рассеяния ( SSC-A) точечный график.Т-клетки отбирали путем стробирования событий CD3 ⁺ , которые далее дифференцировались в Т-клетки CD4 и CD8. ( B) Типичные точечные диаграммы паттернов коэкспрессии цитокинов в CD4 Т-клетках в нестимулированных, стимулированных БЦЖ и SEB условиях.

Анализ интеркуррентной инфекции

M. tuberculosis

В каждый момент времени цельную кровь разбавляли 1: 5 в среде для культивирования тканей RPMI-1640 (Sigma), содержащей 1% L-глутамин (Sigma), и инкубировали с ESAT -6 / CFP-10 слитый белок (предоставлен Томом Оттенхоффом, Медицинский центр Лейденского университета, 10 мкг / мл), фитогемагглютинин (PHA, Sigma, 5 мкг / мл) и SEB (1 мкг / мл; оба положительных контроля) или отсутствие антигена ( отрицательный контроль) в трех экземплярах в 96-луночных планшетах (модифицировано из Black et al ) [16].Планшеты инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 7 дней, супернатанты собирали, три лунки объединяли и хранили при -80 ° C. Позже супернатанты оттаивали, и сэндвич-ELISA на IFN-γ использовали для количественного определения IFN-γ в супернатантах, полученных в результате 7-дневного анализа цельной крови (BD Pharmingen). Положительный ответ IFN-γ был определен как 62 пг / мл после вычитания фона (удвоенный предел обнаружения анализа 31 пг / мл). Младенцы с признаками интеркуррентной инфекции / контакта M. tuberculosis в возрасте 10, 20 или 50 недель были исключены из анализа.

Анализ данных

Для анализа внутриклеточных цитокинов уровни экспрессии цитокинов в нестимулированной крови вычитали из уровней, полученных после стимуляции БЦЖ. (Средний уровень экспрессии IFN-γ, IL-2 и TNF среди Т-лимфоцитов CD4 в нестимулированной крови составлял 0,002%, 0,03% и 0,06% соответственно.) Различия в весе при рождении участников и их поле оценивались с помощью параметрических тестов. U-критерий Манна-Уитни использовался для оценки различий в частотах экспрессии цитокинов CD4 и CD8 Т-клеток между двумя группами.Значения P ниже 0,05 считались значимыми.

Результаты

Характеристики участников

Всего в исследование было включено 46 младенцев: 25 в группе рождения и 21 в группе отсроченной вакцинации. Младенцы, не явившиеся для проведения флеботомии в определенный момент времени, с кровотечением за пределами определенного периода окна на 10 неделе посещения или положительными на инфекцию M.tb , были исключены из анализа (). Результаты для младенцев с инфекцией M.tb были исключены из временной точки, в которой это было диагностировано, и из последующих временных точек.На исходном уровне не наблюдалось различий в массе тела при рождении или полу между группами рождения и отсроченной вакцинации (средний вес при рождении, (стандартное отклонение): 3306 г (435,6) при рождении против 3200 г (371,9) при задержке; p = 0,390). Шестнадцать (64%) младенцев в группе рождения были мальчиками по сравнению с 9 (43%) младенцами в группе отсроченных родов (p = 0,235).

Обзор правомочности, потока исследования и участников

Обнаружение БЦЖ-специфичных CD4 Т-клеток с использованием жизнеспособной БЦЖ в качестве антигена

Перед тем, как сравнивать БЦЖ-индуцированный иммунитет между новорожденными и отложенной вакцинацией, мы оценили, была ли инкубация целых кровь с жизнеспособной БЦЖ может привести к неспецифической активации Т-клеток или к обнаружению вакцино-специфического ответа.Мы сравнили Т-клеточный иммунитет CD4, измеренный в возрасте 10 недель с помощью теста на определение внутриклеточных цитокинов (: пример результатов анализа), между участниками, которые получали БЦЖ при рождении, и теми, кто еще не принимал БЦЖ (младенцы в группе отсроченного приема). . Продукция цитокинов CD4 Т-клетками легко определялась у младенцев из группы, вакцинированной при рождении, но не обнаруживалась или обнаруживалась только на очень низких уровнях у младенцев, не получивших вакцину при рождении (). Младенцы, вакцинированные при рождении, имели высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4, специфичных для БЦЖ, т.е.е. Т-клетки CD4, которые вместе экспрессируют IFN-γ, TNF-α и IL-2, и Т-клетки CD4, экспрессирующие другие комбинации цитокинов Th2. Полифункциональные БЦЖ-специфические CD4 Т-клетки отсутствовали у младенцев в группе отсроченной вакцинации. У всех младенцев был положительный ответ на положительный контроль, SEB (данные не показаны). Мы пришли к выводу, что ответы Т-клеток, измеренные с помощью нашей системы анализа, когда БЦЖ используется в качестве антигена, являются антиген-специфическими, а не обусловлены неспецифической активацией Т-клеток.

Сравнение ответов Т-лимфоцитов CD4 после инкубации цельной крови из крови вакцинированных БЦЖ и невакцинированных младенцев с БЦЖ в возрасте 10 недель

Частоты Т-лимфоцитов CD4, экспрессирующих цитокины, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови (см. Методы) показаны.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация привела к умеренно более высокой частоте БЦЖ-специфичных Т-клеток CD4 через 10 недель после вакцинации

Для оценки различий в ответах Т-лимфоцитов CD4 и CD8 при вакцинации при рождении или в возрасте 10 недель мы измерили Паттерн экспрессии Th2-цитокинов, индуцированный БЦЖ через 10 недель после вакцинации, т.е.е., в возрасте 10 недель в группе рождения и в возрасте 20 недель в группе отсроченного рождения. В обеих группах наблюдались высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4 или клеток, экспрессирующих другие комбинации цитокинов Th2 (). Частота встречаемости IFN-γ ⁺ и IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ BCG-специфичных CD4 Т-клеток была значительно выше в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении (). Поскольку частота индуцированных специфических субпопуляций CD8 Т-лимфоцитов была очень низкой, в обеих группах вакцинации оценивались только общие БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы CD8: не было никакой разницы между двумя группами ().Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ на 10 недель может привести к увеличению частоты БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток через 10 недель после вакцинации.

БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы через 10 недель после вакцинации у младенцев, получавших БЦЖ при рождении и тех, кто получил БЦЖ в возрасте 10 недель

(A) Частоты БЦЖ-специфических цитокинов, экспрессирующих Т-клетки CD4, показаны в виде обнаруживается с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (B) Частоты всех экспрессирующих CD8 Т-клеток, оцененные вместе, после инкубации цельной крови с БЦЖ.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация увеличивала частоту полифункциональных БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток в возрасте одного года

Мы также сравнили БЦЖ-специфический ответ памяти в возрасте 50 недель. Мы наблюдали значительно более высокие частоты БЦЖ-специфичных полифункциональных IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ CD4 Т-клеток в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении ().Частоты специфических субпопуляций Т-клеток, коэкспрессирующих TNF-α и IL-2, TNF-α и IFN-γ или только TNF-α, также были выше в группе отсроченной вакцинации. В этом возрасте общие ответы Т-лимфоцитов CD8, специфичные для БЦЖ, были слишком низкими для надежного анализа данных (данные не показаны). При сравнении ответов на положительный контроль, SEB, различий между двумя группами не наблюдалось (дополнительная фигура 1). Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до возраста 10 недель приводит к количественному увеличению и качественно более оптимальному БЦЖ-специфическому ответу памяти CD4 Т-клеток в возрасте одного года.

БЦЖ-специфические ответы Т-лимфоцитов CD4 в 2 группах младенцев в возрасте 1 года

Показаны частоты цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Пик общего БЦЖ-специфического ответа Т-лимфоцитов CD4 достигается через 10 недель после вакцинации в группах родов и отсроченной вакцинации. через 10 недель мы измерили общий ответ памяти Т-лимфоцитов CD4, специфичный для БЦЖ, в возрасте 10, 20 и 50 недель.Общие ответы обозначаются БЦЖ-специфическими CD4 Т-клетками, которые экспрессируют IFN-γ, TNF-α или IL-2, по отдельности или в комбинации. В группах родов и отсроченной вакцинации БЦЖ-специфические ответы CD4 достигли пика через 10 недель после вакцинации и постепенно уменьшались в течение первого года жизни ().

Кинетика общих БЦЖ-специфичных ответов Т-лимфоцитов CD4 в группах отсроченной вакцинации и вакцинации при рождении в течение одного года

Средние частоты БЦЖ-специфичных общих цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженных с помощью краткосрочного анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови при 10, Возраст 20 и 50 недель.

Сопоставимый БЦЖ-специфический фенотип памяти Т-лимфоцитов CD4 в группах рождения и отсроченной вакцинации

Чтобы оценить, приводит ли отсрочка вакцинации БЦЖ к измененному вакцино-специфическому фенотипу памяти Т-клеток CD4, мы охарактеризовали цитокин, экспрессирующий БЦЖ-специфические Т-клетки. Фенотип памяти специфических Т-клеток, определяемый поверхностной экспрессией CD45RA и CCR7, на животных моделях, как было показано, определяет исход вакцинации [17]. Как в группе вакцинации при рождении, так и в группе отсроченной вакцинации эффекторная память (CD45RA-CCR7-, T _EM ) преобладала и во всех временных точках оценивалась (для данных в возрасте 1 года).В возрасте одного года не было значительных различий для T _EM или центральной памяти (T _CM , CD45RA ^— CCR7 ⁺ ) в двух младенческих группах ().

Сравнение фенотипа поверхностной памяти БЦЖ-специфических CD4 T-клеток между двумя группами младенцев в возрасте 1 года

Антигенспецифические CD4 T-клетки были идентифицированы по экспрессии цитокинов с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (A) Графики в виде прямоугольников и усов, изображающие фенотип памяти всех BCG-специфичных CD4 T-клеток, проанализированных вместе.(B) Репрезентативные точечные графики поверхностного фенотипа БЦЖ-специфических CD4 T-клеток (точки), наложенные на поверхностный фенотип памяти всех CD4 T-клеток (контурные графики). Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Обсуждение

Наше исследование показало, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель приводит к индукции более высокой частоты детектируемых специфических Т-лимфоцитов CD4.Кроме того, специфические CD4 Т-клетки с большей вероятностью будут полифункциональными в группе отсроченной вакцины, что указывает на повышение «качества» индуцированного БЦЖ ответа.

Наши результаты отличаются от результатов двух предыдущих исследований, в которых не было выявлено различий в индуцированном иммунитете, когда вакцинация БЦЖ откладывалась после периода ближайшего новорожденного [10, 14]. Важно отметить, что в обоих этих исследованиях в качестве результата использовалось только измерение IFN-γ. Наши результаты показывают, что подробное изучение ответа Т-лимфоцитов позволяет провести более полную и контрастную оценку результата.Мы показали, что наиболее разительные различия в индуцированном иммунитете наблюдались в возрасте 1 года, что подчеркнуло важность лонгитюдного дизайна таких исследований. Данные о кинетике иммунного ответа, индуцированного БЦЖ, в детских когортах ограничены, особенно в условиях высокой эндемичности по ТБ.

Иммунные корреляты защиты от туберкулеза, вызванной вакцинацией, неизвестны. Следовательно, остается вопрос, могут ли частоты конкретных клеток, паттерны продукции цитокинов и фенотип памяти важны для долгосрочной защиты от туберкулеза.Большинство вакцинологов сочли бы более оптимальным количественно более высокий антиген-специфический ответ после новой вакцинации против туберкулеза в клинических испытаниях. Это мнение было подтверждено многочисленными исследованиями на животных, которые продемонстрировали, что более высокая частота специфических Т-клеток приводит к улучшенной защите от ТБ [18–20]. Напротив, другие исследования показали, что частота антиген-специфических Т-клеток, индуцированных противотуберкулезной вакциной, не обязательно может коррелировать с исходом после вирулентного M.tb [21–24]. Переменные дизайна исследования, такие как оцениваемый момент времени и проанализированный отсек, могут быть ответственны за эти противоречивые результаты. Кроме того, во многих из этих исследований оценивались специфические ответы Т-клеток только за счет продукции IFN-γ. Защита от ТБ без оптимального ответа IFN-γ невозможна. Однако постулируется, что измерение других цитокинов Th2 в дополнение к IFN-γ позволит лучше оценить «качество» Т-клеточного ответа. Например, наличие полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, стало полезным показателем «качественных» иммунных ответов [25, 26].В моделях вакцинации животных против Leishmania major [27] и против туберкулеза [28] стратегии, которые вызывают наибольшую частоту полифункциональных антиген-специфических CD4 Т-клеток, связаны с наилучшей защитой от последующего заражения патогеном. Кроме того, у людей, инфицированных ВИЧ-1, медленное прогрессирование заболевания тесно связано с более высокой частотой полифункциональных ВИЧ-специфических Т-клеток [29].

Классически CD45RA и CCR7 использовались для разделения Т-клеток на 4 подмножества памяти, а именно на наивные клетки (CD45RA ⁺ CCR7 ⁺ , T _Naive ), клетки центральной памяти (CD45RA ^— CCR7 ⁺ , T _CM ), эффекторные клетки памяти (CD45RA ^— CCR7 ^— , T _EM ) и эффекторные клетки памяти, которые повторно экспрессировали CD45RA (CD45RA ⁺ CCR7 ^— , T _EMRA ) [30, 31].Долгоживущие T _CM расширяются в лимфатических узлах и дифференцируются в эффекторные клетки [30]. Напротив, T _EM или более терминально дифференцированные популяции T _EMRA могут немедленно стать домом для эффекторных функций, но их пролиферативная способность и продолжительность жизни ограничены [30]. С гипотетической точки зрения, индукция долгоживущего T _CM должна быть целью вакцинации — эта точка зрения была подтверждена на животных моделях заражения макак вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) [17].Напротив, индукция T _EM или T _EMRA может быть не столь оптимальной, поскольку эти короткоживущие популяции не могут расширяться и более склонны к истощению [32]. Интересно, что в большинстве исследований Т-клеток человека, специфичных к микобактериям, преобладают популяции T _EM и относительно нечасто T _CM [11, 33–35]. Наши выводы подтверждают это; однако не было значительных различий в этих субпопуляциях Т-клеток после отсрочки вакцинации БЦЖ.

Считается, что на иммунитет, индуцированный БЦЖ, влияют многие переменные, как описано во введении выше.Например, Lalor и др. [36] сообщили, что сезонные изменения влияют на ответ IFN-γ у младенцев, вакцинированных БЦЖ, при измерении с помощью стимуляции PPD цельной крови в течение 6 дней. В нашем исследовании в возрасте 50 недель, когда наблюдались наиболее значимые различия в иммунитете, специфичном для БЦЖ, не было значительной разницы в распределении сезона родов между группами отсроченной вакцинации и вакцинацией при рождении. Кроме того, возможно, что различное воздействие микобактерий окружающей среды могло искажать наши результаты, хотя мы считаем это маловероятным, поскольку все младенцы были зачислены из одной географической области.Мы не можем исключить, что другие переменные могли повлиять на результаты.

Почему после отложенной вакцинации БЦЖ иммунный ответ усилился? Иммунный ответ новорожденного часто считается «незрелым» по сравнению с иммунным ответом взрослых [37]. «Незрелый» может быть неправильным названием, поскольку ответ может быть очень подходящим для ребенка, попадающего в мир непрерывного антигенного воздействия, и где чрезмерный иммунитет к этим стимулам может быть вредным. Однако это может привести к неоптимальному ответу на определенные вакцины, такие как БЦЖ.Мы предполагаем, что различная природа иммунитета, индуцированного БЦЖ в возрасте 10 недель, по сравнению с рождением, может быть приписана ранним «созревающим» изменениям иммунитета младенца. Существуют очень ограниченные данные о «созревании» иммунного ответа младенца в течение первых нескольких месяцев жизни, но факторы, которые, возможно, способствовали этому, включают неэффективную функцию антигенпредставляющих клеток, в том числе ограниченную способность продуцировать IL-12 [37], критический цитокин для индукция ответов Th2, характерных для успешного микобактериального иммунитета.Кроме того, данные животных и людей свидетельствуют о том, что иммунная система новорожденного смещена в сторону ответа Th3 [38-40], который может подавлять индукцию иммунитета Th2.

