Бифидумбактерин для кошек в каких пропорциях давать?
Средства от расстройства пищеварения для домашних любимцев всегда должны быть под рукой у каждого хозяина. Лучше всего выбрать «Бифидумбактерин для кошек» (дозировка его указана в инструкции). «Бифидумбактерин» для кошек — это очень действенное и эффективное средство.
Расстройство пищеварения у котов и кошек случается достаточно часто. Особенно это касается животных, которые регулярно бывают на улице и могут «полакомиться» чем-то несвежим и запрещенным. Поэтому их владельцам стоит заранее запастись средствами, которые позволят быстро и просто избавиться от таких проблем.
Очень популярным на сегодняшний день является препарат «Бифидумбактерин». Это действенный и эффективный пробиотик, который нормализует микрофлору кишечника и в целом налаживает работу всего желудочно-кишечного тракта. Он помогает справиться не только с временным расстройством пищеварения, но также и с более серьезными регулярными проблемами. Особенно актуально давать его животному при хронических запорах, при нарушениях работы желудочно-кишечного тракта, а также при аллергии (чтобы избежать возможного нарушения пищеварения).
Специалисты рекомендуют также применять такое лекарство в тех случаях, если кот или кошка проходит курс лечения антибиотиками, часто более ОРВИ, подвергается сильным стрессам и т.д. При этом препарат используется в качестве профилактического средства, которое помогает избежать многих серьезных проблем со здоровьем своего домашнего любимца.
«Бифидумбактерин» на сегодняшний день в продаже можно найти в самых разных лекарственных формах. Покупателю удастся выбрать из них наиболее оптимальную и удобную для себя. Это свечи, таблетки или специальный порошок в миниатюрных флаконах. В целом можно наловчиться давать животному лекарство в любой из перечисленных форм. Но удобно, что есть такой большой выбор для каждого владельца домашних питомцев.
В состав такого препарата входят высушенные особым образом живые активные бифидобактерии. Именно благодаря им лекарство получилось не только действенным, но еще и безопасным. Никаких вредных химических веществ в его составе не содержится.
Также важно отметить, что обсуждаемое средство разрешено давать даже маленьким котятам. Главное, чтобы малыши были старше двух недельного возраста. Особенно актуально применять такое лекарство для котят при поносе. Например, часто проблема возникает при переходе с материнского молока на обычный корм. Особенно, если он был совершен слишком резко. «Бифидумбактерин» поможет наладить пищеварение и быстро перестроиться на новый тип питания без каких-либо последствий для организма.
Проще всего применять средство именно в виде порошка. Один флакон лекарства — это одна порция для взрослых животных. Перед его использованием потребуется налить небольшое количество кипяченой воды (лучше всего комнатной температуры) в чашку. Достаточно будет приблизительно 5 чайных ложек жидкости. Далее аккуратно открывается флакон с лечебным препаратом, в него добавляется пара капель воды, емкость встряхивается и выливается в заранее подготовленную чашку. Главное, чтобы при встряхивании лекарство растворилось.
Далее средство полностью готово к употреблению животным. Очень важно, чтобы кот или кошка употребили его как можно быстрее. Хранить препарат в разведенном виде дольше 5 часов категорически запрещено. По прошествии этого времени его придется просто вылить.
Готовое лекарство при помощи пипетки потребуется дать кошке. Можно просто залить его в пасть животному. Но, как правило, такая крайняя мера требуется лишь для котят. Взрослые животные сами лакают лечебную жидкость. Состав ингредиентов подобран таким образом, что вкус препарата нравится практически всем представителям семейства кошачьих.
Если котенок младше 6 месяцев, то ему достаточно будет принимать половину указанной порции. Тогда лекарство из флакона можно будет просто разделить на два раза. В период лечения животное рекомендуется минимально кормить и давать ему исключительно молочные продукты.
Если давать препарат животному 2-3 раза в день (например, утром в обед и вечером), то полного излечения от расстройства пищеварения удастся добиться приблизительно за одни сутки. Иногда это срок приходится увеличивать до двух-трех суток.
инструкция по применению с дозировкой. Можно ли давать человеческий препарат животным при поносе?
Хозяин четвероногого лучшего друга всегда радуется, когда его собачка здорова. Однако, к сожалению, неприятности случаются и у домашних любимцев. Например, у них появляется такое патологическое состояние, как диарея.
Пёс при этом может плохо кушать, часто ходить по большой нужде. Стул при этом у собаки становится жидким и зачастую может изменять свой цвет. Однако такое состояние домашнего питомца может быть вызвано не только инфекциями. Диарея может быть лекарственной.
Лекарственная диарея
Таковой чаще всего она является при длительном применении антибактериальных препаратов, что неминуемо приводит к уничтожению, уменьшению или увеличению количества условно-патогенных микроорганизмов и сапрофитов кишечника собаки. Это состояние обозначается термином «дисбактериоз».
В таком случае для оказания медицинской помощи любимцу необходимо давать медикаментозные препараты, нормализующие микрофлору толстой кишки животного. Одним из таких препаратов на слуху многих людей является пробиотик бифидумбактерин.
Можно ли использовать препарат?
Применение данного лекарственного средства допускается ветеринарными врачами, так как домашним питомцам (в том числе и собакам) от него становится лучше.
Внимание! Назначение и расчёт дозировки для каждой собаки производится строго индивидуально и только врачом ветеринарной медицины. Если здоровье собаки важно хозяину, то не следует заниматься самолечением.
При поносе
Именно диарея является основным показанием к применению описываемого лекарственного препарата в отношении собак.
Другие показания
Данный препарат назначается врачом ветеринарной медицины, как правило, в следующих случаях:
- лекарственная диарея;
- нарушение аппетита, связанное с длительным применением антибактериальных средств;
- диарея и нарушение пищеварения без клинических проявлений общей интоксикации организма животного.
Форма выпуска
Справка. Бифидумбактерин – это человеческий препарат, содержащий в себе бифидобактерии. Он дозирован с учётом параметров именно человеческого организма.
Описываемый медикаментозный препарат имеет две формы выпуска: порошок во флаконах и капсулы. Одна капсула, как и один флакон, содержат в себе пять доз средства. Так как собаки бывают абсолютно разных размеров с абсолютно различными массами тела, дозировка для каждого пса подбирается строго индивидуально.
В ветеринарной медицине принято рассчитывать каждое лекарство на 1 килограмм массы тела животного. С бифидобактерином такая же ситуация. Так как капсулы разделить на части определённого размера не представляется возможным, лучше всего для собаки использовать препарат в виде порошка.
Он легко поддаётся дозированию, легко разводится обычной чистой водой. К тому же, имеет не совсем отвратительный вкус. Некоторые хозяева отмечают, что их подопечные сами могли слизать раствор с ложки.
Человеческий
Бифидумбактерин является только лишь человеческим препаратом, распространяющимся лишь обычными аптечными сетями каждого города. Специальная ветеринарная форма для собак не разработана.
В связи с этим возникает вопрос, можно ли давать питомцам человеческий бифидумбактерин? Ответ — да, данный препарат в правильно рассчитанной дозировке не нанесёт питомцу никакого вреда, а лишь будет полезен.
Инструкция по применению
Дозировка
Так как каждая собака имеет свои размеры и массу тела, для каждой собаки существует своя дозировка. Не существует строго универсальных критериев для определённых пород. В среднем, 1 доза препарата рассчитана на 10 кг массы тела собаки. В день домашний питомец должен получить не менее трёх доз на 10 кг массы тела в три приёма.
Справка. Одна доза лекарства должна быть растворена в одной чайной ложке чистой воды. Бифидумбактерин в пищу лучше не добавлять.
Как давать?
Разведённый бифидумбактерин можно дать псу различными методами:
- Если собаке нравится препарат, она самостоятельно его слижет с ложки.
- У собак с другими вкусами всё несколько иначе. Необходимо несколько приподнять мордочку собаки кверху и открыть пасть. После открытия её нужно быстро вылить суспензию препарата как можно ближе к глотке, чтобы собака проглотила полную дозу.
Если стало плохо
Бифидумбактерин – это препарат с живыми бактериями бифидум. Как правило, плохо собакам становится редко даже при передозировке. Однако бывает всякое. Обычно в таком случае помогает прекращение приёма препарата. Однако собаку обязательно нужно показать ветеринару для выяснения, что же могло повлечь за собой такую реакцию.
Беременным, кормящим и щенкам
Бифидумбактерин отлично переносится собаками любого возраста, пола и породы.
Применение данного пробиотика допускается даже у щенков, возраст которого не превышает и нескольких часов от роду. Но самостоятельно применять его не стоит. Необходимо обязательно показать заболевшего малыша ветеринарному врачу для назначения адекватного лечения и наиболее точной и правильной дозировки всех препаратов.
При наличии показаний к применению бифидобактерин используют у беременных и кормящих сук.
Отзывы
Владельцы
1. «У меня кабель немецкой овчарки. Масса тела 56 кг. Как-то однажды случилось у него кишечное расстройство. Его рвало, тошнило, поносило. Он практически ничего не ел. Иногда просто приходил попить водички. Нам врач-ветеринар в клинике взял анализы и назначил антибиотики. Мы их прокололи.
Чарли стало гораздо лучше. Он уже сам просился на улицу, больше пил, меньше спал. Однако осталась одна проблема: он всё ещё отказывался кушать. Я уже пробовала ему покупать его любимые вкусняшки, но всё без толку. И тут я вспомнила, что у меня дома был бифидумбактерин.
Я позвонила нашему ветеринару и уточнила, можно ли попробовать дать Чарли этот препарат и сколько. Врач сказал, что его применение допускается и давать на наш вес нужно 5 доз три раза в сутки. Как раз нам не пришлось заморачиваться с делением препарата, так как во флаконе как раз 5 доз.
Я его развела в тёплой водичке и дала Чарли. Он слизывал препарат с ложечки самостоятельно. Видимо, ему понравилось. В итоге уже после второго приёма он охотно попросил у меня покушать! А уже через сутки Чарли вернулся к своему привычному образу жизни и кормления».
2. «Мы длительное время лечили нашу Матильду от респираторной инфекции антибиотиками. И тут наша красавица начала как-то странно ходить в туалет. Стул у неё стал неоформленным и жидким. Матильдочку это очень беспокоило, как и нас с мужем. Вечером мы отвезли любимицу к ветеринару.
Нам сказали, что такая диарея обусловлена действием антибиотиков на бактерии, которые обычно живут в кишечнике. Поэтому нам посоветовали принимать пробиотики.
Так как было уже достаточно поздно, и ветеринарная аптека была закрыта, мы спросили, можно ли купить что-нибудь человеческое, чтобы не ждать утра и начать помогать нашей крошке уже по приезду домой. Доктор нам рассказал, какие бывают пробиотики, которые можно давать собакам.
Мы заскочили в ближайшую круглосуточную аптеку. Наш выбор пал на бифидумбактерин в виде порошка. Дома растворила его по схеме, описанной доктором, и дала Матильде. Утром повторила.
Когда пришла домой с работы, не увидела нигде остатков жидкого кала в квартире. Так как муж был всё это время на работе, я поняла, что малышку мою больше не поносит! Во время прогулки Матильда сделала свои «большие дела» уже как положено здоровой собаке. Я очень довольна применением этого лекарства!»
Ветеринар
«Бифидумбактерин показывает свою эффективность в случае его назначения мною и моими коллегами. Однако такое случается редко. Существует множество аналогов, которые имеют специализированную ветеринарную форму для улучшения эффективности и простоты использования препарата.
Однако если пробиотик необходимо давать уже сейчас, а приобрести тот же лактобифадол не представляется возможным, мы рекомендуем применение обычного человеческого бифидумбактерина».
Чем заменить?
Существует несколько пробиотических лекарственных средств, которые приспособлены для употребления животными (в том числе и собаками). К таковым относятся:
- Лактобифадол;
- Ветом;
- Велес;
- Бифидум;
- Бактонеотим и многие-многие другие.
Важно! Выбирать следует тот пробиотик, который содержит в себе несколько десятков миллионов бактерий. Желательно, чтобы штаммов было не менее 10.
Заключение
Бифидумбактерин – человеческий лекарственный препарат, хорошо проявивший себя как препарат резерва при различных видах диареи, проходящей с нарушением микрофлоры кишечника у животных. Его применение достаточно эффективно в отношении заболевшей собаки.
Вконтакте
Одноклассники
Мой мир
Бифидумбактерин кошке: инструкция по применению
Несмотря на то, что кошки считаются весьма чистоплотными животными, и они болеют. Часто домашним питомцам назначают такой препарат как Бифидумбактерин для кошек. От болезней не застрахован никто, но вот какова будет продолжительность болезни, каково ее течение во многом зависит от хозяина.
Ведь важно на самом начальном этапе вовремя привезти кошку на осмотр к ветеринару для постановки точного диагноза, возможно, сдать необходимые анализы и проследить за эффективным лечением. Ко всему этому нужно быть готовым. Это и временные затраты и конечно же, денежные. Но как говорится, кошка становится полноправным членом семьи, и лечить ее нужно также как и любого другого члена семьи.
© shutterstock
Полезные лекарства в аптечке
В каждой кошачьей аптечке должно быть средство от поноса и внезапной рвоты у кошек, отлично подойдет для этих целей Бифидумбактерин. Ветеринары считают это средство действенным и достаточно эффективным. Особенно это касается владельцев кошек, которые любят гулять сами по себе и часто посещают улицу. Там они могут съесть несвежую пищу, что и приведет к рвоте и возникновению расстройства кишечника.
Бифидумбактерин является современным препаратом, это пробиотик, основное действие которого заключено в нормализации работы желудочно-кишечного тракта. Его назначают не только при запорах, при поносе у кота Бифидумбактерин также будет необходим. Этот препарат можно использовать как при хроническом течении заболеваний, так и при временной проблеме. С осторожностью нужно использовать препарат, если кошка страдает от хронических запоров, а также, если животное подвержено аллергии.
Также будет полезно применение Бифидумбактерина при частых и затяжных вирусных заболеваниях, если кошка принимает антибиотики и с целью профилактики. Ведь все помнят, болезнь легче предупредить, чем лечить.
О препарате
Перед покупкой лучше посоветоваться с ветеринаром, поскольку препарат выпускается в разных лекарственных формах:
- таблетки;
- свечи;
- порошковая форма, в специальных флаконах.
Для каждого случая подбирается наиболее приемлемая форма, в том числе многое зависит от особенностей характера кошки. И тут уже нужно принимать решение хозяину, ведь он знает свою кошку как никто другой. Если кошка может проглотить таблетку Бифидумбактерина, то проблемы не существует, но не все животные это могут сделать. Для некоторых кисок этот момент превращается в настоящую пытку.
© shutterstock
В составе препарата живые и активные Бифидобактерии, но они на производстве высушиваются специальным образом. Все это позволяет говорить о безопасности продукта, ведь в качестве добавок химические вещества не используются. Именно поэтому Бифидумбактерин рекомендуется к использованию котятам, но старше 2-х недельного возраста.
Часто у малышей случается расстройство стула при переходе на корм после маминого молока. В таком случае будет актуальным назначение данного препарата. Важно помнить! Малышей нельзя резко переводить на взрослый корм. Применение Бифидобактерина в качестве лекарства поможет максимально быстро наладить стул котенка.
По отзывам хозяев удобнее всего использовать порошок. В одном флаконе содержится суточная дозировка Бифидумбактерина кошке.
А есть ли альтернатива?
Часто ветеринары назначат аналогичные по своему действию препараты, по разным причинам:
- стоимость;
- отсутствие в продаже;
- просто нравится какой-то один препарат.
Например, Бифидумбактерин можно заменить аналогами: Лактобифадол, Бифидум — схж или Лактобактерин. Но здесь уже нужно прислушиваться к рекомендациям лечащего врача-ветеринара. Только он может решать какой из препаратов будет наиболее эффективен в данном конкретном случае.
© shutterstock
Какие симптомы устраняет
Как уже писалось выше, назначается Бифидумбактерин при рвоте и расстройстве стула у кошек. Но эти симптомы могут быть у достаточно серьезных заболеваний, а значит нужно сначала правильно диагностировать заболевание, а уже потом принимать лекарство, в качестве основного или дополнительного средства.
Дозировка рассчитывается с учетом веса животного. Например, для котенка весом менее 2 кг, можно давать не целую капсулу, а ее половину, предварительно капсулу Бифидумбактерина раскрыв и аккуратно разделив содержимое.
Давать при рвоте Бифидумбактерин кошке, нужно по схеме, рекомендованной в инструкции. Нежелательно увеличивать самостоятельно дозу препарата.
Если выбран порошок, то важно помнить, что в разведенном виде давать котам Бифидумбактерин можно в течение 5 часов, затем его необходимо будет выбросить. Этот действенный препарат способен снять симптомы рвоты и расстройства кишечника за сутки, если принимать его 2-3 раза в день. В некоторых случаях организм кошки справляется с проблемой за 2-3 дня.
биологически активная добавка к пище «Бифидумбактерин БАД для детей от 6 месяцев до 3 лет» (без ароматизатора, с ароматом яблока) (порошок в пакетах по (0,9+/-0,1) г)
| Токсичные элементы (мг/кг, не более): свинец | 1,0 |
| кадмий | 0,05 |
| ртуть | 0,01 |
| мышьяк | 0,5 |
| Пестициды, мг/кг не более, ГХЦГ (сумма изомеров) | 0,05 |
| ДДТ и его метаболиты мг/кг, не более | 0,05 |
| гептахлор, мг/кг, не более | не допускается <0,002 |
| алдрин, мг/кг, не более | не допускается <0,002 |
| Микробиологические показатели : | |
| БГКП в 1,0 г | не допускаются |
| E.coli в 5 г | не допускаются |
| S.aures в 1,0 г | не допускаются |
| Количество микроорганизмов вида Bifidobacterium bifidum 200000000 , КОЕ/г, не менее | |
| Патогенные, в том числе сальмонеллы в 10,0 г | не допускаются |
| Дрожжи, КОЕ/г, не более | 50 |
| Плесени, КОЕ/г, не более | 50 |
| Состав: лиофилизированная биомасса бифидобактерий №1, лактоза |
Как разводить бифидумбактерин в разных случаях?
Сегодня мы узнаем, как принимать бифидумбактерин. Этот препарат помогает многим людям, и есть много показаний к его приему. Только не все понимают, как правильно принимать это средство. Многое зависит от возраста пациента, а также от его болезни. Главное преимущество — единственное противопоказание — индивидуальная непереносимость препарата. Даже во время беременности и кормления грудью можно принимать это лекарство. Но как его развести и какие дозировки для этого используются?
Прием пищи
Итак, первое, что нужно помнить, это принимать лекарство только запивая жидкостью.Без него не даст видимого результата. Как развести бифидумбактерин?
В инструкции написано, что можно просто растворить два пакетика препарата в воде или любой другой жидкости. Конечно, разовую дозу придется выпить полностью. Принимать бифидумбактерин следует за полчаса до еды. Таким образом, он лучше усваивается. Допускается принимать препарат и через час после еды.
Капсулы
Далее следует учитывать форму выпуска лекарства. Бифидумбактерин на данный момент в современной фармакологии может быть представлен как капсулами, так и порошком.Иногда можно встретить его в виде ампул.
Указано, что капсулы нельзя разводить. Они растворяются прямо в желудке. Поэтому, если вы думаете, как развести бифидумбактерин, просто проглотите 2 капсулы и запейте небольшим количеством воды (или любого другого напитка). Это касается только взрослых пациентов. О частоте приема мы расскажем чуть позже.
Капсулы для детей
Как быть, если необходимо дать ребенку средство, а у вас препарат в капсулах (бифидумбактерин)? Как его развести в таком случае? Первое, что нужно сделать, это открыть капсулу и вылить ее содержимое в столовую ложку.Осталось только смешать порошок с небольшим количеством воды. Жидкость желательно влить прямо в ложку.
Теперь узнаем, какой температуры должна быть вода. Как разводить бифидумбактерин, который однозначно вне зависимости от формы выпуска следует хранить в холодильнике. Из этого можно сделать вывод, что нагревание этого препарата противопоказано. Столовую ложку содержимого одной капсулы рекомендуется залить кипяченой водой 40-градусной температуры. Ни в коем случае нельзя использовать горячую жидкость.По краям наливается вода, и полученная масса аккуратно перемешивается. Эту смесь ребенок сразу же принимает внутрь. Затем можно выпить бифидумбактерин несколькими глотками любого напитка.
Ампулы
Как развести бифидумбактерин в ампулах? Еще один вопрос, интересующий многих. Особенно родители, так как этот препарат часто назначают детям. Если вы прочитаете информацию на флаконе, то увидите, что концентрация вещества в контейнере составляет 10 доз.Следовательно, необходимо разбавить лекарство. Одна чайная ложка — это разовая доза. Поэтому, если вам нужно разделить бифидумбактерин на 5 частей, вам придется добавить 5 чайных ложек кипяченой воды комнатной температуры. Этот вариант рассчитан на полный день (2 приема). Этот момент обязательно нужно учитывать.
Порошок для взрослых
Что делать, если взрослому назначен бифидумбактерин в порошке? Как вырастить порошок для приема внутрь взрослым? Если это обычная дозировка, то вам потребуется 100 миллилитров воды.Это должна быть только кипяченая вода. Доведите до комнатной температуры, затем растворите в жидкости 2 пакетика препарата. А затем выпейте полученный раствор за один раз.
Получается, что на один пакет нужно около 50 миллилитров жидкости. При обычной дозировке необходимо, как уже было сказано, растворить 2 пакета и принимать полученный раствор 2-3 раза в день. Больше в дозировке и схемах для взрослых особых особенностей нет. Но если вы думаете о том, чтобы дать лекарство новорожденному, вам придется очень постараться.Ведь необходимо соблюдать не только пропорции, но и некоторые рекомендации.
До одного года
Для повышения уровня бифидумбактерия у новорожденного необходимо соблюдать особые правила. Взрослым и детям от 3 лет необходимо растворить порошок или содержимое капсул в простой воде или любом другом напитке. Но малышам до года такой способ приема не работает.
Дело в том, что если вы думаете, как сажать бифидумбактерин новорожденным, придется употреблять кисломолочный продукт, искусственную смесь или грудное молоко.В кипяченой воде развести малышей этим средством можно, но только это не лучшее решение.
Набрать немного грудного молока или теплой искусственной смеси (комнатной температуры) и растворить в жидкости 1 пакетик препарата. Примерный объем жидкости 30-50 миллилитров. При этом должна получиться неоднородная масса с черными частицами сорбента. Полностью дается ребенку для приема внутрь. Процесс лечения повторяют 2-3 раза в день. Это точная схема, показывающая, как разводить бифидумбактерин.
Но помните: давать препарат детям необходимо непосредственно во время кормления. Желательно сначала предложить малышу раствор, а потом полностью его накормить.
Дозировка
Теперь можно остановиться на дозировках препарата. Распространенная схема следующая: взрослым по 2 упаковки / капсулы 3-4 раза в день, новорожденным по 1 пакетику до 3 раз в день, детям от 3 лет 3-4 раза в день по 1 дозе лекарства.
Острые кишечные инфекции требуют увеличения дозы, но решение принимает исключительно гастроэнтеролог.Если это хроническое заболевание ЖКТ, дозировка значительно увеличивается — с 25 до 50 доз до 3-х раз в сутки для взрослых. А продолжительность лечения в среднем составляет около 2 недель.
Для профилактики бифидумбактерина. О том, как его разводить, рассказано выше. Но как часто нужно использовать этот препарат в профилактических целях? 2-3 раза в год в течение 10 дней (иногда до 3 недель) взрослым и детям старше 36 месяцев следует принимать 1-2 упаковки / капсулы максимум 2 раза в день.Малышам старше года назначают ровно 1 дозу препарата 1 раз в сутки. Именно эти правила можно увидеть в инструкции к бифидумбактерину.
В статье рассказывается, как развести бифидумбактерин в том или ином случае, а также сколько длится курс лечения различных заболеваний у детей и взрослых. Если врач назначил бифидумбактерин, то он подробно расскажет пациенту и его семье о правилах разведения лекарства до желаемого состояния.
Количественное определение жизнеспособных клеток Bifidobacterium bifidum BF-1 в кале человека с использованием моноазида пропидия и штамм-специфичных праймеров
Abstract
Мы разработали метод на основе ПЦР для обнаружения и количественного определения жизнеспособных клеток Bifidobacterium bifidum BF-1 человека кал.В этом методе (PMA-qPCR) используется моноазид пропидия (PMA) для отличия жизнеспособных клеток от мертвых и количественная ПЦР с использованием набора BF-1-специфических праймеров, разработанного на основе результатов анализа полиморфной ДНК с произвольной амплификацией. Во время длительного культивирования (10 дней) количество жизнеспособных клеток BF-1, обнаруженное путем подсчета количества КОЕ на модифицированном агаре MRS, путем измерения содержания АТФ, преобразованного в КОЕ, и при использовании PMA-qPCR снизилось примерно с 10 . От 10 до 10 6 клеток / мл; Напротив, общее количество (жизнеспособных и мертвых) клеток BF-1, обнаруженное путем подсчета клеток, окрашенных 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), и с использованием qPCR без PMA и qPCR с обратной транскрипцией, оставалось постоянным.Количество жизнеспособных клеток BF-1 в образцах фекалий, обнаруженных с помощью PMA-qPCR, было высоко и значительно коррелировало с количеством жизнеспособных клеток BF-1, добавленных в образцы фекалий, в диапазоне от 10 5,3 до 10 10,3 клеток / г кала (сырой вес) ( r > 0,99, P <0,001). После приема 12 здоровых субъектов от 10 10,3 до 10 11,0 КОЕ BF-1 в кисломолочном продукте ежедневно в течение 28 дней, 10 4,5 ± 1,5 (среднее ± стандартное отклонение [SD]) BF-1 КОЕ / г был обнаружен в образцах фекалий с использованием штамм-специфичного селективного агара; напротив, 10 6.2 ± 0,4 жизнеспособных клеток BF-1 / г детектировали с помощью PMA-qPCR, и всего 10 7,6 ± 0,7 клеток BF-1 / г определяли с помощью qPCR без PMA. Таким образом, количество жизнеспособных клеток BF-1, обнаруженных с помощью PMA-qPCR, было примерно в 50 раз выше ( P <0,01), чем количество, обнаруженное зависимым от культуры методом. Мы пришли к выводу, что штамм-специфичная PMA-qPCR может использоваться для быстрой и точной оценки жизнеспособного BF-1 в кале.
ВВЕДЕНИЕ
В желудочно-кишечном тракте человека бифидобактерии представляют собой численно важную группу микроорганизмов, которые, как считается, оказывают положительное влияние на биологическую активность, связанную со здоровьем хозяина (1–4). Bifidobacterium bifidum штамм YIT 10347 (BF-1) был выделен из B. bifidum YIT 4007 как устойчивый к кислороду штамм, и он используется в качестве закваски для производства кисломолочных продуктов. Употребление ферментированного молока, содержащего BF-1, может улучшить желудочные симптомы, вызванные инфекцией Helicobacter pylori (5), а BF-1 влияет на регуляторные механизмы в клетках человека, особенно на экспрессию ядерного фактора каппа B (NF-κB), которая индуцируется автор: H.pylori (6).
Общепринятое определение пробиотиков было предложено Продовольственной и сельскохозяйственной организацией (ФАО) и Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) (7). «Пробиотики — это живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью хозяина». Поэтому для определения эффективности пробиотиков важно разработать конкретный метод их выявления и количественной оценки (8).
Во-первых, мы разработали штамм-специфический метод обнаружения и идентификации BF-1, основанный на традиционном методе культивирования.Поскольку BF-1 устойчив к эритромицину и стрептомицину (9), мы использовали селективный агар, содержащий трансгалактозилированный олигосахарид-эритромицин-стрептомицин (T-EMSM), с последующей штамм-специфической идентификацией колоний на чашке агара с помощью случайного амплифицированного полиморфизма ДНК. (RAPD) снятие отпечатков пальцев (10). Однако такие основанные на культуре методы требуют значительного времени, труда, опыта и навыков.
Таким образом, растет интерес к разработке основанных на быстрой ПЦР методов для выявления штаммов (11–13) и определения жизнеспособности клеток (14–17).Недавно был описан метод количественного определения жизнеспособных клеток, специфичных для штаммов (18). В этом методе используется комбинация интеркалирующего красителя, моноазида пропидия (PMA) (который избирательно проникает в мертвые клетки через их поврежденные клеточные мембраны и ковалентно связывается с их ДНК в ярком видимом свете) и штамм-специфичных праймеров для количественной ПЦР (qPCR).
Здесь мы разработали основанную на ПЦР процедуру для обнаружения и количественного определения жизнеспособных клеток BF-1 в фекалиях. Процедура сочетает использование PMA с qPCR с использованием штамм-специфичных праймеров, разработанных на основе BF-1-специфических последовательностей, полученных в результате анализа RAPD.Мы использовали этот метод для изучения изменений проницаемости мембран клеток BF-1 в условиях длительного культивирования и после обработки искусственным желудочным соком. Мы также успешно использовали эту технику для количественного определения жизнеспособных клеток BF-1 в кале субъектов, которые принимали ферментированное молоко, содержащее BF-1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эталонные штаммы и условия культивирования.
127 бактериальных штаммов (30 штаммов B. bifidum и 97 штаммов других бактерий, обычно выделяемых из фекалий человека) () были получены из коллекции культур Центрального института Якульт (YIT) (Токио, Япония).Анаэробные бактерии культивировали при 37 ° C в течение 1-2 дней в бульоне GAM (модифицированный «Nissui»; Nissui Pharmaceutical, Токио, Япония) с добавлением 0,5% глюкозы. Молочнокислые бактерии культивировали в бульоне MRS (Becton, Dickinson, Sparks, MD) при 37 ° C в течение 1 дня. Поскольку для количественного стандарта ПЦР необходимо было знать количество клеток, клетки BF-1 окрашивали 4 ‘, 6-диамино-2-фенилиндолом (DAPI) в монтажной среде Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) и считали как описанный Fujimoto et al.(11).
Таблица 1
Бактериальные штаммы, использованные в данном исследовании
| Род | Штаммы |
|---|---|
| Bacteroides | B. caccae YIT 1059 YIT 6162 T , B. eggerthii YIT 10227 T , B. fragilis YIT 6158 T , B. ovatus YIT 6161 T , B. thetaiotaomicron YIT 6163 T , Б.uniformis YIT 6164 T , B. vulgatus YIT 6159 T |
| Bifidobacterium | |
| B. bifidum | B. YIT 4039 T , YIT 4042 (ATCC 11863), YIT 4069, YIT 4070, YIT 10987, YIT 10988, YIT 10990, YIT 10991, YIT 10992, YIT 10993, YIT 10994, YIT 10995, YIT 10996, YIT 10997, YIT 10998, YIT 10999, YIT 11000, YIT 11001, YIT 11002, YIT 11003, YIT 11004, YIT 11005, YIT 11007, YIT 1100, YIT 11009, YIT 11010, YIT 11011, YIT 11012, YIT 10347 (BF-1) |
| Не B.bifidum | B. adolescentis YIT 4011 T , B. angulatum YIT 4012 T , B. animalis subsp. animalis YIT 4044 T , B. animalis subsp. lactis YIT 4121 T , B. asteroides YIT 4033 T , B. boum YIT 4091 T , B. breve YIT 4014 T , B. breve YIT 12272, B. catenulatum YIT 4016 T , B.choerinum YIT 4067 T , B. coryneforme YIT 4092 T , B. cuniculi YIT 4093 T , B. dentium YIT 4017 T , B. gallicum YIT 4085 T , B. gallinarum YIT 4094 T , B. indicum YIT 4083 T , B. longum subsp. infantis YIT 4018 T , B. longum subsp. longum YIT 4021 T , B.longum subsp. suis YIT 4082 T , B. magnum YIT 4098 T , B. merycicum YIT 4095 T , B. минимум YIT 4097 T , B. pseudocatenulatum YIT 4072 Т , B. pseudolongum subsp. globosum YIT 4101 T , B. pseudolongum subsp. псевдолонгум YIT 4102 T , B. pullorum YIT 4104 T , B.руминантия YIT 4105 T , B. saeculare YIT 4111 T , B. subtile YIT 4116 T , B. thermophilum YIT 4073 T |
| Blautia | 0 | B. producta YIT 6141 T
| Clostridium | C. acetobutylicum YIT 10170 T , C. bifermentans YIT 10228 T , C.butyricum YIT 10073 T , C. celatum YIT 6056 T , C. coccoides YIT 6035 T , C. perfringens YIT 6050 T |
| Collinsella | C. aerofaciens YIT 10235 T |
| Enterococcus | E. faecalis YIT 2031 T , E. faecium YIT 2032 T |
| Escheria .coli YIT 6044 T | |
| Eubacterium | E. biforme YIT 6076 T , E. rectale YIT 6082 T |
| L. YIT 0070 T , L. amylophilus YIT 0255 T , L. amylovorus YIT 0211 T , L. bifermentans YIT 0260 T , L. brevis YIT 0076 T , л.buchneri YIT 0077 T , L. casei YIT 0078 T , L. coryniformis YIT 0237 T , L. crispatus YIT 0212 T , L. delbrueckii subsp. bulgaricus YIT 0181 T , L. delbrueckii subsp. delbrueckii YIT 0080 T , L. delbrueckii subsp. lactis YIT 0086 T , L. fermentum YIT 0081 T , L.gallinarum YIT 0218 T , L. gasseri YIT 0192 T , L. helveticus YIT 0083 T , L. johnsonii YIT 0219 T , L. malefermentans YIT 0271 T , L. oris YIT 0277 T , L. parabuchneri YIT 0272 T , L. paracasei YIT 0209 T L. paraplantarum YIT 0445 T , L. pentosus YIT 0238 T , L.plantarum YIT 0102 T , L. pontis YIT 0273 T , L. reuteri YIT 0197 T , L. rhamnosus YIT 0105 T , L. sakei YIT 0247 T , L. salivarius подвид. salicinius YIT 0089 T , L. salivarius subsp. salivarius YIT 0104 T , L. sharpeae YIT 0274 T , L. vaginalis YIT 0276 T | |
| Lactococcus | L.garviae YIT 2071 T , L. lactis subsp. cremoris YIT 2007 T , L. lactis subsp. hordiniae YIT 2060 T , L. lactis subsp. lactis YIT 2008 T , L. plantarum YIT 2061 T , L. raffinolactis YIT 2062 T |
| Parascardovia | P. denticolens YIT 4114 901 |
| Propionibacterium | P.acnes YIT 6165 T |
| Ruminococcus | R. bromii YIT 6078 T , R. lactaris YIT 6084 T |
| Scardovia 9057 YIT 4115 T | |
| Streptococcus | S. thermophilus YIT 2001, S. thermophilus YIT 2021, S. thermophilus YIT 2037 T |
Бактериальная ДНК для анализа RAPD была извлечена путем физического разрушения клеток и очистки бензилхлоридом, как описано ранее (11). ПЦР-амплификацию выполняли с использованием 27 праймеров RAPD, как описано Fujimoto et al. (11). Продукты RAPD разделяли электрофорезом при 50 В в 1,5% агарозном геле.