В отличие от многих детских вакцин, которые обеспечивают повышенную защиту при бустинге, было показано, что вторая вакцинация БЦЖ не усиливает защиту [41]. Новые стратегии вакцинации против туберкулеза направлены на повышение иммунитета, вызванного вакциной БЦЖ, за счет использования гетерологичных вакцин. Поэтому крайне важно использовать первичную вакцину наиболее оптимальным образом.Наши результаты показывают, что возраст, в котором вводят БЦЖ, может быть критической переменной. Следующим шагом будет подтверждение этих результатов в другой когорте до проведения более крупных исследований, чтобы оценить, приводит ли отсроченная вакцинация к усилению защиты от заболевания туберкулезом. В этом случае потребуется всесторонняя оценка последствий отсрочки вакцинации БЦЖ до возраста 6–14 недель, когда другие детские вакцины вводятся регулярно.

Отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до 10-недельного возраста может привести к усилению Т-клеточного ответа CD4

Резюме

Общие сведения

В большинстве эндемичных по туберкулезу стран бацилла Кальметта Герена (БЦЖ) обычно вводится при рождении для предотвращения тяжелой формы туберкулеза у младенцев.Иммунная система новорожденного еще не сформировалась. Наша гипотеза заключалась в том, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до 10-недельного возраста усилит иммунный ответ, индуцированный вакциной.

Методы

В рандомизированном клиническом исследовании БЦЖ вводили внутрикожно либо при рождении (n = 25), либо в возрасте 10 недель (n = 21). Через десять недель после вакцинации и в возрасте 1 года были измерены вакцино-специфические Т-клеточные ответы CD4 и CD8 с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови.

Результаты

Младенцы, получившие отсроченную вакцинацию БЦЖ, демонстрировали более высокую частоту БЦЖ-специфических Т-лимфоцитов CD4, особенно полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, и наиболее заметно в возрасте 1 года.

Выводы

Отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель усиливает количественный и качественный БЦЖ-специфический Т-клеточный ответ при измерении в возрасте одного года.

Ключевые слова: БЦЖ, вакцинация, рождение, отсроченное, полифункциональные Т-лимфоциты CD4

Введение

Бацилла Кальметта Герена (БЦЖ), единственная современная вакцина против туберкулеза (ТБ), представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Ежегодно более 100 миллионов детей во всем мире получают вакцину БЦЖ [1].Вакцинация БЦЖ обеспечивает защиту от тяжелых форм детского туберкулеза, т. Е. Туберкулезного менингита и милиарного туберкулеза [1, 2]. Защита, обеспечиваемая вакцинацией БЦЖ от легочного туберкулеза, наиболее распространенной формы туберкулеза, неодинакова и в основном низка [3]. Факторы, которые участвуют в различной защите БЦЖ от туберкулеза, включают штамм БЦЖ, дозу БЦЖ, предшествующее воздействие нетуберкулезных микобактерий (NTM) из окружающей среды, генетические вариации хозяина, штамм Mycobacterium tuberculosis ( M.tb ) и способ вакцинации. [3–7].

CD4 Т-клетки, которые продуцируют Т-хелперные цитокины типа 1 (Th2) IFN-γ, TNF-α и IL-2, считаются критическими для защиты от туберкулеза [8, 9]. Такой ответ Th2 характерен для вакцинации БЦЖ [10, 11]. В регионах, где широко распространен туберкулез, вакцинация БЦЖ широко проводится при рождении или вскоре после него из-за риска раннего контакта с M.tb [12]. Существуют доказательства того, что ответ Th2 при рождении является «незрелым», например, прогрессивное повышение специфического опосредованного клетками Th2 иммунитета было показано, когда вакцина против кори вводилась в возрасте 6, 9 и 12 месяцев соответственно [13].Мы предположили, что созревание иммунной системы новорожденных до 10-недельного возраста до вакцинации БЦЖ повысит индуцированный вакцинацией Т-клеточный иммунитет. Эффект оптимизации времени вакцинации может иметь важные последствия для улучшения защиты от туберкулеза с помощью вакцинации БЦЖ.

Марчант, и др. сообщил, что изменение возраста вакцинации БЦЖ не влияет на иммуногенность БЦЖ при оценке продукции интерферона гамма (IFN-γ) мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC), стимулированными микобактериальными антигенами [10].В небольшом исследовании Hussey, et al. также сообщил, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель не влияет на секрецию IFN-γ, пролиферативные ответы или цитотоксический потенциал БЦЖ-специфических Т-клеток после инкубации PBMC с микобактериальными антигенами [14]. С тех пор как появились эти результаты, мы показали, что измерение одного IFN-γ недооценивает сложность Th2-ответа, индуцированного БЦЖ. Вакцинация БЦЖ у младенцев индуцирует несколько подмножеств Th2, что определяется экспрессией различных комбинаций IFN-γ, TNF-α и IL-2 специфическими клетками [11].Мы хотели всесторонне изучить влияние возраста на величину и качество Th2-иммунитета, индуцируемого БЦЖ у младенцев.

Материалы и методы

Набор участников и последующее наблюдение

Участники были зарегистрированы в период с апреля 2006 г. по март 2008 г. в Хайелитше, пригороде Кейптауна с чрезвычайно высокой заболеваемостью туберкулезом, составившей 1614 на 100000 в первом квартале 2008 г. (Уровень уведомления о случаях, город Кейптаун).

Это было частью более крупного исследования, посвященного изучению клинических и иммунологических характеристик новорожденных, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию ВИЧ.Короче говоря, в государственную женскую консультацию к беременным женщинам обращались с просьбой принять их младенцев. Для исследования, представленного здесь, младенцы, которые родились от ВИЧ-инфицированных женщин или женщин с неизвестным ВИЧ-статусом, подвергались активному туберкулезу в домашнем хозяйстве, родились преждевременно (гестационный возраст ≤36 недель) или имели низкую массу тела при рождении (≤2,5 кг), или те, у кого были значительные перинатальные осложнения, были исключены. Кроме того, были исключены все младенцы с положительным ответом IFN-γ на ESAT-6 / CFP-10 в возрасте 10 недель (подробности анализа см. Ниже).Младенцы были случайным образом распределены во время дородового набора для получения вакцины БЦЖ (внутрикожный датский штамм 1331, Statens Serum Institute) в первый день жизни («вакцинация при рождении») или аналогичной вакцинации БЦЖ в возрасте 10 недель («отложенная вакцинация»). Младенцы наблюдались в возрасте 10, 20 и 50 недель. Был разрешен период окна от -2 до +4 недель вокруг визита на 10 неделе (например, от 8 до 14 недель). Период времени для 20-недельного посещения составлял от 18 до 28 недель и от 41 до 54 недель для 50-недельного посещения.

Разрешение регулирующих органов было получено от комитетов по этике исследований Стелленбошского и Кейптаунского университетов. Письменное информированное согласие было получено от всех матерей на их родном языке. Все тесты на ВИЧ проводились в сочетании с информированным согласием и консультированием до и после тестирования.

Сбор крови и анализ внутриклеточных цитокинов

Один мл крови собирали в возрасте 10, 20 и 50 недель в гепаринизированные шприцы. Цельную кровь обрабатывали в течение 2 часов после сбора, как описано ранее [15].Вкратце, 250 мкл цельной крови инкубировали в течение 12 часов при 37 ° C с жизнеспособной БЦЖ (восстановленной из флакона с вакциной, датский штамм, Staten Serum Institute, 1,2 × 10 ⁶ КОЕ / мл) и костимулирующими антителами анти-CD28. и анти-CD49d (BD Biosciences, 0,5 мкг / мл каждый). 250 мкл крови, инкубированной со стафилококковым энтеротоксином B (SEB, Sigma, 10 мкг / мл), и 250 мкл крови, инкубированной только с костимулирующими антителами (нестимулированными), служили в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Брефельдин A (Sigma, 10 мкг / мл) добавляли в течение последних 5 часов инкубации.После инкубации эритроциты лизировали и лейкоциты фиксировали лизирующим раствором BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences), а клетки криоконсервировали.

Криоконсервированные клетки позже оттаивали и промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (PBS, BioWhittaker) и повышали проницаемость, используя раствор Perm / Wash Solution (BD Biosciences). Затем клетки окрашивали следующими антителами: анти-CD3 Pacific Blue (клон UCHT1), анти-CD4 PerCPCy5.5 (SK3), анти-CD45RA PECy7 (L48), анти-IFN-γ AlexaFluor700 (B27), анти-IL. -2 FITC (5344.111), анти-TNF-α PE (MAb11; все от BD Biosciences), анти-CD8 Qdot605 (3B5, Invitrogen) и анти-CCR7 APC (150503, R&D Systems). После промывок клетки собирали на проточном цитометре LSR II (BD Biosciences), для этого эксперимента использовали 3 лазера и 10 детекторов с использованием программного обеспечения FACS Diva 6.1. Параметры компенсации были установлены с использованием каппа-шариков антимышиных (BD Biosciences), меченных соответствующими антителами, конъюгированными с флуорохромом. Flowjo 8.7.1 (Treestar) использовался для компенсации и анализа данных проточной цитометрии.Для создания комбинаций цитокинов, экспрессирующих субнаборы Т-клеток CD4 и CD8, применяли логическое стробирование ().

Стратегия гейтинга, используемая для анализа Т-клеточных цитокиновых ответов CD4 и CD8

Цельную кровь инкубировали с БЦЖ для завершения проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов, как описано в Методиках.

( A ) Дублетные клетки были исключены путем стробирования по площади прямого рассеяния (FSC-A) против высоты прямого рассеяния (FSC-H), а затем лимфоциты были отобраны в FSC-A против площади бокового рассеяния ( SSC-A) точечный график.Т-клетки отбирали путем стробирования событий CD3 ⁺ , которые далее дифференцировались в Т-клетки CD4 и CD8. ( B) Типичные точечные диаграммы паттернов коэкспрессии цитокинов в CD4 Т-клетках в нестимулированных, стимулированных БЦЖ и SEB условиях.

Анализ интеркуррентной инфекции

M. tuberculosis

В каждый момент времени цельную кровь разбавляли 1: 5 в среде для культивирования тканей RPMI-1640 (Sigma), содержащей 1% L-глутамин (Sigma), и инкубировали с ESAT -6 / CFP-10 слитый белок (предоставлен Томом Оттенхоффом, Медицинский центр Лейденского университета, 10 мкг / мл), фитогемагглютинин (PHA, Sigma, 5 мкг / мл) и SEB (1 мкг / мл; оба положительных контроля) или отсутствие антигена ( отрицательный контроль) в трех экземплярах в 96-луночных планшетах (модифицировано из Black et al ) [16].Планшеты инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 7 дней, супернатанты собирали, три лунки объединяли и хранили при -80 ° C. Позже супернатанты оттаивали, и сэндвич-ELISA на IFN-γ использовали для количественного определения IFN-γ в супернатантах, полученных в результате 7-дневного анализа цельной крови (BD Pharmingen). Положительный ответ IFN-γ был определен как 62 пг / мл после вычитания фона (удвоенный предел обнаружения анализа 31 пг / мл). Младенцы с признаками интеркуррентной инфекции / контакта M. tuberculosis в возрасте 10, 20 или 50 недель были исключены из анализа.

Анализ данных

Для анализа внутриклеточных цитокинов уровни экспрессии цитокинов в нестимулированной крови вычитали из уровней, полученных после стимуляции БЦЖ. (Средний уровень экспрессии IFN-γ, IL-2 и TNF среди Т-лимфоцитов CD4 в нестимулированной крови составлял 0,002%, 0,03% и 0,06% соответственно.) Различия в весе при рождении участников и их поле оценивались с помощью параметрических тестов. U-критерий Манна-Уитни использовался для оценки различий в частотах экспрессии цитокинов CD4 и CD8 Т-клеток между двумя группами.Значения P ниже 0,05 считались значимыми.

Результаты

Характеристики участников

Всего в исследование было включено 46 младенцев: 25 в группе рождения и 21 в группе отсроченной вакцинации. Младенцы, не явившиеся для проведения флеботомии в определенный момент времени, с кровотечением за пределами определенного периода окна на 10 неделе посещения или положительными на инфекцию M.tb , были исключены из анализа (). Результаты для младенцев с инфекцией M.tb были исключены из временной точки, в которой это было диагностировано, и из последующих временных точек.На исходном уровне не наблюдалось различий в массе тела при рождении или полу между группами рождения и отсроченной вакцинации (средний вес при рождении, (стандартное отклонение): 3306 г (435,6) при рождении против 3200 г (371,9) при задержке; p = 0,390). Шестнадцать (64%) младенцев в группе рождения были мальчиками по сравнению с 9 (43%) младенцами в группе отсроченных родов (p = 0,235).

Обзор правомочности, потока исследования и участников

Обнаружение БЦЖ-специфичных CD4 Т-клеток с использованием жизнеспособной БЦЖ в качестве антигена

Перед тем, как сравнивать БЦЖ-индуцированный иммунитет между новорожденными и отложенной вакцинацией, мы оценили, была ли инкубация целых кровь с жизнеспособной БЦЖ может привести к неспецифической активации Т-клеток или к обнаружению вакцино-специфического ответа.Мы сравнили Т-клеточный иммунитет CD4, измеренный в возрасте 10 недель с помощью теста на определение внутриклеточных цитокинов (: пример результатов анализа), между участниками, которые получали БЦЖ при рождении, и теми, кто еще не принимал БЦЖ (младенцы в группе отсроченного приема). . Продукция цитокинов CD4 Т-клетками легко определялась у младенцев из группы, вакцинированной при рождении, но не обнаруживалась или обнаруживалась только на очень низких уровнях у младенцев, не получивших вакцину при рождении (). Младенцы, вакцинированные при рождении, имели высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4, специфичных для БЦЖ, т.е.е. Т-клетки CD4, которые вместе экспрессируют IFN-γ, TNF-α и IL-2, и Т-клетки CD4, экспрессирующие другие комбинации цитокинов Th2. Полифункциональные БЦЖ-специфические CD4 Т-клетки отсутствовали у младенцев в группе отсроченной вакцинации. У всех младенцев был положительный ответ на положительный контроль, SEB (данные не показаны). Мы пришли к выводу, что ответы Т-клеток, измеренные с помощью нашей системы анализа, когда БЦЖ используется в качестве антигена, являются антиген-специфическими, а не обусловлены неспецифической активацией Т-клеток.

Сравнение ответов Т-лимфоцитов CD4 после инкубации цельной крови из крови вакцинированных БЦЖ и невакцинированных младенцев с БЦЖ в возрасте 10 недель

Частоты Т-лимфоцитов CD4, экспрессирующих цитокины, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови (см. Методы) показаны.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация привела к умеренно более высокой частоте БЦЖ-специфичных Т-клеток CD4 через 10 недель после вакцинации

Для оценки различий в ответах Т-лимфоцитов CD4 и CD8 при вакцинации при рождении или в возрасте 10 недель мы измерили Паттерн экспрессии Th2-цитокинов, индуцированный БЦЖ через 10 недель после вакцинации, т.е.е., в возрасте 10 недель в группе рождения и в возрасте 20 недель в группе отсроченного рождения. В обеих группах наблюдались высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4 или клеток, экспрессирующих другие комбинации цитокинов Th2 (). Частота встречаемости IFN-γ ⁺ и IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ BCG-специфичных CD4 Т-клеток была значительно выше в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении (). Поскольку частота индуцированных специфических субпопуляций CD8 Т-лимфоцитов была очень низкой, в обеих группах вакцинации оценивались только общие БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы CD8: не было никакой разницы между двумя группами ().Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ на 10 недель может привести к увеличению частоты БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток через 10 недель после вакцинации.

БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы через 10 недель после вакцинации у младенцев, получавших БЦЖ при рождении и тех, кто получил БЦЖ в возрасте 10 недель

(A) Частоты БЦЖ-специфических цитокинов, экспрессирующих Т-клетки CD4, показаны в виде обнаруживается с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (B) Частоты всех экспрессирующих CD8 Т-клеток, оцененные вместе, после инкубации цельной крови с БЦЖ.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация увеличивала частоту полифункциональных БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток в возрасте одного года

Мы также сравнили БЦЖ-специфический ответ памяти в возрасте 50 недель. Мы наблюдали значительно более высокие частоты БЦЖ-специфичных полифункциональных IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ CD4 Т-клеток в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении ().Частоты специфических субпопуляций Т-клеток, коэкспрессирующих TNF-α и IL-2, TNF-α и IFN-γ или только TNF-α, также были выше в группе отсроченной вакцинации. В этом возрасте общие ответы Т-лимфоцитов CD8, специфичные для БЦЖ, были слишком низкими для надежного анализа данных (данные не показаны). При сравнении ответов на положительный контроль, SEB, различий между двумя группами не наблюдалось (дополнительная фигура 1). Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до возраста 10 недель приводит к количественному увеличению и качественно более оптимальному БЦЖ-специфическому ответу памяти CD4 Т-клеток в возрасте одного года.

БЦЖ-специфические ответы Т-лимфоцитов CD4 в 2 группах младенцев в возрасте 1 года

Показаны частоты цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Пик общего БЦЖ-специфического ответа Т-лимфоцитов CD4 достигается через 10 недель после вакцинации в группах родов и отсроченной вакцинации. через 10 недель мы измерили общий ответ памяти Т-лимфоцитов CD4, специфичный для БЦЖ, в возрасте 10, 20 и 50 недель.Общие ответы обозначаются БЦЖ-специфическими CD4 Т-клетками, которые экспрессируют IFN-γ, TNF-α или IL-2, по отдельности или в комбинации. В группах родов и отсроченной вакцинации БЦЖ-специфические ответы CD4 достигли пика через 10 недель после вакцинации и постепенно уменьшались в течение первого года жизни ().

Кинетика общих БЦЖ-специфичных ответов Т-лимфоцитов CD4 в группах отсроченной вакцинации и вакцинации при рождении в течение одного года

Средние частоты БЦЖ-специфичных общих цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженных с помощью краткосрочного анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови при 10, Возраст 20 и 50 недель.

Сопоставимый БЦЖ-специфический фенотип памяти Т-лимфоцитов CD4 в группах рождения и отсроченной вакцинации

Чтобы оценить, приводит ли отсрочка вакцинации БЦЖ к измененному вакцино-специфическому фенотипу памяти Т-клеток CD4, мы охарактеризовали цитокин, экспрессирующий БЦЖ-специфические Т-клетки. Фенотип памяти специфических Т-клеток, определяемый поверхностной экспрессией CD45RA и CCR7, на животных моделях, как было показано, определяет исход вакцинации [17]. Как в группе вакцинации при рождении, так и в группе отсроченной вакцинации эффекторная память (CD45RA-CCR7-, T _EM ) преобладала и во всех временных точках оценивалась (для данных в возрасте 1 года).В возрасте одного года не было значительных различий для T _EM или центральной памяти (T _CM , CD45RA ^— CCR7 ⁺ ) в двух младенческих группах ().

Сравнение фенотипа поверхностной памяти БЦЖ-специфических CD4 T-клеток между двумя группами младенцев в возрасте 1 года

Антигенспецифические CD4 T-клетки были идентифицированы по экспрессии цитокинов с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (A) Графики в виде прямоугольников и усов, изображающие фенотип памяти всех BCG-специфичных CD4 T-клеток, проанализированных вместе.(B) Репрезентативные точечные графики поверхностного фенотипа БЦЖ-специфических CD4 T-клеток (точки), наложенные на поверхностный фенотип памяти всех CD4 T-клеток (контурные графики). Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Обсуждение

Наше исследование показало, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель приводит к индукции более высокой частоты детектируемых специфических Т-лимфоцитов CD4.Кроме того, специфические CD4 Т-клетки с большей вероятностью будут полифункциональными в группе отсроченной вакцины, что указывает на повышение «качества» индуцированного БЦЖ ответа.

Наши результаты отличаются от результатов двух предыдущих исследований, в которых не было выявлено различий в индуцированном иммунитете, когда вакцинация БЦЖ откладывалась после периода ближайшего новорожденного [10, 14]. Важно отметить, что в обоих этих исследованиях в качестве результата использовалось только измерение IFN-γ. Наши результаты показывают, что подробное изучение ответа Т-лимфоцитов позволяет провести более полную и контрастную оценку результата.Мы показали, что наиболее разительные различия в индуцированном иммунитете наблюдались в возрасте 1 года, что подчеркнуло важность лонгитюдного дизайна таких исследований. Данные о кинетике иммунного ответа, индуцированного БЦЖ, в детских когортах ограничены, особенно в условиях высокой эндемичности по ТБ.

Иммунные корреляты защиты от туберкулеза, вызванной вакцинацией, неизвестны. Следовательно, остается вопрос, могут ли частоты конкретных клеток, паттерны продукции цитокинов и фенотип памяти важны для долгосрочной защиты от туберкулеза.Большинство вакцинологов сочли бы более оптимальным количественно более высокий антиген-специфический ответ после новой вакцинации против туберкулеза в клинических испытаниях. Это мнение было подтверждено многочисленными исследованиями на животных, которые продемонстрировали, что более высокая частота специфических Т-клеток приводит к улучшенной защите от ТБ [18–20]. Напротив, другие исследования показали, что частота антиген-специфических Т-клеток, индуцированных противотуберкулезной вакциной, не обязательно может коррелировать с исходом после вирулентного M.tb [21–24]. Переменные дизайна исследования, такие как оцениваемый момент времени и проанализированный отсек, могут быть ответственны за эти противоречивые результаты. Кроме того, во многих из этих исследований оценивались специфические ответы Т-клеток только за счет продукции IFN-γ. Защита от ТБ без оптимального ответа IFN-γ невозможна. Однако постулируется, что измерение других цитокинов Th2 в дополнение к IFN-γ позволит лучше оценить «качество» Т-клеточного ответа. Например, наличие полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, стало полезным показателем «качественных» иммунных ответов [25, 26].В моделях вакцинации животных против Leishmania major [27] и против туберкулеза [28] стратегии, которые вызывают наибольшую частоту полифункциональных антиген-специфических CD4 Т-клеток, связаны с наилучшей защитой от последующего заражения патогеном. Кроме того, у людей, инфицированных ВИЧ-1, медленное прогрессирование заболевания тесно связано с более высокой частотой полифункциональных ВИЧ-специфических Т-клеток [29].

Классически CD45RA и CCR7 использовались для разделения Т-клеток на 4 подмножества памяти, а именно на наивные клетки (CD45RA ⁺ CCR7 ⁺ , T _Naive ), клетки центральной памяти (CD45RA ^— CCR7 ⁺ , T _CM ), эффекторные клетки памяти (CD45RA ^— CCR7 ^— , T _EM ) и эффекторные клетки памяти, которые повторно экспрессировали CD45RA (CD45RA ⁺ CCR7 ^— , T _EMRA ) [30, 31].Долгоживущие T _CM расширяются в лимфатических узлах и дифференцируются в эффекторные клетки [30]. Напротив, T _EM или более терминально дифференцированные популяции T _EMRA могут немедленно стать домом для эффекторных функций, но их пролиферативная способность и продолжительность жизни ограничены [30]. С гипотетической точки зрения, индукция долгоживущего T _CM должна быть целью вакцинации — эта точка зрения была подтверждена на животных моделях заражения макак вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) [17].Напротив, индукция T _EM или T _EMRA может быть не столь оптимальной, поскольку эти короткоживущие популяции не могут расширяться и более склонны к истощению [32]. Интересно, что в большинстве исследований Т-клеток человека, специфичных к микобактериям, преобладают популяции T _EM и относительно нечасто T _CM [11, 33–35]. Наши выводы подтверждают это; однако не было значительных различий в этих субпопуляциях Т-клеток после отсрочки вакцинации БЦЖ.

Считается, что на иммунитет, индуцированный БЦЖ, влияют многие переменные, как описано во введении выше.Например, Lalor и др. [36] сообщили, что сезонные изменения влияют на ответ IFN-γ у младенцев, вакцинированных БЦЖ, при измерении с помощью стимуляции PPD цельной крови в течение 6 дней. В нашем исследовании в возрасте 50 недель, когда наблюдались наиболее значимые различия в иммунитете, специфичном для БЦЖ, не было значительной разницы в распределении сезона родов между группами отсроченной вакцинации и вакцинацией при рождении. Кроме того, возможно, что различное воздействие микобактерий окружающей среды могло искажать наши результаты, хотя мы считаем это маловероятным, поскольку все младенцы были зачислены из одной географической области.Мы не можем исключить, что другие переменные могли повлиять на результаты.

Почему после отложенной вакцинации БЦЖ иммунный ответ усилился? Иммунный ответ новорожденного часто считается «незрелым» по сравнению с иммунным ответом взрослых [37]. «Незрелый» может быть неправильным названием, поскольку ответ может быть очень подходящим для ребенка, попадающего в мир непрерывного антигенного воздействия, и где чрезмерный иммунитет к этим стимулам может быть вредным. Однако это может привести к неоптимальному ответу на определенные вакцины, такие как БЦЖ.Мы предполагаем, что различная природа иммунитета, индуцированного БЦЖ в возрасте 10 недель, по сравнению с рождением, может быть приписана ранним «созревающим» изменениям иммунитета младенца. Существуют очень ограниченные данные о «созревании» иммунного ответа младенца в течение первых нескольких месяцев жизни, но факторы, которые, возможно, способствовали этому, включают неэффективную функцию антигенпредставляющих клеток, в том числе ограниченную способность продуцировать IL-12 [37], критический цитокин для индукция ответов Th2, характерных для успешного микобактериального иммунитета.Кроме того, данные животных и людей свидетельствуют о том, что иммунная система новорожденного смещена в сторону ответа Th3 [38-40], который может подавлять индукцию иммунитета Th2.

В отличие от многих детских вакцин, которые обеспечивают повышенную защиту при бустинге, было показано, что вторая вакцинация БЦЖ не усиливает защиту [41]. Новые стратегии вакцинации против туберкулеза направлены на повышение иммунитета, вызванного вакциной БЦЖ, за счет использования гетерологичных вакцин. Поэтому крайне важно использовать первичную вакцину наиболее оптимальным образом.Наши результаты показывают, что возраст, в котором вводят БЦЖ, может быть критической переменной. Следующим шагом будет подтверждение этих результатов в другой когорте до проведения более крупных исследований, чтобы оценить, приводит ли отсроченная вакцинация к усилению защиты от заболевания туберкулезом. В этом случае потребуется всесторонняя оценка последствий отсрочки вакцинации БЦЖ до возраста 6–14 недель, когда другие детские вакцины вводятся регулярно.

Отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до 10-недельного возраста может привести к усилению Т-клеточного ответа CD4

Резюме

Общие сведения

В большинстве эндемичных по туберкулезу стран бацилла Кальметта Герена (БЦЖ) обычно вводится при рождении для предотвращения тяжелой формы туберкулеза у младенцев.Иммунная система новорожденного еще не сформировалась. Наша гипотеза заключалась в том, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до 10-недельного возраста усилит иммунный ответ, индуцированный вакциной.

Методы

В рандомизированном клиническом исследовании БЦЖ вводили внутрикожно либо при рождении (n = 25), либо в возрасте 10 недель (n = 21). Через десять недель после вакцинации и в возрасте 1 года были измерены вакцино-специфические Т-клеточные ответы CD4 и CD8 с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови.

Результаты

Младенцы, получившие отсроченную вакцинацию БЦЖ, демонстрировали более высокую частоту БЦЖ-специфических Т-лимфоцитов CD4, особенно полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, и наиболее заметно в возрасте 1 года.

Выводы

Отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель усиливает количественный и качественный БЦЖ-специфический Т-клеточный ответ при измерении в возрасте одного года.

Ключевые слова: БЦЖ, вакцинация, рождение, отсроченное, полифункциональные Т-лимфоциты CD4

Введение

Бацилла Кальметта Герена (БЦЖ), единственная современная вакцина против туберкулеза (ТБ), представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Ежегодно более 100 миллионов детей во всем мире получают вакцину БЦЖ [1].Вакцинация БЦЖ обеспечивает защиту от тяжелых форм детского туберкулеза, т. Е. Туберкулезного менингита и милиарного туберкулеза [1, 2]. Защита, обеспечиваемая вакцинацией БЦЖ от легочного туберкулеза, наиболее распространенной формы туберкулеза, неодинакова и в основном низка [3]. Факторы, которые участвуют в различной защите БЦЖ от туберкулеза, включают штамм БЦЖ, дозу БЦЖ, предшествующее воздействие нетуберкулезных микобактерий (NTM) из окружающей среды, генетические вариации хозяина, штамм Mycobacterium tuberculosis ( M.tb ) и способ вакцинации. [3–7].

CD4 Т-клетки, которые продуцируют Т-хелперные цитокины типа 1 (Th2) IFN-γ, TNF-α и IL-2, считаются критическими для защиты от туберкулеза [8, 9]. Такой ответ Th2 характерен для вакцинации БЦЖ [10, 11]. В регионах, где широко распространен туберкулез, вакцинация БЦЖ широко проводится при рождении или вскоре после него из-за риска раннего контакта с M.tb [12]. Существуют доказательства того, что ответ Th2 при рождении является «незрелым», например, прогрессивное повышение специфического опосредованного клетками Th2 иммунитета было показано, когда вакцина против кори вводилась в возрасте 6, 9 и 12 месяцев соответственно [13].Мы предположили, что созревание иммунной системы новорожденных до 10-недельного возраста до вакцинации БЦЖ повысит индуцированный вакцинацией Т-клеточный иммунитет. Эффект оптимизации времени вакцинации может иметь важные последствия для улучшения защиты от туберкулеза с помощью вакцинации БЦЖ.

Марчант, и др. сообщил, что изменение возраста вакцинации БЦЖ не влияет на иммуногенность БЦЖ при оценке продукции интерферона гамма (IFN-γ) мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC), стимулированными микобактериальными антигенами [10].В небольшом исследовании Hussey, et al. также сообщил, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель не влияет на секрецию IFN-γ, пролиферативные ответы или цитотоксический потенциал БЦЖ-специфических Т-клеток после инкубации PBMC с микобактериальными антигенами [14]. С тех пор как появились эти результаты, мы показали, что измерение одного IFN-γ недооценивает сложность Th2-ответа, индуцированного БЦЖ. Вакцинация БЦЖ у младенцев индуцирует несколько подмножеств Th2, что определяется экспрессией различных комбинаций IFN-γ, TNF-α и IL-2 специфическими клетками [11].Мы хотели всесторонне изучить влияние возраста на величину и качество Th2-иммунитета, индуцируемого БЦЖ у младенцев.

Материалы и методы

Набор участников и последующее наблюдение

Участники были зарегистрированы в период с апреля 2006 г. по март 2008 г. в Хайелитше, пригороде Кейптауна с чрезвычайно высокой заболеваемостью туберкулезом, составившей 1614 на 100000 в первом квартале 2008 г. (Уровень уведомления о случаях, город Кейптаун).