Клонирование и анализ последовательности продуктов RAPD, специфичных для BF-1.
Потенциальные штамм-специфичные маркеры RAPD экстрагировали из агарозных гелей с использованием набора для выделения ДНК из гелевых индикаторов (BioDynamics Laboratory, Tokyo, Japan).Экстрагированные продукты амплификации клонировали с использованием вектора pTAC-1 и Jet Competent Cells (DH5α) (набор для клонирования TA PCR; BioDynamics Laboratory). Последовательности ДНК 5 клонов каждого потенциального штамм-специфичного маркера определяли с использованием ДНК-секвенатора ABI 3130xl (Applied Biosystems, Foster, CA) и набора для секвенирования BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems).
Специфичность праймеров на основе RAPD.
Набор BF-1-специфических праймеров (pBF-1) был разработан на основе потенциальных штамм-специфичных последовательностей, идентифицированных с помощью RAPD-анализа.Специфичность этого набора праймеров подтверждена ПЦР-анализом ДНК 127 штаммов бактерий (). ПЦР-амплификации выполняли в ДНК-механизме PTC-200 (MJ Research, Waltham, MA), как описано ранее Fujimoto et al. (11), с небольшими изменениями. Каждая реакционная смесь (20 мкл) содержала 10 мМ трис-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2 , 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP), 0,4 ед. Taq ДНК-полимеразы (TaKaRa Bio, Shiga , Япония), 0,4 мкмоль праймеров и 10 нг матричной ДНК.Программа амплификации состояла из 1 цикла 94 ° C в течение 2 минут, 32 цикла 94 ° C в течение 20 секунд, 60 ° C в течение 10 секунд и 72 ° C в течение 20 секунд и 1 цикла 72 ° C в течение 3 минут. . Продукты ПЦР разделяли электрофорезом при 100 В в 1,5% агарозном геле.
Обработка ПМА.
Чистые культуры BF-1 или образцы фекалий обрабатывали 50 мкМ PMA (Biotium, Inc., Калифорния) и подвергали фотоактивации в течение 2 минут, как описано Fujimoto et al. (18). Осадки клеток, обработанные PMA, хранили при -20 ° C до проведения экстракции ДНК.
Количественное определение содержания АТФ в образцах.
Содержание АТФ в каждом тестируемом образце измеряли с использованием набора для реакции на АТФ-люциферазу (Lucifer HS; Kikkoman, Chiba, Japan), основанного на реакции люциферин-люциферазы светлячков (19), и прибора для измерения люминесценции TD- 20/20 (Turner Designs, Саннивейл, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Содержание АТФ измеряли в относительных световых единицах (RLU). Чтобы преобразовать RLU в CFU, мы использовали соотношение (RLU / CFU), полученное из BF-1, который культивировали анаэробно при 37 ° C в течение 24 часов в модифицированном MRS (m-MRS) (глюкоза заменена лактозой) бульоне, содержащем (на литр ) 10 г пептона триптиказы BBL (BD, Sparks, MD), 5 г дрожжевого экстракта, 3 г бакто триптозы (BD), 3.9 г K 2 HPO 4 · 3H 2 O, 3 г KH 2 PO 4 , 2 г диаммонийгидроцитрата, 5 мл раствора соли (11,5% [вес / объем] MgSO 4 · 7H 2 O, 3,09% MnSO 4 · 5H 2 O, 0,68% FeSO 4 · 7H 2 O), 1 г Tween 80, 1,7 г ацетата натрия, 10 г лактозы и 0,2 г l-цистеина HCl · H 2 O (20). Клетки собирали центрифугированием при 20000 × g в течение 4 мин при 4 ° C и суспендировали в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7.0). Образцы хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Количество КОЕ BF-1 определяли с использованием чашки с агаром m-MRS, культивированной в анаэробных условиях при 37 ° C в течение 72 часов.
Экстракция нуклеиновой кислоты из клеток BF-1.
Бактериальную культуру (250 мкл) центрифугировали при 20000 × g в течение 5 минут при 4 ° C, и осадок суспендировали в 500 мкл раствора РНК позже (Ambion, Austin, TX) для стабилизации РНК. После инкубации при 4 ° C в течение 1 часа раствор центрифугировали при 20000 × g в течение 5 минут при 4 ° C и осадок хранили при -80 ° C до экстракции нуклеиновой кислоты.Осадок встряхивали с 250 мкл буфера для экстракции (100 мМ Трис, 40 мМ динатриевая соль ЭДТА [pH 9,0]), 500 мкл трис-ЭДТА (ТЕ) -насыщенного фенола (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония), 50 мкл 10% SDS и стеклянные шарики (700 мг; 0,1 мм в диаметре) (Shinmaru Enterprises, Осака, Япония) с помощью прибора FastPrep 24 (MP Biomedicals, Ирвин, Калифорния) со скоростью 6,5 м / с в течение 30 с при комнатной температуре. К суспензии добавляли 100 мкл 3 М ацетата натрия (pH 4,8) и инкубировали на льду в течение 5 мин.Затем суспензию центрифугировали при 20000 × g в течение 8 минут при 4 ° C и супернатант (400 мкл) смешивали с 400 мкл охлажденного льдом 100% изопропанола. После центрифугирования при 20000 × г в течение 8 минут при 4 ° C осажденные нуклеиновые кислоты промывали ледяным 70% этанолом и сушили на воздухе перед суспендированием в 250 мкл буфера TE (10 мМ Трис, 1 мМ EDTA. [pH 8,0]).
Количественное определение клеток BF-1 с использованием количественной ПЦР с обратной транскрипцией и количественной ПЦР.
Для количественной оценки жизнеспособных клеток BF-1, количественный ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR) в реальном времени был проведен в два этапа.На первом этапе была выполнена обратная транскрипция с использованием набора TaKaRa RNA PCR kit (AMV) версии 3.0 (TaKaRa Bio). Нуклеиновые кислоты-матрицы перед использованием разбавляли 1:50. Каждая реакционная смесь (10 мкл) содержала 1 мкл матричных нуклеиновых кислот, 1 × буфер RT, 1 мМ смесь dNTP, 5 мМ MgCl 2 , 10 ед. Ингибитора РНКазы, 2,5 ед. AMV обратной транскриптазы XL и 1 мкМ обратного праймера ( B. bifidum видоспецифичные; BiBIF-2) (21). Реакцию проводили при 52 ° C в течение 20 минут, а затем реакционную смесь нагревали до 95 ° C в течение 10 минут и быстро охлаждали на льду.На втором этапе кПЦР выполняли с использованием системы обнаружения последовательности ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems), как описано ранее (18), с небольшими модификациями. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10 мМ трис-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2 , 0,2 мМ каждого dNTP, 0,2 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (TaKaRa Bio), 1: 75 000 разбавление SYBR green I (Invitrogen), 0,4 U Taq ДНК-полимераза Hot Start версия (TaKaRa Bio), 0,4 мкмоль каждого из B.bifidum видоспецифических праймеров (BiBIF-F и BiBIF-R) (21) и 5 мкл кДНК матрицы, разведенной в 10, 10 2 или 10 3 раз. Программа амплификации состояла из начальной стадии нагревания при 94 ° C в течение 5 минут, 40 циклов при 94 ° C в течение 20 секунд, 55 ° C в течение 20 секунд и 72 ° C в течение 50 секунд, а также заключительного этапа удлинения при 72 ° C. C в течение 3 мин. Интенсивность флуоресценции определяли на последнем этапе каждого цикла. Чтобы отличить целевой продукт ПЦР от нецелевых продуктов ПЦР (22), кривые плавления RT-qPCR были получены после амплификации путем непрерывного сбора результатов измерений интенсивности флуоресценции при медленном нагревании реакционной смеси от 60 до 95 ° C с шагом 0.2 ° C / с.
Количественный анализ ПЦР в реальном времени (qPCR) был проведен для количественного определения общего количества клеток BF-1 (без обработки PMA) или жизнеспособных клеток BF-1 (с обработкой PMA) с использованием системы обнаружения последовательности ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems ), как описано выше, в качестве второго этапа RT-qPCR, с небольшими изменениями: qPCR выполняли с pBF-1, а температуру отжига изменяли на 60 ° C в течение 10 с.
Длительное культивирование и обработка искусственным желудочным соком клеток BF-1.
Длительное культивирование проводили следующим образом. После предварительной инкубации в бульоне m-MRS в анаэробных условиях при 37 ° C в течение 24 часов, B. bifidum культура BF-1 была инокулирована в 4 мл бульона m-MRS (1%, об. / Об.) И культивирована анаэробно при 37 ° C. на 1, 2, 4, 7 или 10 дней.
Обработку искусственным желудочным соком проводили следующим образом. После предварительной инкубации при 37 ° C в течение 24 часов культуру BF-1 инокулировали в 16 мл бульона m-MRS (1% об. / Об.) И культивировали в анаэробных условиях при 37 ° C в течение 24 часов.Клетки BF-1 собирали центрифугированием при 8000 × g в течение 5 минут при 4 ° C и суспендировали в 16 мл искусственного желудочного сока. Искусственный желудочный сок был приготовлен путем добавления в базальную среду (pH 2,8) пепсина следующим образом: 900 мл базальной среды (5,0 г / л пептона триптиказы, 1,5 г / л муцина из желудка свиньи [Wako Pure Chemical Industries], 5,0 г. / литр NaCl, 3,0 г / литр NaHCO 3 , 1,0 г / литр KH 2 PO 4 , доведенный до pH 2,8 с помощью 1 н. HCl) автоклавировали в течение 15 минут при 115 ° C, а затем добавляли 100 мл стерилизованного фильтром раствора пепсина 400 мг / л (пепсин, разведенный 1: 10 000 из слизистой оболочки желудка свиньи [Wako Pure Chemical Industries]).Клетки BF-1, суспендированные в искусственном желудочном соке, культивировали в аэробных условиях при 37 ° C в течение 1, 2 или 3 часов.
Количественное определение клеток BF-1, добавленных к образцам фекалий.
Образцы фекалий собирали в отдельные стерильные контейнеры для фекалий (Sarstedt, Nümbrecht, Германия), охлаждали при 4 ° C и отправляли в лабораторию в течение 4 часов. Общая концентрация кишечных микроорганизмов, полученная путем подсчета клеток, окрашенных DAPI (подсчет DAPI), составляла 10 11,1 ± 0,2 (среднее ± стандартное отклонение) / г кала (сырой вес).Мы добавили жизнеспособные или убитые нагреванием (80 ° C в течение 10 мин) клетки BF-1 в расчетной (по подсчету DAPI) концентрации 10 10,3 клеток / г фекалий (сырой вес) к 3 образцам фекалий (200 мкл из 10 -кратно разведенная суспензия) (от разных добровольцев), не содержащая BF-1, что было подтверждено с использованием метода культивирования с использованием селективного агара T-EMSM, специфичного для штамма BF-1 (описанного ниже), и штамм-специфической КПЦР с pBF-1 . Затем жизнеспособные клетки BF-1 добавляли к 2 образцам фекалий (200 мкл 10-кратно разведенной суспензии) (от разных добровольцев), не содержащим BF-1, с получением конечных концентраций в диапазоне от 10 4.От 3 до 10 10,3 клеток / г. После обработки PMA ДНК экстрагировали, как описано ранее (11), из каждого образца и подвергали анализу qPCR с использованием pBF-1.
Исследование образцов кала, полученных после приема BF-1.
В исследуемую популяцию вошли 12 здоровых добровольцев (возрастной диапазон от 25 до 60 лет; среднее ± стандартное отклонение, 45,5 ± 11,3 года). Субъекты принимали коммерчески доступный кисломолочный продукт (BF-1), содержащий от 10 10,3 до 10 11.0 КОЕ BF-1 / флакон, один раз в день в течение 28 дней. Образцы фекалий, выделенные до и после приема ферментированного молочного продукта, собирали в отдельные стерильные контейнеры для фекалий (Sarstedt), охлаждали при 4 ° C и отправляли в лабораторию в течение 4 часов. Ни один субъект не принимал пробиотические продукты, включая исследуемый продукт, в течение 2-недельного периода до начала этого исследования. Информированное согласие было получено от всех добровольцев, предоставивших образцы фекалий. Комитет по этике Восточного центра укрепления здоровья Уэно (Токио, Япония) предоставил этическое разрешение для данного микробиологического исследования в соответствии с Хельсинкской декларацией.
Количественное определение проглоченного BF-1 в кале с помощью количественной ПЦР.
ДНК из образцов фекалий экстрагировали с использованием мини-набора для стула (Qiagen, Валенсия, Калифорния), как описано ранее (18). Метод qPCR с PMA или без PMA был выполнен для количественной оценки жизнеспособных или общих (жизнеспособных плюс мертвых) клеток BF-1 в кале субъектов, которые пили кисломолочный продукт, содержащий BF-1, в соответствии с методом, описанным ранее (18) , используя pBF-1.
Количественное определение клеток BF-1 путем культивирования на селективном агаре T-EMSM.
Подсчет (в КОЕ) BF-1 определяли с использованием штамм-специфической чашки с селективным агаром T-EMSM, который содержал трансгалактозилированный олигосахарид (TOS) в качестве фактора роста и эритромицин (EM) и стрептомицин (SM) в качестве селективных агентов для БФ-1 (8). Селективный агар T-EMSM был основан на коммерчески доступной агаризованной среде с пропионатом TOS (Yakult Pharmaceutical Industry, Токио, Япония) и состоял из (на литр) 10 г триптиказы, 1,0 г дрожжевого экстракта, 3,0 г KH 2 PO 4 , 4.8 г K 2 HPO 4 , 3,0 г (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,2 г MgSO 4 , 0,5 г l-цистеина, 15 г пропионата натрия, 10 г TOS, 15 г порошкообразного агара, 50 мг эритромицина (Wako Pure Chemical Industries) и 5 000 000 ед. сульфата стрептомицина (Sigma Chemical, Сент-Луис, Миссури). Аликвоты (по 100 мкл каждая) 10-кратных серийных разведений фекалий (исходный образец, 0,5 г) в 0,85% NaCl наносили на агаре T-EMSM и инкубировали анаэробно при 37 ° C в течение 72 часов в анаэробной камере (Coy Laboratory Products , Grass Lake, MI) (в атмосфере, содержащей 91: 6: 3 N 2 / CO 2 / H 2 ).Для каждого образца фекалий мы выделили колонии из планшета T-EMSM, которые были засеяны самым высоким разведением, которое давало рост, и подвергли эти колонии ПЦР-анализу с использованием pBF-1. Количество клеток BF-1 / г фекалий оценивали по количеству колоний, которые были идентифицированы как BF-1 с помощью ПЦР-анализа с pBF-1. Все изоляты также анализировали RAPD-анализом.
Статистические методы.
Различия в концентрациях BF-1, добавленных к образцам фекалий, измеренные с помощью кПЦР, анализировали с помощью парного теста Стьюдента t .Простая линейная регрессия использовалась для разработки уравнений регрессии для статистически значимых взаимосвязей. Коэффициенты корреляции Пирсона использовали для определения корреляции между количеством клеток BF-1, добавленных к образцам фекалий, и количеством клеток BF-1, определенным с помощью qPCR. Метод Тьюки был использован для определения корреляции между количеством клеток BF-1, обнаруженных в образцах фекалий, полученных после приема ферментированного молочного продукта, содержащего BF-1, с использованием трех методов (селективная культура на основе агара T-EMSM, PMA -qPCR и qPCR без PMA). P Значения <0,05 были классифицированы как статистически значимые.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Скрининг на штамм-специфические маркеры RAPD.
Чтобы идентифицировать штамм-специфичный маркер для BF-1, мы протестировали в общей сложности 27 праймеров RAPD на 30 штаммах B. bifidum и проанализировали специфичность полученных продуктов ПЦР. Праймер OPA11 (5 ‘CAA TCG CCG T 3’) генерировал 1,4 т.п.н. BF-1-специфичный продукт ПЦР (). Мы определили последовательность этого BF-1-специфичного продукта ПЦР (номер доступа DDBJ.{«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AB748455», «term_id»: «474440974», «term_text»: «AB748455»}} AB748455).
RAPD-паттернов, полученных из 10 штаммов B. bifidum с использованием праймера OPA11. Дорожка 1, маркер размера ДНК 100 п.н .; дорожки 2, 5 и 13: B. bifidum BF-1; дорожка 3, ЮИТ 4013; полоса 4, ЮИТ 4039 Т ; полоса 6, ЮИТ 4042; полоса 7, ЮИТ 4069; переулок 8, ЮИТ 4070; полоса 9, ЮИТ 10990; переулок 10, ЮИТ 10994; дорожка 11, ЮИТ 10996; дорожка 12, YIT 10999. Стрелки указывают полосы, соответствующие BF-1-специфичному продукту ПЦР.
Конструирование конкретной пары праймеров, производных от RAPD.
На основе последовательности BF-1-специфичного продукта ПЦР мы разработали BF-1-специфические праймеры (pBF-1 [pBF-1f, 5 ‘ATG GCA AAA CCG GGC TGA A 3’ и pBF-1r, 5 ′ GCG GAT GAG AGG TGG G 3 ′]). Мы проверили специфичность этих праймеров против ДНК, выделенной из 127 штаммов бактерий, включая 30 штаммов B. bifidum (). Праймеры поддерживали исключительно ПЦР-амплификацию матричной ДНК BF-1 без амплификации против нецелевых микроорганизмов (данные не показаны).Продукт амплификации имел длину 697 п.н. и имел две температуры плавления: 89,3 ° C (основная) и 86,7 ° C.
Количественное определение ПЦР жизнеспособных или убитых нагреванием клеток BF-1 в фекалиях.
Когда жизнеспособный BF-1 был добавлен к образцам фекалий, количество клеток BF-1, полученное с помощью PMA-qPCR (50 мкМ раствор PMA и 2-минутная фотоактивация), было аналогично количеству, полученному с помощью qPCR без обработки PMA (). Напротив, в случае добавления убитых нагреванием клеток BF-1 к образцам фекалий использование PMA-qPCR привело к значительному снижению количества клеток BF-1 (10 6.8 ± 0,3 клеток / мл) ( P <0,001) по сравнению с полученным без обработки PMA (10 10,4 ± 0,1 клеток / мл) ().
Влияние обработки PMA на количественную ПЦР-амплификацию в реальном времени убитых нагреванием клеток BF-1 в человеческих фекалиях. Жизнеспособные или убитые нагреванием клетки BF-1 (80 ° C, 10 мин) вводили в образцы фекалий человека и количественно определяли клетки с помощью ПЦР в реальном времени с обработкой PMA или без нее. ***, P <0,001 для лечения PMA по сравнению с отсутствием лечения PMA.Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (из 3 независимых экспериментов).
Точность метода PMA-qPCR для количественного определения жизнеспособных клеток BF-1 в кале.
Мы добавили жизнеспособный BF-1 непосредственно к 200 мкл 10-кратно разведенных образцов фекалий в количестве от 10 4,3 до 10 10,3 клеток / г фекалий (сырой вес) и определили количество клеток BF-1. с использованием PMA-qPCR с pBF-1. Продукты амплификации не всегда обнаруживались в образцах с 10 4,8 клеток / г фекалий, поэтому это количество было сочтено ниже предела обнаружения.Когда количество добавленных жизнеспособных клеток BF-1 составляло от 10 5,3 до 10 10,3 клеток / г фекалий (сырой вес), результаты PMA-qPCR значительно коррелировали с количеством добавленных жизнеспособных клеток BF-1 ( r > 0,99, P <0,001;), предполагая, что метод PMA-qPCR точно определил количество жизнеспособных клеток BF-1 без какого-либо ингибирования для амплификации жизнеспособных клеток BF-1.
Корреляция между количеством жизнеспособных клеток BF-1, добавленных к образцам фекалий, и количеством, определенным с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) с PMA.Линия регрессии была построена между 10 5,3 клеток / г и 10 10,3 клеток / г (сырой вес), как обнаружено с помощью кПЦР, поскольку продукты амплификации не всегда обнаруживались при вводе 10 4,8 клеток / г ( открытый ромб). Линия регрессии была рассчитана с точкой пересечения, равной 0. Каждая полоса ошибок представляет собой стандартное отклонение трех независимых тестов.
PMA-qPCR обнаружение жизнеспособных клеток BF-1 в культурах, длительно обработанных и обработанных искусственным желудочным соком.
Во время длительного культивирования (10 дней) общее количество клеток BF-1, определенное подсчетом DAPI или RT-qPCR, оставалось постоянным и составляло около 10 10 клеток / мл, а количество, определенное qPCR без обработки PMA медленно снижалась примерно до 10 9 клеток / мл. Напротив, количество жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, путем измерения содержания АТФ, которое было преобразовано в КОЕ, и методом культивирования с использованием агара m-MRS, все резко снизилось до аналогичного конечного уровня 10 . 6 клеток / мл или КОЕ / мл ().
Использование количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) с PMA и другими методами для определения количества клеток BF-1 во время длительного культивирования в бульоне m-MRS или искусственном желудочном соке. Клетки длительно культивировали (10 дней) в бульоне m-MRS при 37 ° C (A) или обрабатывали искусственным желудочным соком при 37 ° C в течение 3 часов (B), а количество клеток определяли различными методами в указанные временные точки. Методами были подсчет DAPI (DAPI), qPCR с pBF-1, но без обработки клеток PMA перед экстракцией ДНК (qPCR), нацеливание RT-qPCR на B.bifidum -специфические последовательности 16S рРНК (RT-qPCR), qPCR с обработкой pBF-1 и PMA клеток перед экстракцией ДНК (PMA-qPCR), измерение содержания АТФ в виде RLU, преобразованного в CFU (ATP), и культивирование клеток на Селективный агар T-EMSM (КОЕ).
В течение первого часа лечения искусственным желудочным соком количество жизнеспособных клеток BF-1, определенных путем измерения содержания АТФ и методом культивирования на основе m-MRS, быстро уменьшалось с 10 9,4 до 10 5,9 КОЕ / мл и от 10 9.От 4 до 10 4,2 КОЕ / мл, соответственно, тогда как количество жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, медленно снижалось с 10 9,9 до 10 9,0 клеток / мл. В течение всего 3-часового лечения количество жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, снизилось до 10 6 клеток / мл. Напротив, количество жизнеспособных клеток BF-1, определенных методом культивирования на основе m-MRS, быстро уменьшалось до 10 2 КОЕ / мл, а количество жизнеспособных клеток BF-1, определяемых с помощью RT-qPCR, нацеливания на BF- 1-специфичные последовательности 16S рРНК немного уменьшились с 10 9.От 9 до 10 9,1 клеток / мл ().
Селективность селективного агара T-EMSM, специфичного к штамму BF-1.
Для определения эффективности селективного агара T-EMSM, равные количества клеток BF-1, взятых из клеток BF-1, культивированных в течение ночи в бульоне m-MRS, и ферментированный молочный продукт, содержащий BF-1, отдельно инокулировали на агар T-EMSM. чашки или чашки с агаром TOS с пропионатом. Как в чистых культурах, так и в ферментированном молоке BF-1 образовывал большие молочно-белые гладкие колонии на чашке с агаром T-EMSM, и не было значительной разницы между количеством колоний на чашке с агаром T-EMSM и на TOS. пластина с пропионатным агаром (непарный тест Стьюдента t ) ().Когда образцы фекалий, взятые у субъектов до приема ферментированного молока, высевали на чашки с агаром T-EMSM, некоторые колонии росли на селективной среде; однако эти колонии можно было отличить от колоний BF-1 по размеру или цвету, и было подтверждено, что они не являются BF-1 с помощью ПЦР с использованием pBF-1 и анализа RAPD (данные не показаны).
Таблица 2
Сравнение извлечения BF-1 селективной средой T-EMSM и неселективной средой (агаризованная среда с пропионатом TOS)
| Агаровая среда | Среднее количество (log КОЕ / мл ± стандартное отклонение) в: | |
|---|---|---|
| Чистая культура BF-1 | Ферментированное молоко, содержащее BF-1 | |
| T-EMSM | 9.34 ± 0,03 | 9,01 ± 0,05 |
| TOS пропионат | 9,33 ± 0,02 | 8,97 ± 0,07 |
Количественное определение проглоченного BF-1 в кале.
Мы использовали наш метод PMA-qPCR для измерения количества жизнеспособных клеток BF-1 в образцах фекалий субъектов, которые пили кисломолочный продукт, содержащий BF-1. Перед употреблением кисломолочного продукта количество клеток BF-1 в образцах фекалий было ниже предела обнаружения для штамм-специфичного метода qPCR без обработки PMA (<10 5.3 клеток / г фекалий [влажный вес]) и обычным методом культивирования с использованием чашки с агаром T-EMSM (<10 2,0 КОЕ / г). После приема ферментированного молока BF-1 был обнаружен в образцах фекалий всех субъектов в концентрациях 10 7,6 ± 0,7 клеток / г с помощью кПЦР без обработки PMA и 10 6,2 ± 0,4 клеток / г с помощью PMA-qPCR . Кроме того, BF-1 был изолирован от всех субъектов в концентрации 10 4,5 ± 1,5 КОЕ / г с использованием чашки с агаром T-EMSM ().
Таблица 3
Количество клеток BF-1 в фекалиях 12 добровольцев, которые принимали кисломолочный продукт, содержащий BF-1, в течение 28 дней
| Субъект | Количество клеток BF-1 (лог. Ячейки / г фекалий или логарифм КОЕ / г фекалий [влажный вес]) | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Количественно до приема внутрь a | Количественно после приема внутрь | ||||||||||||
| КПЦР b | 909Культура | ||||||||||||
| Без PMA | С PMA | Без PMA | С PMA | ||||||||||
| a | <5.3 | <5,3 | <2 | 6,8 | 5,5 | 4,9 | |||||||
| b | <5,3 | <5,3 | <2 | 3,3 | 6,2 | <5,3 | <5,3 | <2 | 8,0 | 6,5 | 5,1 | ||
| d | <5,3 | <5,3 | <2 | 8,0 | 6,6 901.6 | ||||||||
| e | <5,3 | <5,3 | <2 | 8,2 | 5,9 | 4,8 | |||||||
| f | <5,3 | <5,3128,5 | 5,3 | ||||||||||
| г | <5,3 | <5,3 | <2 | 7,8 | 6,4 | 6,1 | |||||||
| h | <5,3 | 8122 | 5,7 | 2,8 | |||||||||
| i | <5,3 | <5,3 | <2 | 6,7 | 6,0 | 2,0 | |||||||
| j | <5,3 | 7,6 | 5,9 | 3,7 | |||||||||
| k | <5,3 | <5,3 | <2 | 7,7 | 6,9 | 6,5 | |||||||
| л3 | <5,3 | <2 | 5,9 | 5,8 | 2,9 | ||||||||
ОБСУЖДЕНИЕ
Из-за недостатков обычных микробиологических методов, например, недооценка с помощью селективных реагентов, скопление бактериальных клеток Из-за необходимости трудоемкого процесса и навыков все чаще используется количественная оценка бактерий на основе обнаружения нуклеиновых кислот с помощью ПЦР (11, 23–25). Здесь мы подтвердили, что метод RAPD является одним из лучших методов разработки штамм-специфичных праймеров для использования в анализе qPCR.Как отмечают Бричински и др. (26) и Fujimoto et al. (18), RAPD может всесторонне сравнивать полные геномы многих штаммов, чтобы легко и быстро находить специфичные для штамма последовательности.
Использование основанных на ДНК инструментов молекулярного обнаружения бактерий затруднено из-за невозможности различать сигналы, исходящие от жизнеспособных и мертвых клеток; Однако недавно дифференциация жизнеспособных и мертвых клеток в образцах с несколькими типами бактерий была достигнута с помощью методов, которые ПЦР-амплифицируют ДНК из клеток, обработанных моноазидом этидия (EMA) или PMA (27–30).Однако было высказано предположение, что EMA токсичен для некоторых жизнеспособных клеток (15). Когда клетки BF-1, убитые нагреванием обработкой при 80 ° C в течение 10 мин (18), вводили в образцы фекалий, количество клеток BF-1, обнаруженных в кале с помощью PMA-qPCR, составляло 1/10 000 от количества, обнаруженного без Лечение ПМА (). Этот результат подтвердил, что PMA-qPCR обнаруживает только жизнеспособные клетки из незначительного количества амплификации мертвых клеток. Мы также продемонстрировали точность PMA-qPCR, подтвердив, что количество BF-1 в фекалиях, проанализированных с помощью PMA-qPCR, было высоко и значительно коррелировало с количеством жизнеспособных клеток BF-1, добавленных в образцы фекалий ().
Мы сравнили изменения в количестве жизнеспособных клеток BF-1, определенные различными методами (селективная культура на основе T-EMSM агара, измерение содержания АТФ, нацеливание RT-qPCR на B. bifidum -специфические последовательности 16S рРНК и PMA-qPCR), когда клетки подвергались умеренно медленной гибели при длительном культивировании и быстрой гибели при обработке искусственным желудочным соком. После длительного культивирования количество жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, было аналогично количеству, определенному с помощью селективной культуры на основе агара T-EMSM и измерения содержания АТФ, преобразованного в КОЕ ().Напротив, во время лечения искусственным желудочным соком количество жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, которое продиктовано проницаемостью мембраны, начало уменьшаться на 1 час позже, чем количество, определенное с помощью селективного T-EMSM на основе агара. культура и измерение содержания АТФ преобразовано в КОЕ (). Метод селективного культивирования на основе агара T-EMSM имеет присущий недостаток недооценку жизнеспособных микробов из-за использования антибиотиков или скопления клеток. Метод количественного определения содержания АТФ также имеет недостатки; его нельзя использовать для нацеливания на определенные бактериальные штаммы в сложных образцах окружающей среды, таких как фекалии.Кроме того, вопреки нашим ожиданиям, метод RT-qPCR, который нацелен на B. bifidum -специфических последовательностей 16S рРНК и, как полагают, позволяет количественно определять только жизнеспособные клетки только у некоторых видов бактерий (31, 32), не позволил успешно различить между жизнеспособные и мертвые клетки BF-1 (). Lahtinen et al. (33) продемонстрировали, что жизнеспособные, но не культивируемые пробиотики поддерживают высокий уровень рРНК и сохраняют жизнеспособные свойства. В нашем исследовании содержание рРНК в BF-1 не изменилось или незначительно снизилось после длительного культивирования или обработки искусственным желудочным соком, тогда как другие характеристики жизнеспособности (КОЕ оценивались с помощью селективной культуры на основе агара T-EMSM, измерение содержания АТФ и целостность мембраны при помощи PMA-qPCR) были снижены.Наши результаты предполагают, что рРНК BF-1 сохраняется после того, как клетки теряют свою жизнеспособность. Поэтому мы считаем, что PMA-qPCR — лучший способ быстро и точно определить количество жизнеспособных клеток BF-1.