Это было частью более крупного исследования, посвященного изучению клинических и иммунологических характеристик новорожденных, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию ВИЧ.Короче говоря, в государственную женскую консультацию к беременным женщинам обращались с просьбой принять их младенцев. Для исследования, представленного здесь, младенцы, которые родились от ВИЧ-инфицированных женщин или женщин с неизвестным ВИЧ-статусом, подвергались активному туберкулезу в домашнем хозяйстве, родились преждевременно (гестационный возраст ≤36 недель) или имели низкую массу тела при рождении (≤2,5 кг), или те, у кого были значительные перинатальные осложнения, были исключены. Кроме того, были исключены все младенцы с положительным ответом IFN-γ на ESAT-6 / CFP-10 в возрасте 10 недель (подробности анализа см. Ниже).Младенцы были случайным образом распределены во время дородового набора для получения вакцины БЦЖ (внутрикожный датский штамм 1331, Statens Serum Institute) в первый день жизни («вакцинация при рождении») или аналогичной вакцинации БЦЖ в возрасте 10 недель («отложенная вакцинация»). Младенцы наблюдались в возрасте 10, 20 и 50 недель. Был разрешен период окна от -2 до +4 недель вокруг визита на 10 неделе (например, от 8 до 14 недель). Период времени для 20-недельного посещения составлял от 18 до 28 недель и от 41 до 54 недель для 50-недельного посещения.

Разрешение регулирующих органов было получено от комитетов по этике исследований Стелленбошского и Кейптаунского университетов. Письменное информированное согласие было получено от всех матерей на их родном языке. Все тесты на ВИЧ проводились в сочетании с информированным согласием и консультированием до и после тестирования.

Сбор крови и анализ внутриклеточных цитокинов

Один мл крови собирали в возрасте 10, 20 и 50 недель в гепаринизированные шприцы. Цельную кровь обрабатывали в течение 2 часов после сбора, как описано ранее [15].Вкратце, 250 мкл цельной крови инкубировали в течение 12 часов при 37 ° C с жизнеспособной БЦЖ (восстановленной из флакона с вакциной, датский штамм, Staten Serum Institute, 1,2 × 10 ⁶ КОЕ / мл) и костимулирующими антителами анти-CD28. и анти-CD49d (BD Biosciences, 0,5 мкг / мл каждый). 250 мкл крови, инкубированной со стафилококковым энтеротоксином B (SEB, Sigma, 10 мкг / мл), и 250 мкл крови, инкубированной только с костимулирующими антителами (нестимулированными), служили в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Брефельдин A (Sigma, 10 мкг / мл) добавляли в течение последних 5 часов инкубации.После инкубации эритроциты лизировали и лейкоциты фиксировали лизирующим раствором BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences), а клетки криоконсервировали.

Криоконсервированные клетки позже оттаивали и промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (PBS, BioWhittaker) и повышали проницаемость, используя раствор Perm / Wash Solution (BD Biosciences). Затем клетки окрашивали следующими антителами: анти-CD3 Pacific Blue (клон UCHT1), анти-CD4 PerCPCy5.5 (SK3), анти-CD45RA PECy7 (L48), анти-IFN-γ AlexaFluor700 (B27), анти-IL. -2 FITC (5344.111), анти-TNF-α PE (MAb11; все от BD Biosciences), анти-CD8 Qdot605 (3B5, Invitrogen) и анти-CCR7 APC (150503, R&D Systems). После промывок клетки собирали на проточном цитометре LSR II (BD Biosciences), для этого эксперимента использовали 3 лазера и 10 детекторов с использованием программного обеспечения FACS Diva 6.1. Параметры компенсации были установлены с использованием каппа-шариков антимышиных (BD Biosciences), меченных соответствующими антителами, конъюгированными с флуорохромом. Flowjo 8.7.1 (Treestar) использовался для компенсации и анализа данных проточной цитометрии.Для создания комбинаций цитокинов, экспрессирующих субнаборы Т-клеток CD4 и CD8, применяли логическое стробирование ().

Стратегия гейтинга, используемая для анализа Т-клеточных цитокиновых ответов CD4 и CD8

Цельную кровь инкубировали с БЦЖ для завершения проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов, как описано в Методиках.

( A ) Дублетные клетки были исключены путем стробирования по площади прямого рассеяния (FSC-A) против высоты прямого рассеяния (FSC-H), а затем лимфоциты были отобраны в FSC-A против площади бокового рассеяния ( SSC-A) точечный график.Т-клетки отбирали путем стробирования событий CD3 ⁺ , которые далее дифференцировались в Т-клетки CD4 и CD8. ( B) Типичные точечные диаграммы паттернов коэкспрессии цитокинов в CD4 Т-клетках в нестимулированных, стимулированных БЦЖ и SEB условиях.

Анализ интеркуррентной инфекции

M. tuberculosis

В каждый момент времени цельную кровь разбавляли 1: 5 в среде для культивирования тканей RPMI-1640 (Sigma), содержащей 1% L-глутамин (Sigma), и инкубировали с ESAT -6 / CFP-10 слитый белок (предоставлен Томом Оттенхоффом, Медицинский центр Лейденского университета, 10 мкг / мл), фитогемагглютинин (PHA, Sigma, 5 мкг / мл) и SEB (1 мкг / мл; оба положительных контроля) или отсутствие антигена ( отрицательный контроль) в трех экземплярах в 96-луночных планшетах (модифицировано из Black et al ) [16].Планшеты инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 7 дней, супернатанты собирали, три лунки объединяли и хранили при -80 ° C. Позже супернатанты оттаивали, и сэндвич-ELISA на IFN-γ использовали для количественного определения IFN-γ в супернатантах, полученных в результате 7-дневного анализа цельной крови (BD Pharmingen). Положительный ответ IFN-γ был определен как 62 пг / мл после вычитания фона (удвоенный предел обнаружения анализа 31 пг / мл). Младенцы с признаками интеркуррентной инфекции / контакта M. tuberculosis в возрасте 10, 20 или 50 недель были исключены из анализа.

Анализ данных

Для анализа внутриклеточных цитокинов уровни экспрессии цитокинов в нестимулированной крови вычитали из уровней, полученных после стимуляции БЦЖ. (Средний уровень экспрессии IFN-γ, IL-2 и TNF среди Т-лимфоцитов CD4 в нестимулированной крови составлял 0,002%, 0,03% и 0,06% соответственно.) Различия в весе при рождении участников и их поле оценивались с помощью параметрических тестов. U-критерий Манна-Уитни использовался для оценки различий в частотах экспрессии цитокинов CD4 и CD8 Т-клеток между двумя группами.Значения P ниже 0,05 считались значимыми.

Результаты

Характеристики участников

Всего в исследование было включено 46 младенцев: 25 в группе рождения и 21 в группе отсроченной вакцинации. Младенцы, не явившиеся для проведения флеботомии в определенный момент времени, с кровотечением за пределами определенного периода окна на 10 неделе посещения или положительными на инфекцию M.tb , были исключены из анализа (). Результаты для младенцев с инфекцией M.tb были исключены из временной точки, в которой это было диагностировано, и из последующих временных точек.На исходном уровне не наблюдалось различий в массе тела при рождении или полу между группами рождения и отсроченной вакцинации (средний вес при рождении, (стандартное отклонение): 3306 г (435,6) при рождении против 3200 г (371,9) при задержке; p = 0,390). Шестнадцать (64%) младенцев в группе рождения были мальчиками по сравнению с 9 (43%) младенцами в группе отсроченных родов (p = 0,235).

Обзор правомочности, потока исследования и участников

Обнаружение БЦЖ-специфичных CD4 Т-клеток с использованием жизнеспособной БЦЖ в качестве антигена

Перед тем, как сравнивать БЦЖ-индуцированный иммунитет между новорожденными и отложенной вакцинацией, мы оценили, была ли инкубация целых кровь с жизнеспособной БЦЖ может привести к неспецифической активации Т-клеток или к обнаружению вакцино-специфического ответа.Мы сравнили Т-клеточный иммунитет CD4, измеренный в возрасте 10 недель с помощью теста на определение внутриклеточных цитокинов (: пример результатов анализа), между участниками, которые получали БЦЖ при рождении, и теми, кто еще не принимал БЦЖ (младенцы в группе отсроченного приема). . Продукция цитокинов CD4 Т-клетками легко определялась у младенцев из группы, вакцинированной при рождении, но не обнаруживалась или обнаруживалась только на очень низких уровнях у младенцев, не получивших вакцину при рождении (). Младенцы, вакцинированные при рождении, имели высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4, специфичных для БЦЖ, т.е.е. Т-клетки CD4, которые вместе экспрессируют IFN-γ, TNF-α и IL-2, и Т-клетки CD4, экспрессирующие другие комбинации цитокинов Th2. Полифункциональные БЦЖ-специфические CD4 Т-клетки отсутствовали у младенцев в группе отсроченной вакцинации. У всех младенцев был положительный ответ на положительный контроль, SEB (данные не показаны). Мы пришли к выводу, что ответы Т-клеток, измеренные с помощью нашей системы анализа, когда БЦЖ используется в качестве антигена, являются антиген-специфическими, а не обусловлены неспецифической активацией Т-клеток.

Сравнение ответов Т-лимфоцитов CD4 после инкубации цельной крови из крови вакцинированных БЦЖ и невакцинированных младенцев с БЦЖ в возрасте 10 недель

Частоты Т-лимфоцитов CD4, экспрессирующих цитокины, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови (см. Методы) показаны.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация привела к умеренно более высокой частоте БЦЖ-специфичных Т-клеток CD4 через 10 недель после вакцинации

Для оценки различий в ответах Т-лимфоцитов CD4 и CD8 при вакцинации при рождении или в возрасте 10 недель мы измерили Паттерн экспрессии Th2-цитокинов, индуцированный БЦЖ через 10 недель после вакцинации, т.е.е., в возрасте 10 недель в группе рождения и в возрасте 20 недель в группе отсроченного рождения. В обеих группах наблюдались высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4 или клеток, экспрессирующих другие комбинации цитокинов Th2 (). Частота встречаемости IFN-γ ⁺ и IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ BCG-специфичных CD4 Т-клеток была значительно выше в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении (). Поскольку частота индуцированных специфических субпопуляций CD8 Т-лимфоцитов была очень низкой, в обеих группах вакцинации оценивались только общие БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы CD8: не было никакой разницы между двумя группами ().Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ на 10 недель может привести к увеличению частоты БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток через 10 недель после вакцинации.

БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы через 10 недель после вакцинации у младенцев, получавших БЦЖ при рождении и тех, кто получил БЦЖ в возрасте 10 недель

(A) Частоты БЦЖ-специфических цитокинов, экспрессирующих Т-клетки CD4, показаны в виде обнаруживается с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (B) Частоты всех экспрессирующих CD8 Т-клеток, оцененные вместе, после инкубации цельной крови с БЦЖ.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация увеличивала частоту полифункциональных БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток в возрасте одного года

Мы также сравнили БЦЖ-специфический ответ памяти в возрасте 50 недель. Мы наблюдали значительно более высокие частоты БЦЖ-специфичных полифункциональных IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ CD4 Т-клеток в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении ().Частоты специфических субпопуляций Т-клеток, коэкспрессирующих TNF-α и IL-2, TNF-α и IFN-γ или только TNF-α, также были выше в группе отсроченной вакцинации. В этом возрасте общие ответы Т-лимфоцитов CD8, специфичные для БЦЖ, были слишком низкими для надежного анализа данных (данные не показаны). При сравнении ответов на положительный контроль, SEB, различий между двумя группами не наблюдалось (дополнительная фигура 1). Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до возраста 10 недель приводит к количественному увеличению и качественно более оптимальному БЦЖ-специфическому ответу памяти CD4 Т-клеток в возрасте одного года.

БЦЖ-специфические ответы Т-лимфоцитов CD4 в 2 группах младенцев в возрасте 1 года

Показаны частоты цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Пик общего БЦЖ-специфического ответа Т-лимфоцитов CD4 достигается через 10 недель после вакцинации в группах родов и отсроченной вакцинации. через 10 недель мы измерили общий ответ памяти Т-лимфоцитов CD4, специфичный для БЦЖ, в возрасте 10, 20 и 50 недель.Общие ответы обозначаются БЦЖ-специфическими CD4 Т-клетками, которые экспрессируют IFN-γ, TNF-α или IL-2, по отдельности или в комбинации. В группах родов и отсроченной вакцинации БЦЖ-специфические ответы CD4 достигли пика через 10 недель после вакцинации и постепенно уменьшались в течение первого года жизни ().

Кинетика общих БЦЖ-специфичных ответов Т-лимфоцитов CD4 в группах отсроченной вакцинации и вакцинации при рождении в течение одного года

Средние частоты БЦЖ-специфичных общих цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженных с помощью краткосрочного анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови при 10, Возраст 20 и 50 недель.

Сопоставимый БЦЖ-специфический фенотип памяти Т-лимфоцитов CD4 в группах рождения и отсроченной вакцинации

Чтобы оценить, приводит ли отсрочка вакцинации БЦЖ к измененному вакцино-специфическому фенотипу памяти Т-клеток CD4, мы охарактеризовали цитокин, экспрессирующий БЦЖ-специфические Т-клетки. Фенотип памяти специфических Т-клеток, определяемый поверхностной экспрессией CD45RA и CCR7, на животных моделях, как было показано, определяет исход вакцинации [17]. Как в группе вакцинации при рождении, так и в группе отсроченной вакцинации эффекторная память (CD45RA-CCR7-, T _EM ) преобладала и во всех временных точках оценивалась (для данных в возрасте 1 года).В возрасте одного года не было значительных различий для T _EM или центральной памяти (T _CM , CD45RA ^— CCR7 ⁺ ) в двух младенческих группах ().

Сравнение фенотипа поверхностной памяти БЦЖ-специфических CD4 T-клеток между двумя группами младенцев в возрасте 1 года

Антигенспецифические CD4 T-клетки были идентифицированы по экспрессии цитокинов с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (A) Графики в виде прямоугольников и усов, изображающие фенотип памяти всех BCG-специфичных CD4 T-клеток, проанализированных вместе.(B) Репрезентативные точечные графики поверхностного фенотипа БЦЖ-специфических CD4 T-клеток (точки), наложенные на поверхностный фенотип памяти всех CD4 T-клеток (контурные графики). Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Обсуждение

Наше исследование показало, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель приводит к индукции более высокой частоты детектируемых специфических Т-лимфоцитов CD4.Кроме того, специфические CD4 Т-клетки с большей вероятностью будут полифункциональными в группе отсроченной вакцины, что указывает на повышение «качества» индуцированного БЦЖ ответа.

Наши результаты отличаются от результатов двух предыдущих исследований, в которых не было выявлено различий в индуцированном иммунитете, когда вакцинация БЦЖ откладывалась после периода ближайшего новорожденного [10, 14]. Важно отметить, что в обоих этих исследованиях в качестве результата использовалось только измерение IFN-γ. Наши результаты показывают, что подробное изучение ответа Т-лимфоцитов позволяет провести более полную и контрастную оценку результата.Мы показали, что наиболее разительные различия в индуцированном иммунитете наблюдались в возрасте 1 года, что подчеркнуло важность лонгитюдного дизайна таких исследований. Данные о кинетике иммунного ответа, индуцированного БЦЖ, в детских когортах ограничены, особенно в условиях высокой эндемичности по ТБ.

Иммунные корреляты защиты от туберкулеза, вызванной вакцинацией, неизвестны. Следовательно, остается вопрос, могут ли частоты конкретных клеток, паттерны продукции цитокинов и фенотип памяти важны для долгосрочной защиты от туберкулеза.Большинство вакцинологов сочли бы более оптимальным количественно более высокий антиген-специфический ответ после новой вакцинации против туберкулеза в клинических испытаниях. Это мнение было подтверждено многочисленными исследованиями на животных, которые продемонстрировали, что более высокая частота специфических Т-клеток приводит к улучшенной защите от ТБ [18–20]. Напротив, другие исследования показали, что частота антиген-специфических Т-клеток, индуцированных противотуберкулезной вакциной, не обязательно может коррелировать с исходом после вирулентного M.tb [21–24]. Переменные дизайна исследования, такие как оцениваемый момент времени и проанализированный отсек, могут быть ответственны за эти противоречивые результаты. Кроме того, во многих из этих исследований оценивались специфические ответы Т-клеток только за счет продукции IFN-γ. Защита от ТБ без оптимального ответа IFN-γ невозможна. Однако постулируется, что измерение других цитокинов Th2 в дополнение к IFN-γ позволит лучше оценить «качество» Т-клеточного ответа. Например, наличие полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, стало полезным показателем «качественных» иммунных ответов [25, 26].В моделях вакцинации животных против Leishmania major [27] и против туберкулеза [28] стратегии, которые вызывают наибольшую частоту полифункциональных антиген-специфических CD4 Т-клеток, связаны с наилучшей защитой от последующего заражения патогеном. Кроме того, у людей, инфицированных ВИЧ-1, медленное прогрессирование заболевания тесно связано с более высокой частотой полифункциональных ВИЧ-специфических Т-клеток [29].

Классически CD45RA и CCR7 использовались для разделения Т-клеток на 4 подмножества памяти, а именно на наивные клетки (CD45RA ⁺ CCR7 ⁺ , T _Naive ), клетки центральной памяти (CD45RA ^— CCR7 ⁺ , T _CM ), эффекторные клетки памяти (CD45RA ^— CCR7 ^— , T _EM ) и эффекторные клетки памяти, которые повторно экспрессировали CD45RA (CD45RA ⁺ CCR7 ^— , T _EMRA ) [30, 31].Долгоживущие T _CM расширяются в лимфатических узлах и дифференцируются в эффекторные клетки [30]. Напротив, T _EM или более терминально дифференцированные популяции T _EMRA могут немедленно стать домом для эффекторных функций, но их пролиферативная способность и продолжительность жизни ограничены [30]. С гипотетической точки зрения, индукция долгоживущего T _CM должна быть целью вакцинации — эта точка зрения была подтверждена на животных моделях заражения макак вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) [17].Напротив, индукция T _EM или T _EMRA может быть не столь оптимальной, поскольку эти короткоживущие популяции не могут расширяться и более склонны к истощению [32]. Интересно, что в большинстве исследований Т-клеток человека, специфичных к микобактериям, преобладают популяции T _EM и относительно нечасто T _CM [11, 33–35]. Наши выводы подтверждают это; однако не было значительных различий в этих субпопуляциях Т-клеток после отсрочки вакцинации БЦЖ.

Считается, что на иммунитет, индуцированный БЦЖ, влияют многие переменные, как описано во введении выше.Например, Lalor и др. [36] сообщили, что сезонные изменения влияют на ответ IFN-γ у младенцев, вакцинированных БЦЖ, при измерении с помощью стимуляции PPD цельной крови в течение 6 дней. В нашем исследовании в возрасте 50 недель, когда наблюдались наиболее значимые различия в иммунитете, специфичном для БЦЖ, не было значительной разницы в распределении сезона родов между группами отсроченной вакцинации и вакцинацией при рождении. Кроме того, возможно, что различное воздействие микобактерий окружающей среды могло искажать наши результаты, хотя мы считаем это маловероятным, поскольку все младенцы были зачислены из одной географической области.Мы не можем исключить, что другие переменные могли повлиять на результаты.

Почему после отложенной вакцинации БЦЖ иммунный ответ усилился? Иммунный ответ новорожденного часто считается «незрелым» по сравнению с иммунным ответом взрослых [37]. «Незрелый» может быть неправильным названием, поскольку ответ может быть очень подходящим для ребенка, попадающего в мир непрерывного антигенного воздействия, и где чрезмерный иммунитет к этим стимулам может быть вредным. Однако это может привести к неоптимальному ответу на определенные вакцины, такие как БЦЖ.Мы предполагаем, что различная природа иммунитета, индуцированного БЦЖ в возрасте 10 недель, по сравнению с рождением, может быть приписана ранним «созревающим» изменениям иммунитета младенца. Существуют очень ограниченные данные о «созревании» иммунного ответа младенца в течение первых нескольких месяцев жизни, но факторы, которые, возможно, способствовали этому, включают неэффективную функцию антигенпредставляющих клеток, в том числе ограниченную способность продуцировать IL-12 [37], критический цитокин для индукция ответов Th2, характерных для успешного микобактериального иммунитета.Кроме того, данные животных и людей свидетельствуют о том, что иммунная система новорожденного смещена в сторону ответа Th3 [38-40], который может подавлять индукцию иммунитета Th2.

В отличие от многих детских вакцин, которые обеспечивают повышенную защиту при бустинге, было показано, что вторая вакцинация БЦЖ не усиливает защиту [41]. Новые стратегии вакцинации против туберкулеза направлены на повышение иммунитета, вызванного вакциной БЦЖ, за счет использования гетерологичных вакцин. Поэтому крайне важно использовать первичную вакцину наиболее оптимальным образом.Наши результаты показывают, что возраст, в котором вводят БЦЖ, может быть критической переменной. Следующим шагом будет подтверждение этих результатов в другой когорте до проведения более крупных исследований, чтобы оценить, приводит ли отсроченная вакцинация к усилению защиты от заболевания туберкулезом. В этом случае потребуется всесторонняя оценка последствий отсрочки вакцинации БЦЖ до возраста 6–14 недель, когда другие детские вакцины вводятся регулярно.

Отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до 10-недельного возраста может привести к усилению Т-клеточного ответа CD4

Резюме

Общие сведения

В большинстве эндемичных по туберкулезу стран бацилла Кальметта Герена (БЦЖ) обычно вводится при рождении для предотвращения тяжелой формы туберкулеза у младенцев.Иммунная система новорожденного еще не сформировалась. Наша гипотеза заключалась в том, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до 10-недельного возраста усилит иммунный ответ, индуцированный вакциной.

Методы

В рандомизированном клиническом исследовании БЦЖ вводили внутрикожно либо при рождении (n = 25), либо в возрасте 10 недель (n = 21). Через десять недель после вакцинации и в возрасте 1 года были измерены вакцино-специфические Т-клеточные ответы CD4 и CD8 с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови.

Результаты

Младенцы, получившие отсроченную вакцинацию БЦЖ, демонстрировали более высокую частоту БЦЖ-специфических Т-лимфоцитов CD4, особенно полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, и наиболее заметно в возрасте 1 года.

Выводы

Отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель усиливает количественный и качественный БЦЖ-специфический Т-клеточный ответ при измерении в возрасте одного года.

Ключевые слова: БЦЖ, вакцинация, рождение, отсроченное, полифункциональные Т-лимфоциты CD4

Введение

Бацилла Кальметта Герена (БЦЖ), единственная современная вакцина против туберкулеза (ТБ), представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Ежегодно более 100 миллионов детей во всем мире получают вакцину БЦЖ [1].Вакцинация БЦЖ обеспечивает защиту от тяжелых форм детского туберкулеза, т. Е. Туберкулезного менингита и милиарного туберкулеза [1, 2]. Защита, обеспечиваемая вакцинацией БЦЖ от легочного туберкулеза, наиболее распространенной формы туберкулеза, неодинакова и в основном низка [3]. Факторы, которые участвуют в различной защите БЦЖ от туберкулеза, включают штамм БЦЖ, дозу БЦЖ, предшествующее воздействие нетуберкулезных микобактерий (NTM) из окружающей среды, генетические вариации хозяина, штамм Mycobacterium tuberculosis ( M.tb ) и способ вакцинации. [3–7].

CD4 Т-клетки, которые продуцируют Т-хелперные цитокины типа 1 (Th2) IFN-γ, TNF-α и IL-2, считаются критическими для защиты от туберкулеза [8, 9]. Такой ответ Th2 характерен для вакцинации БЦЖ [10, 11]. В регионах, где широко распространен туберкулез, вакцинация БЦЖ широко проводится при рождении или вскоре после него из-за риска раннего контакта с M.tb [12]. Существуют доказательства того, что ответ Th2 при рождении является «незрелым», например, прогрессивное повышение специфического опосредованного клетками Th2 иммунитета было показано, когда вакцина против кори вводилась в возрасте 6, 9 и 12 месяцев соответственно [13].Мы предположили, что созревание иммунной системы новорожденных до 10-недельного возраста до вакцинации БЦЖ повысит индуцированный вакцинацией Т-клеточный иммунитет. Эффект оптимизации времени вакцинации может иметь важные последствия для улучшения защиты от туберкулеза с помощью вакцинации БЦЖ.

Марчант, и др. сообщил, что изменение возраста вакцинации БЦЖ не влияет на иммуногенность БЦЖ при оценке продукции интерферона гамма (IFN-γ) мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC), стимулированными микобактериальными антигенами [10].В небольшом исследовании Hussey, et al. также сообщил, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель не влияет на секрецию IFN-γ, пролиферативные ответы или цитотоксический потенциал БЦЖ-специфических Т-клеток после инкубации PBMC с микобактериальными антигенами [14]. С тех пор как появились эти результаты, мы показали, что измерение одного IFN-γ недооценивает сложность Th2-ответа, индуцированного БЦЖ. Вакцинация БЦЖ у младенцев индуцирует несколько подмножеств Th2, что определяется экспрессией различных комбинаций IFN-γ, TNF-α и IL-2 специфическими клетками [11].Мы хотели всесторонне изучить влияние возраста на величину и качество Th2-иммунитета, индуцируемого БЦЖ у младенцев.

Материалы и методы

Набор участников и последующее наблюдение

Участники были зарегистрированы в период с апреля 2006 г. по март 2008 г. в Хайелитше, пригороде Кейптауна с чрезвычайно высокой заболеваемостью туберкулезом, составившей 1614 на 100000 в первом квартале 2008 г. (Уровень уведомления о случаях, город Кейптаун).

Это было частью более крупного исследования, посвященного изучению клинических и иммунологических характеристик новорожденных, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию ВИЧ.Короче говоря, в государственную женскую консультацию к беременным женщинам обращались с просьбой принять их младенцев. Для исследования, представленного здесь, младенцы, которые родились от ВИЧ-инфицированных женщин или женщин с неизвестным ВИЧ-статусом, подвергались активному туберкулезу в домашнем хозяйстве, родились преждевременно (гестационный возраст ≤36 недель) или имели низкую массу тела при рождении (≤2,5 кг), или те, у кого были значительные перинатальные осложнения, были исключены. Кроме того, были исключены все младенцы с положительным ответом IFN-γ на ESAT-6 / CFP-10 в возрасте 10 недель (подробности анализа см. Ниже).Младенцы были случайным образом распределены во время дородового набора для получения вакцины БЦЖ (внутрикожный датский штамм 1331, Statens Serum Institute) в первый день жизни («вакцинация при рождении») или аналогичной вакцинации БЦЖ в возрасте 10 недель («отложенная вакцинация»). Младенцы наблюдались в возрасте 10, 20 и 50 недель. Был разрешен период окна от -2 до +4 недель вокруг визита на 10 неделе (например, от 8 до 14 недель). Период времени для 20-недельного посещения составлял от 18 до 28 недель и от 41 до 54 недель для 50-недельного посещения.

Разрешение регулирующих органов было получено от комитетов по этике исследований Стелленбошского и Кейптаунского университетов. Письменное информированное согласие было получено от всех матерей на их родном языке. Все тесты на ВИЧ проводились в сочетании с информированным согласием и консультированием до и после тестирования.

Сбор крови и анализ внутриклеточных цитокинов

Один мл крови собирали в возрасте 10, 20 и 50 недель в гепаринизированные шприцы. Цельную кровь обрабатывали в течение 2 часов после сбора, как описано ранее [15].Вкратце, 250 мкл цельной крови инкубировали в течение 12 часов при 37 ° C с жизнеспособной БЦЖ (восстановленной из флакона с вакциной, датский штамм, Staten Serum Institute, 1,2 × 10 ⁶ КОЕ / мл) и костимулирующими антителами анти-CD28. и анти-CD49d (BD Biosciences, 0,5 мкг / мл каждый). 250 мкл крови, инкубированной со стафилококковым энтеротоксином B (SEB, Sigma, 10 мкг / мл), и 250 мкл крови, инкубированной только с костимулирующими антителами (нестимулированными), служили в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Брефельдин A (Sigma, 10 мкг / мл) добавляли в течение последних 5 часов инкубации.После инкубации эритроциты лизировали и лейкоциты фиксировали лизирующим раствором BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences), а клетки криоконсервировали.

Криоконсервированные клетки позже оттаивали и промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (PBS, BioWhittaker) и повышали проницаемость, используя раствор Perm / Wash Solution (BD Biosciences). Затем клетки окрашивали следующими антителами: анти-CD3 Pacific Blue (клон UCHT1), анти-CD4 PerCPCy5.5 (SK3), анти-CD45RA PECy7 (L48), анти-IFN-γ AlexaFluor700 (B27), анти-IL. -2 FITC (5344.111), анти-TNF-α PE (MAb11; все от BD Biosciences), анти-CD8 Qdot605 (3B5, Invitrogen) и анти-CCR7 APC (150503, R&D Systems). После промывок клетки собирали на проточном цитометре LSR II (BD Biosciences), для этого эксперимента использовали 3 лазера и 10 детекторов с использованием программного обеспечения FACS Diva 6.1. Параметры компенсации были установлены с использованием каппа-шариков антимышиных (BD Biosciences), меченных соответствующими антителами, конъюгированными с флуорохромом. Flowjo 8.7.1 (Treestar) использовался для компенсации и анализа данных проточной цитометрии.Для создания комбинаций цитокинов, экспрессирующих субнаборы Т-клеток CD4 и CD8, применяли логическое стробирование ().

Стратегия гейтинга, используемая для анализа Т-клеточных цитокиновых ответов CD4 и CD8

Цельную кровь инкубировали с БЦЖ для завершения проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов, как описано в Методиках.

( A ) Дублетные клетки были исключены путем стробирования по площади прямого рассеяния (FSC-A) против высоты прямого рассеяния (FSC-H), а затем лимфоциты были отобраны в FSC-A против площади бокового рассеяния ( SSC-A) точечный график.Т-клетки отбирали путем стробирования событий CD3 ⁺ , которые далее дифференцировались в Т-клетки CD4 и CD8. ( B) Типичные точечные диаграммы паттернов коэкспрессии цитокинов в CD4 Т-клетках в нестимулированных, стимулированных БЦЖ и SEB условиях.

Анализ интеркуррентной инфекции

M. tuberculosis

В каждый момент времени цельную кровь разбавляли 1: 5 в среде для культивирования тканей RPMI-1640 (Sigma), содержащей 1% L-глутамин (Sigma), и инкубировали с ESAT -6 / CFP-10 слитый белок (предоставлен Томом Оттенхоффом, Медицинский центр Лейденского университета, 10 мкг / мл), фитогемагглютинин (PHA, Sigma, 5 мкг / мл) и SEB (1 мкг / мл; оба положительных контроля) или отсутствие антигена ( отрицательный контроль) в трех экземплярах в 96-луночных планшетах (модифицировано из Black et al ) [16].Планшеты инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 7 дней, супернатанты собирали, три лунки объединяли и хранили при -80 ° C. Позже супернатанты оттаивали, и сэндвич-ELISA на IFN-γ использовали для количественного определения IFN-γ в супернатантах, полученных в результате 7-дневного анализа цельной крови (BD Pharmingen). Положительный ответ IFN-γ был определен как 62 пг / мл после вычитания фона (удвоенный предел обнаружения анализа 31 пг / мл). Младенцы с признаками интеркуррентной инфекции / контакта M. tuberculosis в возрасте 10, 20 или 50 недель были исключены из анализа.

Анализ данных

Для анализа внутриклеточных цитокинов уровни экспрессии цитокинов в нестимулированной крови вычитали из уровней, полученных после стимуляции БЦЖ. (Средний уровень экспрессии IFN-γ, IL-2 и TNF среди Т-лимфоцитов CD4 в нестимулированной крови составлял 0,002%, 0,03% и 0,06% соответственно.) Различия в весе при рождении участников и их поле оценивались с помощью параметрических тестов. U-критерий Манна-Уитни использовался для оценки различий в частотах экспрессии цитокинов CD4 и CD8 Т-клеток между двумя группами.Значения P ниже 0,05 считались значимыми.