Для оказания ожидаемых положительных эффектов основное требование к пробиотическим штаммам состоит в том, чтобы они оставались живыми в пищеварительном тракте (34). Здесь мы продемонстрировали, что проглоченный BF-1 определялся как жизнеспособные клетки в образцах фекалий человека с использованием селективного агара T-EMSM и снятия отпечатков пальцев RAPD. Мы использовали ПЦР с pBF-1 для идентификации 74 колоний, которые появлялись на чашках с агаром T-EMSM при самом высоком разведении фекалий, которое давало рост.Сорок девять изолятов, которые образовывали большие молочно-белые гладкие колонии, были идентифицированы как B. bifidum с помощью анализа pBF-1 и RAPD, а оставшиеся 25 изолятов образовали колонии меньше, чем у BF-1; колонии серого или охристого цвета были подтверждены как не-BF-1 обоими методами. Таким образом, ПЦР с использованием pBF-1 позволила нам эффективно и точно идентифицировать колонии BF-1 на селективном агаре T-EMSM. Это также позволило нам сократить трудоемкий процесс идентификации, включая выделение и очистку изолятов, а также анализ RAPD.
После того, как субъекты проглотили кисломолочный продукт, содержащий BF-1, общее количество клеток BF-1 в их фекальных образцах, определенное с помощью кПЦР без обработки ФМА, составило 10 7,6 ± 0,7 клеток / г, но количество жизнеспособных BF- 1 клеток, определенная с помощью PMA-qPCR, составила 10 6,2 ± 0,4 клеток / г. Этот результат предполагает, что около 11% (среднее отношение BF-1 для PMA-qPCR к qPCR у 12 субъектов) от общего количества клеток BF-1 в образцах фекалий все еще оставались жизнеспособными после прохождения через пищеварительный тракт, когда жизнеспособность оценивалась в с точки зрения целостности клеточной мембраны.Число жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, было в 50 раз выше ( P <0,01), чем количество, определенное методом селективного культивирования на основе T-EMSM, что позволяет предположить, что использование антибиотиков в культуре-зависимом метод может привести к недооценке количества жизнеспособных клеток BF-1, даже если использовалось минимальное количество антибиотиков, необходимое для отбора (эритромицин и стрептомицин в концентрации 5000 мкг / мл и 50 мкг / мл соответственно [9]).
После того, как субъекты принимали кисломолочный продукт, содержащий BF-1, в течение 28 дней, количество клеток BF-1 в образцах кала сравнивали между субъектами ().Количество жизнеспособных клеток BF-1, обнаруженных с помощью метода культивирования на основе селективного агара T-EMSM, варьировалось от 10 2,0 до 10 6,6 КОЕ / г среди субъектов; Напротив, числа, определенные методом PMA-qPCR, показали меньший диапазон от 10 5,5 до 10 6,9 клеток / г. Количество жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, у 5 из 12 субъектов (b, h, i, j и l) было более чем в 100 раз выше ( P <0,01), чем количество, определенное T-EMSM. селективная культура на агаровой основе (пунктирные линии).Напротив, количество жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, у других семи субъектов (a, c, d, e, f, g и k) было почти на том же уровне, что и количество, определенное T-EMSM. селективная культура на агаровой основе (пунктирные линии). Таким образом, межпредметные различия в восстановлении жизнеспособных клеток BF-1 с помощью культуры на основе селективного агара T-EMSM могут быть связаны с различиями в величине повышенной проницаемости мембраны (отраженной в различиях в результатах PMA-qPCR) и снижением количества колоний. формирующая способность BF-1 при прохождении по желудочно-кишечному тракту у каждого человека.Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять механизмы выживания BF-1 в различных отделах пищеварительного тракта и влияние различных параметров на эти механизмы.
Количество клеток BF-1 в кале 12 добровольцев, принимавших кисломолочный продукт в течение 28 дней. Пунктирная линия представляет добровольца, у которого количество жизнеспособных клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, было в 10 раз меньше, чем количество, определенное с помощью селективной культуры на основе агара T-EMSM. Пунктирная линия представляет добровольца, у которого количество клеток BF-1, определенное с помощью PMA-qPCR, было в 100 раз больше ( P <0.01), чем определено с помощью селективной культуры на основе агара T-EMSM.
В заключение, набор праймеров для ПЦР, специфичный для BF-1, pBF-1, который мы разработали в этом исследовании, позволил эффективно и точно идентифицировать колонии, образовавшиеся на агаре T-EMSM. Мы подтвердили, что сочетание обработки образцов PMA перед экстракцией ДНК и количественной ПЦР с pBF-1 можно использовать для быстрого и точного анализа количества жизнеспособных клеток BF-1 в образцах фекалий. Мы считаем, что описанная здесь методология PMA-qPCR станет мощным инструментом в будущих исследованиях для понимания использования BF-1 в качестве пробиотика.
Олигосахариды грудного молока способствуют взаимодействию Bifidobacterium в пределах одной экосистемы
O’Neill I, Schofield Z, Hall LJ. Изучение роли члена микробиоты Bifidobacterium в модулировании иммуно-связанных заболеваний. Emerg Top Life Sci. 2017; 1: 333–49.
Google ученый
Вампах Л., Хайнц-Бушарт А., Фриц Дж. В., Рамиро-Гарсия Дж., Хабье Дж., Герольд М. и др.Режим рождения определяет функции кишечного микробиома и иммуностимулирующий потенциал, вызванные штаммом на ранней стадии. Nat Commun. 2018; 9: 1–14.
Бэкхед Ф., Росвалл Дж., Пэн Й., Фэн К., Цзя Х., Ковачева-Датчари П. и др. Динамика и стабилизация микробиома кишечника человека в течение первого года жизни. Клеточный микроб-хозяин. 2015; 17: 690–703.
PubMed Google ученый
Gomez de Aguero M, Ganal-Vonarburg SC, Fuhrer T., Rupp S, Uchimura Y, Li H, et al.Материнская микробиота способствует раннему постнатальному развитию врожденного иммунитета. Наука. 2016; 351: 1296–302.
PubMed Google ученый
Сиван А., Корралес Л., Хуберт Н., Уильямс Дж. Б., Акино-Майклс К., Эрли З. М. и др. Commensal Bifidobacterium способствует противоопухолевому иммунитету и повышает эффективность против PD-L1. Наука. 2015; 350: 1084–9.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Оки К., Акияма Т., Мацуда К., Гавад А., Макино Н., Исикава Е. и др. Длительная колонизация более шести лет с раннего детства Bifidobacterium longum subsp. longum в кишечнике человека. BMC Microbiol. 2018; 18: 209.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Stachowicz JJ. Мутуализм, содействие и структура экологических сообществ: позитивные взаимодействия играют важную, но недооцененную роль в экологических сообществах, снижая физические или биотические нагрузки в существующих средах обитания и создавая новые среды обитания.Биология. 2013; 51: 235–46.
Google ученый
Trosvik P, de Muinck EJ. Экология бактерий в желудочно-кишечном тракте человека — идентификация ключевых и основных таксонов. Микробиом. 2015; 3:44.
PubMed PubMed Central Google ученый
Doare K Le, Holder B, Bassett A, Pannaraj PS. Материнское молоко: целенаправленный вклад в развитие детской микробиоты и иммунитета.Фронт Иммунол. 2018; 9: 1–10.
ВОЗ. Запечатлеть момент. Раннее начало грудного вскармливания: лучшее начало для каждого новорожденного. http://www.who.int/nutrition/publications/infantfeeding/capture-moment-early-initiation-bf/en/2018; 41.
Forbes JD, Azad MB, Vehling L, Tun HM, Konya TB, Guttman DS, et al. Связь воздействия смеси в больнице и последующей практики вскармливания младенцев с микробиотой кишечника и риском избыточного веса в первый год жизни.JAMA Pediatr 2018; 172: 1–11.
Google ученый
Ly NP, Litonjua A, Gold DR, Celedón JC. Микробиота кишечника, пробиотики и витамин D: взаимосвязанные воздействия, влияющие на аллергию, астму и ожирение? J Allergy Clin Immunol. 2011; 127: 1087–94.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Turroni F, Milani C, Duranti S, Mahony J, van Sinderen D, Ventura M.Утилизация гликанов и перекрестное питание бифидобактериями. Trends Microbiol. 2018; 26: 339–50.
CAS PubMed Google ученый
Ninonuevo MR, Park Y, Yin H, Zhang J, Ward RE, Clowers BH, et al. Стратегия аннотирования гликома грудного молока. J. Agric Food Chem. 2006; 54: 7471–80.
CAS PubMed Google ученый
Томсон П., Медина Д.А., Гарридо Д.Олигосахариды грудного молока и бифидобактерии кишечника младенцев: молекулярные стратегии их использования. Food Microbiol. 2017; 75: 1–10.
Google ученый
Ферретти П., Пазолли Э., Тетт А., Асникар Ф., Горфер В., Феди С. и др. Передача микробов от матери к ребенку из разных участков тела формирует развивающийся микробиом кишечника младенца. Клеточный микроб-хозяин. 2018; 24: 133–45.e5.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Яссур М., Джейсон Э., Хогстром Л.Дж., Артур Т.Д., Трипати С., Сильяндер Х. и др. Штаммовый анализ передачи бактерий от матери ребенку в течение первых нескольких месяцев жизни. Клеточный микроб-хозяин. 2018; 24: 146–54.e4.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Села Д.А., Чепмен Дж., Адеуя А., Ким Дж. Х., Чен Ф., Уайтхед Т. Р. и др. Последовательность генома Bifidobacterium longum subsp. Infantis обнаруживает адаптацию к усвоению молока в микробиоме младенца.Proc Natl Acad Sci. 2008; 105: 18964–9.
CAS PubMed Google ученый
Джеймс К., Мазеруэй М.О., Боттачини Ф., ван Синдерен Д. Bifidobacterium breve UCC2003 метаболизирует олигосахариды грудного молока лакто-N-тетраозу и лакто-N-нео-тетраозу через перекрывающиеся, но разные пути. Научный доклад 2016; 6: 38560.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Ашида Х., Мияке А., Киёхара М., Вада Дж., Йошида Е., Кумагаи Х. и др. Две различные l-фукозидазы из Bifidobacterium bifidum необходимы для использования фукозилированных олигосахаридов и гликоконъюгатов молока. Гликобиология. 2009; 19: 1010–7.
CAS PubMed Google ученый
Asnicar F, Manara S, Zolfo M, Truong DT, Scholz M, Armanini F, et al. Изучение вертикальной передачи микробиома от матери младенцу с помощью метагеномного профилирования на уровне штаммов.mSystems. 2017; 2: 1–13.
Google ученый
Барретт Э., Дешпандей А.К., Райан К.А., Демпси Э.М., Мерфи Б., О’Салливан Л. и др. В кишечнике новорожденных обитают различные штаммы бифидобактерий. Arch Dis Child — Fetal Neonatal Ed. 2015; 100: F405–10.
PubMed Google ученый
Яцуненко Т., Рей Ф. Э., Манари М. Дж., Трехан И., Домингес-Белло М. Г., Контрерас М. и др.Микробиом кишечника человека в зависимости от возраста и географии. Природа. 2012; 486: 222–7.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Turroni F, Peano C, Pass DA, Foroni E, Severgnini M, Claesson MJ и др. Разнообразие бифидобактерий в кишечной микробиоте младенцев. PLoS One. 2012; 7: e36957.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Hill C, Guarner F, Reid G, Gibson GR, Merenstein DJ, Pot B и др. Документ о консенсусе экспертов: Консенсусное заявление Международной научной ассоциации пробиотиков и пребиотиков относительно области применения и надлежащего использования термина пробиотик. Нат Рев Гастроэнтерол Гепатол. 2014; 11: 9.
Google ученый
Milani C, Lugli GA, Duranti S, Turroni F, Bottacini F, Mangifesta M, et al. Геномная энциклопедия типовых штаммов рода Bifidobacterium .Appl Environ Microbiol. 2014; 80: 6290–302.
PubMed PubMed Central Google ученый
Milani C, Lugli GA, Duranti S, Turroni F, Mancabelli L, Ferrario C и др. Бифидобактерии проявляют социальное поведение за счет обмена углеводов в кишечнике. Научный доклад 2015; 5: 15782.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Lugli GA, Milani C, Turroni F, Duranti S, Mancabelli L, Mangifesta M, et al.Сравнительный геномный и филогеномный анализ семейства Bifidobacteriaceae. BMC Genomics. 2017; 18: 568.
PubMed PubMed Central Google ученый
Боттачини Ф., Моррисси Р., Эстебан-Торрес М., Джеймс К., ван Брин Дж., Дикарева Е. и др. Сравнительная геномика и ассоциации генотип-фенотип у Bifidobacterium breve . Научный доклад 2018; 8: 10633.
PubMed PubMed Central Google ученый
Arboleya S, Bottacini F, O’Connell-Motherway M, Ryan CA, Ross RP, van Sinderen D, et al. Соответствие генов по пангеному Bifidobacterium longum показывает значительное разнообразие в катаболизме углеводов среди человеческих младенческих штаммов. BMC Genomics. 2018; 19: 1–16.
Google ученый
Wu G, Zhang C, Wu H, Wang R, Shen J, Wang L и др. Геномное микроразнообразие Bifidobacterium pseudocatenulatum, лежащее в основе дифференциальной реакции на уровне штамма на диетическое углеводное вмешательство.MBio. 2017; 8: e02348–16.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Milani C, Turroni F, Duranti S, Lugli GA, Mancabelli L, Ferrario C и др. Геномика рода Bifidobacterium выявляет видоспецифичную адаптацию к богатой гликаном кишечной среде. Appl Environ Microbiol. 2016; 82: 980–91.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Juge N, Tailford L, Owen CD. Сиалидазы кишечных бактерий: мини-обзор. Biochem Soc Trans. 2016; 44: 166–75.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Иган М., Motherway MOC, Вентура М., ван Синдерен Д. Метаболизм сиаловой кислоты с помощью Bifidobacterium breve UCC2003. Appl Environ Microbiol. 2014; 80: 4414–26.
PubMed PubMed Central Google ученый
Гарридо Д., Руис-Мояно С., Лемай Д.Г., Села Д.А., Герман Дж.Б., Миллс Д.А. Сравнительная транскриптомика выявляет ключевые различия в реакции на олигосахариды молока младенческих кишечных бифидобактерий. Научный доклад 2015; 5: 13517.
PubMed PubMed Central Google ученый
Гарридо Д., Руис-Мояно С., Кирмиз Н., Дэвис Дж. К., Тоттен С. М., Лемей Д. Г. и др. Новый кластер генов позволяет преимущественно использовать фукозилированные олигосахариды молока в Bifidobacterium longum subsp.longum SC596. Научный отчет 2016; 6: 35045.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Нишимото М., Китаока М. Идентификация N-ацетилгексозамин-1-киназы в полном метаболическом пути Lacto-N-Biose I / Galacto-N-Biose в Bifidobacterium longum . Appl Environ Microbiol. 2007. 73: 6444–9.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Nishiyama K, Nagai A, Uribayashi K, Yamamoto Y, Mukai T., Okada N. Две внеклеточные сиалидазы из Bifidobacterium bifidum способствуют разложению сиалил-олигосахаридов и поддерживают рост Bifidobacterium breve . Анаэроб. 2018; 52: 22–8.
CAS PubMed Google ученый
Нишияма К., Ямамото Ю., Сугияма М., Такаки Т., Урасима Т., Фукия С. и др. Bifidobacterium bifidum Внеклеточная сиалидаза усиливает адгезию к поверхности слизистой оболочки и поддерживает усвоение углеводов.MBio. 2017; 8: e00928–17.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Смиловиц Дж. Т., О’Салливан А., Бариле Д., Герман Дж. Б., Лоннердал Б., Слупский С. М.. Метаболом грудного молока обнаруживает различные профили олигосахаридов. J Nutr. 2013; 143: 1709–18.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Ward RE, Niñonuevo M, Mills DA, Lebrilla CB, German JB.Ферментация олигосахаридов грудного молока in vitro с помощью Bifidobacterium infantis и Lactobacillus gasseri . Appl Environ Microbiol. 2006; 72: 4497–9.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Мацуки Т., Яхаги К., Мори Х., Мацумото Х., Хара Т., Таджима С. и др. Ключевой генетический фактор использования фукозиллактозы влияет на развитие микробиоты кишечника младенца. Nat Commun. 2016; 7: 11939.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Села Д.А., Гарридо Д., Лерно Л., Ву С., Тан К., Эом Х.-Дж. И др. Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697 альфа-фукозидазы активны в отношении фукозилированных олигосахаридов грудного молока. Appl Environ Microbiol. 2012; 78: 795–803.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Bohari MH, Yu X, Zick Y, Blanchard H.Обоснование на основе структуры дифференциального распознавания гликосфинголипидов лакто- и неолакто-ряда N-концевым доменом галектина-8 человека. Научный доклад 2016; 6: 1–12.
Google ученый
Каллаган А.О., Ван Синдерен Д. Бифидобактерии и их роль в составе микробиоты кишечника человека. Front Microbiol. 2016; 15: 7.
Google ученый
Ruiz-Moyano S, Totten SM, Garrido DA, Smilowitz JT, German JB, Lebrilla CB, et al.Различия в потреблении олигосахаридов грудного молока младенческими кишечными штаммами Bifidobacterium breve . Appl Environ Microbiol. 2013; 79: 6040–9.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Milani C, Mancabelli L, Lugli GA, Duranti S, Turroni F, Ferrario C и др. Изучение вертикальной передачи бифидобактерий от матери к ребенку. Appl Environ Microbiol. 2015; 81: 7078–87.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Като К., Одамаки Т., Мицуяма Э, Сугахара Х., Сяо Дж. З., Осава Р. Возрастные изменения в составе кишечника Bifidobacterium видов. Curr Microbiol. 2017; 74: 987–95.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Нагпал Р., Куракава Т., Цудзи Х., Такахаши Т., Кавасима К., Нагата С. и др. Эволюция кишечной популяции Bifidobacterium у здоровых японских младенцев в течение первых трех лет жизни: количественная оценка.Научный доклад 2017; 7: 1–11.
CAS Google ученый
Engfer MB, Stahl B, Finke B, Sawatzki G, Daniel H. Олигосахариды грудного молока устойчивы к ферментативному гидролизу в верхних отделах желудочно-кишечного тракта. Am J Clin Nutr. 2000; 71: 1589–96.
CAS PubMed Google ученый
O’Connell Motherway M, O’Brien F, O’Driscoll T., Casey PG, Shanahan F, van Sinderen D.Синтрофия углеводов способствует формированию Bifidobacterium breve UCC2003 в кишечнике новорожденных. Научный доклад 2018; 8: 10627.
PubMed PubMed Central Google ученый
Schwab C, Ruscheweyh HJ, Bunesova V, Pham VT, Beerenwinkel N, Lacroix C. Трофические взаимодействия детских бифидобактерий и eubacterium hallii во время деградации L-фукозы и фукозиллактозы. Front Microbiol. 2017; 8: 95.
PubMed PubMed Central Google ученый
D’Souza G, Shitut S, Preussger D, Yousif G, Waschina S, Kost C. Экология и эволюция метаболических взаимодействий перекрестного питания у бактерий. Nat Prod Rep.2018; 35: 455–88.
PubMed Google ученый
Mee MT, Collins JJ, Church GM, Wang HH. Синтрофный обмен в синтетических микробных сообществах. Proc Natl Acad Sci. 2014; 111: E2149–56.
CAS PubMed Google ученый
Пачеко А.Р., Моэль М., Сегре Д. Беззатратные метаболические выделения как движущие силы межвидовых взаимодействий в микробных экосистемах. Nat Commun. 2019; 10: 103.
PubMed PubMed Central Google ученый
Smith NW, Shorten PR, Altermann E, Roy NC, McNabb WC. Классификация и эволюция бактериального перекрестного вскармливания. Передняя часть Ecol Evol. 2019; 7: 1–15.
Google ученый
Фаннинг С., Холл Л.Дж., Кронин М., Зомер А., МакШарри Дж., Гулдинг Д. и др. Поверхностный экзополисахарид бифидобактерий способствует взаимодействию комменсала с хозяином посредством иммуномодуляции и защиты от патогенов. Proc Natl Acad Sci. 2012; 109: 2108–13.
CAS PubMed Google ученый
Алкон-Гинер С., Далби М., Кайм С., Кетскемети Дж., Шоу А., Сим К. и др. Добавление микробиоты Bifidobacterium и Lactobacillus изменяет микробиоту и метаболом кишечника недоношенных детей.2019. [Препринт] bioRxiv. https://doi.org/10.1101/6
Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T., Yarza P, et al. Проект базы данных генов рибосомной РНК SILVA: улучшенная обработка данных и веб-инструменты. Nucleic Acids Res. 2013; 41: 590–6.
Google ученый
Альтшул С.Ф., Мэдден Т.Л., Шеффер А.А., Чжан Дж., Чжан З., Миллер В. и др. Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска по базам данных белков.Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389–402.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Хусон Д., Митра С., Рушевей Х. Интегративный анализ экологических последовательностей с использованием MEGAN4. Genome Res. 2011; 21: 1552–60.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Page AJ, De Silva N, Hunt M, Quail MA, Parkhill J, Harris SR, et al.Надежный высокопроизводительный конвейер сборки и улучшения prokaryote de novo для данных Illumina. Микрогеномика. 2016; 2: e000083.
Google ученый
Geer LY, Marchler-Bauer A, Geer RC, Han L, He J, He S, et al. База данных NCBI BioSystems. Nucleic Acids Res. 2010. 38: D492–6.
CAS PubMed Google ученый
Seemann T. Prokka: быстрая аннотация прокариотического генома.Биоинформатика. 2014; 30: 2068–9.
CAS PubMed Google ученый
Пейдж AJ, Cummins CA, Hunt M, Wong VK, Reuter S, Holden MTG и др. Roary: быстрый крупномасштабный анализ генома прокариот. Биоинформатика. 2015; 31: 3691–3.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Katoh K, Standley DM. Программное обеспечение MAFFT для множественного выравнивания последовательностей, версия 7: улучшения производительности и удобства использования.Mol Biol Evol. 2013; 30: 772–80.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Castresana J. Выбор консервативных блоков из нескольких выравниваний для их использования в филогенетическом анализе. Mol Biol Evol. 2000; 17: 540–52.
CAS PubMed Google ученый
Talavera G, Castresana J. Улучшение филогении после удаления расходящихся и неоднозначно выровненных блоков из выравнивания последовательностей белков.Syst Biol. 2007; 56: 564–77.
CAS PubMed Google ученый
Gouy M, Guindon S, Gascuel O. Sea view version 4: мультиплатформенный графический пользовательский интерфейс для выравнивания последовательностей и построения филогенетического дерева. Mol Biol Evol. 2010; 27: 221–4.
CAS PubMed Google ученый
Guindon S, Dufayard JF, Lefort V, Anisimova M, Hordijk W., Gascuel O.Новые алгоритмы и методы для оценки филогении максимального правдоподобия: оценка производительности PhyML 3.0. Syst Biol. 2010; 59: 307–21.
CAS PubMed Google ученый
Причард Л., Гловер Р., Хамфрис С., Эльфинстон Дж. Г., Тот И. К.. Геномика и таксономия в диагностике продовольственной безопасности: энтеробактериальные патогены растений с мягким гниением. Анальные методы. 2016; 8: 12–24.
Google ученый
Huerta-Cepas J, Forslund K, Coelho LP, Szklarczyk D, Jensen LJ, Von Mering C, et al. Быстрая функциональная аннотация по всему геному через назначение ортологии с помощью eggNOG-mapper. Mol Biol Evol. 2017; 34: 2115–22.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Huerta-Cepas J, Szklarczyk D, Forslund K, Cook H, Heller D, Walter MC, et al. EGGNOG 4.5: иерархическая структура ортологии с улучшенными функциональными аннотациями для эукариотических, прокариотических и вирусных последовательностей.Nucleic Acids Res. 2016; 44: D286–93.
CAS PubMed Google ученый
Yin Y, Mao X, Yang J, Chen X, Mao F, Xu Y. DbCAN: веб-ресурс для автоматической аннотации углеводно-активных ферментов. Nucleic Acids Res. 2012; 40: 445–51.
Google ученый
Арндт Д., Грант Дж. Р., Марку А., Саджед Т., Пон А., Лян Ю. и др. PHASTER: улучшенная и быстрая версия инструмента поиска фагов PHAST.Nucleic Acids Res. 2016; 44: W16–21.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Чжоу Й, Лян И, Линч К. Х., Деннис Дж. Дж., Вишарт Д. С.. PHAST: инструмент быстрого поиска фагов. Nucleic Acids Res. 2011; 39: W347–52.
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
де Вос MGJ, Загорски М., МакНалли А., Болленбах Т. Сети взаимодействия, экологическая стабильность и коллективная толерантность к антибиотикам при полимикробных инфекциях.Proc Natl Acad Sci. 2017; 114: 201713372.
Google ученый
Стойкость добавленных Bifidobacterium longum subsp. infantis EVC001 у младенцев, находящихся на грудном вскармливании
ВВЕДЕНИЕ
Во многих странах с ограниченными ресурсами бифидобактерии являются доминирующими фекальными микробами у младенцев, находящихся на грудном вскармливании (1–3), тогда как в странах с богатыми ресурсами наблюдается заметная вариабельность, при этом некоторые исследования показывают низкое количество фекальных микробов. бифидобактерии среди младенцев, находящихся на грудном вскармливании (4–6).Режим родов, диета и бифидобактерии в кале матери влияют на колонизацию ребенка бифидобактериями. Уменьшение количества кишечных бифидобактерий имеет клиническое значение, основанное на большом количестве доказательств того, что дисбактериоз кишечника в раннем возрасте предрасполагает к воспалению и увеличивает риск ожирения, атопических и аллергических заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника (7–9) и сахарного диабета ( типы 1 и 2) (6, 10). Не случайно, что заболевания, связанные с дисбактериозом, значительно реже встречаются в странах с ограниченными ресурсами.Бифидобактерии, по-видимому, особенно важны, учитывая данные об обращении вызванного стрессом воспаления и повышенной проницаемости кишечника как in vitro, , так и на животных моделях (11–13). Пробиотики обещают стать потенциальным средством коррекции дисбактериоза в раннем возрасте и предотвращения заболеваний, связанных с кишечной микробиотой; однако многие коммерчески доступные пробиотические продукты на сегодняшний день показали лишь ограниченные преимущества. Частично это может быть связано с высокой степенью вариабельности чистоты и жизнеспособности существующих пробиотических продуктов (14).Кроме того, испытания пробиотиков на сегодняшний день продемонстрировали только временную колонизацию введенным штаммом (15-17). Вероятно, это является следствием экологической и эволюционной адаптации используемых пробиотических штаммов, поскольку возможно стабильное сохранение экзогенного штамма (18). Человеческое молоко содержит пребиотические олигосахариды, которые не усваиваются младенцем-хозяином, но быстро потребляются ограниченным количеством животных. количество видов Bifidobacterium и Bacteroides (19).Bifidobacterium longum subsp. infantis ( B. infantis ) является уникальным среди кишечных микробов своей способностью переноситься в цитоплазму и потреблять полный спектр олигосахаридов грудного молока (HMO) (20). Ранее мы сообщали о клиническом испытании B. infantis EVC001 у доношенных детей, находящихся на грудном вскармливании, в котором пары мать-ребенок получали либо поддержку в период лактации, либо в сочетании с пробиотиком в течение 21 дня (21). Теперь мы представляем вторичный анализ образцов кала, собранных у этих младенцев.Мы предположили, что с учетом способности B. infantis конкурировать с другими кишечными бактериями для HMO, младенцы, колонизированные этим штаммом в первые недели жизни, будут стабильно колонизироваться до тех пор, пока поступает грудное молоко. Мы также предположили, что предоставление этого штамма увеличит количество короткоцепочечных жирных кислот в кале и снизит pH в кале, содержание HMO в кале и концентрацию эндотоксина в кале.ОБСУЖДЕНИЕ
Новорожденные быстро колонизируются организмами, с которыми они сталкиваются во время родов, в результате воздействия вагинальных и фекальных микробов во время вагинальных родов или контакта с кожей и поверхностями, связанными с больницей, во время кесарева сечения (24, 25).Несмотря на исключительно грудное вскармливание, в этом исследовании многие младенцы CON оставались неколонизированными Bifidobacterium в течение первоначального 60-дневного периода исследования, а те, которые были колонизированы этим родом, имели виды, отличные от B. infantis , преобладающего вида, обнаруженного в многие младенцы на грудном вскармливании в странах с ограниченными ресурсами (15, 26). Самым поразительным открытием этого исследования была стабильная колонизация B. infantis значительно дольше периода приема добавок.Несмотря на то, что B. infantis EVC001 не поступало после 28-го дня, фекальные бифидобактерии, которые мы подтвердили как B. infantis EVC001 на основе количественной ПЦР, оставались доминирующим организмом у этих младенцев на 60-й день (рис. 2). Мы предполагаем, что эта продолжительная колонизация, которая редко наблюдалась в исследованиях пробиотиков (18), является функцией древних адаптаций B. longum subsp. infantis для ОПЗ (27), и некоторые из этих адаптаций обеспечивают особое экологическое преимущество перед другими кишечными микробами (например,g., Bacteroides ) (28). Таким образом, как инокуляция пробиотиками, так и постоянное обеспечение селективным питательным веществом (HMOs) для пробиотического штамма, вероятно, будут иметь важное значение для долгосрочной колонизации; эти данные аналогичны недавним открытиям для B. longum subsp. longum у взрослых (18). В дистальном отделе кишечника углеводы играют основную роль в формировании структуры микробного сообщества. ОПЗ являются энергетически дорогостоящими для матери, поскольку они производят и составляют третью по величине долю твердых веществ в материнском молоке (19).Учитывая, что ОПЗ не перевариваются младенцем, их много в стуле в отсутствие B. infantis или других микробов, потребляющих ОПЗ. Это может представлять собой потенциальный маркер дисбактериоза кишечника (то есть, когда в микробиоме кишечника преобладают микробы, не потребляющие HMO, такие как Proteobacteria и Firmicutes , содержание HMO в фекалиях высокое) (22, 29, 30) . Было предложено несколько функций ОПЗ, от передачи иммунных сигналов до использования в качестве пребиотиков (31), а изменения концентраций ОПЗ в молоке и составах микробиома связаны с различными воздействиями на результаты для здоровья (3).В данном случае предоставление B. infantis EVC001 заметно снизило количество ОПЗ в фекалиях, что согласуется с высоким уровнем потребления B. infantis EVC001. Связанное с этим повышение лактата и ацетата и снижение pH в фекалиях не было неожиданностью, учитывая, что центральный метаболический путь для Bifidobacterium дает лактат и ацетат в качестве основных продуктов ферментации (32). В отсутствие Bifidobacterium сообщество, которое доминирует в микробиоме кишечника младенцев в странах, богатых ресурсами, обычно характеризуется низкой стабильностью сообщества и пониженной резистентностью к колонизации, которые являются одними из ключевых экосистемных функций микробиома кишечника (33).У младенцев, колонизированных B. infantis EVC001, стабильность сообщества высока и насыщена даже при низком уровне разнообразия сообщества по сравнению с экосистемой кишечника взрослых. Таким образом, мы предполагаем, что эволюционные и экологические адаптации, которые сформировали отношения мать-младенец — B. infantis , сошлись на оптимуме, который максимизирует стабильность сообщества и ферментативный выход органических кислот на благо хозяина. Здесь мы обнаружили, что низкий pH фекалий отрицательно связан с Proteobacteria , присутствие которых в кишечном сообществе считается признаком дисбактериоза (34).Вырабатывая лактат и ацетат, B. infantis EVC001 также может превращать неперевариваемые углеводы, которые в противном случае теряются с калом, в субстраты, которые активно транспортируются хозяином и играют центральную роль в общем энергетическом балансе хозяина, развитии иммунной системы и поддержке. роста эпителиальных клеток толстой кишки во время критического окна развития младенца (35, 36). Действительно, недавние исследования показали, что младенцы колонизировали B. infantis на уровнях, сопоставимых с таковыми у младенцев, получавших добавку B.Infantis EVC001 улучшили показатели здоровья по сравнению с младенцами с дисбиотическим микробиомом кишечника (1), и что высокие уровни B. infantis типичны для здоровых младенцев (37). Будущие исследования потребуются, чтобы выяснить, насколько этот эффект сохраняется в более позднем детстве, и влияют ли эти эффекты на общее состояние здоровья в более позднем возрасте.БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы благодарят матерей и их младенцев, включенных в клиническое исследование, за сбор информации и образцов с методологическими подробностями.Мы благодарим наших сотрудников, Аннетт Файнберг, Кэтлин Ангкустсири, Дебору Альберт и Питера Трович, а также Хизер Конвей, Мари-Селин Фарвер, Ширли Герман и Лонну Хэмптон, консультантов исследования по грудному вскармливанию, которые предоставили участникам исследования поддержку и руководство для выполнения их цели в области грудного вскармливания.