Результаты

Характеристики участников

Всего в исследование было включено 46 младенцев: 25 в группе рождения и 21 в группе отсроченной вакцинации. Младенцы, не явившиеся для проведения флеботомии в определенный момент времени, с кровотечением за пределами определенного периода окна на 10 неделе посещения или положительными на инфекцию M.tb , были исключены из анализа (). Результаты для младенцев с инфекцией M.tb были исключены из временной точки, в которой это было диагностировано, и из последующих временных точек.На исходном уровне не наблюдалось различий в массе тела при рождении или полу между группами рождения и отсроченной вакцинации (средний вес при рождении, (стандартное отклонение): 3306 г (435,6) при рождении против 3200 г (371,9) при задержке; p = 0,390). Шестнадцать (64%) младенцев в группе рождения были мальчиками по сравнению с 9 (43%) младенцами в группе отсроченных родов (p = 0,235).

Обзор правомочности, потока исследования и участников

Обнаружение БЦЖ-специфичных CD4 Т-клеток с использованием жизнеспособной БЦЖ в качестве антигена

Перед тем, как сравнивать БЦЖ-индуцированный иммунитет между новорожденными и отложенной вакцинацией, мы оценили, была ли инкубация целых кровь с жизнеспособной БЦЖ может привести к неспецифической активации Т-клеток или к обнаружению вакцино-специфического ответа.Мы сравнили Т-клеточный иммунитет CD4, измеренный в возрасте 10 недель с помощью теста на определение внутриклеточных цитокинов (: пример результатов анализа), между участниками, которые получали БЦЖ при рождении, и теми, кто еще не принимал БЦЖ (младенцы в группе отсроченного приема). . Продукция цитокинов CD4 Т-клетками легко определялась у младенцев из группы, вакцинированной при рождении, но не обнаруживалась или обнаруживалась только на очень низких уровнях у младенцев, не получивших вакцину при рождении (). Младенцы, вакцинированные при рождении, имели высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4, специфичных для БЦЖ, т.е.е. Т-клетки CD4, которые вместе экспрессируют IFN-γ, TNF-α и IL-2, и Т-клетки CD4, экспрессирующие другие комбинации цитокинов Th2. Полифункциональные БЦЖ-специфические CD4 Т-клетки отсутствовали у младенцев в группе отсроченной вакцинации. У всех младенцев был положительный ответ на положительный контроль, SEB (данные не показаны). Мы пришли к выводу, что ответы Т-клеток, измеренные с помощью нашей системы анализа, когда БЦЖ используется в качестве антигена, являются антиген-специфическими, а не обусловлены неспецифической активацией Т-клеток.

Сравнение ответов Т-лимфоцитов CD4 после инкубации цельной крови из крови вакцинированных БЦЖ и невакцинированных младенцев с БЦЖ в возрасте 10 недель

Частоты Т-лимфоцитов CD4, экспрессирующих цитокины, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови (см. Методы) показаны.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация привела к умеренно более высокой частоте БЦЖ-специфичных Т-клеток CD4 через 10 недель после вакцинации

Для оценки различий в ответах Т-лимфоцитов CD4 и CD8 при вакцинации при рождении или в возрасте 10 недель мы измерили Паттерн экспрессии Th2-цитокинов, индуцированный БЦЖ через 10 недель после вакцинации, т.е.е., в возрасте 10 недель в группе рождения и в возрасте 20 недель в группе отсроченного рождения. В обеих группах наблюдались высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4 или клеток, экспрессирующих другие комбинации цитокинов Th2 (). Частота встречаемости IFN-γ ⁺ и IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ BCG-специфичных CD4 Т-клеток была значительно выше в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении (). Поскольку частота индуцированных специфических субпопуляций CD8 Т-лимфоцитов была очень низкой, в обеих группах вакцинации оценивались только общие БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы CD8: не было никакой разницы между двумя группами ().Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ на 10 недель может привести к увеличению частоты БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток через 10 недель после вакцинации.

БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы через 10 недель после вакцинации у младенцев, получавших БЦЖ при рождении и тех, кто получил БЦЖ в возрасте 10 недель

(A) Частоты БЦЖ-специфических цитокинов, экспрессирующих Т-клетки CD4, показаны в виде обнаруживается с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (B) Частоты всех экспрессирующих CD8 Т-клеток, оцененные вместе, после инкубации цельной крови с БЦЖ.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация увеличивала частоту полифункциональных БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток в возрасте одного года

Мы также сравнили БЦЖ-специфический ответ памяти в возрасте 50 недель. Мы наблюдали значительно более высокие частоты БЦЖ-специфичных полифункциональных IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ CD4 Т-клеток в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении ().Частоты специфических субпопуляций Т-клеток, коэкспрессирующих TNF-α и IL-2, TNF-α и IFN-γ или только TNF-α, также были выше в группе отсроченной вакцинации. В этом возрасте общие ответы Т-лимфоцитов CD8, специфичные для БЦЖ, были слишком низкими для надежного анализа данных (данные не показаны). При сравнении ответов на положительный контроль, SEB, различий между двумя группами не наблюдалось (дополнительная фигура 1). Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до возраста 10 недель приводит к количественному увеличению и качественно более оптимальному БЦЖ-специфическому ответу памяти CD4 Т-клеток в возрасте одного года.

БЦЖ-специфические ответы Т-лимфоцитов CD4 в 2 группах младенцев в возрасте 1 года

Показаны частоты цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Пик общего БЦЖ-специфического ответа Т-лимфоцитов CD4 достигается через 10 недель после вакцинации в группах родов и отсроченной вакцинации. через 10 недель мы измерили общий ответ памяти Т-лимфоцитов CD4, специфичный для БЦЖ, в возрасте 10, 20 и 50 недель.Общие ответы обозначаются БЦЖ-специфическими CD4 Т-клетками, которые экспрессируют IFN-γ, TNF-α или IL-2, по отдельности или в комбинации. В группах родов и отсроченной вакцинации БЦЖ-специфические ответы CD4 достигли пика через 10 недель после вакцинации и постепенно уменьшались в течение первого года жизни ().

Кинетика общих БЦЖ-специфичных ответов Т-лимфоцитов CD4 в группах отсроченной вакцинации и вакцинации при рождении в течение одного года

Средние частоты БЦЖ-специфичных общих цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженных с помощью краткосрочного анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови при 10, Возраст 20 и 50 недель.

Сопоставимый БЦЖ-специфический фенотип памяти Т-лимфоцитов CD4 в группах рождения и отсроченной вакцинации

Чтобы оценить, приводит ли отсрочка вакцинации БЦЖ к измененному вакцино-специфическому фенотипу памяти Т-клеток CD4, мы охарактеризовали цитокин, экспрессирующий БЦЖ-специфические Т-клетки. Фенотип памяти специфических Т-клеток, определяемый поверхностной экспрессией CD45RA и CCR7, на животных моделях, как было показано, определяет исход вакцинации [17]. Как в группе вакцинации при рождении, так и в группе отсроченной вакцинации эффекторная память (CD45RA-CCR7-, T _EM ) преобладала и во всех временных точках оценивалась (для данных в возрасте 1 года).В возрасте одного года не было значительных различий для T _EM или центральной памяти (T _CM , CD45RA ^— CCR7 ⁺ ) в двух младенческих группах ().

Сравнение фенотипа поверхностной памяти БЦЖ-специфических CD4 T-клеток между двумя группами младенцев в возрасте 1 года

Антигенспецифические CD4 T-клетки были идентифицированы по экспрессии цитокинов с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (A) Графики в виде прямоугольников и усов, изображающие фенотип памяти всех BCG-специфичных CD4 T-клеток, проанализированных вместе.(B) Репрезентативные точечные графики поверхностного фенотипа БЦЖ-специфических CD4 T-клеток (точки), наложенные на поверхностный фенотип памяти всех CD4 T-клеток (контурные графики). Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Обсуждение

Наше исследование показало, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель приводит к индукции более высокой частоты детектируемых специфических Т-лимфоцитов CD4.Кроме того, специфические CD4 Т-клетки с большей вероятностью будут полифункциональными в группе отсроченной вакцины, что указывает на повышение «качества» индуцированного БЦЖ ответа.

Наши результаты отличаются от результатов двух предыдущих исследований, в которых не было выявлено различий в индуцированном иммунитете, когда вакцинация БЦЖ откладывалась после периода ближайшего новорожденного [10, 14]. Важно отметить, что в обоих этих исследованиях в качестве результата использовалось только измерение IFN-γ. Наши результаты показывают, что подробное изучение ответа Т-лимфоцитов позволяет провести более полную и контрастную оценку результата.Мы показали, что наиболее разительные различия в индуцированном иммунитете наблюдались в возрасте 1 года, что подчеркнуло важность лонгитюдного дизайна таких исследований. Данные о кинетике иммунного ответа, индуцированного БЦЖ, в детских когортах ограничены, особенно в условиях высокой эндемичности по ТБ.

Иммунные корреляты защиты от туберкулеза, вызванной вакцинацией, неизвестны. Следовательно, остается вопрос, могут ли частоты конкретных клеток, паттерны продукции цитокинов и фенотип памяти важны для долгосрочной защиты от туберкулеза.Большинство вакцинологов сочли бы более оптимальным количественно более высокий антиген-специфический ответ после новой вакцинации против туберкулеза в клинических испытаниях. Это мнение было подтверждено многочисленными исследованиями на животных, которые продемонстрировали, что более высокая частота специфических Т-клеток приводит к улучшенной защите от ТБ [18–20]. Напротив, другие исследования показали, что частота антиген-специфических Т-клеток, индуцированных противотуберкулезной вакциной, не обязательно может коррелировать с исходом после вирулентного M.tb [21–24]. Переменные дизайна исследования, такие как оцениваемый момент времени и проанализированный отсек, могут быть ответственны за эти противоречивые результаты. Кроме того, во многих из этих исследований оценивались специфические ответы Т-клеток только за счет продукции IFN-γ. Защита от ТБ без оптимального ответа IFN-γ невозможна. Однако постулируется, что измерение других цитокинов Th2 в дополнение к IFN-γ позволит лучше оценить «качество» Т-клеточного ответа. Например, наличие полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, стало полезным показателем «качественных» иммунных ответов [25, 26].В моделях вакцинации животных против Leishmania major [27] и против туберкулеза [28] стратегии, которые вызывают наибольшую частоту полифункциональных антиген-специфических CD4 Т-клеток, связаны с наилучшей защитой от последующего заражения патогеном. Кроме того, у людей, инфицированных ВИЧ-1, медленное прогрессирование заболевания тесно связано с более высокой частотой полифункциональных ВИЧ-специфических Т-клеток [29].

Классически CD45RA и CCR7 использовались для разделения Т-клеток на 4 подмножества памяти, а именно на наивные клетки (CD45RA ⁺ CCR7 ⁺ , T _Naive ), клетки центральной памяти (CD45RA ^— CCR7 ⁺ , T _CM ), эффекторные клетки памяти (CD45RA ^— CCR7 ^— , T _EM ) и эффекторные клетки памяти, которые повторно экспрессировали CD45RA (CD45RA ⁺ CCR7 ^— , T _EMRA ) [30, 31].Долгоживущие T _CM расширяются в лимфатических узлах и дифференцируются в эффекторные клетки [30]. Напротив, T _EM или более терминально дифференцированные популяции T _EMRA могут немедленно стать домом для эффекторных функций, но их пролиферативная способность и продолжительность жизни ограничены [30]. С гипотетической точки зрения, индукция долгоживущего T _CM должна быть целью вакцинации — эта точка зрения была подтверждена на животных моделях заражения макак вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) [17].Напротив, индукция T _EM или T _EMRA может быть не столь оптимальной, поскольку эти короткоживущие популяции не могут расширяться и более склонны к истощению [32]. Интересно, что в большинстве исследований Т-клеток человека, специфичных к микобактериям, преобладают популяции T _EM и относительно нечасто T _CM [11, 33–35]. Наши выводы подтверждают это; однако не было значительных различий в этих субпопуляциях Т-клеток после отсрочки вакцинации БЦЖ.

Считается, что на иммунитет, индуцированный БЦЖ, влияют многие переменные, как описано во введении выше.Например, Lalor и др. [36] сообщили, что сезонные изменения влияют на ответ IFN-γ у младенцев, вакцинированных БЦЖ, при измерении с помощью стимуляции PPD цельной крови в течение 6 дней. В нашем исследовании в возрасте 50 недель, когда наблюдались наиболее значимые различия в иммунитете, специфичном для БЦЖ, не было значительной разницы в распределении сезона родов между группами отсроченной вакцинации и вакцинацией при рождении. Кроме того, возможно, что различное воздействие микобактерий окружающей среды могло искажать наши результаты, хотя мы считаем это маловероятным, поскольку все младенцы были зачислены из одной географической области.Мы не можем исключить, что другие переменные могли повлиять на результаты.

Почему после отложенной вакцинации БЦЖ иммунный ответ усилился? Иммунный ответ новорожденного часто считается «незрелым» по сравнению с иммунным ответом взрослых [37]. «Незрелый» может быть неправильным названием, поскольку ответ может быть очень подходящим для ребенка, попадающего в мир непрерывного антигенного воздействия, и где чрезмерный иммунитет к этим стимулам может быть вредным. Однако это может привести к неоптимальному ответу на определенные вакцины, такие как БЦЖ.Мы предполагаем, что различная природа иммунитета, индуцированного БЦЖ в возрасте 10 недель, по сравнению с рождением, может быть приписана ранним «созревающим» изменениям иммунитета младенца. Существуют очень ограниченные данные о «созревании» иммунного ответа младенца в течение первых нескольких месяцев жизни, но факторы, которые, возможно, способствовали этому, включают неэффективную функцию антигенпредставляющих клеток, в том числе ограниченную способность продуцировать IL-12 [37], критический цитокин для индукция ответов Th2, характерных для успешного микобактериального иммунитета.Кроме того, данные животных и людей свидетельствуют о том, что иммунная система новорожденного смещена в сторону ответа Th3 [38-40], который может подавлять индукцию иммунитета Th2.

В отличие от многих детских вакцин, которые обеспечивают повышенную защиту при бустинге, было показано, что вторая вакцинация БЦЖ не усиливает защиту [41]. Новые стратегии вакцинации против туберкулеза направлены на повышение иммунитета, вызванного вакциной БЦЖ, за счет использования гетерологичных вакцин. Поэтому крайне важно использовать первичную вакцину наиболее оптимальным образом.Наши результаты показывают, что возраст, в котором вводят БЦЖ, может быть критической переменной. Следующим шагом будет подтверждение этих результатов в другой когорте до проведения более крупных исследований, чтобы оценить, приводит ли отсроченная вакцинация к усилению защиты от заболевания туберкулезом. В этом случае потребуется всесторонняя оценка последствий отсрочки вакцинации БЦЖ до возраста 6–14 недель, когда другие детские вакцины вводятся регулярно.

Отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до 10-недельного возраста может привести к усилению Т-клеточного ответа CD4

Резюме

Общие сведения

В большинстве эндемичных по туберкулезу стран бацилла Кальметта Герена (БЦЖ) обычно вводится при рождении для предотвращения тяжелой формы туберкулеза у младенцев.Иммунная система новорожденного еще не сформировалась. Наша гипотеза заключалась в том, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до 10-недельного возраста усилит иммунный ответ, индуцированный вакциной.

Методы

В рандомизированном клиническом исследовании БЦЖ вводили внутрикожно либо при рождении (n = 25), либо в возрасте 10 недель (n = 21). Через десять недель после вакцинации и в возрасте 1 года были измерены вакцино-специфические Т-клеточные ответы CD4 и CD8 с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови.

Результаты

Младенцы, получившие отсроченную вакцинацию БЦЖ, демонстрировали более высокую частоту БЦЖ-специфических Т-лимфоцитов CD4, особенно полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, и наиболее заметно в возрасте 1 года.