Это исследование финансировалось Evolve Biosystems и NIH, получившими награды AT007079 и AT008759.
Мы стремимся сделать наши данные, материалы и методы анализа открытыми и доступными по запросу, если это разрешено.
Антимикробная чувствительность бифидобактерий | Журнал антимикробной химиотерапии
Аннотация
Цели : Целью нашего исследования был анализ чувствительности к антибиотикам различных штаммов Bifidobacterium spp. к широкому спектру противомикробных средств.
Методы : Пятьдесят штаммов, принадлежащих к восьми видам бифидобактерий, выделенных от людей, животных или пробиотических продуктов, были протестированы на чувствительность к 30 антибиотикам путем дисковой диффузии на агаре Brucella с добавлением 5% замороженной овечьей крови и витамина K1 (1 мг / Л).МИК девяти антианаэробных агентов, включая три новые молекулы (телитромицин, линезолид и гатифлоксацин), определяли с использованием эталонного метода разведения в агаре.
Результаты : Все штаммы бифидобактерий, независимо от вида, были чувствительны к пенициллинам: пенициллин G, амоксициллин (МИК 50 0,06 мг / л), пиперациллин, тикарциллин, имипенем и обычно анти-грамположительные антибиотики (макролиды , клиндамицин, пристинамицин, ванкомицин и тейкопланин). Чувствительность к цефалотину и цефотетану была переменной.Большинство изолятов (70%) были устойчивы к фузидовой кислоте. Как и ожидалось, высокие показатели устойчивости наблюдались для аминогликозидов. Метронидазол, средство, известное своей антианаэробной активностью, оказался неэффективным против 38% штаммов. Новые коммерчески доступные молекулы, телитромицин, линезолид и гатифлоксацин, были активны с MIC 50 S, равной 1 мг / л. Единственное различие в восприимчивости, наблюдаемое у разных видов, касалось Bifidobacterium breve , которая в целом оказалась более устойчивой.Потенциально приобретенная устойчивость наблюдалась только к тетрациклину и миноциклину у 14% штаммов.
Выводы : Что касается общей озабоченности по поводу безопасности пробиотиков, такой как потенциальная возможность передачи детерминант устойчивости, то бифидобактерии с их низкой естественной и приобретенной устойчивостью к 30 антибиотикам кажутся безопасными.
Введение
Бифидобактерии — анаэробные грамположительные палочковидные организмы с характерным Y- или V-образным концом.Они населяют в основном слизистые оболочки кишечника и влагалища людей и животных. 1 Бифидобактерии относятся к группе молочнокислых бактерий (ЛАБ), в которую входят пробиотические штаммы родов Lactobacillus , Bifidobacterium и Enterococcus . 1 Они известны как пробиотические организмы из-за их потенциально полезной роли в кишечном тракте, особенно в поддержании баланса кишечных микробов, путем подавления роста потенциальных патогенов. 2 Их репутация в качестве пропагандистов здоровья привела к их использованию в микробных добавках, а также в профилактике и лечении желудочно-кишечных инфекций и диареи, связанной с антибиотиками. 3–5
Определение чувствительности бактериального штамма к противомикробным препаратам является важной предпосылкой для его утверждения в качестве пробиотика. Некоторые авторы утверждают, что в случаях совместного приема с антибиотиками для профилактики и лечения кишечных расстройств пробиотики должны быть устойчивыми к определенным антибиотикам, чтобы выжить в желудочно-кишечном тракте. 6 Однако это мнение спорно. Пробиотики, содержащие признаки устойчивости, могут иметь негативные последствия для здоровья человека. Риски, связанные с потенциальной передачей устойчивости к антибиотикам от штаммов пробиотиков кишечным патогенам, вызывают озабоченность, особенно после сообщения о пробиотике Enterococcus faecium , который, как было установлено, является возможным реципиентом гена устойчивости к гликопептидам vanA . 7 О наличии генов устойчивости к антибиотикам во многих LAB, а также о переносе плазмид и конъюгированных транспозонов в и из LAB сообщалось у видов Enterococcus и Lactobacillus .Насколько нам известно, конъюгативные плазмиды у бифидобактерий не описаны. 1 Штаммы бифидобактерий могут, однако, быть патогенными и вызывать желудочно-кишечные и внекишечные инфекции, хотя эти инфекции редко описываются в сравнении с инфекциями, связанными с другими видами пробиотиков. Патогенные штаммы бифидобактерий были изолированы от инфекций, возникающих в брюшной полости, абсцессах, акушерских / гинекологических участках и в грудной клетке. 8 Bifidobacterium dentium и Bifidobacterium adolescentis были ответственны за половину этих инфекций, а также были вовлечены, как описано в другом исследовании, в бактериемию. 9
Чувствительность бифидобактерий к противомикробным препаратам до сих пор серьезно не подвергалась сомнению, а немногочисленные данные, имеющиеся в литературе, неоднородны и противоречивы. Это исследование было проведено для точного определения чувствительности штаммов рода Bifidobacterium , выделенных из различных источников, к нескольким группам обычных противомикробных агентов.
Материалы и методы
Штаммы бактерий
Были изучены пятьдесят штаммов бифидобактерий, в том числе семь эталонных штаммов, полученных из коллекции Института Пастера (Париж, Франция).Эти штаммы, представляющие восемь различных видов бифидобактерий, были выделены из различных мест обитания: 15 штаммов из фекалий взрослых людей, 26 из фекалий новорожденных или младенцев, пять из пробиотических продуктов, два из кишечника младенцев, один из фекалий животных и один из зубов человека. кариес. Количество протестированных штаммов было разделено следующим образом: Bifidobacterium longum — 14; Bifidobacterium pseudocatenulatum , 11; Bifidobacterium bifidum ,8; Bifidobacterium animalis / Bifidobacterium lactis , 8; Bifidobacterium breve , 6; Б.adolescentis , 1; Bifidobacterium angulatum , 1; B. dentium , 1.
Clostridium perfringens ATCC 13124T, Bacteroides fragilis ATCC 25285 и Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741, полученный из Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд, США), использовали в качестве контрольных штаммов в качестве контрольных штаммов. предложено NCCLS.
Медиа
Бульон, содержащий триптон-пептон (30 г / л), глюкозу (5 г / л), дрожжевой экстракт (20 г / л) и гемин (5 мг / л), использовали для культивирования штаммов в жидкой среде (TGYH).Агар Brucella (BBL, Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Франция) с добавлением 5% замороженной овечьей крови и витамина K1 (1 мг / л) использовали для культивирования штаммов на твердой среде и для тестов на чувствительность к антимикробным препаратам.
Все эксперименты проводились в анаэробном шкафу (Don Whitley, AES Laboratoire, Combourg, France), заполненном газовой смесью, не содержащей O 2 (CO 2 / H 2 / N 2 , 10 / 10/80).
Тесты на чувствительность к противомикробным препаратам
В первой части исследования чувствительность штаммов бифидобактерий к антимикробным препаратам определялась диско-диффузионным методом в соответствии с рекомендациями CA-SFM (Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie). 10 Исходные культуры поддерживали при -80 ° C в криопробирках в бульоне для инфузии мозга и сердца, содержащем глицерин (15% об. / Об.), И анаэробно переносили на агар Brucella при 37 ° C за 48 ч до анализа. Затем для каждого тестируемого организма готовили посевной материал путем суспендирования клеток в бульоне TGYH для достижения мутности, эквивалентной мутности стандарта МакФарланда 1,0 (3 × 10 8 клеток / мл), и вносили его на чашку с агаром с ватным тампоном. мазок в трех направлениях. Стандартные диски с 32 антимикробными агентами помещали на поверхность планшетов с помощью механического дозирующего устройства (Bio-Rad, Марн-ла-Кокетт, Франция).Диаметр зон ингибирования измеряли после анаэробной инкубации при 37 ° C в течение 48 часов. Диски с антибиотиками были получены от Bio-Rad, Марн-ла-Кокетт, Франция, за исключением метронидазола (Neo-Sensitabs, Роско, Дания) и телитромицина (Oxoid, Dardilly, Франция).
Во второй части исследования МИК девяти антибиотиков, т.е. пенициллина G, амоксициллина, цефокситина, тетрациклина, эритромицина, телитромицина, линезолида, ванкомицина и гатифлоксацина, определяли с использованием эталонного метода разбавления агара, рекомендованного CA-SFM и NCCLS. 10,11 Пенициллин G, амоксициллин, цефокситин, ванкомицин, тетрациклин и эритромицин были выбраны для проверки наиболее часто встречающихся механизмов приобретенной устойчивости у грамположительных анаэробов. Телитромицин, линезолид и гатифлоксацин были выбраны, потому что это новые антибиотики. Телитромицин, гатифлоксацин и линезолид были предоставлены в виде стандартизированных порошков, соответственно, Aventis Pharmaceuticals (Роменвиль, Франция), Grunenthal (Париж, Франция) и Pharmacia-Upjohn (Guyancourt, Франция).Порошки с известной эффективностью пенициллина G, амоксициллина, цефокситина, тетрациклина, эритромицина и ванкомицина были получены из коммерческих источников. Растворы 512 мг / л каждого антибиотика были приготовлены в соответствующих разбавителях, и были выполнены двукратные разведения в дистиллированной воде перед включением в агар Brucella с добавлением жидкой овечьей крови и витамина K1. Все планшеты были использованы в течение 24 часов после приготовления. Инокулят был приготовлен для каждого тестируемого организма путем суспендирования клеток с чашки в бульоне TGYH для достижения мутности, эквивалентной 1.0 стандарт МакФарланда (3 × 10 8 клеток / мл) и доставляли репликатором Steers на чашки с агаром. В начале каждой серии испытаний чашку без противомикробных агентов инокулировали для определения жизнеспособности организмов и использования в качестве контроля для сравнения роста. Планшеты инкубировали в анаэробной камере при 37 ° C в течение 48 ч. Поскольку для анаэробов могут быть затруднены показания конечных точек, МИК была определена как самая низкая концентрация противомикробного агента, которая привела либо к отсутствию роста, либо к появлению нескольких колоний, либо к значительному падению количества роста, как рекомендовано NCCLS. 12 Уровни резистентности были рассчитаны в соответствии с французскими контрольными точками (мг / л), которые в основном идентичны таковым в NCCLS и соответствуют следующему: пенициллин G (> 16), амоксициллин (> 16), цефокситин (> 32) , тетрациклин (> 8), эритромицин (> 4), телитромицин (> 2), линезолид (> 4), ванкомицин (> 16) и гатифлоксацин (> 2). Каждый эксперимент повторяли трижды в дубликатах и включали контрольные штаммы.
МИК 50 определяли как самую низкую концентрацию антибиотика, которая подавляла 50% тестируемых штаммов, а МИК 90 как самую низкую концентрацию, которая подавляла 90% тестируемых штаммов.
Определение активности β-лактамаз с помощью нитроцефиновых тестов
Диски хромогенного цефалоспорина, нитроцефина (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Франция), использовали для определения активности β-лактамазы. 13 B. fragilis ATCC 25285 использовали в качестве положительного контроля.
Анализы для определения детерминант устойчивости к тетрациклину с помощью ПЦР
Полную геномную ДНК экстрагировали из всех устойчивых к тетрациклину штаммов и использовали для амплификации с вырожденными праймерами, которые идентифицируют все известные гены Tc r типа защиты рибосом.Также были выполнены амплификации с праймерами, специфичными для генов tet (M) и tet (W). Условия ПЦР и наборы праймеров были такими, как описано, соответственно, Barbosa et al. , 14 Робертс и др. 15 и Scott et al. 16 E. faecium UW7 использовали в качестве положительного контроля для ПЦР tet (M) и вырожденного tet , а Butyrivibrio fibrisolvens 1.230 использовали в качестве положительного контроля для ПЦР tet (W) . 14,17
Результаты
Результаты тестов на дискдиффузионную чувствительность к противомикробным препаратам на 50 штаммах бифидобактерий суммированы в таблице 1, а МИК девяти противомикробных агентов, включая недавно коммерциализированные молекулы, телитромицин, линезолид и гатифлоксацин, показаны в таблице 2.
Ни один из штаммы бифидобактерий, независимо от вида, были устойчивы к пенициллину G, амоксициллину, амоксициллину / клавулановой кислоте, тикарциллину, пиперациллину, цефотаксиму и имипенему при проверенных концентрациях антибиотиков.Устойчивость к цефотетану наблюдалась у 26% штаммов. Только один штамм B. longum и один штамм B. breve были устойчивы к цефокситину с МПК, равным 64 мг / л. Имипенем и цефотаксим продуцировали очень большие зоны ингибирования на тестируемых организмах, что указывает на низкие значения МПК. Продукция β-лактамаз штаммами бифидобактерий не обнаружена.
Все штаммы были чувствительны к обычно анти-грамположительным антибиотикам. Эритромицин и телитромицин были высокоактивны с МИК 50 с, соответственно, ≤0.06 и ≤0,0015 мг / л. Ни один из штаммов бифидобактерий не был устойчивым к клиндамицину или пристинамицину. У ванкомицина и линезолида МИК 50 с ≤1 мг / л.
Высокие показатели устойчивости наблюдались для метронидазола и аминогликозидов при использовании метода дисковой диффузии. При испытанной концентрации метронидазол был неэффективен против 38% протестированных организмов. Канамицин (30 мкг) и гентамицин (15 мкг) с низким уровнем активности вообще не проявляли активности, при этом 100% штаммов проявляли устойчивость. Однако тестируемые штаммы были чувствительны к высокому уровню канамицина (1000 мкг) или гентамицина (500 мкг).
Все штаммы были устойчивы к налидиксовой кислоте. Офлоксацин показал различные размеры зоны ингибирования, с устойчивостью, описанной у штаммов каждого вида. Ни один из штаммов бифидобактерий не был устойчив к гатифлоксацину, новому фторхинолону с антианаэробными свойствами (MIC 50 = 1 мг / л).
Фузидиевая кислота в тестируемой концентрации оказалась неэффективной, только 30% штаммов были чувствительны. Рифампицин был относительно активен и подавлял 96% штаммов бифидобактерий.
Антибактериальные средства широкого спектра действия, хлорамфеникол и тетрациклин, вели себя по-разному. Ни один из штаммов не был устойчив к хлорамфениколу, в то время как тетрациклин и миноциклин показали разные паттерны по отношению к тестируемым штаммам. Три штамма B. pseudocatenulatum , два штамма B. longum и два штамма B. bifidum были устойчивы к тетрациклину с МПК, равным 16 или 64 мг / л. Устойчивость к тетрациклину во всех случаях была связана с устойчивостью к миноциклину.Остальные штаммы были чувствительны к этой группе антибиотиков. ПЦР, проведенная на семи устойчивых к тетрациклину штаммах, выявила положительные амплификации с вырожденными праймерами для B. bifidum R2, B. longum B36 и B. pseudocatenulatum R47. Tet (W) был обнаружен в тех же штаммах B. bifidum и B. pseudocatenulatum , которые дали положительные результаты для вырожденной ПЦР (фиг. 1, дорожки C и E). Ген tet (M) не был обнаружен у устойчивых к тетрациклину бифидобактерий, протестированных в этом исследовании.
Согласно опубликованным результатам, профиль восприимчивости, по-видимому, не был специфическим для данного вида, и наблюдалась значительная вариация между штаммами. Однако вид B. breve оказался в целом более устойчивым к антибиотикам.
Обсуждение
Чувствительность бифидобактерий к антибиотикам вызывает серьезное беспокойство не только в тех немногих случаях, когда организм является патогенным и вызывает инфекции, но также для понимания изменения нормальной кишечной флоры при приеме антибиотиков и при выборе штамма бифидобактерий в качестве пробиотика. .Следует отметить, что определение чувствительности к антимикробным препаратам этого типа строго анаэробных и медленнорастущих бактерий затруднено и иногда требует повторения экспериментов.
β-Лактамы, гликопептиды и эритромицин были высокоактивны в отношении тестируемых бифидобактерий. Новые классы антибиотиков, то есть кетолиды и оксазолидиноны, и новые молекулы с антианаэробными свойствами, то есть гатифлоксацин, оказались очень эффективными. Цефалотин и цефотетан были менее активны, чем другие β-лактамы.Устойчивость к β-лактамным противомикробным препаратам может возникать по ряду механизмов, включая выработку β-лактамазы (пенициллиназы или цефалоспориназы), которая гидролизует антибиотический агент. 18 Такой механизм устойчивости не наблюдался в этом исследовании, что предполагает альтернативные механизмы устойчивости к β-лактамам, такие как непроницаемость клеточной стенки или изменение связывающих пенициллин белков. 18 Все протестированные штаммы бифидобактерий были по своей природе устойчивы к низкоуровневым аминогликозидам из-за отсутствия цитохром-опосредованного транспорта лекарств среди анаэробов. 19 Приобретенной устойчивости к аминогликозидам у исследованных штаммов не наблюдалось. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями. 20–23 Charteris et al. 24 наблюдали высокие уровни устойчивости к гликопептидам и цефокситину. Это контрастирует с нашими наблюдениями и данными Citron et al. 25 , где ванкомицин (МПК 50 = 0,5 мг / л в обоих исследованиях) и цефокситин (МПК 50 = 4 мг / л и МПК 50 = 2 мг / л, соответственно) четко указаны как высокие. активные препараты против штаммов бифидобактерий.Это несоответствие может быть связано с ограниченной надежностью метода дисковой диффузии для определения устойчивости к ванкомицину по сравнению с методом разбавления в агаре. Другим объяснением может быть питательная среда, поскольку Charteris et al. 24 использовали среду дрожжей триптиказо-фитона (TPY) вместо агара с жидкой кровью и бруцеллами с добавлением витамина K1.
Чувствительность бифидобактерий к различным антибиотикам представляет интерес для лечения тех редких случаев, когда бифидобактерии являются патогенными агентами. 8 Противомикробные препараты, используемые в определенных клинических условиях для лечения анаэробных или смешанных инфекций, такие как амоксициллин (отдельно или с клавулановой кислотой), имипенем, клиндамицин и цефокситин, очень активны в отношении бифидобактерий. Введение одного из этих соединений может привести к уничтожению этих бактерий из очага инфекции. В то время как устойчивость к клиндамицину имела место у 11% неспорулированных грамположительных анаэробных бацилл, как было исследовано Mory et al. , Все 26 штаммов бифидобактерий ингибировались клиндамицином в этом исследовании.Относительная устойчивость бифидобактерий к метронидазолу хорошо освещена в этом исследовании. Активность метронидазола обусловлена преимущественным восстановлением бактериальной системой ферредоксина исходного соединения с образованием промежуточного продукта, ответственного за разрывы в двухцепочечной ДНК. 27 Некоторые штаммы бифидобактерий лишены ферредоксиновой системы, ответственной за восстановление исходного соединения, и обладают высокой устойчивостью к метронидазолу, активному лекарству практически против всех облигатных анаэробов.Ни в нашем исследовании, ни в исследовании Behra-Miellet et al. Не было обнаружено анаэробного штамма, устойчивого к линезолиду. , 28 , которые оценили этот антибиотик как многообещающий кандидат для лечения инфекций, вызванных анаэробами. В этом исследовании наиболее активным агентом, по-видимому, является телитромицин, демонстрирующий самые низкие МИК против всех протестированных штаммов бифидобактерий.
Чувствительность бифидобактерий к различным антибиотикам представляет интерес для понимания изменения нормальной микрофлоры кишечника при приеме антибиотиков.Бифидобактерии доминируют в кишечнике и составляют часть барьерного эффекта, который предотвращает колонизацию кишечника патогенными бактериями. Относительная резистентность к метронидазолу может быть полезной в случаях совместного применения бифидобактерий с этим антибиотиком, например. диарея, связанная с антибиотиками. С другой стороны, на выживание бифидобактерий и лактобацилл — бактерий, в основном присутствующих в толстой кишке, — влияет концентрация антибиотика, которая достигает дистальной части желудочно-кишечного тракта.Поскольку антибиотики в основном всасываются в подвздошной кишке, терапевтическая доза, которая достигает толстой кишки, может быть низкой по сравнению с начальной дозой. Следовательно, бифидобактерии и лактобациллы могут выжить лучше in vivo , чем in vitro .
Чувствительность кишечных микроорганизмов к противомикробным препаратам является важным критерием выбора организма в качестве пробиотика. По сравнению с лактобациллами, штаммы, обычно используемые в качестве пробиотиков, бифидобактерии более чувствительны к антибиотикам.Действительно, лактобациллы обладают естественной устойчивостью к гликопептидам, с механизмом устойчивости, который не имеет тесной связи с vanA — и vanB -опосредованной энтерококковой устойчивостью к ванкомицину, 29 , несмотря на то, что в ранних работах сообщалось об ассоциации устойчивости к ванкомицину у Lactobacillus acidophilus . в переносимую плазмиду. 30 Кроме того, в недавнем исследовании сообщалось о существовании штаммов пробиотических лактобацилл, устойчивых к тетрациклину (29.5%), хлорамфеникол (8,5%) и эритромицин (12%). 31 В настоящем исследовании только потенциально приобретенная устойчивость к тетрациклину и миноциклину наблюдалась у 14% протестированных штаммов бифидобактерий. Эти фенотипические результаты по устойчивости к тетрациклину аналогичны тем, которые наблюдали Lim et al. 20 Мы впервые идентифицировали tet (W) как ген, ответственный за устойчивость к тетрациклину у B. pseudocatenulatum и B.bifidum . Ген tet (W) был ранее обнаружен у человека B. longum и у трех родов облигатных анаэробов рубца, что предполагает межродовый перенос этого гена устойчивости между анаэробными бактериями. 16
Поскольку наблюдается значительный рост потребления пробиотических продуктов, важно, чтобы пробиотики, разработанные специально для здоровья потребителей, были хорошо задокументированы в отношении устойчивости к антибиотикам. Постоянное внимание следует уделять отбору пробиотических штаммов, не содержащих переносимых детерминант устойчивости к антибиотикам.Что касается общей озабоченности по поводу безопасности пробиотиков, то есть потенциальной возможности передачи детерминант устойчивости к антибиотикам, бифидобактерии с их низкой естественной и приобретенной устойчивостью к антибиотикам кажутся безопасными для использования среди здорового населения в целом.
Рис. 1.
ПЦР-обнаружение гена tet (W) в Bifidobacterium . Дорожки: A, лестница ДНК 100 п.н .; B, Butyrivibrio fibrisolvens 1,230; С, Б.bifidum R2; D, B. longum B36; E, B. pseudocatenulatum R47.
Рис. 1.
ПЦР-обнаружение гена tet (W) в Bifidobacterium . Дорожки: A, лестница ДНК 100 п.н .; B, Butyrivibrio fibrisolvens 1,230; С, В. bifidum R2; D, B. longum B36; E, B. pseudocatenulatum R47.