Выводы

Отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель усиливает количественный и качественный БЦЖ-специфический Т-клеточный ответ при измерении в возрасте одного года.

Ключевые слова: БЦЖ, вакцинация, рождение, отсроченное, полифункциональные Т-лимфоциты CD4

Введение

Бацилла Кальметта Герена (БЦЖ), единственная современная вакцина против туберкулеза (ТБ), представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Ежегодно более 100 миллионов детей во всем мире получают вакцину БЦЖ [1].Вакцинация БЦЖ обеспечивает защиту от тяжелых форм детского туберкулеза, т. Е. Туберкулезного менингита и милиарного туберкулеза [1, 2]. Защита, обеспечиваемая вакцинацией БЦЖ от легочного туберкулеза, наиболее распространенной формы туберкулеза, неодинакова и в основном низка [3]. Факторы, которые участвуют в различной защите БЦЖ от туберкулеза, включают штамм БЦЖ, дозу БЦЖ, предшествующее воздействие нетуберкулезных микобактерий (NTM) из окружающей среды, генетические вариации хозяина, штамм Mycobacterium tuberculosis ( M.tb ) и способ вакцинации. [3–7].

CD4 Т-клетки, которые продуцируют Т-хелперные цитокины типа 1 (Th2) IFN-γ, TNF-α и IL-2, считаются критическими для защиты от туберкулеза [8, 9]. Такой ответ Th2 характерен для вакцинации БЦЖ [10, 11]. В регионах, где широко распространен туберкулез, вакцинация БЦЖ широко проводится при рождении или вскоре после него из-за риска раннего контакта с M.tb [12]. Существуют доказательства того, что ответ Th2 при рождении является «незрелым», например, прогрессивное повышение специфического опосредованного клетками Th2 иммунитета было показано, когда вакцина против кори вводилась в возрасте 6, 9 и 12 месяцев соответственно [13].Мы предположили, что созревание иммунной системы новорожденных до 10-недельного возраста до вакцинации БЦЖ повысит индуцированный вакцинацией Т-клеточный иммунитет. Эффект оптимизации времени вакцинации может иметь важные последствия для улучшения защиты от туберкулеза с помощью вакцинации БЦЖ.

Марчант, и др. сообщил, что изменение возраста вакцинации БЦЖ не влияет на иммуногенность БЦЖ при оценке продукции интерферона гамма (IFN-γ) мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC), стимулированными микобактериальными антигенами [10].В небольшом исследовании Hussey, et al. также сообщил, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель не влияет на секрецию IFN-γ, пролиферативные ответы или цитотоксический потенциал БЦЖ-специфических Т-клеток после инкубации PBMC с микобактериальными антигенами [14]. С тех пор как появились эти результаты, мы показали, что измерение одного IFN-γ недооценивает сложность Th2-ответа, индуцированного БЦЖ. Вакцинация БЦЖ у младенцев индуцирует несколько подмножеств Th2, что определяется экспрессией различных комбинаций IFN-γ, TNF-α и IL-2 специфическими клетками [11].Мы хотели всесторонне изучить влияние возраста на величину и качество Th2-иммунитета, индуцируемого БЦЖ у младенцев.

Материалы и методы

Набор участников и последующее наблюдение

Участники были зарегистрированы в период с апреля 2006 г. по март 2008 г. в Хайелитше, пригороде Кейптауна с чрезвычайно высокой заболеваемостью туберкулезом, составившей 1614 на 100000 в первом квартале 2008 г. (Уровень уведомления о случаях, город Кейптаун).

Это было частью более крупного исследования, посвященного изучению клинических и иммунологических характеристик новорожденных, подвергшихся и не подвергавшихся воздействию ВИЧ.Короче говоря, в государственную женскую консультацию к беременным женщинам обращались с просьбой принять их младенцев. Для исследования, представленного здесь, младенцы, которые родились от ВИЧ-инфицированных женщин или женщин с неизвестным ВИЧ-статусом, подвергались активному туберкулезу в домашнем хозяйстве, родились преждевременно (гестационный возраст ≤36 недель) или имели низкую массу тела при рождении (≤2,5 кг), или те, у кого были значительные перинатальные осложнения, были исключены. Кроме того, были исключены все младенцы с положительным ответом IFN-γ на ESAT-6 / CFP-10 в возрасте 10 недель (подробности анализа см. Ниже).Младенцы были случайным образом распределены во время дородового набора для получения вакцины БЦЖ (внутрикожный датский штамм 1331, Statens Serum Institute) в первый день жизни («вакцинация при рождении») или аналогичной вакцинации БЦЖ в возрасте 10 недель («отложенная вакцинация»). Младенцы наблюдались в возрасте 10, 20 и 50 недель. Был разрешен период окна от -2 до +4 недель вокруг визита на 10 неделе (например, от 8 до 14 недель). Период времени для 20-недельного посещения составлял от 18 до 28 недель и от 41 до 54 недель для 50-недельного посещения.

Разрешение регулирующих органов было получено от комитетов по этике исследований Стелленбошского и Кейптаунского университетов. Письменное информированное согласие было получено от всех матерей на их родном языке. Все тесты на ВИЧ проводились в сочетании с информированным согласием и консультированием до и после тестирования.

Сбор крови и анализ внутриклеточных цитокинов

Один мл крови собирали в возрасте 10, 20 и 50 недель в гепаринизированные шприцы. Цельную кровь обрабатывали в течение 2 часов после сбора, как описано ранее [15].Вкратце, 250 мкл цельной крови инкубировали в течение 12 часов при 37 ° C с жизнеспособной БЦЖ (восстановленной из флакона с вакциной, датский штамм, Staten Serum Institute, 1,2 × 10 ⁶ КОЕ / мл) и костимулирующими антителами анти-CD28. и анти-CD49d (BD Biosciences, 0,5 мкг / мл каждый). 250 мкл крови, инкубированной со стафилококковым энтеротоксином B (SEB, Sigma, 10 мкг / мл), и 250 мкл крови, инкубированной только с костимулирующими антителами (нестимулированными), служили в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Брефельдин A (Sigma, 10 мкг / мл) добавляли в течение последних 5 часов инкубации.После инкубации эритроциты лизировали и лейкоциты фиксировали лизирующим раствором BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences), а клетки криоконсервировали.

Криоконсервированные клетки позже оттаивали и промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (PBS, BioWhittaker) и повышали проницаемость, используя раствор Perm / Wash Solution (BD Biosciences). Затем клетки окрашивали следующими антителами: анти-CD3 Pacific Blue (клон UCHT1), анти-CD4 PerCPCy5.5 (SK3), анти-CD45RA PECy7 (L48), анти-IFN-γ AlexaFluor700 (B27), анти-IL. -2 FITC (5344.111), анти-TNF-α PE (MAb11; все от BD Biosciences), анти-CD8 Qdot605 (3B5, Invitrogen) и анти-CCR7 APC (150503, R&D Systems). После промывок клетки собирали на проточном цитометре LSR II (BD Biosciences), для этого эксперимента использовали 3 лазера и 10 детекторов с использованием программного обеспечения FACS Diva 6.1. Параметры компенсации были установлены с использованием каппа-шариков антимышиных (BD Biosciences), меченных соответствующими антителами, конъюгированными с флуорохромом. Flowjo 8.7.1 (Treestar) использовался для компенсации и анализа данных проточной цитометрии.Для создания комбинаций цитокинов, экспрессирующих субнаборы Т-клеток CD4 и CD8, применяли логическое стробирование ().

Стратегия гейтинга, используемая для анализа Т-клеточных цитокиновых ответов CD4 и CD8

Цельную кровь инкубировали с БЦЖ для завершения проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов, как описано в Методиках.

( A ) Дублетные клетки были исключены путем стробирования по площади прямого рассеяния (FSC-A) против высоты прямого рассеяния (FSC-H), а затем лимфоциты были отобраны в FSC-A против площади бокового рассеяния ( SSC-A) точечный график.Т-клетки отбирали путем стробирования событий CD3 ⁺ , которые далее дифференцировались в Т-клетки CD4 и CD8. ( B) Типичные точечные диаграммы паттернов коэкспрессии цитокинов в CD4 Т-клетках в нестимулированных, стимулированных БЦЖ и SEB условиях.

Анализ интеркуррентной инфекции

M. tuberculosis

В каждый момент времени цельную кровь разбавляли 1: 5 в среде для культивирования тканей RPMI-1640 (Sigma), содержащей 1% L-глутамин (Sigma), и инкубировали с ESAT -6 / CFP-10 слитый белок (предоставлен Томом Оттенхоффом, Медицинский центр Лейденского университета, 10 мкг / мл), фитогемагглютинин (PHA, Sigma, 5 мкг / мл) и SEB (1 мкг / мл; оба положительных контроля) или отсутствие антигена ( отрицательный контроль) в трех экземплярах в 96-луночных планшетах (модифицировано из Black et al ) [16].Планшеты инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 7 дней, супернатанты собирали, три лунки объединяли и хранили при -80 ° C. Позже супернатанты оттаивали, и сэндвич-ELISA на IFN-γ использовали для количественного определения IFN-γ в супернатантах, полученных в результате 7-дневного анализа цельной крови (BD Pharmingen). Положительный ответ IFN-γ был определен как 62 пг / мл после вычитания фона (удвоенный предел обнаружения анализа 31 пг / мл). Младенцы с признаками интеркуррентной инфекции / контакта M. tuberculosis в возрасте 10, 20 или 50 недель были исключены из анализа.

Анализ данных

Для анализа внутриклеточных цитокинов уровни экспрессии цитокинов в нестимулированной крови вычитали из уровней, полученных после стимуляции БЦЖ. (Средний уровень экспрессии IFN-γ, IL-2 и TNF среди Т-лимфоцитов CD4 в нестимулированной крови составлял 0,002%, 0,03% и 0,06% соответственно.) Различия в весе при рождении участников и их поле оценивались с помощью параметрических тестов. U-критерий Манна-Уитни использовался для оценки различий в частотах экспрессии цитокинов CD4 и CD8 Т-клеток между двумя группами.Значения P ниже 0,05 считались значимыми.

Результаты

Характеристики участников

Всего в исследование было включено 46 младенцев: 25 в группе рождения и 21 в группе отсроченной вакцинации. Младенцы, не явившиеся для проведения флеботомии в определенный момент времени, с кровотечением за пределами определенного периода окна на 10 неделе посещения или положительными на инфекцию M.tb , были исключены из анализа (). Результаты для младенцев с инфекцией M.tb были исключены из временной точки, в которой это было диагностировано, и из последующих временных точек.На исходном уровне не наблюдалось различий в массе тела при рождении или полу между группами рождения и отсроченной вакцинации (средний вес при рождении, (стандартное отклонение): 3306 г (435,6) при рождении против 3200 г (371,9) при задержке; p = 0,390). Шестнадцать (64%) младенцев в группе рождения были мальчиками по сравнению с 9 (43%) младенцами в группе отсроченных родов (p = 0,235).

Обзор правомочности, потока исследования и участников

Обнаружение БЦЖ-специфичных CD4 Т-клеток с использованием жизнеспособной БЦЖ в качестве антигена

Перед тем, как сравнивать БЦЖ-индуцированный иммунитет между новорожденными и отложенной вакцинацией, мы оценили, была ли инкубация целых кровь с жизнеспособной БЦЖ может привести к неспецифической активации Т-клеток или к обнаружению вакцино-специфического ответа.Мы сравнили Т-клеточный иммунитет CD4, измеренный в возрасте 10 недель с помощью теста на определение внутриклеточных цитокинов (: пример результатов анализа), между участниками, которые получали БЦЖ при рождении, и теми, кто еще не принимал БЦЖ (младенцы в группе отсроченного приема). . Продукция цитокинов CD4 Т-клетками легко определялась у младенцев из группы, вакцинированной при рождении, но не обнаруживалась или обнаруживалась только на очень низких уровнях у младенцев, не получивших вакцину при рождении (). Младенцы, вакцинированные при рождении, имели высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4, специфичных для БЦЖ, т.е.е. Т-клетки CD4, которые вместе экспрессируют IFN-γ, TNF-α и IL-2, и Т-клетки CD4, экспрессирующие другие комбинации цитокинов Th2. Полифункциональные БЦЖ-специфические CD4 Т-клетки отсутствовали у младенцев в группе отсроченной вакцинации. У всех младенцев был положительный ответ на положительный контроль, SEB (данные не показаны). Мы пришли к выводу, что ответы Т-клеток, измеренные с помощью нашей системы анализа, когда БЦЖ используется в качестве антигена, являются антиген-специфическими, а не обусловлены неспецифической активацией Т-клеток.

Сравнение ответов Т-лимфоцитов CD4 после инкубации цельной крови из крови вакцинированных БЦЖ и невакцинированных младенцев с БЦЖ в возрасте 10 недель

Частоты Т-лимфоцитов CD4, экспрессирующих цитокины, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови (см. Методы) показаны.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация привела к умеренно более высокой частоте БЦЖ-специфичных Т-клеток CD4 через 10 недель после вакцинации

Для оценки различий в ответах Т-лимфоцитов CD4 и CD8 при вакцинации при рождении или в возрасте 10 недель мы измерили Паттерн экспрессии Th2-цитокинов, индуцированный БЦЖ через 10 недель после вакцинации, т.е.е., в возрасте 10 недель в группе рождения и в возрасте 20 недель в группе отсроченного рождения. В обеих группах наблюдались высокие частоты полифункциональных Т-лимфоцитов CD4 или клеток, экспрессирующих другие комбинации цитокинов Th2 (). Частота встречаемости IFN-γ ⁺ и IFN-γ ⁺ IL-2 ⁺ BCG-специфичных CD4 Т-клеток была значительно выше в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении (). Поскольку частота индуцированных специфических субпопуляций CD8 Т-лимфоцитов была очень низкой, в обеих группах вакцинации оценивались только общие БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы CD8: не было никакой разницы между двумя группами ().Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ на 10 недель может привести к увеличению частоты БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток через 10 недель после вакцинации.

БЦЖ-специфические Т-клеточные ответы через 10 недель после вакцинации у младенцев, получавших БЦЖ при рождении и тех, кто получил БЦЖ в возрасте 10 недель

(A) Частоты БЦЖ-специфических цитокинов, экспрессирующих Т-клетки CD4, показаны в виде обнаруживается с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (B) Частоты всех экспрессирующих CD8 Т-клеток, оцененные вместе, после инкубации цельной крови с БЦЖ.Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Отсроченная вакцинация увеличивала частоту полифункциональных БЦЖ-специфических CD4 Т-клеток в возрасте одного года

Мы также сравнили БЦЖ-специфический ответ памяти в возрасте 50 недель. Мы наблюдали значительно более высокие частоты БЦЖ-специфичных полифункциональных IFN-γ ⁺ TNF-α ⁺ IL-2 ⁺ CD4 Т-клеток в группе отсроченной вакцинации по сравнению с группой вакцинации при рождении ().Частоты специфических субпопуляций Т-клеток, коэкспрессирующих TNF-α и IL-2, TNF-α и IFN-γ или только TNF-α, также были выше в группе отсроченной вакцинации. В этом возрасте общие ответы Т-лимфоцитов CD8, специфичные для БЦЖ, были слишком низкими для надежного анализа данных (данные не показаны). При сравнении ответов на положительный контроль, SEB, различий между двумя группами не наблюдалось (дополнительная фигура 1). Мы пришли к выводу, что отсрочка вакцинации БЦЖ с рождения до возраста 10 недель приводит к количественному увеличению и качественно более оптимальному БЦЖ-специфическому ответу памяти CD4 Т-клеток в возрасте одного года.