Таблица 1.Чувствительность бифидобактерий к антимикробным препаратам с использованием метода дисковой диффузии
| Виды (количество штаммов) . | Диапазон диаметров зоны ингибирования (мм) . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | |||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| . | PEN 6 мкг . | AMX 25 мкг . | AMC 20/10 мкг . | TIC 75 мкг . | PIP 75 мкг . | ОХА 5 мкг . | CEF 30 мкг . | FOX 30 мкг . | СТТ 30 мкг . | CTX 30 мкг . | IPM 10 мкг . | KAN a 30 мкг . | GEN a 15 мкг . | TET 30 МЕ . | МИН. 30 МЕ . | |||||||||||||||||
| B. longum (14) | 20–38 | 24–46 | 20–45 | 22–40 | 23–42 | 14–41 | 10–38 | 14–37 | 10–28 | 28–41 | 28–47 | 6 | 6–12 | 8–42 | 12–42 | |||||||||||||||||
| B.pseudocatenulatum (11) | 22–42 | 26–45 | 26–45 | 31–50 | 21–46 | 22–45 | 17–35 | 20–42 | 24–36 | 16–41 | 30–52 | 6–8 | 6 | 8–42 | 10–45 | |||||||||||||||||
| B. bifidum (8) | 24–46 | 26–45 | 25–48 | 20–44 | 20–44 | 23–38 | 11–36 | 20–37 | 15–30 | 28–42 | 34–43 | 6–10 | 6–10 | 9–32 | 14–32 | |||||||||||||||||
| B.animalis / lactis (8) | 20–40 | 24–38 | 25–40 | 25–50 | 20–48 | 18–30 | 10–29 | 18–32 | 10 –30 | 23–41 | 28–46 | 6 | 6 | 17–36 | 24–34 | |||||||||||||||||
| B. breve (6) | 20–24 | 25–40 | 26–42 | 22–36 | 21–34 | 8–34 | 6–28 | 6–32 | 6–26 | 20–36 | 22–42 | 6–10 | 6–10 | 18–31 | 20–36 | |||||||||||||||||
| Другое (3) | 29–44 | 30–36 | 31–34 | 30–42 | 30–41 | 26–31 | 25–31 | 25–32 | 26–31 | 28–36 | 38–42 | 6–8 | 6 | 22–28 | 23–31 | |||||||||||||||||
| Процент резистентных штаммов | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 16 | 20 | 0 | 20 | 9229 | 22226 | 0 | 100 | 100 | 14 | 14 | |||||||||||||||
| Виды (количество деформаций) | Диапазон диаметров зоны ингибирования (мм) 0 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| ERY 15 IU | SPI 100 мкг 922 922 922 PRI | SPI 100 мкг 922 901 мкг | LNZ 30 мкг | VAN 30 мкг 9 0130 | TEC 30 мкг | NAL 30 мкг | OFX 35 мкг | GAT 5 мкг | MTR 16 мкг | CHL 30 мкг | ||||||||||||||||||||||
| Б.longum (14) | 28–45 | 24–40 | 31–50 | 31–46 | 29–44 | 28–48 | 21–36 | 18–32 | 6 | 9–28 | 19–41 | 10–44 | 25–39 | 6–36 | 6–44 | |||||||||||||||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 17–44 | 25–44 | 27–55 | 29–46 | 26–50 | 25–50 | 21–32 | 20–32 | 6 | 12–26 | 23–44 | 10–40 | 29–42 | 6–24 | 24–37 | |||||||||||||||||
| B.bifidum (8) | 29–41 | 20–39 | 24–38 | 26–44 | 32–46 | 29–44 | 22–32 | 19–28 | 6 | 9–21 | 19–29 | 10–44 | 26–40 | 7–21 | 20–32 | |||||||||||||||||
| B. animalis / lactis (8) | 21–45 | 20 –48 | 30–51 | 16–51 | 30–50 | 29–45 | 20–36 | 18–34 | 6 | 6–25 | 19–28 | 10–44 | 22–46 | 6–32 | 20–40 | |||||||||||||||||
| B.breve (6) | 31–38 | 29–40 | 31–46 | 28–44 | 30–44 | 34–42 | 20–34 | 25–32 | 6 | 17–26 | 18–26 | 10–42 | 28–38 | 7–12 | 6–44 | |||||||||||||||||
| Другое (3) | 32–41 | 33–38 | 30– 46 | 38–41 | 41–44 | 33–42 | 26–28 | 20–24 | 6 | 17–20 | 25–28 | 10–25 | 25–35 | 7–15 | 27–33 | |||||||||||||||||
| Процент резистентных штаммов | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 38 | 0 | 70 | 4 | |||||||||||||||||||
| Вид (количество штаммов) . | Диапазон диаметров зоны ингибирования (мм) . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | |||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| . | PEN 6 мкг . | AMX 25 мкг . | AMC 20/10 мкг . | TIC 75 мкг . | PIP 75 мкг . | ОХА 5 мкг . | CEF 30 мкг . | FOX 30 мкг . | СТТ 30 мкг . | CTX 30 мкг . | IPM 10 мкг . | KAN a 30 мкг . | GEN a 15 мкг . | TET 30 МЕ . | МИН. 30 МЕ . | |||||||||||||||||
| B. longum (14) | 20–38 | 24–46 | 20–45 | 22–40 | 23–42 | 14–41 | 10–38 | 14–37 | 10–28 | 28–41 | 28–47 | 6 | 6–12 | 8–42 | 12–42 | |||||||||||||||||
| B.pseudocatenulatum (11) | 22–42 | 26–45 | 26–45 | 31–50 | 21–46 | 22–45 | 17–35 | 20–42 | 24–36 | 16–41 | 30–52 | 6–8 | 6 | 8–42 | 10–45 | |||||||||||||||||
| B. bifidum (8) | 24–46 | 26–45 | 25–48 | 20–44 | 20–44 | 23–38 | 11–36 | 20–37 | 15–30 | 28–42 | 34–43 | 6–10 | 6–10 | 9–32 | 14–32 | |||||||||||||||||
| B.animalis / lactis (8) | 20–40 | 24–38 | 25–40 | 25–50 | 20–48 | 18–30 | 10–29 | 18–32 | 10 –30 | 23–41 | 28–46 | 6 | 6 | 17–36 | 24–34 | |||||||||||||||||
| B. breve (6) | 20–24 | 25–40 | 26–42 | 22–36 | 21–34 | 8–34 | 6–28 | 6–32 | 6–26 | 20–36 | 22–42 | 6–10 | 6–10 | 18–31 | 20–36 | |||||||||||||||||
| Другое (3) | 29–44 | 30–36 | 31–34 | 30–42 | 30–41 | 26–31 | 25–31 | 25–32 | 26–31 | 28–36 | 38–42 | 6–8 | 6 | 22–28 | 23–31 | |||||||||||||||||
| Процент резистентных штаммов | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 16 | 20 | 0 | 20 | 9229 | 22226 | 0 | 100 | 100 | 14 | 14 | |||||||||||||||
| Виды (количество деформаций) | Диапазон диаметров зоны ингибирования (мм) 0 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| ERY 15 IU | SPI 100 мкг 922 922 922 PRI | SPI 100 мкг 922 901 мкг | LNZ 30 мкг | VAN 30 мкг 9 0130 | TEC 30 мкг | NAL 30 мкг | OFX 35 мкг | GAT 5 мкг | MTR 16 мкг | CHL 30 мкг | ||||||||||||||||||||||
| Б.longum (14) | 28–45 | 24–40 | 31–50 | 31–46 | 29–44 | 28–48 | 21–36 | 18–32 | 6 | 9–28 | 19–41 | 10–44 | 25–39 | 6–36 | 6–44 | |||||||||||||||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 17–44 | 25–44 | 27–55 | 29–46 | 26–50 | 25–50 | 21–32 | 20–32 | 6 | 12–26 | 23–44 | 10–40 | 29–42 | 6–24 | 24–37 | |||||||||||||||||
| B.bifidum (8) | 29–41 | 20–39 | 24–38 | 26–44 | 32–46 | 29–44 | 22–32 | 19–28 | 6 | 9–21 | 19–29 | 10–44 | 26–40 | 7–21 | 20–32 | |||||||||||||||||
| B. animalis / lactis (8) | 21–45 | 20 –48 | 30–51 | 16–51 | 30–50 | 29–45 | 20–36 | 18–34 | 6 | 6–25 | 19–28 | 10–44 | 22–46 | 6–32 | 20–40 | |||||||||||||||||
| B.breve (6) | 31–38 | 29–40 | 31–46 | 28–44 | 30–44 | 34–42 | 20–34 | 25–32 | 6 | 17–26 | 18–26 | 10–42 | 28–38 | 7–12 | 6–44 | |||||||||||||||||
| Другое (3) | 32–41 | 33–38 | 30– 46 | 38–41 | 41–44 | 33–42 | 26–28 | 20–24 | 6 | 17–20 | 25–28 | 10–25 | 25–35 | 7–15 | 27–33 | |||||||||||||||||
| Процент резистентных штаммов | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 38 | 0 | 70 | 4 | |||||||||||||||||||
Чувствительность бифидобактерий к антимикробным препаратам методом дисковой диффузии
| Виды (количество штаммов) . | Диапазон диаметров зоны ингибирования (мм) . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | |||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| . | PEN 6 мкг . | AMX 25 мкг . | AMC 20/10 мкг . | TIC 75 мкг . | PIP 75 мкг . | ОХА 5 мкг . | CEF 30 мкг . | FOX 30 мкг . | СТТ 30 мкг . | CTX 30 мкг . | IPM 10 мкг . | KAN a 30 мкг . | GEN a 15 мкг . | TET 30 МЕ . | МИН. 30 МЕ . | |||||||||||||||||
| B. longum (14) | 20–38 | 24–46 | 20–45 | 22–40 | 23–42 | 14–41 | 10–38 | 14–37 | 10–28 | 28–41 | 28–47 | 6 | 6–12 | 8–42 | 12–42 | |||||||||||||||||
| B.pseudocatenulatum (11) | 22–42 | 26–45 | 26–45 | 31–50 | 21–46 | 22–45 | 17–35 | 20–42 | 24–36 | 16–41 | 30–52 | 6–8 | 6 | 8–42 | 10–45 | |||||||||||||||||
| B. bifidum (8) | 24–46 | 26–45 | 25–48 | 20–44 | 20–44 | 23–38 | 11–36 | 20–37 | 15–30 | 28–42 | 34–43 | 6–10 | 6–10 | 9–32 | 14–32 | |||||||||||||||||
| B.animalis / lactis (8) | 20–40 | 24–38 | 25–40 | 25–50 | 20–48 | 18–30 | 10–29 | 18–32 | 10 –30 | 23–41 | 28–46 | 6 | 6 | 17–36 | 24–34 | |||||||||||||||||
| B. breve (6) | 20–24 | 25–40 | 26–42 | 22–36 | 21–34 | 8–34 | 6–28 | 6–32 | 6–26 | 20–36 | 22–42 | 6–10 | 6–10 | 18–31 | 20–36 | |||||||||||||||||
| Другое (3) | 29–44 | 30–36 | 31–34 | 30–42 | 30–41 | 26–31 | 25–31 | 25–32 | 26–31 | 28–36 | 38–42 | 6–8 | 6 | 22–28 | 23–31 | |||||||||||||||||
| Процент резистентных штаммов | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 16 | 20 | 0 | 20 | 9229 | 22226 | 0 | 100 | 100 | 14 | 14 | |||||||||||||||
| Виды (количество деформаций) | Диапазон диаметров зоны ингибирования (мм) 0 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| ERY 15 IU | SPI 100 мкг 922 922 922 PRI | SPI 100 мкг 922 901 мкг | LNZ 30 мкг | VAN 30 мкг 9 0130 | TEC 30 мкг | NAL 30 мкг | OFX 35 мкг | GAT 5 мкг | MTR 16 мкг | CHL 30 мкг | ||||||||||||||||||||||
| Б.longum (14) | 28–45 | 24–40 | 31–50 | 31–46 | 29–44 | 28–48 | 21–36 | 18–32 | 6 | 9–28 | 19–41 | 10–44 | 25–39 | 6–36 | 6–44 | |||||||||||||||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 17–44 | 25–44 | 27–55 | 29–46 | 26–50 | 25–50 | 21–32 | 20–32 | 6 | 12–26 | 23–44 | 10–40 | 29–42 | 6–24 | 24–37 | |||||||||||||||||
| B.bifidum (8) | 29–41 | 20–39 | 24–38 | 26–44 | 32–46 | 29–44 | 22–32 | 19–28 | 6 | 9–21 | 19–29 | 10–44 | 26–40 | 7–21 | 20–32 | |||||||||||||||||
| B. animalis / lactis (8) | 21–45 | 20 –48 | 30–51 | 16–51 | 30–50 | 29–45 | 20–36 | 18–34 | 6 | 6–25 | 19–28 | 10–44 | 22–46 | 6–32 | 20–40 | |||||||||||||||||
| B.breve (6) | 31–38 | 29–40 | 31–46 | 28–44 | 30–44 | 34–42 | 20–34 | 25–32 | 6 | 17–26 | 18–26 | 10–42 | 28–38 | 7–12 | 6–44 | |||||||||||||||||
| Другое (3) | 32–41 | 33–38 | 30– 46 | 38–41 | 41–44 | 33–42 | 26–28 | 20–24 | 6 | 17–20 | 25–28 | 10–25 | 25–35 | 7–15 | 27–33 | |||||||||||||||||
| Процент резистентных штаммов | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 38 | 0 | 70 | 4 | |||||||||||||||||||
| Вид (количество штаммов) . | Диапазон диаметров зоны ингибирования (мм) . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | . | |||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| . | PEN 6 мкг . | AMX 25 мкг . | AMC 20/10 мкг . | TIC 75 мкг . | PIP 75 мкг . | ОХА 5 мкг . | CEF 30 мкг . | FOX 30 мкг . | СТТ 30 мкг . | CTX 30 мкг . | IPM 10 мкг . | KAN a 30 мкг . | GEN a 15 мкг . | TET 30 МЕ . | МИН. 30 МЕ . | |||||||||||||||||
| B. longum (14) | 20–38 | 24–46 | 20–45 | 22–40 | 23–42 | 14–41 | 10–38 | 14–37 | 10–28 | 28–41 | 28–47 | 6 | 6–12 | 8–42 | 12–42 | |||||||||||||||||
| B.pseudocatenulatum (11) | 22–42 | 26–45 | 26–45 | 31–50 | 21–46 | 22–45 | 17–35 | 20–42 | 24–36 | 16–41 | 30–52 | 6–8 | 6 | 8–42 | 10–45 | |||||||||||||||||
| B. bifidum (8) | 24–46 | 26–45 | 25–48 | 20–44 | 20–44 | 23–38 | 11–36 | 20–37 | 15–30 | 28–42 | 34–43 | 6–10 | 6–10 | 9–32 | 14–32 | |||||||||||||||||
| B.animalis / lactis (8) | 20–40 | 24–38 | 25–40 | 25–50 | 20–48 | 18–30 | 10–29 | 18–32 | 10 –30 | 23–41 | 28–46 | 6 | 6 | 17–36 | 24–34 | |||||||||||||||||
| B. breve (6) | 20–24 | 25–40 | 26–42 | 22–36 | 21–34 | 8–34 | 6–28 | 6–32 | 6–26 | 20–36 | 22–42 | 6–10 | 6–10 | 18–31 | 20–36 | |||||||||||||||||
| Другое (3) | 29–44 | 30–36 | 31–34 | 30–42 | 30–41 | 26–31 | 25–31 | 25–32 | 26–31 | 28–36 | 38–42 | 6–8 | 6 | 22–28 | 23–31 | |||||||||||||||||
| Процент резистентных штаммов | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 16 | 20 | 0 | 20 | 9229 | 22226 | 0 | 100 | 100 | 14 | 14 | |||||||||||||||
| Виды (количество деформаций) | Диапазон диаметров зоны ингибирования (мм) 0 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| ERY 15 IU | SPI 100 мкг 922 922 922 PRI | SPI 100 мкг 922 901 мкг | LNZ 30 мкг | VAN 30 мкг 9 0130 | TEC 30 мкг | NAL 30 мкг | OFX 35 мкг | GAT 5 мкг | MTR 16 мкг | CHL 30 мкг | ||||||||||||||||||||||
| Б.longum (14) | 28–45 | 24–40 | 31–50 | 31–46 | 29–44 | 28–48 | 21–36 | 18–32 | 6 | 9–28 | 19–41 | 10–44 | 25–39 | 6–36 | 6–44 | |||||||||||||||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 17–44 | 25–44 | 27–55 | 29–46 | 26–50 | 25–50 | 21–32 | 20–32 | 6 | 12–26 | 23–44 | 10–40 | 29–42 | 6–24 | 24–37 | |||||||||||||||||
| B.bifidum (8) | 29–41 | 20–39 | 24–38 | 26–44 | 32–46 | 29–44 | 22–32 | 19–28 | 6 | 9–21 | 19–29 | 10–44 | 26–40 | 7–21 | 20–32 | |||||||||||||||||
| B. animalis / lactis (8) | 21–45 | 20 –48 | 30–51 | 16–51 | 30–50 | 29–45 | 20–36 | 18–34 | 6 | 6–25 | 19–28 | 10–44 | 22–46 | 6–32 | 20–40 | |||||||||||||||||
| B.breve (6) | 31–38 | 29–40 | 31–46 | 28–44 | 30–44 | 34–42 | 20–34 | 25–32 | 6 | 17–26 | 18–26 | 10–42 | 28–38 | 7–12 | 6–44 | |||||||||||||||||
| Другое (3) | 32–41 | 33–38 | 30– 46 | 38–41 | 41–44 | 33–42 | 26–28 | 20–24 | 6 | 17–20 | 25–28 | 10–25 | 25–35 | 7–15 | 27–33 | |||||||||||||||||
| Процент резистентных штаммов | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 38 | 0 | 70 | 4 | |||||||||||||||||||
Чувствительность бифидобактерий к антимикробным препаратам с использованием метода разведения в агаре
| . | . | МИК (мг / л) . | . | . | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Антибиотики . | Вид (количество штаммов) . | Диапазон MIC . | MIC 50 . | MIC 90 . | |||||
| Пенициллин G | B. longum (14) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | |||||
| B. pseudocatenulatum | ≤0,06 | 0,25 | |||||||
| B. bifidum (8) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | ||||||
| B.animalis / lactis (8) | ≤0,06–0,5 | 0,5 | 0,5 | ||||||
| B. breve (6) | ≤0,06–0,5 | 0,25 | 0,5другое (3) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | |||
| все (50) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | |||
| B. pseudocatenulatum (11) | ≤0,06–0,25 | ≤0,06 | 0,25 | 0,25 B. bifidum (8) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | ||
| B. animalis / lactis (8) | ≤0,06–0,5 | 2296 0,25 | |||||||
| Б.breve (6) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | ||||||
| другое (3) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | ||||||
| все | ≤0.06–1 | ≤0.06 | 0,5 | ||||||
| Цефокситин | B. longum (14) | 0,25–64 | 4 | 32 | |||||
| 0.25–2 | 0,5 | 2 | |||||||
| B. bifidum (8) | 2–8 | 4 | 8 | ||||||
| B. animal58is / lactis | 0,25–4 | 4 | 4 | ||||||
| B. breve (6) | 0,25–32 | 8 | 16 | ||||||
| 30 другие 8 | 2 | 8 | |||||||
| все (50) | 0.25–64 | 4 | 16 | ||||||
| Тетрациклин | B. longum (14) | 0,5–64 | 1 | 8 | |||||
| aten | 96 ulat p.| 0,5–64 | 1 | 64 | | |||||
| B. bifidum (8) | 1–64 | 1 | 16 | ||||||
| B. animalis ) | 4–8 | 8 | 8 | ||||||
| B.breve (6) | 0,5–4 | 0,5 | 1 | ||||||
| другое (3) | 1–2 | 1 | 2 | ||||||
| 30 все (502296) все (502296) –64 | 2 | 16 | |||||||
| Эритромицин | B. longum (14) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| at) | (b. | ≤0.06–0,25 | ≤0,06 | ≤0,06 | |||||
| B. bifidum (8) | ≤0,06 | ≤0,06 | ≤0,06 | ||||||
| животный | lactis (8) | ≤0,06–1 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| B. breve (6) | ≤0,06–0,25 | ≤0,06 | 0,25 | 0 другое (3) | ≤0.06–1 | ≤0,06 | ≤0,06 | ||
| все (50) | ≤0,06–1 | ≤0,06 | 0,25 | ||||||
| Телитромицин | 900 | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | |||||
| B. pseudocatenulatum (11) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | 0,06 | 0,06bifidum (8) | ≤0,0015–0,06 | ≤0,0015 | ≤0,0015 | |
| B. animalis / lactis (8) | ≤0,0015–0,125 | ,00 | 30 ≤0,0015–0,125 | 30 ≤0,00 | |||||
| B. breve (6) | ≤0,0015 | ≤0,0015 | ≤0,0015 | ||||||
| другие (3) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015–0,125 | 9229|||||||
| все (50) | ≤0.0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | ||||||
| Линезолид | B. longum (14) | 0,5–1 | 1 | 1 | |||||
| 0,5–1 | 0,5 | 1 | |||||||
| B. bifidum (8) | 0,5–1 | 1 | 1 | ||||||
| 900 B. 8) | 0.5–1 | 0,5 | 1 | ||||||
| B. breve (6) | 1 | 1 | 1 | ||||||
| другое (3) | 0,5 | 1 | |||||||
| все (50) | 0,5–1 | 1 | 1 | ||||||
| Ванкомицин | B. longum ( 14) | 0,5–1 901 | |||||||
| B.pseudocatenulatum (11) | 0,25–1 | 0,5 | 1 | ||||||
| B. bifidum ( 8) | 0,25–2 | 0,5 | 10 animalis / lactis ( 8) | 0,25–2 | 0,25 | 0,5 | |||
| B. breve ( 6) | 0,25–1 | 0,5 | 0,5 | 0 другие0 (3) | 0.5 | 0,5 | 0,5 | ||
| все (50) | 0,25–2 | 0,5 | 1 | ||||||
| Гатифлоксацин | B. longum ( 922 14) 0,5 1 | 2 | |||||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 0,5–2 | 1 | 2 | ||||||
| B. bifidum (22 8) 90.25–2 | 1 | 2 | |||||||
| B. animalis / lactis ( 8) | 0,5–2 | 1 | 2 | ||||||
| 6 B. breve | 0,25–2 | 2 | 2 | ||||||
| прочее (3) | 0,5–1 | 0,5 | 1 | ||||||
| все (50) | 1 2296 все (50) | 9222 | |||||||
| . | . | МИК (мг / л) . | . | . | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Антибиотики . | Вид (количество штаммов) . | Диапазон MIC . | MIC 50 . | MIC 90 . | ||||
| Пенициллин G | B.longum (14) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | ||||
| B. pseudocatenulatum (11) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | 0,25 B. bifidum (8) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | |
| B. animalis / lactis (8) | ≤0,06–0,5 | 0,5 | 922||||||
| Б.breve (6) | ≤0,06–0,5 | 0,25 | 0,5 | |||||
| другое (3) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | |||||
| все | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | |||||
| Амоксициллин | B. longum (14) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | ||||
| 900 B. (11) | ≤0.06–0,25 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| B. bifidum (8) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| животное (8) | ≤0,06–0,5 | 0,25 | 0,5 | |||||
| B. breve (6) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | |||||
| другие (другие) ) | ≤0.06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | |||||
| все (50) | ≤0,06–1 | ≤0,06 | 0,5 | |||||
| Цефокситин | 1496 B. longum 0,25–64 | 4 | 32 | |||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 0,25–2 | 0,5 | 2 | |||||
| 57 | ||||||||
| 57 2–8 | 4 | 8 | ||||||
| B.animalis / lactis (8) | 0,25–4 | 4 | 4 | |||||
| B. breve (6) | 0,25–32 | 8 | 16 | |||||
| 2–8 | 2 | 8 | ||||||
| все (50) | 0,25–64 | 4 | 16 | |||||
| Тетрациклин 900 (B. 1430 длинный) | 900 | 0.5–64 | 1 | 8 | ||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 0,5–64 | 1 | 64 | |||||
| b. 1–64 | 1 | 16 | ||||||
| B. animalis / lactis (8) | 4–8 | 8 | 8 | |||||
B. breve| 0.5–4 | 0,5 | 1 | | |||||
| прочие (3) | 1–2 | 1 | 2 | |||||
| все (50) | 16 | |||||||
| Эритромицин | B. longum (14) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | ||||
| B. pseudocatenulatum 1309 ≤0.06 | ≤0.06 | | ||||||
| B. bifidum (8) | ≤0.06 | ≤0.06 | ≤0.06 | |||||
| B. animalis / lactis1 0,06–1 | ≤0,06 | 0,25 | ||||||
| B. breve (6) | ≤0,06–0,25 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| ≤ другое 0,06–1 | ≤0.06 | ≤0,06 | ||||||
| все (50) | ≤0,06–1 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| Телитромицин | 15 B. longum (14)0130 | ≤0,0015 | 0,06 | |||||
| B. pseudocatenulatum (11) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | |||||
| um | B. 0.0015–0,06≤0,0015 | ≤0,0015 | ||||||
| B. animalis / lactis (8) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | ≤0,0015 | |||||
| breve (6) | ≤0,0015 | ≤0,0015 | ≤0,0015 | |||||
| прочее (3) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | ≤00615 все0 | ≤0096 | )≤0.0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | |
| Линезолид | B. longum (14) | 0,5–1 | 1 | 1 | ||||
| 0,5–1 | 0,5 | 1 | ||||||
| B. bifidum (8) | 0,5–1 | 1 | 1 | |||||
| 900 B. 8) | 0.5–1 | 0,5 | 1 | |||||
| B. breve (6) | 1 | 1 | 1 | |||||
| другое (3) | 0,5 | 1 | ||||||
| все (50) | 0,5–1 | 1 | 1 | |||||
| Ванкомицин | B. longum ( 14) | 0,5–1 901 | ||||||
| B.pseudocatenulatum (11) | 0,25–1 | 0,5 | 1 | |||||
| B. bifidum ( 8) | 0,25–2 | 0,5 | 10 animalis / lactis ( 8) | 0,25–2 | 0,25 | 0,5 | ||
| B. breve ( 6) | 0,25–1 | 0,5 | 0,5 | 0 другие 0 (3) | 0.5 | 0,5 | 0,5 | |
| все (50) | 0,25–2 | 0,5 | 1 | |||||
| Гатифлоксацин | B. longum ( 922 14) 0,5 1 | 2 | ||||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 0,5–2 | 1 | 2 | |||||
| B. bifidum (22 8) 90.25–2 | 1 | 2 | ||||||
| B. animalis / lactis ( 8) | 0,5–2 | 1 | 2 | |||||
| 6 B. breve () | 0,25–2 | 2 | 2 | |||||
| прочее (3) | 0,5–1 | 0,5 | 1 | |||||
| все (50) | 1 2296 все (50) | 92292 | ||||||
Чувствительность бифидобактерий к антимикробным препаратам с использованием метода разведения в агаре
| . | . | МИК (мг / л) . | . | . | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Антибиотики . | Вид (количество штаммов) . | Диапазон MIC . | MIC 50 . | MIC 90 . | |||||
| Пенициллин G | B. longum (14) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | |||||
| B. pseudocatenulatum | ≤0,06 | 0,25 | |||||||
| B. bifidum (8) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | ||||||
| B.animalis / lactis (8) | ≤0,06–0,5 | 0,5 | 0,5 | ||||||
| B. breve (6) | ≤0,06–0,5 | 0,25 | 0,5другое (3) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | |||
| все (50) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | |||
| B. pseudocatenulatum (11) | ≤0,06–0,25 | ≤0,06 | 0,25 | 0,25 B. bifidum (8) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | ||
| B. animalis / lactis (8) | ≤0,06–0,5 | 2296 0,25 | |||||||
| Б.breve (6) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | ||||||
| другое (3) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | ||||||
| все | ≤0.06–1 | ≤0.06 | 0,5 | ||||||
| Цефокситин | B. longum (14) | 0,25–64 | 4 | 32 | |||||
| 0.25–2 | 0,5 | 2 | |||||||
| B. bifidum (8) | 2–8 | 4 | 8 | ||||||
| B. animal58is / lactis | 0,25–4 | 4 | 4 | ||||||
| B. breve (6) | 0,25–32 | 8 | 16 | ||||||
| 30 другие 8 | 2 | 8 | |||||||
| все (50) | 0.25–64 | 4 | 16 | ||||||
| Тетрациклин | B. longum (14) | 0,5–64 | 1 | 8 | |||||
| aten | 96 ulat p.| 0,5–64 | 1 | 64 | | |||||
| B. bifidum (8) | 1–64 | 1 | 16 | ||||||
| B. animalis ) | 4–8 | 8 | 8 | ||||||
| B.breve (6) | 0,5–4 | 0,5 | 1 | ||||||
| другое (3) | 1–2 | 1 | 2 | ||||||
| 30 все (502296) все (502296) –64 | 2 | 16 | |||||||
| Эритромицин | B. longum (14) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| at) | (b. | ≤0.06–0,25 | ≤0,06 | ≤0,06 | |||||
| B. bifidum (8) | ≤0,06 | ≤0,06 | ≤0,06 | ||||||
| животный | lactis (8) | ≤0,06–1 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| B. breve (6) | ≤0,06–0,25 | ≤0,06 | 0,25 | 0 другое (3) | ≤0.06–1 | ≤0,06 | ≤0,06 | ||
| все (50) | ≤0,06–1 | ≤0,06 | 0,25 | ||||||
| Телитромицин | 900 | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | |||||
| B. pseudocatenulatum (11) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | 0,06 | 0,06bifidum (8) | ≤0,0015–0,06 | ≤0,0015 | ≤0,0015 | |
| B. animalis / lactis (8) | ≤0,0015–0,125 | ,00 | 30 ≤0,0015–0,125 | 30 ≤0,00 | |||||
| B. breve (6) | ≤0,0015 | ≤0,0015 | ≤0,0015 | ||||||
| другие (3) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015–0,125 | 9229|||||||
| все (50) | ≤0.0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | ||||||
| Линезолид | B. longum (14) | 0,5–1 | 1 | 1 | |||||
| 0,5–1 | 0,5 | 1 | |||||||
| B. bifidum (8) | 0,5–1 | 1 | 1 | ||||||
| 900 B. 8) | 0.5–1 | 0,5 | 1 | ||||||
| B. breve (6) | 1 | 1 | 1 | ||||||
| другое (3) | 0,5 | 1 | |||||||
| все (50) | 0,5–1 | 1 | 1 | ||||||
| Ванкомицин | B. longum ( 14) | 0,5–1 901 | |||||||
| B.pseudocatenulatum (11) | 0,25–1 | 0,5 | 1 | ||||||
| B. bifidum ( 8) | 0,25–2 | 0,5 | 10 animalis / lactis ( 8) | 0,25–2 | 0,25 | 0,5 | |||
| B. breve ( 6) | 0,25–1 | 0,5 | 0,5 | 0 другие0 (3) | 0.5 | 0,5 | 0,5 | ||
| все (50) | 0,25–2 | 0,5 | 1 | ||||||
| Гатифлоксацин | B. longum ( 922 14) 0,5 1 | 2 | |||||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 0,5–2 | 1 | 2 | ||||||
| B. bifidum (22 8) 90.25–2 | 1 | 2 | |||||||
| B. animalis / lactis ( 8) | 0,5–2 | 1 | 2 | ||||||
| 6 B. breve | 0,25–2 | 2 | 2 | ||||||
| прочее (3) | 0,5–1 | 0,5 | 1 | ||||||
| все (50) | 1 2296 все (50) | 9222 | |||||||
| . | . | МИК (мг / л) . | . | . | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Антибиотики . | Вид (количество штаммов) . | Диапазон MIC . | MIC 50 . | MIC 90 . | ||||
| Пенициллин G | B.longum (14) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | ||||
| B. pseudocatenulatum (11) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | 0,25 B. bifidum (8) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | |
| B. animalis / lactis (8) | ≤0,06–0,5 | 0,5 | 922||||||
| Б.breve (6) | ≤0,06–0,5 | 0,25 | 0,5 | |||||
| другое (3) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | |||||
| все | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | |||||
| Амоксициллин | B. longum (14) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | ||||
| 900 B. (11) | ≤0.06–0,25 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| B. bifidum (8) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| животное (8) | ≤0,06–0,5 | 0,25 | 0,5 | |||||
| B. breve (6) | ≤0,06–1 | 0,25 | 0,5 | |||||
| другие (другие) ) | ≤0.06–0,5 | ≤0,06 | 0,5 | |||||
| все (50) | ≤0,06–1 | ≤0,06 | 0,5 | |||||
| Цефокситин | 1496 B. longum 0,25–64 | 4 | 32 | |||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 0,25–2 | 0,5 | 2 | |||||
| 57 | ||||||||
| 57 2–8 | 4 | 8 | ||||||
| B.animalis / lactis (8) | 0,25–4 | 4 | 4 | |||||
| B. breve (6) | 0,25–32 | 8 | 16 | |||||
| 2–8 | 2 | 8 | ||||||
| все (50) | 0,25–64 | 4 | 16 | |||||
| Тетрациклин 900 (B. 1430 длинный) | 900 | 0.5–64 | 1 | 8 | ||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 0,5–64 | 1 | 64 | |||||
| b. 1–64 | 1 | 16 | ||||||
| B. animalis / lactis (8) | 4–8 | 8 | 8 | |||||
B. breve| 0.5–4 | 0,5 | 1 | | |||||
| прочие (3) | 1–2 | 1 | 2 | |||||
| все (50) | 16 | |||||||
| Эритромицин | B. longum (14) | ≤0,06–0,5 | ≤0,06 | 0,25 | ||||
| B. pseudocatenulatum 1309 ≤0.06 | ≤0.06 | | ||||||
| B. bifidum (8) | ≤0.06 | ≤0.06 | ≤0.06 | |||||
| B. animalis / lactis1 0,06–1 | ≤0,06 | 0,25 | ||||||
| B. breve (6) | ≤0,06–0,25 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| ≤ другое 0,06–1 | ≤0.06 | ≤0,06 | ||||||
| все (50) | ≤0,06–1 | ≤0,06 | 0,25 | |||||
| Телитромицин | 15 B. longum (14)0130 | ≤0,0015 | 0,06 | |||||
| B. pseudocatenulatum (11) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | |||||
| um | B. 0.0015–0,06≤0,0015 | ≤0,0015 | ||||||
| B. animalis / lactis (8) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | ≤0,0015 | |||||
| breve (6) | ≤0,0015 | ≤0,0015 | ≤0,0015 | |||||
| прочее (3) | ≤0,0015–0,125 | ≤0,0015 | ≤00615 все0 | ≤0096 | )≤0.0015–0,125 | ≤0,0015 | 0,06 | |
| Линезолид | B. longum (14) | 0,5–1 | 1 | 1 | ||||
| 0,5–1 | 0,5 | 1 | ||||||
| B. bifidum (8) | 0,5–1 | 1 | 1 | |||||
| 900 B. 8) | 0.5–1 | 0,5 | 1 | |||||
| B. breve (6) | 1 | 1 | 1 | |||||
| другое (3) | 0,5 | 1 | ||||||
| все (50) | 0,5–1 | 1 | 1 | |||||
| Ванкомицин | B. longum ( 14) | 0,5–1 901 | ||||||
| B.pseudocatenulatum (11) | 0,25–1 | 0,5 | 1 | |||||
| B. bifidum ( 8) | 0,25–2 | 0,5 | 10 animalis / lactis ( 8) | 0,25–2 | 0,25 | 0,5 | ||
| B. breve ( 6) | 0,25–1 | 0,5 | 0,5 | 0 другие 0 (3) | 0.5 | 0,5 | 0,5 | |
| все (50) | 0,25–2 | 0,5 | 1 | |||||
| Гатифлоксацин | B. longum ( 922 14) 0,5 1 | 2 | ||||||
| B. pseudocatenulatum (11) | 0,5–2 | 1 | 2 | |||||
| B. bifidum (22 8) 90.25–2 | 1 | 2 | ||||||
| B. animalis / lactis ( 8) | 0,5–2 | 1 | 2 | |||||
| 6 B. breve () | 0,25–2 | 2 | 2 | |||||
| прочее (3) | 0,5–1 | 0,5 | 1 | |||||
| все (50) | 1 2296 все (50) | 1 2296 | 2 | |||||
Грант на исследования в области питания от Société Française de Nutrition поддержал C.M.
Часть этой работы была представлена на Третьем Всемирном конгрессе по анаэробным бактериям и инфекциям, Глазго, Шотландия, 7–9 мая 2003 г., аннотация 222.
Список литературы
1.Тойбер, М., Мейле, Л. и Шварц, Ф. (
1999
). Приобретенная устойчивость к антибиотикам у молочнокислых бактерий из пищи.Антони Ван Левенгук
76
,115
–37.2.Фуллер Р. (
1989
). Пробиотики у человека и животных.Журнал прикладной бактериологии
66
,365
–78.3.Салливан А., Баркхольт Л. и Норд К. Э. (
2003
). Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis и Lactobacillus F19 предотвращают связанные с антибиотиками экологические нарушения Bacteroides fragilis в кишечнике.Журнал антимикробной химиотерапии
52
,308
–11.4.Коллинз М. Д. и Гибсон Г. Р. (
1999
). Пробиотики, пребиотики и синбиотики: подходы к регулированию микробной экологии кишечника.Американский журнал клинического питания
69
,1052S
–7S.5.Салливан А. и Норд К. Э. (
2002
). Пробиотики при инфекциях человека.Журнал антимикробной химиотерапии
50
,625
–7.6.Даниэльсен, М. и Винд, А. (
2003
). Чувствительность Lactobacillus spp. к противомикробным средствам.Международный журнал пищевой микробиологии
82
,1
–11.7.Lund, B. & Edlund, C. (
2001
). Пробиотический штамм Enterococcus faecium является возможным реципиентом кластера генов vanA.Клинические инфекционные болезни
32
,1384
–5.8.Брук, И. и Фрейзер, Э. Х. (
1993
). Значительное извлечение неспорообразующих анаэробных стержней из клинических образцов.Клинические инфекционные болезни
16
,476
–80.9.Ishibashi, N. & Yamazaki, S.(
2001
). Пробиотики и безопасность.Американский журнал клинического питания
73
,465S
–70S.10.Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (
2004
). Коммюнике 2004 г.Бюллетень французского общества микробиологии
,1
–48.11.Национальный комитет клинических лабораторных стандартов. (
2001
). Методы тестирования анаэробной чувствительности к анимикробным бактериям — пятое издание: утвержденный стандарт M11-A5 .NCCLS, Уэйн, Пенсильвания, США. 12.Jousimies-Somer, H. R., Summanen, P., Citron, D. M. et al. (
2002
) Тестирование чувствительности анаэробных бактерий. В Wadsworth-KTL Руководство по анаэробной бактериологии , 6-е издание (Jousimies-Somer, H. R., Summanen, P., Citron, D. M. и др. , Eds), стр.143
–64. Star Publishing Company, Белмонт, Калифорния, США 13.Ли, Д. Т. и Розенблатт, Дж. Э. (
1983
). Сравнение четырех методов определения β-лактамазы у анаэробных бактерий.Диагностическая микробиология Инфекционные болезни
1
,173
–5.14.Барбоса, Т. М., Скотт, К. П. и Флинт, Х. Дж. (
1999
). Доказательства недавнего межродового переноса нового гена устойчивости к тетрациклину, tet (W), выделенного из Butyrivibrio fibrisolvens, и наличия tet (O) у рубцовых бактерий.Экологическая микробиология
1
,53
–64.15.Робертс, М. К., Панг, Ю., Райли, Д. Е. и др. (
1993
). Обнаружение генов устойчивости к тетрациклину Tet M и Tet O с помощью полимеразной цепной реакции.Молекулярные и клеточные зонды
7
,387
–93,16.Скотт, К. П., Мелвилл, К. М., Барбоза, Т. М. и др. (
2000
). Появление нового гена устойчивости к тетрациклину tet (W) в бактериях кишечника человека.Противомикробные препараты и химиотерапия
44
,775
–7.17.Мубарек, К., Буржуа Н., Курвалин П. и др. (
2003
). Множественный перенос гена устойчивости к антибиотикам от животных к энтерококкам человека в пищеварительном тракте мышей-гнотобиотиков.Противомикробные препараты и химиотерапия
47
,2993
–6.18.Quintiliani, R. Jr, Sahm, D. F. и Courvalin, P. (
1999
). Механизмы устойчивости к антимикробным средствам. В № Руководство по клинической микробиологии № , 7 изд. (изд. Мюррей, П.Р., Барон, Э. Дж. Пфаллер, М. А. и др. ), стр.1505
–25. Американское общество микробиологов, Вашингтон, округ Колумбия, США 19.Брайан Л. Э., Кованд С. К. и Ван ден Эльзен Х. М. (
1979
). Механизм устойчивости к аминогликозидным антибиотикам у анаэробных бактерий: Clostridium perfringens и Bacteroides fragilis.Противомикробные препараты и химиотерапия
15
,7
–13.20.Лим, К. С., Ха, С. С. и Бэк, Ю. Дж. (
1993
).Антимикробная чувствительность бифидобактерий.Journal of Dairy Science
76
,2168
–74.21.Matteuzzi, D., Crociani, F. & Brigidi, P. (
1983
). Антимикробная чувствительность Bifidobacterium.Анналы микробиологии (Париж)
134A
,339
–49.22.Язид А. М., Али А. М., Шухайми М. и др. (
2000
). Антимикробная чувствительность бифидобактерий.Письма по прикладной микробиологии
31
,57
–62.23.Эдни, Л. М., Роттан, А., Джейкобс, М. Р. и др. (
2003
). Антианаэробная активность нового оксазолидинона RBX 7644 (ранбезолид) по сравнению с восемью другими агентами.Противомикробные препараты и химиотерапия
47
,1143
–7.24.Чартерис, У. П., Келли, П. М., Морелли, Л. и др. (
1998
). Чувствительность к антибиотикам потенциально пробиотических изолятов Bifidobacterium из желудочно-кишечного тракта человека.Письма по прикладной микробиологии
26
,333
–7.25.Цитрон, Д. М., Мерриам, К. В., Тиррелл, К. Л. et al. (
2003
). Активность рамопланина, тейкопланина, ванкомицина, линезолида, бацитрацина и четырех других противомикробных препаратов in vitro в отношении кишечных анаэробных бактерий.Противомикробные препараты и химиотерапия
47
,2334
–8.26.Mory, F., Lozniewski, A., Bland, S. et al. (
1998
).Обзор моделей анаэробной восприимчивости: французское многоцентровое исследование.Международный журнал противомикробных агентов
10
,229
–36.27.Миллер-Кэтчпол, Р. (
1989
). Бифидобактерии в клинической микробиологии и медицине. В Биохимия и физиология бифидобактерий (Bezkorovainy, A. & Miller-Catchpole, R. Eds), стр.177
–200. CRC Press, Бока-Ратон, Калифорния, США 28.Behra-Miellet, J., Calvet, L. & Dubreuil, L.(
2003
). Активность линезолида против анаэробных бактерий.Международный журнал противомикробных агентов
22
,28
–34.29.Патель, Р. (
2000
). Гены устойчивости к гликопептидам энтерококкового типа у неэнтерококковых организмов.Письма о микробиологии FEMS
185
,1
–7.30.Весково, М., Морелли, Л. и Боттацци, В. (
1982
). Плазмиды лекарственной устойчивости Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus reuteri.Прикладная и экологическая микробиология
43
,50
–6.31.Temmerman, R., Pot, B., Huys, G. et al. (
2003
). Идентификация и чувствительность к антибиотикам бактериальных изолятов из пробиотических продуктов.Международный журнал пищевой микробиологии
81
,1
–10.Заметки автора
1Laboratoire de Microbiologie, UFR des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université René Descartes, 75270 Paris Cedex 06; 2 INRA, Вильнёв д’Аск; 3 EA3036 Laboratoire de Bactériologie, Virologie et Microbiologie Industrielle, UFR des Sciences Pharmaceutiques, Université Paul Sabatier, 31062 Toulouse cedex 4; 4 Centre Hospitalier de Versailles, Ле-Шене, Франция
JAC vol.55 №1 © Британское общество антимикробной химиотерапии 2004; все права защищены
Протеомный анализ Bifidobacterium longum subsp. Infantis раскрывает метаболические данные о потреблении пребиотиков и гликанов хозяина
Реферат
Bifidobacterium longum subsp. infantis является обычным членом кишечной микробиоты грудных детей и способен метаболизировать олигосахариды грудного молока (HMO).Чтобы исследовать бактериальный ответ на различные пребиотики, мы проанализировали как ассоциированные с клеточной стенкой белки, так и целые клеточные белки у B. infantis. Белки были идентифицированы с помощью LC-MS / MS с последующей сравнительной протеомикой для определения локализации белка в клетке. Ферменты, участвующие в метаболизме лактозы, глюкозы, галактоолигосахаридов, фруктоолигосахаридов и HMO, конститутивно экспрессировались, показывая менее чем двукратное изменение независимо от используемого сахара. Напротив, ферменты катаболизма N-ацетилглюкозамина и сахарозы индуцировались HMO и фруктанами соответственно.Ферменты, метаболизирующие галактозу, фосфоглюкомутаза, UDP-глюкозо-4-эпимераза и UTP-глюкозо-1-P-уридилитрансфераза экспрессировались конститутивно, тогда как галактокиназа и галактозо-1-фосфатуридилилтрансфераза увеличивали свою экспрессию в три раза, когда HMO и лактоза использовались в качестве субстратов для роста клеток. . Связанная с клеточной стенкой протеомика также выявила АТФ-зависимые системы транспорта сахара, связанные с потреблением различных пребиотиков. Кроме того, экспрессия 16 гликозилгидролаз выявила полный метаболический путь для каждого субстрата.Муцин, который содержит O-гликаны, которые структурно подобны HMO, не индуцировал экспрессию транспортных белков, гидролиз или метаболический путь сахара, что указывает на то, что B. infantis не используют эти гликоконъюгаты.
Образец цитирования: Kim JH, An HJ, Garrido D, German JB, Lebrilla CB, Mills DA (2013) Протеомный анализ Bifidobacterium longum subsp. infantis раскрывает метаболические данные о потреблении пребиотиков и гликанов хозяина.PLoS ONE 8 (2): e57535. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535
Редактор: Валери де Креси-Лагар, Университет Флориды, Соединенные Штаты Америки
Поступила: 21.08.2012; Принята к печати: 25 января 2013 г .; Опубликовано: 26 февраля 2013 г.
Авторские права: © 2013 Kim et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Эта работа была частично поддержана программой грантов Калифорнийского университета, Калифорнийским фондом исследований молочных продуктов и наградами Национального института здравоохранения R01HD061923 (C.B.L.) и R01AT007079 (D.A.M.). Исследование также было поддержано Программой конвергентных исследовательских центров Министерства образования, науки и технологий (2011K000985 для J.H.K.). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Введение
Bifidobacterium longum subsp. infantis ( B. infantis ) является обычным членом желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) грудных детей [1]. Установление микробиоты с преобладанием бифидобактерий привлекло большое внимание в отношении развития младенца [2]. Одним из возможных способов, с помощью которого определенные бифидобактерии успешно колонизируют ЖКТ младенца, является обогащение пребиотиков олигосахаридами грудного молока (HMO).Грудное молоко содержит значительное количество олигосахаридов (∼15 г на л -1 ), в отличие от коровьего молока или молочных смесей [3], [4]. HMO — это термин, который в совокупности относится примерно к 200 различным типам гликанов с различными структурами с длиной менее 20 единиц углеводов [5], [6]. Эти HMO состоят из гексоз (Hex) и N-ацетилгексозаминов (HexNAc), связанных через β1-3 или β1-4-гликозидную связь с дополнительным декором из фукозы (Fuc) и N-ацетилнейраминовой кислоты (NeuAc).Поскольку человеческий хозяин не обладает ферментативной способностью расщеплять эти полимеры, считается, что HMO не метаболизируется младенцем, и было показано, что она попадает в нижний отдел ЖКТ [7]. HMO считаются частью врожденной иммунной системы и используются в качестве ложных участков связывания кишечных патогенов у развивающихся новорожденных [8]. Другая роль — обогащение бифидобактериями ЖКТ [9]. В то время как B. infantis и другие бифидобактерии могут активно использовать HMO в качестве субстрата для роста, другие кишечные бактерии, такие как стрептококки, энтерококки, E.coli и Clostridium sp. не могут использовать HMO в качестве источника углерода, подчеркивая бифидогенный потенциал HMO [10]. Секвенирование генома показало, что B. infantis имеет кластер генов 40 kb, называемый HMO кластером I, который кодирует несколько ферментов и транспортных систем, необходимых для катаболизма HMO, включая α-фукозидазу, α-сиалидазу, β-гексозаминидазу, β-галактозидазу и Транспортные системы ABC с шестью семейством 1 внеклеточных белков, связывающих растворенные вещества (SBP), предположительно связывают олигосахариды [11].Эти кластеры HMO-сцепленных генов предполагают более широкое эволюционное партнерство между B. infantis , развивающимся грудным молоком и грудным молоком [12].
Хотя современные коммерческие пребиотики, используемые в смесях для младенцев, такие как фруктоолигосахариды (FOS) и галактоолигосахариды [13], показали свою бифидогенность, эти коммерческие пребиотики не воспроизводят многие различные роли, которые HMO выполняют в развивающемся младенце. Поскольку B. infantis демонстрирует несколько механистических предпочтений в отношении потребления ОПЗ, этот подвид представляет собой полезный ориентир для оценки сходства коммерческих пребиотиков с реальными ОПЗ.Это, в свою очередь, поможет в разработке более эффективных пребиотиков для использования в детских смесях, а также в других условиях, где могут быть полезны очень избирательные симбиотические применения.
Глобальный анализ экспрессии протеома целых клеток с помощью LC-MS / MS может предоставить прямую информацию относительно биологических систем, таких как метаболические пути и регуляторные сети. Несмотря на преимущества протеомики целых клеток, надежная идентификация белков, ассоциированных с клеточной стенкой (CWA), все еще остается сложной задачей из-за того, что эти белки часто изолируются в нерастворимый материал при лизисе клеток.Отсутствие белков CWA в протеомном анализе приводит к значительной потере биологической информации, поскольку мембранные белки или белки, заякоренные в клеточной стенке, также играют важную роль в транспорте, производстве экзополисахаридов, гидролизе макромолекул и восприятии внеклеточных сигналов. Было разработано несколько протеомных методов для специфической идентификации белков CWA, включая протеомный анализ на основе 2-D геля с последующим фракционированием [14], [15], [16] или мечение белков клеточной поверхности посредством биотинилирования с последующим аффинным захватом [ 17], [18].Альтернативный подход — это триптическое расщепление экспонированных эпитопов на белках клеточной поверхности из интактных клеток в изотоническом растворе с последующим анализом МС, который часто называют «бритьем и шеддингом» [19], [20].
В этом исследовании мы исследовали влияние различных пребиотиков на профили протеомной экспрессии B. infantis ATCC 15697. Микроорганизм культивировали с семью различными сахарами и пребиотиками, включая HMO и муцин, и было количественно идентифицировано более 500 белков. позволяя нам исследовать всю активность клетки в данном субстрате.Важно отметить, что мы разработали метод протеомного анализа, который позволил надежно определить белки, связанные с клеточной стенкой. С помощью этого метода может быть определена экспрессия белков, ассоциированных с клеточной поверхностью / мембраной, что позволяет максимально идентифицировать общий белок на клетку. Это позволило провести более полное сравнение физиологии B. infantis по этим пребиотикам.
Материалы и методы
Культура клеток
Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 был получен из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния). Культуры обычно поддерживали в среде де Манна-Рогоза-Шарпа (MRS) без источника углерода и добавляли 0,05% мас. / Об. L-цистеина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и 2% мас. / Об. либо лактоза (Sigma Aldrich, MO), очищенная HMO [21], муцин из желудка свиньи типа III (Sigma Aldrich, MO), FOS (raftilose Synergy 1, Orafti, Malvern, PA), инулин (raftiline HP, Orafti, Malvern, PA) или GOS (Purimune, GTC Nutrition, Golden, CO).Эти эксперименты проводились в двух экземплярах. Клетки выращивали анаэробно в виниловой камере (Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI) при 37 ° C в течение 24 часов в атмосфере, состоящей из 5% диоксида углерода, 5% водорода и 90% азота. Оптическую плотность анализировали с использованием спектрофотометра для микропланшетов PowerWave (BioTek Instruments, Inc., Winoosky, VT). Из-за значительной высокой мутности среды рост клеток на муцине оценивали отдельно. Муцин автоклавировали в течение 10 минут и добавляли в среду (50 мл) до конечной концентрации 20 г / л -1 .Рост клеток контролировали путем измерения оптической плотности клеток при 600 нм на спектрофотометре Shimadzu UV1601 (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia MD). Культуры клеток с добавлением 2% (мас. / Об.) Глюкозы и 2% (мас. / Об.) HMO были получены в условиях, аналогичных контрольным экспериментам.
Протеомный препарат для проб
Клетки B. infantis были взяты в экспоненциальной фазе роста и нормализованы при OD 1,0 путем разбавления или концентрации. После центрифугирования для удаления отработанной среды 15 мл клеток трижды промывали фосфатным буферным солевым раствором (PBS), а затем еще трижды промывали буфером мочевины (8 М мочевина / 0.1 М Трис, pH 8,5). Осадок клеток ресуспендировали в 600 мкл буфера мочевины, затем механически разрушали гранулами диоксида кремния в мешалке для шариков (FastPrep; QBiogen, Карлсбад, Калифорния, США) в течение восьми циклов по 30 с импульсов и 30 с на льду. После центрифугирования растворимые и нерастворимые фракции хранили отдельно при -80 ° C до дальнейшего анализа.
Для протеомного анализа растворимой фракции объем образца, содержащий 200 мг белка, переносили в новую микроцентрифужную пробирку и осаждали добавлением этанола (конечная концентрация 75% (об. / Об.)) При -20 ° C.После центрифугирования белковый осадок ресуспендировали в 100 мкл 0,1 М трис / 1 М мочевинного буфера (pH 8,5). Затем белки переваривали с использованием 5 мкг трипсина для масс-спектрометрии (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) в течение ночи при 37 ° C. Для получения протеома нерастворимой фракции осадок нерастворимого клеточного дебриса ресуспендировали в 1 мл PBS и трижды промывали буфером мочевины (8 М мочевина / 0,1 М трис). Полученный осадок снова ресуспендировали в 100 мкл 0,1 М трис / 1 М буфера мочевины (pH 8,5) и расщепляли трипсином в течение ночи.Эти две фракции, растворимую и CWA, анализировали независимо. Триптические пептиды из двух фракций очищали независимо с использованием макро-ловушки с концентрацией пептидов и картриджа для обессоливания (Michrom, Aurburn, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Полученные пептиды элюировали 98% -ным ацетонитрилом в воде и затем сушили перед масс-спектрометрическим анализом.
Масс-спектрометрический анализ
Пептиды восстанавливали в воде в концентрациях, соответствующих от 40 до 200 нг исходного белка на 2 мкл инъекции.Анализы нано-ЖХ / МС и нано-ЖХ / МС / МС проводили на системе Agilent HPLC-Chip Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) MS, оснащенной автосэмплером для микропланшетов (поддерживаемая при 6 ° C), капиллярная загрузка образца насос, нано-насос, интерфейс HPLC Chip / MS и детектор Agilent 6520 Q-TOF MS. Используемый чип представлял собой внутренний диаметр 9 × 0,075 мм. колонка обогащения и внутренний диаметр 150 × 0,075 мм. аналитическая колонка. Для загрузки пробы капиллярный насос подает 0,1% муравьиной кислоты в 3,0% ацетонитриле / воде (об. / Об.) Изократически при 4.0 мкл / мин. После ввода пробы градиент нанонасоса подавался со скоростью 0,4 мкл / мин с использованием (A) 0,1% муравьиной кислоты в 3,0% ацетонитриле / воде (об. / Об.) И (B) 0,1% муравьиной кислоты в 90,0% ацетонитриле / воде (об. / v). Образцы элюировали 0% B, 0,00–2,50 мин; От 0 до 16% B, 2,50–10,00 мин; От 16 до 44% B, 10.00–30.00 мин; От 44 до 100% B, 30,00–35,00 мин; и 100% B, 35,00–45,00 мин. За этим следовало уравновешивание при 0% B, 45,01–65,00 мин. Температуру сушильного газа устанавливали на уровне 325 ° C с расходом 5,0 л / мин (2.5 л отфильтрованного газообразного азота и 2,5 л отфильтрованного сухого сжатого воздуха).
Одноступенчатые спектры МС были получены в режиме положительной ионизации в диапазоне масс m / z 400–3000 со временем сбора данных 1 с на спектр. Коррекция массы была включена с использованием эталонных масс m / z 322,048, 622,029, 922,010, 1221,991 и 1521,971 (ESI-TOF Calibrant Mix G1969-85000, Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США).
Идентификация белка
Все образцы МС / МС были проанализированы с помощью X! Тандем (менеджер GPM-XE, вер.2.2.1). ИКС! Тандем был настроен для поиска протеома B. infantis ATCC 15697 и обычных загрязняющих белков, и поиск проводился с толерантностью к массе фрагментных ионов 100 ppm. Окисление метионина было указано как переменная модификация в X! Тандем. Вероятность (log (e)) отсечения для отнесения пептида была установлена на -2. Для идентификации требовалось два условия: (а) более двух уникальных пептидов на белок ( P uniq ≥2) и (б) отсечка вероятности для белка меньше −6 (log (e) ≤ −6 ).Дополнительные алгоритмы идентификации белков подтвердили результаты идентификации белков с помощью X! Тандем. Все белки, обозначенные знаком X! Тандем также был назначен алгоритмом пептидного пророка [22] и алгоритмом белка-пророка [23] с вероятностью более 95% и 99% соответственно. Поскольку эксперименты проводились на биологических дубликатах, для определения экспрессии белка было применено дополнительное правило. Если белок был идентифицирован в одном из дубликатов с высокой вероятностью ( P uniq ≥2 и log (e) ≤ −6), то он считался экспрессированным.Если белок имел значение log (e) между -6 и -4 и P uniq ≥2, но обнаруживался в обоих дубликатах, он также считался выраженным.
Количественное определение белка
Относительные количества белка в образце рассчитывали методом спектрального подсчета [24], используя протеом на клетках, выращенных на лактозе в качестве контроля. Нормализованный коэффициент спектрального содержания (NSAF), который представлял относительное содержание белка в образце, оценивался по общему количеству спектров, используемых для идентификации белка ( SpC ) и количеству аминокислот белка ( L ). ).Для точных оценок относительное количество белка рассчитывали только в том случае, если значение белка NSAF было выше 1,0 или SpC обоих белков было ≥6.
Определение локализации белка
Для этой цели была введена система подсчета очков, в которой использовались значения NSAF каждого белка в растворимой и нерастворимой фракциях (Таблица S1). Если белок наблюдался только в нерастворимой фракции или значение NSAF этого белка в нерастворимой фракции было более чем в 3 раза выше, чем значение NSAF того же белка в растворимой фракции, белок имел оценку +1.Если соотношение NSAF составляло от 2 до 3 раз, протеину давали оценку +0,5. Когда значения NSAF одного и того же белка в растворимой и нерастворимой фракциях были в пределах 2-кратной разницы, белку давали нулевую оценку. Если NSAF белка в растворимой фракции было больше, чем в нерастворимой фракции, баллы присваивались с использованием тех же критериев, приведенных выше, однако значения были отрицательными. После определения баллов значения из экспериментов с шестью различными источниками углерода были усреднены.Если белок имел средний балл от +0,5 до +1,0, он классифицировался как белок CWA. Если средняя оценка белка составляла от -0,5 до -1,0, он считался цитозольным (CYT) белком (таблица S2).
Результаты
Рост клеток и общие профили экспрессии белка
B. infantis смог использовать различные моно- и олигосахариды в качестве субстратов для роста. Специфические скорости роста клеток на GOS, FOS, инулине и HMO находились в диапазоне 0,14-0.19 (час -1 ), которые аналогичны глюкозе и лактозе (рисунок S1A). Муцин — это большой внеклеточный белок, который сильно гликозилирован. О-гликан, прикрепленный к сериновому остатку белка муцина, состоит из N-ацетилгалактозамина, N-ацетилглюкозамина, фукозы, галактозы и сиаловой кислоты и имеет структуру, аналогичную HMO. Сообщалось, что некоторые кишечные бактерии способны взаимодействовать с гликанами муцина [25], [26]. При использовании муцина в качестве единственного источника углерода (Рисунок S1B) увеличение OD 600 было оценено для B.Infantis , хотя и с высокими начальными значениями плотности клеток.
Количество белков, идентифицированных из растворимой и нерастворимой фракций, сведено в Таблицу S3. В каждом отдельном образце, выращенном на каждом источнике углерода, было обнаружено от 350 до 400 белков, и 100 ~ 170 белков обычно наблюдались как в растворимой, так и в нерастворимой фракциях в каждом образце. Всего было идентифицировано 540 белков во время роста на семи различных источниках углерода среди 2416 ORF, кодируемых B.Infantis.
Используя нормализованный фактор изобилия спектра (NSAF) для каждого белка (представляющий нормализованное количество белка во всем протеоме одного образца), количественные профили экспрессии целых протеомов сравнивали между клетками, выращенными на разных источниках углерода. В то время как рост на большинстве субстратов демонстрировал сходные паттерны экспрессии протеома, рост на галактоолигосахаридах приводил к образованию отдельного кластера, о чем свидетельствует иерархический кластерный анализ (рис. S2).Кроме того, коэффициенты корреляции (продукт Пирсона) между GOS и другими протеомами были низкими (0,6 ~ 0,8), что указывает на то, что экспрессия белка, наблюдаемая во время роста на GOS, значительно отличается от роста на других тестируемых субстратах (Таблица S4).
Валидация протеомики, ассоциированной с клеточной стенкой (CWA)
Большинство белков, наблюдаемых в текущих экспериментах по протеомике целых клеток, являются цитозольными, тогда как белки, связанные с клеточной стенкой (CWA) (как прикрепленные к клеточной стенке, так и мембранные белки), остаются в нерастворимой фракции вместе с клеточными остатками.Даже если они высвобождаются из растворимой фракции, их часто пропускают из-за низкой эффективности ионизации во время анализа МС. Другим ограничением, влияющим на их обнаружение, является их низкая (и / или непостоянная) численность по сравнению с более легко получаемыми цитозольными белками. Чтобы лучше понять экспрессию белков CWA, нерастворимую фракцию, полученную после разрушения клеток, анализировали отдельно с последующей обширной промывкой сильным денатурирующим агентом (8 М мочевина / 0,1 М Трис). После удаления цитозольных белков промыванием пептиды из белков CWA высвобождались триптическим расщеплением.Локализацию белков оценивали по количественному соотношению их количеств в растворимой и нерастворимой фракциях.
Для подтверждения этого подхода была исследована экспрессия репрезентативных белков CWA, таких как внеклеточные белки, связывающие растворенные вещества (SBP) из B. infantis ATCC 15697 [27]. Это обычные липопротеины, часто связанные с транспортом различных лигандов. В целом, 71 случай экспрессии SBP наблюдали из протеома B. infantis , выращенного на семи различных источниках углерода.Среди них 23 случая экспрессии SBP были обнаружены только в нерастворимой фракции (рис. 1, черная полоса). Более того, 93% наблюдаемых SBP показали в среднем в 2,9 раза более высокое значение NSAF в нерастворимой фракции по сравнению с растворимой фракцией (Рисунок 1). Помимо SBP, экспрессия других известных белков клеточной стенки более четко или исключительно наблюдалась в нерастворимой фракции. Как показано в таблице S5, Blon_1259, белок семейства V5 / Tpx-1 не был идентифицирован в растворимой фракции во время роста на каком-либо источнике углерода, но это был один из наиболее распространенных белков, наблюдаемых в нерастворимой фракции.Также белок клеточной поверхности, участвующий в синтезе капсульного экзополисахарида (Blon_2082), и липопротеин NlpA (Blon_1721) показали в 2 и 14 раз более высокие значения NSAF в нерастворимых фракциях, чем наблюдаемые в растворимых фракциях, соответственно.
Рис. 1. Распределение отношения NSAF каждого SBP между растворимой и нерастворимой фракциями (серые столбцы; ψNSAF инсоль / NSAF золь ).
Белые полосы (растворимые: левый угол) и черные полосы (нерастворимые: правый угол) показывают количество САД, наблюдаемое только в растворимой и нерастворимой фракциях, соответственно.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.g001
Таким образом, сравнивая значения NSAF фракций растворимых и нерастворимых белков, этот подход позволил понять клеточную локализацию каждого идентифицированного белка (таблицы 1 и 2. ). Как показано в таблице 1, 196 белков были классифицированы как белки CWA, а 93 были цитозольными (CYT) белками. Однако оставшиеся 281 белок не могут быть окончательно классифицированы ни по одной из клеточных локализаций (UI: не идентифицировано).Для дальнейшей оценки нашего метода количество теоретического белка CWA было предсказано биоинформатически [28]. Определение трансмембранных доменов и сигнальных пептидов с помощью TMHMM 2.0 [29] и SignalP 2.0 HMM [30] показало, что 127 белков являются предполагаемыми белками, ассоциированными с клеточной поверхностью. Среди этого пула белков 108 были подтверждены как клеточная стенка, связанная с этим протеомным подходом. Только два из белков, ассоциированных с клеточной поверхностью, идентифицированных биоинформатически, были отнесены к категории цитозольных. Кроме того, 17 из 127 теоретических поверхностных белков были обнаружены в группе UI.Таким образом, хотя 281 белок был отнесен к этой группе по вышеуказанным критериям оценки, последние результаты для предполагаемых белков клеточной поверхности предполагают, что группа UI с большей вероятностью содержит цитозольные белки.
Углеводный метаболизм
Белки, участвующие в углеводном обмене у B. infantis , суммированы на рисунке 2. Ферменты бифидного шунта и гликолитического пути, которые являются общими для использования различных источников углерода, проявили конститутивную экспрессию на субстратах, используемых в этом исследовании (рисунок S3).По сравнению с клетками, выращенными на лактозе, количество каждого белка в этих путях варьировалось менее чем в два раза среди различных субстратов. Интересно, что геном B. infantis ATCC 15697 указывает на то, что некоторые ферменты имеют изоферменты. Например, он содержит семь генов, кодирующих предполагаемые фосфоглицерат мутазы, но оценивалась только экспрессия одного гена, Blon_2152 (рисунок S3).
Рисунок 2. Центральные метаболические пути, восстановленные из протеомных наборов данных.
Сахарные субстраты представлены в красных квадратах. Пути, регулируемые или индуцируемые присутствием определенного сахара, обозначены цветным фоном, а их экспрессия на разных сахарах представлена рядом с путем в виде гистограмм: (а) путь Лелуара, (б) катаболический путь HexNAc, (в) ферментация пирувата. путь, (d) ФОС / инулингликозилгидролаза. Относительные количества ферментов, участвующих в бифидном шунте, представлены на рисунке S3. Цифры в скобках рядом с ферментом представляют собой метку локуса каждого экспрессированного белка.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.g002
B. infantis метаболизирует галактозу по пути Лелуара. Белки этого пути наблюдались в протеомах клеток, выращенных на всех семи источниках углерода, хотя их количество варьировалось. Как показано на Фигуре 2A, галактокиназа ( galK, : Blon_2062), Gal-1-P уридилилтрансфераза ( galT : Blon_2063) и эпимераза UDP-glc ( galE : Blon_0538) были высоко экспрессированы на лактозе, HMO и FOS.Однако альтернатива galE (Blon_2171) и фосфоглюкомутаза ( мкг : Blon_2184) конститутивно экспрессировались на всех субстратах.
N-Ацетилглюкозамин (GlcNAc) является одним из основных компонентов HMO. Чтобы метаболизировать этот моносахарид, B. infantis , возможно, превращает GlcNAc в фруктозу-6-P (Fru-6-P) путем деацетилирования с последующим дезамидированием. GalNAc — еще один гексозамин, обнаруженный в O-связанных гликанах, и он может быть сначала изомеризован в GlcNAc с помощью N-ацетилглюкозамин 6-фосфат 2-эпимеразы ( nanE : Blon_0645).Затем ацетильные и аминогруппы GlcNAc-6-P могут быть удалены с помощью GlcNAc-6-P деацетилазы ( nagA : Blon_0882) и глюкозамин-6-P изомеразы ( nagB : Blon_0881) соответственно. Эти три фермента значительно экспрессируются только при культивировании B. infantis на HMO, что указывает на специфическую индукцию катаболического пути для HexNAc (рис. 2B).
В то время как белки основного гликолитического пути экспрессировались конститутивно, ферменты, участвующие в ферментации пирувата, изменяли уровень своей экспрессии в зависимости от источника углерода.Как показано на рисунке 2C, пируват восстанавливается до лактата лактатдегидрогеназой ( ldh : Blon_0840) с регенерацией NAD + . В качестве альтернативы, пируват превращается в формиат и ацетат комбинацией пируват-формиатлиазы ( pfl : Blon_1715), расщепляющей пируват до формиата и ацетил-КоА, и ацетаткиназы ( ack : Blon_1731), превращающей ацетил-КоА в ацетат с образованием АТФ. Экспрессия ацетаткиназы и формиат C-ацетилтрансферзы была постоянной на всех субстратах для роста.Однако лактатдегидрогеназа проявляла различный характер экспрессии в зависимости от используемых источников углерода. Во время роста на лактозе или FOS количество LDH было в 2–3,5 раза меньше, чем при росте B. infantis на глюкозе, GOS, инулине и HMO. Интересно, что LDH экспрессировалась в 5,5 раза больше на муцине по сравнению с лактозой. Ферменты альтернативного пути, которые могут продуцировать ацетил-КоА из пирувата, т.е. пируватдегидрогеназа или пируватоксидаза, не экспрессировались ни в одном из протеомов (данные не показаны).
Инулин и ФОС представляют собой полимеры фруктозы с разной степенью полимеризации (DP). Когда FOS и инулин использовались в качестве источников углерода, индуцировалась специфическая гликозилгидролаза (GH) (рис. 2D). Blon_0128 представляет собой семейство 13 GH, аннотированное как фосфорилаза сахарозы. Эти ферменты расщепляют сахарозу до глюкозы и фруктозо-6-фосфата. NSAF Blon_0128 в растворимой фракции выше, чем в нерастворимой фракции, что свидетельствует о цитозольной локализации. Два белка GH семейства 32 (Blon_2056 и Blon_0787) также экспрессировались исключительно на FOS и / или инулине.Известные активности семейства 32 GH включают инулиназу (EC: 3.2.1.7), леваназу (EC: 3.2.1.65) и экзоинулиназу (EC: 3.2.1.80). В то время как Blon_0128 и Blon_2056 экспрессировались как на инулине, так и на FOS, экспрессия Blon_0787 наблюдалась только в протеоме клеток, выращенных на FOS. Локализация Blon_0787 была определена в группе UI, но, скорее всего, это цитозольный белок.
Растворенные связывающие белки (SBP)
Внеклеточные SBP обычно связаны со специфическими транспортными системами ABC, состоящими также из двух компонентов транспортера внутренней мембраны и АТФазы.Геном B. infantis содержит 39 SBP трех разных классов: семейства 1, 3 и 5 [31]. В частности, считается, что внеклеточные SBP семейства 1 ответственны за транслокацию олигосахаридов [31]. Как показано на фиг. 3, разные САД экспрессировались во время роста B. infantis на разных углеводах. Как указано выше, все SBP семейства 1 были отнесены к категории CWA.
Рисунок 3. Экспрессия внеклеточных SBP семейства 1 на различных источниках углерода.
Количественное выражение каждого SBP описывается значением NSAF. Черные и серые полосы указывают значения NSAF, полученные в нерастворимой и растворимой фракциях, соответственно. Поле указывает SBP в кластере HMO.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.g003
Когда B. infantis выращивали на GOS, количества SBP Blon_2414 были заметно высокими, а FOS и инулин индуцировали экспрессию Blon_2061. В последнем случае также наблюдались низкие количества других SBP, однако экспрессия Blon_2061 была в 10-20 раз выше, чем у других.Когда HMO была добавлена в СМИ, в основном выражались SBP Blon_2344 и Blon_2347. Существенная экспрессия SBP не наблюдалась, когда B. infantis росли на глюкозе и лактозе. Интересно, что муцин, чья структура гликана подобна HMO, не индуцирует экспрессию какого-либо SBP семейства 1.
B. infantis имеет семь SBP семейства 3 и девять SBP семейства 5 с широким сродством к ди- и олигопептидам. SBP семейства 3 активно экспрессировались на протяжении клеточного роста (рисунок S4).Blon_0747 и Blon_0760 обычно выражались независимо от источников углерода. Blon_2021 индуцировался глюкозой, лактозой, GOS, FOS и муцином, но не HMO или инулином. Экспрессия Blon_0710 и Blon_2022 наблюдалась при культивировании B. infantis на глюкозе и лактозе. Среди SBP семейства 5 Blon_0922 был высоко экспрессирован на всех исследованных источниках углерода. Уровень экспрессии Blon_0922 был постоянным и очень высоким: это был один из наиболее высоко экспрессируемых SBP во всех условиях (за исключением Blon_2061 во время роста на инулине).NSAF Blon_0834 был высоким, но специфичным в протеоме GOS. Blon_0053 и Blon_2419, по-видимому, экспрессируются конститутивно на всех субстратах, но на низком уровне.