БЦЖ-специфические ответы Т-лимфоцитов CD4 в 2 группах младенцев в возрасте 1 года

Показаны частоты цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженные с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Пик общего БЦЖ-специфического ответа Т-лимфоцитов CD4 достигается через 10 недель после вакцинации в группах родов и отсроченной вакцинации. через 10 недель мы измерили общий ответ памяти Т-лимфоцитов CD4, специфичный для БЦЖ, в возрасте 10, 20 и 50 недель.Общие ответы обозначаются БЦЖ-специфическими CD4 Т-клетками, которые экспрессируют IFN-γ, TNF-α или IL-2, по отдельности или в комбинации. В группах родов и отсроченной вакцинации БЦЖ-специфические ответы CD4 достигли пика через 10 недель после вакцинации и постепенно уменьшались в течение первого года жизни ().

Кинетика общих БЦЖ-специфичных ответов Т-лимфоцитов CD4 в группах отсроченной вакцинации и вакцинации при рождении в течение одного года

Средние частоты БЦЖ-специфичных общих цитокин-экспрессирующих CD4 Т-клеток, обнаруженных с помощью краткосрочного анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови при 10, Возраст 20 и 50 недель.

Сопоставимый БЦЖ-специфический фенотип памяти Т-лимфоцитов CD4 в группах рождения и отсроченной вакцинации

Чтобы оценить, приводит ли отсрочка вакцинации БЦЖ к измененному вакцино-специфическому фенотипу памяти Т-клеток CD4, мы охарактеризовали цитокин, экспрессирующий БЦЖ-специфические Т-клетки. Фенотип памяти специфических Т-клеток, определяемый поверхностной экспрессией CD45RA и CCR7, на животных моделях, как было показано, определяет исход вакцинации [17]. Как в группе вакцинации при рождении, так и в группе отсроченной вакцинации эффекторная память (CD45RA-CCR7-, T _EM ) преобладала и во всех временных точках оценивалась (для данных в возрасте 1 года).В возрасте одного года не было значительных различий для T _EM или центральной памяти (T _CM , CD45RA ^— CCR7 ⁺ ) в двух младенческих группах ().

Сравнение фенотипа поверхностной памяти БЦЖ-специфических CD4 T-клеток между двумя группами младенцев в возрасте 1 года

Антигенспецифические CD4 T-клетки были идентифицированы по экспрессии цитокинов с помощью анализа внутриклеточных цитокинов цельной крови. (A) Графики в виде прямоугольников и усов, изображающие фенотип памяти всех BCG-специфичных CD4 T-клеток, проанализированных вместе.(B) Репрезентативные точечные графики поверхностного фенотипа БЦЖ-специфических CD4 T-клеток (точки), наложенные на поверхностный фенотип памяти всех CD4 T-клеток (контурные графики). Медиана представлена ​​горизонтальной линией, межквартильный размах — прямоугольником, а диапазон — усами. U-критерий Манна-Уитни использовался для расчета значений p различий между двумя группами.

Обсуждение

Наше исследование показало, что отсрочка вакцинации БЦЖ от рождения до возраста 10 недель приводит к индукции более высокой частоты детектируемых специфических Т-лимфоцитов CD4.Кроме того, специфические CD4 Т-клетки с большей вероятностью будут полифункциональными в группе отсроченной вакцины, что указывает на повышение «качества» индуцированного БЦЖ ответа.

Наши результаты отличаются от результатов двух предыдущих исследований, в которых не было выявлено различий в индуцированном иммунитете, когда вакцинация БЦЖ откладывалась после периода ближайшего новорожденного [10, 14]. Важно отметить, что в обоих этих исследованиях в качестве результата использовалось только измерение IFN-γ. Наши результаты показывают, что подробное изучение ответа Т-лимфоцитов позволяет провести более полную и контрастную оценку результата.Мы показали, что наиболее разительные различия в индуцированном иммунитете наблюдались в возрасте 1 года, что подчеркнуло важность лонгитюдного дизайна таких исследований. Данные о кинетике иммунного ответа, индуцированного БЦЖ, в детских когортах ограничены, особенно в условиях высокой эндемичности по ТБ.

Иммунные корреляты защиты от туберкулеза, вызванной вакцинацией, неизвестны. Следовательно, остается вопрос, могут ли частоты конкретных клеток, паттерны продукции цитокинов и фенотип памяти важны для долгосрочной защиты от туберкулеза.Большинство вакцинологов сочли бы более оптимальным количественно более высокий антиген-специфический ответ после новой вакцинации против туберкулеза в клинических испытаниях. Это мнение было подтверждено многочисленными исследованиями на животных, которые продемонстрировали, что более высокая частота специфических Т-клеток приводит к улучшенной защите от ТБ [18–20]. Напротив, другие исследования показали, что частота антиген-специфических Т-клеток, индуцированных противотуберкулезной вакциной, не обязательно может коррелировать с исходом после вирулентного M.tb [21–24]. Переменные дизайна исследования, такие как оцениваемый момент времени и проанализированный отсек, могут быть ответственны за эти противоречивые результаты. Кроме того, во многих из этих исследований оценивались специфические ответы Т-клеток только за счет продукции IFN-γ. Защита от ТБ без оптимального ответа IFN-γ невозможна. Однако постулируется, что измерение других цитокинов Th2 в дополнение к IFN-γ позволит лучше оценить «качество» Т-клеточного ответа. Например, наличие полифункциональных Т-клеток, коэкспрессирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2, стало полезным показателем «качественных» иммунных ответов [25, 26].В моделях вакцинации животных против Leishmania major [27] и против туберкулеза [28] стратегии, которые вызывают наибольшую частоту полифункциональных антиген-специфических CD4 Т-клеток, связаны с наилучшей защитой от последующего заражения патогеном. Кроме того, у людей, инфицированных ВИЧ-1, медленное прогрессирование заболевания тесно связано с более высокой частотой полифункциональных ВИЧ-специфических Т-клеток [29].

Классически CD45RA и CCR7 использовались для разделения Т-клеток на 4 подмножества памяти, а именно на наивные клетки (CD45RA ⁺ CCR7 ⁺ , T _Naive ), клетки центральной памяти (CD45RA ^— CCR7 ⁺ , T _CM ), эффекторные клетки памяти (CD45RA ^— CCR7 ^— , T _EM ) и эффекторные клетки памяти, которые повторно экспрессировали CD45RA (CD45RA ⁺ CCR7 ^— , T _EMRA ) [30, 31].Долгоживущие T _CM расширяются в лимфатических узлах и дифференцируются в эффекторные клетки [30]. Напротив, T _EM или более терминально дифференцированные популяции T _EMRA могут немедленно стать домом для эффекторных функций, но их пролиферативная способность и продолжительность жизни ограничены [30]. С гипотетической точки зрения, индукция долгоживущего T _CM должна быть целью вакцинации — эта точка зрения была подтверждена на животных моделях заражения макак вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) [17].Напротив, индукция T _EM или T _EMRA может быть не столь оптимальной, поскольку эти короткоживущие популяции не могут расширяться и более склонны к истощению [32]. Интересно, что в большинстве исследований Т-клеток человека, специфичных к микобактериям, преобладают популяции T _EM и относительно нечасто T _CM [11, 33–35]. Наши выводы подтверждают это; однако не было значительных различий в этих субпопуляциях Т-клеток после отсрочки вакцинации БЦЖ.

Считается, что на иммунитет, индуцированный БЦЖ, влияют многие переменные, как описано во введении выше.Например, Lalor и др. [36] сообщили, что сезонные изменения влияют на ответ IFN-γ у младенцев, вакцинированных БЦЖ, при измерении с помощью стимуляции PPD цельной крови в течение 6 дней. В нашем исследовании в возрасте 50 недель, когда наблюдались наиболее значимые различия в иммунитете, специфичном для БЦЖ, не было значительной разницы в распределении сезона родов между группами отсроченной вакцинации и вакцинацией при рождении. Кроме того, возможно, что различное воздействие микобактерий окружающей среды могло искажать наши результаты, хотя мы считаем это маловероятным, поскольку все младенцы были зачислены из одной географической области.Мы не можем исключить, что другие переменные могли повлиять на результаты.

Почему после отложенной вакцинации БЦЖ иммунный ответ усилился? Иммунный ответ новорожденного часто считается «незрелым» по сравнению с иммунным ответом взрослых [37]. «Незрелый» может быть неправильным названием, поскольку ответ может быть очень подходящим для ребенка, попадающего в мир непрерывного антигенного воздействия, и где чрезмерный иммунитет к этим стимулам может быть вредным. Однако это может привести к неоптимальному ответу на определенные вакцины, такие как БЦЖ.Мы предполагаем, что различная природа иммунитета, индуцированного БЦЖ в возрасте 10 недель, по сравнению с рождением, может быть приписана ранним «созревающим» изменениям иммунитета младенца. Существуют очень ограниченные данные о «созревании» иммунного ответа младенца в течение первых нескольких месяцев жизни, но факторы, которые, возможно, способствовали этому, включают неэффективную функцию антигенпредставляющих клеток, в том числе ограниченную способность продуцировать IL-12 [37], критический цитокин для индукция ответов Th2, характерных для успешного микобактериального иммунитета.Кроме того, данные животных и людей свидетельствуют о том, что иммунная система новорожденного смещена в сторону ответа Th3 [38-40], который может подавлять индукцию иммунитета Th2.

В отличие от многих детских вакцин, которые обеспечивают повышенную защиту при бустинге, было показано, что вторая вакцинация БЦЖ не усиливает защиту [41]. Новые стратегии вакцинации против туберкулеза направлены на повышение иммунитета, вызванного вакциной БЦЖ, за счет использования гетерологичных вакцин. Поэтому крайне важно использовать первичную вакцину наиболее оптимальным образом.Наши результаты показывают, что возраст, в котором вводят БЦЖ, может быть критической переменной. Следующим шагом будет подтверждение этих результатов в другой когорте до проведения более крупных исследований, чтобы оценить, приводит ли отсроченная вакцинация к усилению защиты от заболевания туберкулезом. В этом случае потребуется всесторонняя оценка последствий отсрочки вакцинации БЦЖ до возраста 6–14 недель, когда другие детские вакцины вводятся регулярно.

Страница не найдена | ЗдоровьеEd

Ключевое слово или код ресурса:

Ключевое слово или код ресурса:

Ресурсы

Сайт

Тема здоровья: Тема здоровьяАстмаКоррекции здоровьяЗдоровье детейМладенцы и дети ясельного возрастаДети (3 года +) Программа Well ChildДиабетЗдоровье окружающей средыЗдоровое питаниеСлышаниеHPA — Агентство по укреплению здоровьяHPA — Минимизация вреда от азартных игрHPA — Питание и физическая активностьHPA — Профилактика рака кожи — иммунизация SunSmart 6 месяцев (вакцинация при рождении) –12 лет) Вакцина против рака шейки матки (девочки, 12–18 лет) Национальный регистр иммунизацииИнфекционные заболевания и вирусыМужское здоровьеПсихическое здоровьеФундация психического здоровьяНациональные программы скринингаНациональная программа скрининга кишечникаПрограмма скрининга шейки матки Скрининг груди Скрининг AotearoaБеременность и скрининг новорожденныхЗдоровье молодых мигрантовЗдоровье здоровьяПоддержка здоровьяФизическая активность здоровье — прочее

Предпочтительный язык: ЯзыкАмхарскийАрабскийБурманскийКамбоджийско-кхмерскийКитайский, УпрощенныйКитайский, ТрадиционныйКитайский, Маори Островов КукаАнглийскийФиджийскийГуджаратиХиндиЯпонскийКирибати (Гильбертский) КорейскийМаориНиуэйскийNZ Язык жестовПерсидский (Фарси) ПунджабиПушанто-Афганский

Предпочтительный формат: Формат A3, сложенный в блокнот A4, 25 дубликатов листов, блокнот A4 из 20 листовок, блокнот A4 из 50 листовок, блокнот A5 из 100 листовок, блокнот A5 из 20 листовок, блокнот A5 из 25 листовок, блокнот A5 из 50 листовок, Буклет 150 x 148 мм, буклет A4, буклет A5, буклет размера компакт-диска SizeCard, размер кредитной карты с магнитомDVDДокумент ExcelFlip chartСложенная карта, размер кредитной картыЛистец A4Листец A4 (только онлайн) Leaflet A5Leaflet DLEOnline onlyPack из шести листовок A2Poster A3Poster A4Sign A4Стандартный знак 60 мм x 70 мм Наклейка 200 мм x 50 мм Наклейка 210 мм x 100 мм Наклейка 80 мм x 53 мм Наклейка A5 Наклейка A6 Наклейка: листВидеоКарточка размером с кошелекСлово документ

Организация: Организация Фонд астмы и респираторных заболеванийИзменение для наших детей Департамент исправительных учрежденийАгентство по продвижению здоровьяКомиссия по качеству и безопасности здравоохранения Новой Зеландии Фонд психического здоровьяМинистерство здравоохраненияНациональное скрининговое отделение Поиск

вакцинация БЦЖ для младенцев | nidirect

Вакцинация против бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) проводится новорожденным с риском заражения туберкулезом (ТБ).Туберкулез — очень серьезное инфекционное заболевание, которое может вызвать туберкулезный менингит у младенцев.

Как действует вакцина БЦЖ

Вакцина БЦЖ имеет ослабленную форму бактерий, вызывающих туберкулез (ТБ).

Вакцина не вызывает туберкулез, но помогает вашему ребенку развить защиту (иммунитет) против болезни.

Вакцинация БЦЖ особенно эффективна для защиты младенцев и детей раннего возраста от более редких тяжелых форм туберкулеза, таких как туберкулезный менингит (отек слизистой оболочки головного мозга).

Туберкулез

ТБ — серьезное, но излечимое инфекционное заболевание, которое может привести к туберкулезному менингиту у младенцев.

Большинство людей в Северной Ирландии полностью выздоравливают после лечения, однако туберкулезный менингит может привести к летальному исходу или серьезной инвалидности.

Как передается туберкулез

Вы можете заразиться туберкулезом только от того, кто кашляет, чьи легкие или горло уже инфицированы туберкулезом.

При кашле выделяются крошечные капельки, содержащие бактерии. Если вы вдохнете капельки, вы тоже можете заразиться инфекцией.

Обычно вам необходимо провести длительное время в тесном контакте с инфицированным человеком (с туберкулезом в легких или горле), прежде чем вы заразитесь туберкулезом.

Симптомы туберкулеза

ТБ может поражать любую часть тела. Вам следует обратиться к врачу, если вы или ваш ребенок:

• кашель, который длится дольше трех недель
• лихорадка
• пот, особенно ночью
• необъяснимая потеря веса
• общее и необычное чувство усталости и беспокойства плохое самочувствие
• кашель с кровью

При вакцинации БЦЖ

Вакцина вводится младенцам, если они могут вступить в контакт с больным туберкулезом.

Сюда входят младенцы, которые:

• живут в районе с высоким уровнем заболеваемости туберкулезом
• имеют родителей или бабушек и дедушек из страны с высоким уровнем заболеваемости туберкулезом

Вакцина предлагается, когда ваш новорожденный ребенок находится в больнице или после того, как принесете домой ребенка.

Как вводится вакцина

Вашему ребенку сделают вакцинацию БЦЖ в верхней части левой руки.

Возможные побочные эффекты

Сразу после инъекции появится приподнятый волдырь.Это показывает, что инъекция была сделана правильно.

В течение двух-шести недель после инъекции появится небольшое пятно. Это может быть довольно болезненно в течение нескольких дней, но, если вы не прикрываете его, оно должно постепенно зажить. Это может оставить небольшой шрам.

Иногда у вашего ребенка может появиться неглубокая язва в месте укола. Если это сочится жидкостью и ее необходимо прикрыть, используйте сухую повязку, но не пластырь, пока не образуется струп. Заживление этой язвы может занять несколько месяцев.

Если вы беспокоитесь или думаете, что в язву заразилась инфекция, обратитесь к врачу.

Запрос вакцинации БЦЖ

Вакцина предлагается только людям с повышенным риском заражения туберкулезом. Вы или ваш ребенок будете обследованы, чтобы проверить, имеете ли вы право на вакцинацию.