Экспрессия белка кластера I HMO
B. infantis содержит кластер размером 43 т.п.н. (кластер I HMO), который кодирует гены катаболизма HMO ([11]; рис. 4A). Во время роста на HMO наблюдалась экспрессия всех различных гликозилгидролаз, необходимых для разложения HMO. Β-галактозидаза (Blon_2334) экспрессировалась на всех семи протеомах, но экспрессия во время роста на GOS была в 2–3 раза выше, чем у других источников углерода (рис. 4B).Экспрессия α-1 / 3,4 фукозидазы Blon_2336 [32] наблюдалась на лактозе, FOS, инулине и HMO, что указывает на более конститутивную экспрессию (рис. 4C). Интересно, что экспрессия α-сиалидазы Blon_2348 [33] была исключительной для протеома HMO (рис. 4D). Экспрессия β-гексозаминидазы (Blon_2355) наблюдалась только во время роста на HMO и инулине (рис. 4E). Используя критерии оценки, описанные выше, клеточное расположение β-галактозидазы и β-гексозаминидазы было неубедительным, однако NSAF этих белков в нерастворимой фракции было более чем в 2 раза выше, чем в растворимой фракции, что указывает на возможную мембранную ассоциацию.Как показано на рисунке 4A, предполагаемые SBP-транспортеры, связанные с HMO, Blon_2344 и Blon_2347 соседствовали с генами двух компонентов транспортеров внутренней мембраны, в то время как SBP Blon_2350, Blon_2351, Blon_2352 и Blon_2354 располагались в другом месте кластера HMO 1 без смежных компонентов пермеазы. Белок из Blon_2344 был идентифицирован во время роста на большинстве источников углерода, но его количество было низким (Рисунок 4F). Однако во время роста на HMO экспрессия Blon_2344 значительно увеличивалась. Blon_2347 экспрессировался только при культивировании на HMO (рис. 4G).Другие SBP семейства 1 в HMO Cluster 1 были определены (если обнаружены вообще) в небольших количествах, что позволяет предположить базальный уровень экспрессии (рис. 4H-K). Белки Blon_2338, Blon_2339 и Blon_2340 также расположены в кластере HMO 1, и они экспрессировались конститутивно (рис. 4L – N). Их локализация, по-видимому, цитозольная, однако их функция и / или связь с утилизацией HMO неясны.
Рисунок 4. Экспрессия белков в кластере HMO в B. infantis во время роста на различных пребиотиках.
(а) Графическое отображение генов в кластере ОПЗ. Белки, участвующие в транслокации и деградации HMO, отмечены меткой локуса под геном. Наборы генов внутри красного прямоугольника — это транспортные системы, которые включают внеклеточный SBP семейства 1 и два компонента внутренней мембраны. Столбцы представляют собой относительные количества каждого белка в разных источниках углерода. Черные и серые полосы указывают значения NSAF в растворимой и нерастворимой фракциях соответственно. (b) ∼ (e) — гликозилгидролазы для деградации HMO.(f) ∼ (k) — SBP семейства 1 и (l) ∼ (n) — белки, количество которых было высоким, но роль в метаболизме HMO не очень хорошо известна.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.g004
Гликозилгидролазы (GH) и гликозилтрансферазы [34]
Гликозилгидролазы (GH) и гликозилтрансферазы (GT) являются важными ферментами, которые соответственно разлагают или синтезируют олигосахариды. Экспрессия 16 GH наблюдалась во всех полученных протеомах (фиг. 5).Blon_1905 представляет собой GH семейства 1, предположительно β-глюкозидазу, которая постоянно и высоко экспрессируется во время роста на всех различных источниках углерода. Были идентифицированы экспрессии четырех различных β-галактозидаз. Blon_2334 (семейство GH 2) и Blon_2016 (семейство GH 42) постоянно и высоко экспрессировались на всех субстратах в соответствии с предыдущими наблюдениями [35]. Blon_0268 (Gh3) и Blon_2416 (Gh52) были специально обнаружены во время роста на GOS. Интересно, что NSAF Blon_2334, Blon_0268 и Blon_2016 в нерастворимой фракции были в два раза выше, чем в растворимой фракции, что указывает на ассоциацию этих активностей GH с клеточной стенкой.Три других GH (Blon_2056, Blon_0787 и Blon_0128) специфически экспрессировались, когда B. infantis выращивали на FOS и инулине. Blon_2056 и Blon_0787 — это белки семейства 32 GH, предположительно экзо-инулиназы [36]. Местоположение этих двух ферментов в клетке окончательно не определено. Blon_0128 представляет собой белок семейства 13 GH, обозначенный как фосфорилаза сахарозы, и был классифицирован здесь как цитозольный белок. В дополнение к Blon_2355 в кластере I HMO, B. infantis имеет вторую β-гексозаминидазу (Blon_0732; Gh30).В то время как Blon_2355 специфически экспрессировался во время роста на HMO и инулине и был связан с клеточной стенкой, Blon_0732 экспрессировался конститутивно и, более вероятно, цитозольный, демонстрируя аналогичный или более низкий уровень NSAF в нерастворимой фракции. Наконец, экспрессия GH семейства 13 (Blon_2456) и семейства 36 (Blon_2460) была обнаружена в протеоме GOS, однако их количество было относительно низким по сравнению с другими GH.
Рисунок 5. Экспрессия гликозилгидролаз и гликозилтрансфераз в B.Infantis во время роста на разных пребиотиках.
Количество выраженного белка в шкале от зеленого до красного цвета, как показано в легенде. Серый цвет означает, что выражение не было обнаружено. Левая и правая панели тепловой карты представляют экспрессию белка в растворимой и нерастворимой фракциях соответственно. Белок CWA определяли по соотношению NSAF между растворимой и нерастворимой фракциями (NSAF insol / NSAF sol ≥2,5).
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0057535.g005
Также были идентифицированы ферменты, участвующие в синтезе гликанов и производстве экзополисахаридов (рис. 5). Blon_2246 и Blon_1761 представляют собой 4-α-глюканотрансферазу и 1,4-α-глюкан 6-разветвительные ферменты соответственно, и оба они стабильно экспрессируются независимо от источника углерода. Α-Глюканфосфорилаза (Blon_0070, семейство GT 35), которая обратимо продуцирует глюкозу-1-P из глюкана, также конститутивно экспрессировалась на всех субстратах. Соотношение NSAF между растворимой и нерастворимой фракциями близко к 1.0 раз или меньше, предполагая внутриклеточную локализацию. Были идентифицированы девять гликозилтрансфераз и один белок синтеза внеклеточного полисахарида, и было обнаружено, что они сильно обогащены нерастворимой фракцией, что указывает на ассоциацию на клеточной поверхности. Среди них Blon_2082 предположительно участвует в синтезе экзополисахарида, и было обнаружено, что он присутствует во всех проанализированных протеомах, независимо от субстрата роста. За исключением Blon_2381, другие гликозилтрансферазы CWA экспрессировались только во время роста на GOS (фиг. 5).
Гипотетические белки
В геноме B. infantis ATCC 15697 содержится 845 гипотетических или неизвестных белков, что составляет 35% всех открытых рамок считывания [11]. Среди этих белков мы наблюдали экспрессию 63 белков в семи различных сахарах (Рисунок S5). Большинство из них были цитозольными белками, экспрессируемыми без значительных различий в количестве среди используемых субстратов для роста. Примечательно, что некоторые из цитозольных гипотетических белков были высоко экспрессированы до уровня глицеральдегид-3-P дегидрогеназы.
Заметный результат был получен в отношении экспрессии гипотетических белков CWA. Когда B. infantis выращивали на GOS, гипотетические белки CWA были сильно индуцированы и / или значительно сверхэкспрессированы. 26 гипотетических белков CWA наблюдались из протеома во время роста на GOS, в то время как от 8 до 17 гипотетических белков CWA были обнаружены в протеомах во время роста на других субстратах. Кроме того, выраженное количество этих 26 белков CWA, наблюдаемое на протеоме GOS, было значительно выше. чем на других субстратах (Рисунок S5).
Обсуждение
Масс-спектрометрический анализ белков цельной клетки — это распространенный метод прямого получения информации о существующих белках в биологической системе, что позволяет прогнозировать активные метаболические пути или регуляторные сети. Поскольку у белков скорость оборота ниже, чем у мРНК и метаболитов, протеомика может обеспечить более стабильную картину метаболической системы клетки в момент сбора клеток. В то время как цитозольные белки легко анализируются количественно и качественно, анализ белков CWA все еще является сложной задачей из-за трудностей фракционирования и очистки.«Сбривание» открытых на поверхности белков интактных клеток является многообещающим, в частности, для высокопроизводительного анализа протеома целых клеток [19], [28], [37]. Однако часто наблюдается секвестрация цитозольных белков в нерастворимую фракцию, и это существенно искажает протеомику клеточной поверхности [38], [39], [40]. Действительно, когда мы применили реакцию бритья к интактной клетке B. infantis , протеомные результаты были такими же, как и результаты, полученные для цитозольной фракции (данные не показаны).
Чтобы улучшить определение протеома CWA, для B.Infantis . Вместо интактных клеток мы сначала разрушили клеток B. infantis , а оставшиеся цитозольные белки, а также клеточный экзополисахарид были удалены с помощью обширных промывок с использованием сильного денатурирующего буфера (8 М мочевина / 0,1 М Трис). Затем белки CWA были отщеплены трипсином от клеточного дебриса, полученного из нерастворимой фракции. Несмотря на увеличенное количество белков клеточной стенки, наблюдаемое при использовании этого подхода, высокоэкспрессированные цитозольные белки (т.е. энолаза или пируваткиназа) все еще обнаруживались в качестве основных белков в нерастворимой фракции (Таблица S6).Поэтому мы приписали ассоциацию клеточной стенки относительным соотношением содержания белка между растворимой и нерастворимой фракциями. Как показано на рисунке 1, большинство внеклеточных SBP показали более чем трехкратное увеличение содержания белка в нерастворимой фракции, а 23 SBP наблюдались только в нерастворимой фракции. Между тем цитозольные белки демонстрируют такое же или меньшее относительное содержание в нерастворимой фракции. Например, относительное содержание енолазы и пируваткиназы составляло 1.55 ± 0,43 и -1,14 ± 0,29, соответственно, предполагая, что эти ферменты не следует классифицировать как белки CWA.
Определение локализации белка с использованием соотношения белков NSAF, наблюдаемого в растворимой и нерастворимой фракциях, было подтверждено сравнением с биоинформатическими свойствами целевых белков. Среди 127 идентифицированных белков, которые обладали трансмембранными доменами или последовательностями сигнального пептида, 108 были определены как белки CWA. Только два теоретических белка клеточной стенки / мембраны были определены исключительно как цитозольные (таблица 1).Из 196 белков, которые были классифицированы как белки CWA, 88 белков не представили каких-либо биоинформатических доказательств ассоциации клеточной стенки / мембраны. Однако ассоциация клеточной стенки, определенная здесь, не обязательно указывает на интеграцию белка в клеточную мембрану или внеклеточную позицию per se . Поскольку триптическое расщепление происходит после разрушения клетки, белки, связанные с внутренней частью клеточной мембраны, также могут быть захвачены.
Было показано, что B.Infantis может использовать различные пребиотики [27], [41], [42], [43]. Однако родственные пути метаболизма этих субстратов не исследованы. Протеомика всей клетки позволила нам определить экспрессию ключевых клеточных белков, участвующих в катаболическом процессе для различных пребиотиков (рис. 6). HMO, GOS, FOS и инулин представляют собой олигосахариды с различным химическим составом и степенью полимеризации. В частности, HMO представляет собой гетерологичную смесь более 200 различных структурных и композиционных изомеров [5].В B. infantis , полный гидролиз HMO до моносахаридов, по-видимому, происходит в цитозоле после транслокации [9]. Как показано на рисунке 3, индукция специфических SBP семейства 1 во время роста на различных олигосахаридах предполагает, что они транспортируются внутри клеток с помощью связанных транспортных систем ABC. SBP семейства 1 индуцируются во время роста на HMO, связывая различные изомеры этих молекул, и мы ранее наблюдали аналогичный паттерн экспрессии SBP с помощью протеомного анализа и транскриптомного анализа [27].Кроме того, два SBP семейства 1, β-гексозаминидаза, α-фукозидаза и α-сиалидаза из основного кластера HMO были экспрессированы только тогда, когда B. infantis росли на HMO в качестве единственного источника углерода. Proteomics также предположила, что и инулин, и FOS импортируются переносчиком, связанным с SBP семейства 1 Blon_2061, которые затем расщепляются двумя экзоинулиназами (Blon_2056 и Blon_0787) с помощью фосфорилазы сахарозы (Blon_0128) для разложения полимера. в гексозофосфат для дальнейшего метаболизма.ГСН, по-видимому, имеет особую систему транспорта и гидролиза. Blon_2414 был единственным SBP семейства 1, экспрессируемым во время роста на GOS, а соседняя β-галактозидаза (Blon_2416) также индуцировалась GOS.
Рис. 6. Схематическая диаграмма потенциальных метаболических путей для различного потребления пребиотиков у B. infantis .
Катаболические пути для моносахаридов были подробно описаны на рисунке 2. Жирные изогнутые стрелки указывают поток олигосахаридов.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0057535.g006
B. infantis содержит как конститутивно экспрессируемые, так и индуцибельные гликозилгидролазы (рис. 6). В то время как набор GH был экспрессирован в ассоциации со специфическими олигосахаридами, β-галактозидазы Blon_2334 и 2016, β-гексозаминидаза Blon_0732 и гидролаза олигосахаридов (семейство 13 GH: Blon_1740) в разной степени стабильно экспрессировались во всех источниках углерода. Α1-3 / 4 фукозидаза Blon_2336 высоко экспрессировалась во время роста на HMO.Активность некоторых из этих ферментов в отношении HMO была недавно исследована [32], [33], [35], [44]. Ряд β-галактозидаз, а также GH семейства 13 были экспрессированы, когда B. infantis выращивали на GOS (фиг. 5). Было установлено, что большинство идентифицированных GH являются цитозольными (рис. 5). Однако две β-галактозидазы (Blon_0268 и Blon_2416) и одна α-галактозидаза (Blon_2460), которые экспрессировались только при выращивании на GOS, были классифицированы как белки CWA. Отсутствие трансмембранного домена или последовательности сигнального пептида может означать близость к клеточной стенке / мембране внутри цитозоля вместо внеклеточного отображения.
После гидролиза олигосахаридов входящие в их состав моносахариды или их фосфорилированные формы далее метаболизируются через общие центральные пути. Глюкоза и фруктоза напрямую попадают в бифидный шунт, для которого, по-видимому, конститутивно экспрессируются родственные ферменты (рис. 2). Галактоза входит в центральные углеродные метаболические пути через путь Лелуара. Ферменты этого пути конститутивно экспрессируются в B. infantis , но интересно, что GalK и GalE активируются в присутствии сахаров, содержащих галактозу (т.е.е. лактоза, GOS или HMO). Ферменты, которые превращают GlcNAc во фруктозу-6-P, экспрессировались только тогда, когда HMO находилась в среде, что предполагает их индукцию GlcNAc.
Муцин — это высокополимеризованный белок, содержащий О-связанные гликаны по определенным сериновым или треониновым остаткам. Поскольку O-гликаны муцина структурно похожи на HMO, вероятно, подобный набор ферментов метаболизирует эти субстраты у бифидобактерий. Однако рост на муцине B. infantis не привел к аналогичному протеомному профилю по сравнению с ростом на HMO, что свидетельствует об отсутствии гидролиза или метаболизма этих O-гликанов.В свою очередь, B. infantis способен расщеплять и потреблять N-связанные гликаны [45]. Напротив, Bifidobacterium bifidum PRL2010 может метаболизировать как HMO, так и муцин [26] с помощью аналогичных механизмов, включая мембранные гликозилгидролазы и пермеазы [26], как ранее было определено протеомикой и микрочипами. Таким образом, B. bifidum и B. infantis представляют конвергентные стратегии потребления HMO микробиотой кишечника младенца [9].
Основными конечными продуктами метаболизма бифидобактерий обычно являются молочная кислота, ацетат и формиат [11].Ацетаткиназа ( ack ) превращает ацетил-P в ацетат и АТФ (рис. 2C). Этот фермент конститутивно экспрессировался на используемых субстратах для роста. Напротив, лактатдегидрогеназа ( ldh ), продуцирующая лактат из пирувата с превращением NADH в NAD +, по-разному экспрессировалась в зависимости от источника углерода. Интересно, что этот фермент присутствовал на более низких уровнях во время роста на ФОС и инулине, и это коррелирует с более высоким соотношением ацетат: лактат во время роста на этих пребиотиках [46].Было показано, что продукция некоторых короткоцепочечных жирных кислот комменсальными бактериями оказывает защитное действие против патогенов [47]. Более высокое количество белка ldh , наблюдаемое для определенных субстратов роста, таких как GOS и HMO, подразумевает более высокие уровни лактата в качестве конечного продукта.
Сообщалось, что виды Bifidobacterium , включая B. infantis , способны продуцировать экзополисахариды (EPS), и их структура была выяснена [48], [49], [50], [51], [ 52], [53], [54].Действительно, Tone-Shimokawa и др. показали, что ЭПС, продуцируемый B. infantis ATCC 15697 (формально обозначаемый как B. infantis Reuteri ATCC 15697), представляет собой полимер галактозы со структурой β-D-Gal- (1 → 3) -α-D-Гал [55]. Важные функции во взаимодействиях хозяин-микроб, такие как устойчивость к стрессу и иммуномодуляция, были недавно определены для B. breve EPS [56]. Кроме того, геномы бифидобактерий показывают, что они могут синтезировать запасные полисахариды, такие как глюкан или гликоген [11].Три фермента в B. infantis , α-глюканфосфорилаза, 1,4-α-глюкан 6-разветвительный фермент и 4-α-глюканотрансфераза, которые могут синтезировать (или обратимо разлагать) α-глюканы, экспрессировались конститутивно (рис. 5) . Интересно, что их экспрессия была классифицирована как цитозольная, в то время как другие гликозилтрансферазы [34] были связаны с фракцией CWA. Blon_2082, белок биосинтеза липополисахаридов, постоянно экспрессировался на клеточной поверхности независимо от сахара. Экспрессии дополнительных девяти GT были идентифицированы в нерастворимой фракции.Восемь из них, которые включали более трех различных семейств GT, были исключительно или высоко экспрессированы в присутствии GOS в среде.
В заключение, это исследование дает общую картину потребления важных пребиотиков, таких как HMO, GOS и FOS, B. infantis ATCC 15697 с акцентом на белки, задействованные для катаболизма этих сахаров. Используя усовершенствованный протеомный подход для специфического определения клеточной стенки, ассоциированной с цитозольными белками, мы показали, что в целом использование этих субстратов происходит посредством специфических транспортных механизмов, определяемых специфическими белками, связывающими растворенные вещества, и гликозилгидролазами, которые превращают эти олигосахариды в моносахариды.В то время как несколько известных белков в кластере I HMO экспрессировались только во время роста бактерий на этих субстратах, ответы GOS включали важное количество гипотетических белков, а также индивидуальных β-галактозидаз и SBP.
Дополнительная информация
Рисунок S1.
Профиль роста клеток B. infantis ATCC 15697, выращенных на различных источниках углерода. (A) B. infantis культивировали в 15 мл среды ZMB и 2% (мас. / Об.) Источников углерода.Оптическую плотность (OD) измеряли автоматически при 600 нм без разбавления. Источники углерода и их символ отмечены в легенде. LAC; лактоза, ГЖХ; глюкоза, ФОС; фруктоолигосахарид, INL; инулин, HMO; олигосахарид грудного молока, GOS; галактоолигосахариды. (B) B. infantis культивировали в 25 мл среды M17 с 2% (мас. / Об.) Глюкозы, муцина и HMO в качестве источника углерода. Оптическую плотность клетки измеряли при соответствующем разбавлении в диапазоне 0,3 ~ 0,5 на длине волны 600 нм.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.s001
(PDF)
Рисунок S2.
Иерархический кластерный анализ профиля экспрессии белка B. infantis , выращенных на различных источниках углерода. Сходство было рассчитано по Евклидову расстоянию, а кластер построен по методу средней связи. LAC, лактоза; ГЖХ, глюкоза; ФОС, фруктоолигосахариды; INL, инулин; HMO, олигосахариды грудного молока; MUC, муцин; ГОС, галактоолигосахариды.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.s002
(PDF)
Рисунок S3.
Экспрессия белков, участвующих в гликолизе и бифидном шунте. Сравнительная протеомика с использованием протеома лактозы в качестве контроля показала, что уровень экспрессии был изменен менее чем в два раза, показывая конститутивную экспрессию независимо от источников углерода. LAC, лактоза; ГЖХ, глюкоза; ФОС, фруктоолигосахариды; INL, инулин; HMO, олигосахариды грудного молока; MUC, муцин; ГОС, галактоолигосахариды.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.s003
(PDF)
Рисунок S4.
Экспрессия белков внеклеточного связывания растворенных веществ (SBP) семейства (a) семейства 3 и (b) семейства 5. Серые столбцы и столбики представляют собой значения NSAF, полученные из протеома ассоциированной клеточной стенки и цитозольной фракции, соответственно. LAC, лактоза; ГЖХ, глюкоза; ФОС, фруктоолигосахариды; INL, инулин; HMO, олигосахариды грудного молока; MUC, муцин; ГОС, галактоолигосахариды.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0057535.s004
(PDF)
Рисунок S5.
Экспрессия гипотетических белков. Растворимые и нерастворимые указывают фракции, в которых расположены белки: связанные с клеточной стенкой (CWA), цитозольные (CYT) или общие, как описано в разделе «Методы и материалы». SigP и TM обозначают наличие последовательности сигнального пептида и количество трансмембранных доменов соответственно. LAC, лактоза; ГЖХ, глюкоза; ФОС, фруктоолигосахариды; INL, инулин; HMO, олигосахариды грудного молока; MUC, муцин; ГОС, галактоолигосахариды.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.s005
(PDF)
Таблица S6.
Список из 30 наиболее экспрессируемых белков в (а) растворимой и (б) нерастворимой фракциях. Ранг определялся суммой всех значений NSAF для каждого источника углерода. Белки CWA были отмечены серой зоной. Рибосомные белки были исключены из списка. LAC; лактоза, ГЖХ; глюкоза, GOS; галактоолигосахариды, ФОС; фруктоолигосахариды, INL; инулин, HMO; олигосахариды грудного молока, MUC; муцин.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057535.s011
(PDF)
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: JHK HJA DG CBL DAM. Проведены эксперименты: JHK HJA DG. Проанализированы данные: JHK HJA DG DAM. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: JBG CBL DAM. Написал бумагу: JHK DG DAM.
Ссылки
- 1. Roger LC, McCartney AL (2010) Продольное исследование фекальной микробиоты здоровых доношенных детей с использованием флуоресцентной гибридизации in situ и денатурирующего градиентного гель-электрофореза.Микробиология 156: 3317–3328.
- 2. Яцуненко Т., Рей Ф.Э., Манари М.Дж., Трехан И., Домингес-Белло М.Г. и др. (2012) Микробиом кишечника человека в зависимости от возраста и географии. Природа 486: 222–227.
- 3. Ninonuevo MR, Ward RE, LoCascio RG, German JB, Freeman SL и др. (2007) Методы количественного определения олигосахаридов грудного молока при бактериальной ферментации с помощью масс-спектрометрии. Аналитическая биохимия 361: 15–23.
- 4. Тао Н., Депетерс Э. Дж., Фриман С., Герман Дж. Б., Гримм Р. и др.(2008) Гликом из коровьего молока. Журнал молочной науки 91: 3768–3778.
- 5. Ninonuevo MR, Park Y, Yin H, Zhang J, Ward RE и др. (2006) Стратегия аннотирования гликома грудного молока. J. Agric Food Chem., 54: 7471–7480.
- 6. Рудлофф С., Кунц С. (2012) Олигосахариды молока и метаболизм у младенцев. Adv Nutr 3: 398S – 405S.
- 7. Kunz C, Rudloff S, Baier W, Klein N, Strobel S (2000) Олигосахариды в материнском молоке: структурные, функциональные и метаболические аспекты.Анну Рев Нутр 20: 699–722.
- 8. Ньюбург Д.С., Руис-Паласиос Г.М., Морроу А.Л. (2005) Гликаны грудного молока защищают младенцев от кишечных патогенов. Анну Рев Нутр 25: 37–58.
- 9. Гарридо Д., Бариле Д., Миллс Д.А. (2012) Молекулярная основа обогащения бифидобактериями в желудочно-кишечном тракте младенцев. Adv Nutr 3: 415S – 421S.
- 10. Marcobal A, Barboza M, Froehlich JW, Block DE, German JB, et al. (2010) Потребление олигосахаридов грудного молока микробами кишечника.Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии 58: 5334–5340.
- 11. Села Д.А., Чепмен Дж., Адеуя А., Ким Дж. Х., Чен Ф. и др. (2008) Последовательность генома Bifidobacterium longum subsp. Infantis обнаруживает адаптацию к усвоению молока в микробиоме младенца. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 18964–18969.
- 12. Села Д.А., Миллс Д.А. (2010) Уход за нашей микробиотой: молекулярные связи между бифидобактериями и олигосахаридами молока. Trends Microbiol 18: 298–307.
- 13. Gosling A, Stevens GW, Barber AR, Kentish SE, Gras SL (2010) Последние достижения в очистке производства галактоолигосахаридов из лактозы. Химия пищевых продуктов 121: 307–318.
- 14. Mujahid S, Pechan T, Wang CL (2007) Улучшенная солюбилизация поверхностных белков из Listeria monocytogenes для 2-DE. Электрофорез 28: 3998–4007.
- 15. Pocsfalvi G, Cacace G, Cuccurullo M, Serluca G, Sorrentino A и др. (2008) Протеомный анализ экзопротеинов, экспрессируемых энтеротоксигенными штаммами Staphylococcus aureus .Протеомика 8: 2462–2476.
- 16. Insenser MR, Hernaez ML, Nombela C, Molina M, Molero G и др. (2010) Протеомика без геля и без геля для идентификации Saccharomyces cerevisiae белков клеточной поверхности. J Proteomics 73: 1183–1195.
- 17. Коул Дж. Н., Рамирес Р. Д., Карри Б. Дж., Кордуэлл С. Дж., Джорджевич С. П. и др. (2005) Поверхностный анализ и иммунная реактивность основных белков, связанных с клеточной стенкой, группы A Streptococcus . Инфекция и иммунитет 73: 3137–3146.
- 18. Sabarth N, Lamer S, Zimny-Arndt U, Jungblut PR, Meyer TF и др. (2002) Идентификация поверхностных белков Helicobacter pylori путем селективного биотинилирования, аффинной очистки и двумерного гель-электрофореза. Журнал биологической химии 277: 27896–27902.
- 19. Solis N, Larsen MR, Cordwell SJ (2010) Повышенная точность протеомики бритья клеточной поверхности в Staphylococcus aureus с использованием ложноположительного контроля.Протеомика 10: 2037–2049.
- 20. Tjalsma H, Lambooy L, Hermans PW, Swinkels DW (2008) Шеддинг и бритье: раскрытие протеомных выражений на лице бактерий. Протеомика 8: 1415–1428.
- 21. Ward RE, Ninonuevo M, Mills DA, Lebrilla CB, German JB (2006) Ферментация олигосахаридов грудного молока in vitro с помощью Bifidobacterium infantis и Lactobacillus gasseri. Appl Environ Microbiol 72: 4497–4499.
- 22. Келлер А., Несвижский А.И., Колкер Э., Эберсолд Р. (2002) Эмпирическая статистическая модель для оценки точности идентификации пептидов с помощью MS / MS и поиска в базе данных.Аналитическая химия 74: 5383–5392.
- 23. Несвижский А.И., Келлер А., Колкер Е., Эберсолд Р. (2003) Статистическая модель для идентификации белков с помощью тандемной масс-спектрометрии. Аналитическая химия 75: 4646–4658.
- 24. Washburn MP, Ulaszek R, Deciu C, Schieltz DM, Yates JR, 3rd (2002) Анализ количественных протеомных данных, полученных с помощью технологии многомерной идентификации белков. Аналитическая химия 74: 1650–1657.
- 25. Marcobal A, Barboza M, Sonnenburg ED, Pudlo N, Martens EC и др.(2011) Бактероиды в кишечнике младенцев потребляют олигосахариды молока через пути утилизации слизи. Клеточный хозяин и микроб 10: 507–514.
- 26. Туррони Ф., Боттачини Ф., Форони Э., Малдер И., Ким Дж. Х. и др. (2010) Анализ генома Bifidobacterium bifidum PRL2010 показывает метаболические пути для кормления гликанов хозяина. Proc Natl Acad Sci USA 107: 19514–19519.
- 27. Garrido D, Kim JH, German JB, Raybould HE, Mills DA (2011) Олигосахаридные связывающие белки из Bifidobacterium longum subsp. infantis демонстрируют предпочтение гликанов хозяина. PLoS One 6: e17315.
- 28. Руис Л., Коут Y, Санчес Б., де лос Рейес-Гавилан К. Г., Санчес Дж. К. и др. (2009) Протеом клеточной оболочки Bifidobacterium longum в желчной среде in vitro. Microbiology-SGM 155: 957–967.
- 29. Krogh A, Larsson B, von Heijne G, Sonnhammer ELL (2001) Прогнозирование топологии трансмембранного белка с помощью скрытой марковской модели: применение для полных геномов.Журнал молекулярной биологии 305: 567–580.
- 30. Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H (2007) Определение местонахождения белков в клетке с помощью TargetP, SignalP и связанных с ними инструментов. Протоколы природы 2: 953–971.
- 31. Tam R, Saier MH Jr (1993) Структурные, функциональные и эволюционные отношения между внеклеточными рецепторами связывания растворенных веществ бактерий. Microbiol Rev 57: 320–346.
- 32. Села Д.А., Гарридо Д., Лерно Л., Ву С., Тан К. и др.(2012) Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697 альфа-фукозидазы активны в отношении фукозилированных олигосахаридов человеческого молока. Appl Environ Microbiol 78: 795–803.
- 33. Села Д.А., Ли Й., Лерно Л., Ву С., Маркобал А.М. и др. (2011) Бактериальный комменсал, ассоциированный с младенцами, использует сиалилолигосахариды грудного молока. J Biol Chem 286: 11909–11918.
- 34. Lane JA, Mehra RK, Carrington SD, Hickey RM (2010) Пищевой гликом: источник защиты от колонизации патогенов в желудочно-кишечном тракте.Int J Food Microbiol 142: 1–13.
- 35. Йошида Э., Сакурама Х., Киёхара М., Накадзима М., Китаока М. и др. (2012) Bifidobacterium longum subsp. Infantis использует две разные бета-галактозидазы для селективного разложения олигосахаридов грудного молока 1 и 2 типа. Гликобиология 22: 361–368.
- 36. Henrissat B, Callebaut I, Fabrega S, Lehn P, Mornon JP и др. (1995) Консервированный каталитический аппарат и предсказание общей укладки для нескольких семейств гликозилгидролаз.Proc Natl Acad Sci U S A 92: 7090–7094.
- 37. Северин А., Никбарг Е., Вутерс Дж., Квази С.А., Мацука Ю.В. и др. (2007) Протеомный анализ и идентификация Streptococcus pyogenes поверхностно-ассоциированных белков. Журнал бактериологии 189: 1514–1522.
- 38. Cordwell SJ, Solis N (2011) Современные методологии протеомики белков бактериальной поверхности и белков клеточной оболочки. Протеомика 11: 3169–3189.
- 39. Cordwell SJ, Solis N, Larsen MR (2010) Повышенная точность протеомики бритья клеточной поверхности в Staphylococcus aureus с использованием ложноположительного контроля.Протеомика 10: 2037–2049.
- 40. Elschenbroich S, Kim Y, Medin JA, Kislinger T (2010) Выделение белков клеточной поверхности для протеомики на основе масс-спектрометрии. Эксперт Rev Proteomics 7: 141–154.
- 41. Seipert RR, Barboza M, Ninonuevo MR, LoCascio RG, Mills DA и др. (2008) Анализ и количественное определение фруктоолигосахаридов с использованием матричной лазерной десорбции / ионизации с преобразованием Фурье ионно-циклотронной масс-спектрометрии. Аналитическая химия 80: 159–165.
- 42. Lee HW, Park YS, Jung JS, Shin WS (2002) Хитозановые олигосахариды, dp 2-8, оказывают пребиотическое действие на Bifidobacterium bifidium и Lactobacillus sp. Анаэроб 8: 319–324.
- 43. Rabiu BA, Jay AJ, Gibson GR, Rastall RA (2001) Синтез и свойства ферментации новых галактоолигосахаридов с помощью бета-галактозидаз из видов Bifidobacterium . Appl Environ Microbiol 67: 2526–2530.
- 44.Гарридо Д., Руис-Мойано С., Миллс Д.А. (2012) Высвобождение и использование N-ацетил-d-глюкозамина из олигосахаридов грудного молока с помощью Bifidobacterium longum subsp. Infantis. Анаэроб 18: 430–435.
- 45. Гарридо Д., Нвосу С., Руис-Мояно С., Олдридж Д., Герман Дж. Б. и др. (2012) Эндо-бета-N-ацетилглюкозаминидазы из ассоциированных с кишечником младенцев бифидобактерий высвобождают сложные N-гликаны из гликопротеинов грудного молока. Протеомика клеток Mol 11: 775–785.
- 46. Гарридо Д., Руис-Мояно С., Хименес-Эспиноза Р., Эом Х. Дж., Блок DE и др.(2012) Использование галактоолигосахаридов Bifidobacterium longum subsp. Infantis изоляты. Пищевая микробиология 33: 262–270.
- 47. Фукуда С., Тох Х, Хасе К., Осима К., Наканиши Ю. и др. (2011) Бифидобактерии могут защищать от энтеропатогенной инфекции за счет выработки ацетата. Природа 469: 543–547.
- 48. Andaloussi SA, Talbaoui H, Marczak R, Bonaly R (1995) Выделение и характеристика внеклеточных полисахаридов, продуцируемых Bifidobacterium longum .Прикладная микробиология и биотехнология 43: 995–1000.
- 49. Habu Y, Nagaoka M, Yokokura T, Azuma I (1987) Структурные исследования полисахаридов клеточной стенки из Bifidobacterium breve yit-4010 и родственных видов Bifidobacterium . Журнал биохимии 102: 1423–1432.
- 50. Коно М., Сузуки С., Каная Т., Йошино Т., Мацуура Ю. и др. (2009) Структурная характеристика внеклеточного полисахарида, продуцируемого Bifidobacterium longum JBL05.Углеводные полимеры 77: 351–357.
- 51. Лю CT, Hsu IT, Chou CC, Lo PR, Yu RC (2009) Производство экзополисахаридов Lactobacillus salivarius BCRC 14759 и Bifidobacterium bifidum BCRC 14615. Всемирный журнал микробиологии и биотехнологии 25: 883–890.
- 52. Новик Г.И., Астапович Н.И., Кублер Дж., Гамиан А. (2002) Характеристика связанных с клетками полисахаридов Bifidobacterium adolescentis 94 BIM. Микробиология 71: 173–177.
- 53. Салазар Н., Руас-Мадиедо П., Колида С., Коллинз М., Расталл Р. и др. (2009) Экзополисахариды, продуцируемые Bifidobacterium longum IPLA E44 и Bifidobacterium animalis subsp lactis IPLA R1, изменяют состав и метаболическую активность фекальной микробиоты человека в периодических культурах с контролируемым pH. Международный журнал пищевой микробиологии 135: 260–267.
- 54. Здоровенко Е.Л., Качала В.В., Сидаренко А.В., Ижик А.В., Кисилева Е.П. и др.(2009) Структура полисахаридов клеточной стенки пробиотических бифидобактерий Bifidobacterimum bifidum BIM B-465. Исследование углеводов 344: 2417–2420.
- 55. ToneShimokawa Y, Toida T, Kawashima T (1996) Выделение и структурный анализ полисахарида, содержащего галактофуранозу, из клеточных стенок Bifidobacterium infantis. Журнал бактериологии 178: 317–320.
- 56. Fanning S, Hall LJ, Cronin M, Zomer A, MacSharry J, et al. (2012) Поверхностный экзополисахарид бифидобактерий способствует взаимодействию комменсала с хозяином посредством иммуномодуляции и защиты от патогенов.Proc Natl Acad Sci U S A 109: 2108–2113.
Bifidobacterium изменяет микробиоту кишечника и модулирует функциональный метаболизм Т-регуляторных клеток в контексте блокады иммунных контрольных точек
Значение
Многие миллионы людей принимают пробиотики без рецепта, но очень мало известно о том, что они делают и действительно ли они Работа. Здесь мы показываем, что у мышей введение Bifidobacterium , одного из наиболее часто используемых пробиотиков, не только колонизирует кишечник, но и изменяет весь микробиотический ландшафт.Ранее мы обнаружили, что это лечение спасает мышей от воспалительного синдрома со смертельным исходом, вызванного антителом против CTLA-4, ингибитором контрольной точки, который часто вызывает аутоиммунитет у людей, подвергающихся лечению рака. Здесь мы показываем, что этот эффект обусловлен, по крайней мере частично, воздействием этой пробиотической обработки на регуляторные клетки CD4 + , метаболические и иммуносупрессивные функции которых изменены. Эти регуляторные Т-клетки CD4 + , как известно, являются ключевым механизмом в контроле аутореактивности иммунной системы как у мышей, так и у людей.Таким образом, мы обнаружили прямую связь между лечением пробиотиками и одним из известных основных механизмов контроля избыточных иммунных ответов.
Abstract
Антитела, блокирующие иммунные контрольные точки, которые ослабляют иммунную толерантность, используются для эффективного лечения рака, но они также могут вызывать серьезные иммунные побочные эффекты. Ранее мы обнаружили, что Bifidobacterium может смягчать кишечную иммунопатологию в контексте блокады CTLA-4 у мышей. Здесь мы рассмотрели механизм, лежащий в основе этого процесса.Мы обнаружили, что Bifidobacterium систематически изменяет состав микробиоты кишечника в зависимости от регуляторных Т-клеток (Treg). Более того, это измененное комменсальное сообщество усилило как митохондриальную пригодность, так и опосредованные IL-10 подавляющие функции кишечных Treg, способствуя облегчению колита во время блокады иммунных контрольных точек.
Терапия блокадой иммунных контрольных точек стала очень успешным методом лечения рака. Первое моноклональное антитело (mAb), одобренное для клинического использования, специфично для цитотоксического Т-лимфоцит-ассоциированного белка 4 (CTLA-4) для лечения меланомы (1).Однако применение ингибиторов иммунных контрольных точек (ICI) может вызывать различные и даже фатальные аутоиммунные реакции, из которых диарея и колит являются одними из самых частых и тяжелых (2, 3).
Было показано, что компоненты микробиоты кишечника регулируют противоопухолевый иммунный ответ хозяина (4–7), и несколько исследований показали, что функция кишечной микробиоты модулирует эффективность терапии блокадой иммунных контрольных точек (5, 8, 9). Например, присутствие Bifidobacterium может стимулировать иммунную систему хозяина реагировать на терапию анти-PD-L1 зависимым от CD8 + Т-клетками образом (10).
Хотя эти исследования продемонстрировали роль микробиоты в противоопухолевом иммунитете, основные события, связанные с аутоиммунитетом, индуцированным контрольными точками антител, остаются неуловимыми. В клинике пациенты, перенесшие колит после лечения ICI, содержали состав кишечных бактерий, которые отличаются от таковых у пациентов без колита (11). В недавнем исследовании сообщалось о первом клиническом случае, в котором восстановление кишечной микробиоты с помощью трансплантации фекальной микробиоты успешно помогло избавиться от колита, связанного с ICI (9).Было также показано, что исходный уровень микробиоты кишечника связан с клиническим ответом на ипилимумаб с обогащением Faecalibacterium , что соответствует долгосрочному клиническому эффекту и колиту (12). Ранее мы сообщали, что введение Bifidobacterium ослабляет воспаление кишечника без нарушения противоопухолевой функции CTLA-4 у мышей (13). Здесь мы анализируем фундаментальные принципы, регулирующие взаимосвязь между индуцированной пробиотиками оптимизацией микробиома и результатом блокады CTLA-4.Мы демонстрируем, что Bifidobacterium систематически изменяет состав микробиоты кишечника, значительно увеличивая другие виды пробиотиков, Lactobacillus . Такая оптимизация микробиома зависит от существования регуляторных Т-клеток (Treg). Кроме того, мы обнаружили, что как метаболические, так и подавляющие функции кишечных Treg усиливаются этим измененным комменсальным сообществом, способствуя поддержанию регионального иммунного гомеостаза в условиях блокады CTLA-4.Взятые вместе, наши наблюдения раскрывают иммунологический принцип, управляющий сложными функциями динамики микробиоты, а также механизм переключения с Bifidobacterium на Lactobacillus в улучшении колита, связанного с блокадой иммунных контрольных точек.
Результаты
Bifidobacterium систематически изменяет микробиоту кишечника в зависимости от Treg.Наше открытие (13), что для модуляции индуцированной CTLA-4 иммунопатологии, опосредованной Bifidobacterium-, требуются Tregs, заставило нас задаться вопросом, влияют ли Treg напрямую на микробный состав кишечника ( SI, приложение , рис.S1). Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали мышей Foxp3-DTR, которые несут рецептор дифтерийного токсина на Treg, что делает возможным временное истощение Treg. Мы выделили ДНК из образцов стула и провели секвенирование 16S рРНК для сравнения кишечного бактериального сообщества как у контрольных, так и у мышей с истощенным Treg. Анализ главных компонентов показал, что обработка смесью Bifidobacterium привела к кластерам генотипов, отличным от групп, получавших PBS, как у мышей WT, так и у мышей с истощенным Treg (рис.1 А ). В частности, мы обнаружили, что обработка смесью Bifidobacterium значительно увеличивала численность не только Bifidobacterium , но также Lactobacillus , Kosakonia и Cronobacter у контрольных мышей, в то время как численность этих бактерий снижалась. резко, даже до необнаруживаемых уровней, у мышей с истощенным Treg (Рис. 1 B , Верхний и SI Приложение , Рис. S2 A и B ).
Рис. 1.Bifidobacterium изменяет сообщество кишечной микробиоты. ( A ) График основных координат состава микробиоты с PBS (красный) и Bifidobacterium (синий). ( B ) Процент (среднее ± SEM) от общей бактериальной численности значительно изменившихся бактерий у контрольных мышей и мышей de-Treg после введения PBS или Bifidobacterium . n.s., не имеет значения. u.d., не обнаруживается. * P <0,05, ** P <0.01, *** P <0,001, **** P <0,0001.
И Bifidobacterium , и Lactobacillus являются хорошо известными пробиотиками, которые, как сообщается, участвуют в гомеостазе кишечника (14, 15). Наши предыдущие данные показали, что Bifidobacterium утратила свою функцию у мышей с истощенным Treg, которым также не хватало Lactobacillus , что свидетельствует о связанном с иммунным статусом взаимодействии между этими двумя типами бактерий. Мы также обнаружили, что обработка Bifidobacterium значительно изменила процентное содержание Clostridium , Anaerostipes , Aporacetigenium и Peptoclostridium у мышей с обедненным Treg, в то время как у контрольных мышей значительных изменений не было (рис.1 B , Средний ). Кроме того, Bifidobacterium увеличивал численность Enterobacter и Pediococcus как у контрольных мышей, так и у мышей с истощенным Treg (рис. by Bifidobacterium не зависели от иммунной среды кишечника.
Штаммы, улучшающие колит, идентифицированные как из родов
Bifidobacterium , так и из Lactobacillus .Мы дополнительно протестировали каждый отдельный штамм Bifidobacterium из смеси четырех видов Bifidobacterium , использованных в предыдущих экспериментах. Мы обнаружили, что введение Bifidobacterium breve , но не других штаммов Bifidobacterium или контроля PBS, предотвращало потерю веса у мышей с колитом, получавших αCTLA-4 (рис. 2 A ), демонстрируя, что B. breve , вероятно, является ключевым функциональным штаммом, ответственным за улучшение состояния колита.Поскольку наши данные показали корреляцию между численностью Bifidobacterium и Lactobacillus на уровне рода (рис.1 B ), мы затем вводили через зонд мышей с различными штаммами Lactobacillus , включая Lactobacillus plantarum , Lactobacillus r. и Lactobacillus salivarius , чтобы проверить, влияют ли они на предрасположенность к колиту. Мы обнаружили, что обработка L. rhamnosum привела к значительно меньшей потере веса у мышей с колитом (рис.2 В ). В соответствии с этим открытием, окрашивание срезов толстой кишки гематоксилином и эозином (H&E) показало частичное восстановление структуры толстой кишки и меньшее количество лейкоцитов, инфильтрирующих в ткань кишечника как у мышей, обработанных B. breve- , так и у мышей, обработанных L. rhamnosum . Эти два штамма также привели к снижению сывороточных уровней воспалительных цитокинов IL-6, CSF3 и KC. Таким образом, мы можем идентифицировать B. breve и L. rhamnosum как два функциональных штамма, которые улучшают иммунопатологию кишечника во время блокады CTLA-4.
Рис. 2.B. breve и L. rhamnosum являются потенциальными функциональными штаммами для уменьшения воспаления кишечника. ( A ) Процент исходной массы мышей с 2,5% DSS-индуцированным колитом, которым инъецировали αCTLA-4 mAb и лечили контрольным PBS, B. longum , B. bifidum , B. breve или Bifidobacterium angulatum . ( B ) Процент исходной массы мышей с 2,5% DSS-индуцированным колитом, которым инъецировали αCTLA-4 mAb и лечили контрольным PBS, л.plantarum , L. rhamnosum или L. salivarius . Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. n = 5. n.s., не имеет значения. **** П <0,0001. ( C ) Типичные срезы толстой кишки мышей, обработанных контрольным PBS, B. breve или L. rhamnosum (окрашивание H и E; масштабная линейка: 100 мкм). ( D ) Концентрации IL-6, CSF3 и KC в сыворотке мышей, получавших контрольный PBS, B. breve, или L.Рхамносум . *** P <0,001; **** П <0,0001.
Bifidobacterium усиливает функцию Treg, продвигая самостимулирующую петлю IL-10 / IL-10Rα.Затем мы исследовали влияние Bifidobacterium на Tregs кишечника, которые необходимы для защитной функции Bifidobacterium (13). Сначала мы проанализировали паттерн экспрессии генов Tregs собственной пластинки толстой кишки (LP) у мышей, обработанных Bifidobacterium и обработанных PBS.График вулкана показывает, что обработка Bifidobacterium увеличила несколько ключевых генов, связанных с воспалением, таких как Il10rα , Cxcr5 и Il17rα (рис. 3 A ). Мы также подтвердили с помощью проточной цитометрии, что экспрессия IL-10Rα в Treg LP толстой кишки увеличивается после обработки Bifidobacterium (рис. 3 B и SI, приложение , рис. S3), а уровень внутриклеточного IL-10 был также увеличились в этих Treg, но не в других клетках (рис.3 C и SI Приложение , рис. S4). Эти данные показывают, что Bifidobacterium способствует самостимулирующей петле IL-10 / IL-10Rα в кишечных Treg.
Рис. 3.IL-10 и IL-22 необходимы для функции Bifidobacterium . ( A ) Вулканический график значительно измененных генов в Treg LP толстой кишки, сравнивая мышей, получавших Bifidobacterium , с мышами, получавшими PBS, в условиях блокады CTLA-4. ( B и C ) Анализ проточной цитометрии IL-10Rα ( B ) и IL-10 ( C ) в Treg LP толстой кишки, выделенных от мышей, которым инъецировали CTLA-4.Данные взяты из двух независимых экспериментов. n = 2 мыши на группу в каждом эксперименте. n.s., не значимо, * P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001. ( D ) Анализ супрессии Treg, выполняемый путем совместного культивирования Teff-клеток селезенки, антигенпрезентирующих клеток и Treg толстой кишки от мышей, обработанных PBS или Bifidobacterium , через 4 дня после получения антитела против CTLA-4. Данные взяты из трех независимых экспериментов. * P <0.05. ( E ) Процент начального веса мышей WT и Il-10 KO с 2,5% DSS-индуцированным колитом, подвергнутых инъекции IgG или αIL-22. Мышей лечили αCTLA-4 mAb и Bifidobacterium . n = 5. *** P <0,001, **** P <0,0001. ( F и G ) Типичные срезы ткани толстой кишки мышей WT, обработанных Bifidobacterium , мышей WT, получавших инъекцию αIL-22, и мышей Il-10 KO, обработанных IgG, на 10-й день после анти-CTLA-4 инъекция антител и введение DSS (окрашивание H и E; шкала: 100 мкм) ( F ) и концентрации цитокинов в сыворотке ( G ).* P <0,05, ** P <0,01. ( H ) Процент исходной массы инъецированных αIL-22 мышей Il-10 KO с 2,5% DSS-индуцированным колитом, подвергнутых обработке mAb против CTLA-4 и PBS или через желудочный зонд Bifidobacterium . Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. n = 5. n.s., не имеет значения. ( I ) Гистологические оценки мышей, получавших PBS или Bifidobacterium .
Поскольку передача сигналов IL-10 важна для усиления функции Treg и поддержания гомеостаза кишечника (16⇓ – 18), мы затем исследовали супрессивную функцию Treg толстой кишки in vitro.Мы обнаружили, что эффекторные Т-клетки, которые были совместно культивированы с Treg, обработанными Bifidobacterium , показали меньшую пролиферацию, чем те, которые совместно культивировались с Treg, обработанными PBS, что указывает на то, что этот тип кишечных микробов усиливает их подавляющую функцию (Рис. 3 D и SI Приложение , рис. S5).
И IL-10, и IL-22 участвуют в улучшающей функции колита
Bifidobacterium .Для дальнейшего анализа роли IL-10 в функции Bifidobacterium , мы использовали IL-10 нокаутных (KO) мышей для анализа симптомов колита в условиях блокады CTLA-4 с обработкой Bifidobacterium .Мы наблюдали более сильную потерю веса у мышей Il-10 KO по сравнению с мышами дикого типа (WT), подвергнутых такой же обработке (фиг. 3 E , синяя линия). IL-22 разделяет иммунную регуляторную функцию с IL-10R и играет важную роль в поддержании гомеостаза кишечника (16, 18). Таким образом, мы использовали IL-22-нейтрализующее антитело для тестирования эффекта удаления этого цитокина на ремиссию колита, опосредованного Bifidobacterium , во время блокады CTLA-4. Мы обнаружили, что мыши, получавшие антитела, потеряли больше веса, чем мыши, получавшие нерелевантное антитело.В частности, средний вес мышей, обработанных Bifidobacterium , снизился с 90% от исходного веса в контрольной группе до ~ 70% от исходного веса в группе, получавшей инъекции анти-IL-22, на 10-й день после DSS (сульфат декстрана). натрия) (рис.3 E , красная линия). В соответствии с этим открытием, окрашивание срезов толстой кишки H&E показало большую инфильтрацию лейкоцитами и более серьезные повреждения структуры кишечника у мышей, обработанных антителом против IL-22, или мышей Il-10 KO (рис.3 F ). Обработка анти-IL-22 и нокаут IL-10 также увеличивали сывороточные уровни воспалительных цитокинов IL-6, CSF3 и KC (фиг. 3 G ).
Важно отметить, что мы обнаружили, что при применении блокады IL-22 к мышам Il-10 KO, мыши, обработанные Bifidobacterium , показали сильную потерю веса, сравнимую с таковой у контрольных мышей, получавших PBS (рис. 3 H ). Сопоставимые гистологические баллы также наблюдались в двух группах (рис.3 I ). Вместе эти результаты показывают, что как IL-22, так и IL-10 необходимы для функции Bifidobacterium в улучшении иммунопатологии кишечника.
Bifidobacterium Усиливает митохондриальный метаболизм Treg-клеток.Помимо воздействия на функцию иммунных клеток, микробиота кишечника также может влиять на метаболизм клетки-хозяина (19, 20). Мы провели масс-спектрометрический анализ метаболитов сыворотки мышей, обработанных Bifidobacterium , и контрольных мышей (21).Интересно, что мы обнаружили, что лечение Bifidobacterium увеличивало сывороточный уровень субериновой кислоты (рис. 4 A ), кислоты, которая отражает митохондриальную активность и часто выявляется у пациентов с нарушениями липидного обмена (22). Затем мы оценили данные экспрессии генов из отсортированных Treg LP толстой кишки с помощью анализа Gene Ontology (GO). В соответствии с вышеизложенными результатами, мы обнаружили обогащение биологических путей, связанных как с метаболическими процессами, так и с митохондриальной организацией в группе, обработанной Bifidobacterium по сравнению сконтрольная группа (рис. 4 Б ). Обогащенный анализ набора генов (GSEA) показал, что четыре набора генов, напрямую связанных с метаболизмом, включая «метаболизм желчных кислот», «пероксисому», «метаболизм жирных кислот» и «гомеостаз холестерина», представляют собой сигнатуру активированного гена в Tregs толстой кишки. после обработки Bifidobacterium (рис. 4 C ).
Рис. 4.Bifidobacterium влияет на митохондриальный метаболизм Treg толстой кишки. ( A ) Концентрации субериновой кислоты в сыворотке мышей, получавших PBS или Bifidobacterium. * P <0,05. ( B ) GO анализ существенно нарушенных биологических процессов. ( C ) GSEA толстой кишки Tregs. На диаграмме показан GSEA для четырех наборов генов, активированных в группах, обработанных Bifidobacterium (слева, Bifidobacterium ; справа, PBS). Вертикальная ось на верхнем графике показывает оценку обогащения (ES) для генов в каждом наборе генов. График штрих-кода указывает положение генов в каждом наборе генов. NES, нормализованная ES; FDR, коэффициент ложного обнаружения.( D ) Митохондриальная масса Tregs LP толстой кишки ( n = 5), обнаруженная с помощью мечения MitoTracker Deep Red FM и проточной цитометрии. * P <0,05. ( E ) Митохондриальный стресс Tregs LP толстой кишки ( n = 5), обнаруженный с помощью маркировки MitoTracker Red CMXROS и проточной цитометрии. * P <0,05. ( F ) Паттерн экспрессии генов, связанных с митохондриями, в обработанных Bifidobacterium и обработанных PBS LP Treg.
Чтобы исследовать, влияет ли Bifidobacterium на объем и функцию Treg в митохондриях, мы окрашивали клетки флуоресцентными зондами для мониторинга объема митохондрий и мембранного потенциала.Данные проточной цитометрии показали, что Treg в группе, обработанной Bifidobacterium , демонстрировали увеличение как объема митохондрий, так и митохондриального стресса (рис. 4 D и E ) по сравнению с таковыми в группе PBS. В соответствии с этим открытием, множественные гены, связанные с функцией митохондрий и структурными компонентами митохондрий, были значительно усилены обработкой Bifidobacterium (рис. 4 F ). В совокупности эти результаты демонстрируют, что Bifidobacterium модулирует метаболические процессы и усиливает митохондриальную активность в кишечных Treg.
Обсуждение
В этом исследовании мы использовали модель колита DSS у мышей в условиях блокады иммунных контрольных точек, чтобы изучить эффекты Bifidobacterium как на комменсальное сообщество, так и на иммунную систему хозяина. Важно отметить, что мы обнаружили, что введение Bifidobacterium вызывает системные изменения в микробиоте кишечника. Более того, на эту модуляцию влияет иммунная регуляторная среда слизистых оболочек, определяемая Treg.
Интересно, что мы обнаружили, что введение Bifidobacterium значительно изменило численность Lactobacillus , предполагая, что Bifidobacterium способствует ремиссии кишечного воспаления, составляя благоприятную экосистему кишечника с другими таксонами, связанными с пробиотической активностью.Примечательно, что низкий процент колонизации Bifidobacterium (∼0,002%) может привести к обогащению Lactobacillus , достигая ∼10% от общего количества комменсальных бактерий (рис. 1 B ), что указывает на роль Bifidobacteria. как вид-первопроходец, позволивший колонизировать другие, более многочисленные виды пробиотиков. Более того, мы обнаружили, что этот пробиотический ретранслятор от Bifidobacterium до Lactobacillus также чувствителен к статусу воспаления кишечника, установленному Tregs.Идентифицировав B. breve и L. rhamnosum как два конкретных функциональных штамма из родов Bifidobacterium и Lactobacillus , мы дополнительно подтвердили положительную роль этих бактерий в контроле вызванной CTLA-4 кишечной токсичности.
Таким образом, мы обнаружили, что введение Bifidobacterium мышам в корне изменяет их микробиом, указывая на то, что это динамичная и взаимосвязанная экосистема. В отношении влияния этих бактерий на подавление вредных эффектов анти-CTLA-4 / повреждения кишечника мы обнаружили как повышенную экспрессию IL-10Ra, так и повышенную продукцию IL-10 в кишечных Treg, предполагая, что Bifidobacterium может прямо или косвенно усиливать подавляющая функция Tregs за счет стимуляции сигнальной петли IL-10 / IL10Ra в Treg без изменения их количества.Кроме того, мы показываем, что этот процесс связан с повышенной митохондриальной активностью в этих Treg, обеспечивая метаболическую связь с их усиленной функцией в этой системе.
Материалы и методы
Мыши.
Мыши Il-10 KO ( Il-10 — / — ; C57BL / 6-Il10tm1Cgn) были приобретены в лаборатории Джексона. Все эксперименты проводились на самках мышей в возрасте от 6 до 14 недель. Мышей содержали в специальном помещении, свободном от патогенов, в Шанхайском университете Цзяо Тонг или Стэнфордском университете.Эксперименты на мышах были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинской школы Шанхайского университета Цзяо Тонг и Стэнфордского университета.
Модель колита DSS в условиях блокады CTLA-4.
Между 2% и 4% DSS (MP Biomedicals) добавляли к питьевой воде мышей на 7-12 дней. Изменения веса контролировали каждый день. Для манипуляции с кишечником мышам вводили ванкомицин (0,5 г / л; Sigma-Aldrich) по крайней мере за 14 дней до введения DSS.Мышам вводили 200 мкг mAb против CTLA-4 (BioXCell, клон 9D9) или изотипического контроля в начале введения DSS.
Гистологический анализ.
Ткани толстой кишки фиксировали 4% параформальдегидом, заливали парафином, делали срезы от 3 до 6 мкм и окрашивали H&E. Каждому сегменту была присвоена оценка от 0 до 4 по пяти критериям: тяжесть воспаления, процент площади, пораженной воспалением, степень гиперплазии, процент площади, пораженной гиперпластическими изменениями, и изъязвление.
Введение пробиотиков.
Смесь четырех видов Bifidobacterium , состоящих из B.bifidum , B. longum , B. lactis и B. breve (Seeking Health) или отдельных штаммов пробиотиков, ресуспендировали в PBS. Каждая мышь получала 1 × 10 9 бактериальных КОЕ через желудочный зонд. При колите DSS пробиотики вводили до лечения DSS.
Экстракция фекальной ДНК и анализ последовательности 16S.
Геномная ДНК была выделена из образцов фекалий (собранных через 4 дня после перорального введения пробиотиков) с использованием набора для выделения ДНК PowerSoil (MO BIO Laboratories) в соответствии с инструкциями производителя. Универсальные эубактериальные праймеры 16S 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA и 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT использовали для оценки микробной экологии каждого образца в системе секвенирования Illumina HiSeq 2500. Данные последовательности, полученные в процессе секвенирования, были обработаны с использованием запатентованного конвейера анализа (MR DNA).Затем OTU были таксономически классифицированы с использованием BLASTn по отношению к курируемой базе данных GreenGenes / Ribosomal Database Project / Национального центра биотехнологической базы данных.
Выделение кишечных лимфоцитов LP.
лимфоцитов LP были выделены, как описано ранее, с простой модификацией (19). Вкратце, мышей умерщвляли, толстую кишку удаляли и открывали в продольном направлении. Кишечник тщательно промывали PBS и разрезали на кусочки размером 1,5 см. Кишечник встряхивали в PBS, содержащем 1 мМ DTT, 30 мМ EDTA и 10 мМ Hepes, при 37 ° C в течение 10 мин.Затем кишечник встряхивали в PBS, содержащем 30 мМ EDTA и 10 мМ Hepes, при 37 ° C в течение 10 мин. После промывки полной средой RPMI 1640 ткани переваривали в среде RPMI 1640, содержащей 16% коллагеназы VIII (Sigma-Aldrich; 50 KU) и ДНКазу I (Sigma Aldrich; 90 мг / мл), при 37 ° C в течение 55 минут. Затем клеточные суспензии, полученные в результате ферментного переваривания, наносили на градиент Percoll (GE Healthcare) (для лимфоцитов: 40% Percoll вверху, 80% Percoll внизу) центрифугированием при 2500 об / мин в течение 25 минут при комнатной температуре.Лимфоциты собирали из интерфазы и дважды промывали 0,5% BSA-PBS.
Проточная цитометрия.
Клетки окрашивали указанными конъюгированными с флуорохромом антителами в PBS, содержащем 0,5% BSA, для анализа поверхностных маркеров. Проточный цитометрический анализ выполняли с использованием проточного цитометра Fortessa (BD Biosciences) с программным обеспечением FlowJo.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов.
Уровни внутриклеточной экспрессии IL-17A, IL-22 и IL-10 в Т-клетках CD4 + анализировали с помощью набора буферов для окрашивания Foxp3 / фактора транскрипции (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, кишечные LP инкубировали со смесью для стимуляции клеток и ингибитором транспорта белка (Invitrogen) в полной RPMI 1640 при 37 ° C в течение 5 часов. Окрашивание поверхности проводили при 4 ° C в течение 30 мин. После фиксации и обработки для повышения проницаемости проводили внутриклеточное окрашивание анти-IL-17A (eBioscience), анти-IL-22 (eBioscience), анти-IL-10 (BD Biosciences), анти-Foxp3 (eBioscience) и анти-RORγt. (eBioscience) антитела в течение 1 ч. Данные были получены с помощью проточного цитометра BD Biosciences Fortessa и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo.
Анализ цитокинов сыворотки.
Образцы крови собирали на 6-7 день после индукции колита с помощью DSS. После свертывания при комнатной температуре в течение не менее 30 минут сыворотку отделяли при RCF 1200 в течение 10 минут с помощью центрифуги. Измерения цитокинов проводили в соответствии с инструкциями в руководстве по системе Luminex.
Анализ данных секвенирования РНК.
Каждый отдельный образец имел в среднем 35 миллионов считываний парных концов по 75 пар оснований. Fastqc (версия 0.11.4) использовался для оценки качества секвенирования.Затем считанные данные были сопоставлены с транскриптомом человека (hg19) с использованием Bowtie версии 2.2.7, со сплайсинговыми соединениями, определенными в файле GTF (полученном из UCSC). В среднем 65% считываний были сопоставлены с эталонным транскриптомом. Экспрессию на уровне гена определяли путем расчета считываний на килобазу на миллион выровненных считываний и необработанных подсчетов с использованием RSEM версии 1.2.30. Дифференциально экспрессируемые гены с кратными изменениями были дополнительно обнаружены с помощью DEseq2 версии 1.10.1 для двух сопоставимых условий.Анализ GO проводился с помощью онлайн-инструмента Дэвида (https://david.ncifcrf.gov). GSEA проводили с использованием модели с предварительным ранжированием, и наборы генов с FDR ниже 25% считались значительным обогащением.
Анализ подавления Treg.
Эффекторные Т-клетки (CD4 + TCRβ + GFP — CD44 + CD62L — ) и не Т-клетки (TCRβ — ) были очищены методом проточной цитометрии с сортировкой клеток из селезенки C57BL. / 6 мышей. Т-клетки метили CellTrace Violet (Invitrogen; 5 мкм).Не-Т-клетки инкубировали с митомицином C (Sigma-Aldrich; 50 мкг / мл) при 37 ° C в течение 30 мин. Tregs (CD45 + CD4 + TCRβ + GFP + ) были отсортированы из LP толстой кишки мышей Foxp3-GFP . Treg и меченые эффекторные Т-клетки (Teffs) помещали в 96-луночные планшеты при соотношениях Treg: Teff 1: 8, 1:16, 1:32 и 1:64, а затем в каждую лунку добавляли не-Т-клетки. в три раза больше числа ячеек Teff. Клетки культивировали с анти-CD3ε (BD Biosciences; клон 2C11) при 0.1 мкг / мл в течение 3 дней. Подавляющую активность Treg оценивали как пролиферацию клеток Teff на основании разведения цитозольного красителя CellTrace Violet.
Митохондриальный анализ.
Лимфоциты LP толстой кишки выделяли и затем окрашивали маркерами клеточной поверхности. После двух промывок 0,5% BSA-PBS клетки инкубировали с митохондриальным красителем (Invitrogen) (для Mito Tracker Red FM, 50 нМ; для Mito Tracker Red CMXRos, 100 нМ) при 37 ° C в течение 25 мин.
Метаболомический анализ.
Образцы сыворотки экстрагировали метанолом, и осажденный белок осаждали центрифугированием. Затем экстракты сушили и восстанавливали в 50% метаноле. Затем образцы были проанализированы методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС) с использованием Agilent 6545 Q-TOF с использованием трех методов, включая ЖХ-МС с обратной фазой в положительном и отрицательном режимах и хроматографию гидрофильного взаимодействия. Затем была проведена идентификация пиков с использованием библиотеки стандартов масс-спектрометрии и соответствующего программного обеспечения от IROA Technologies.
Статистический анализ.
Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 7.00.
Доступность данных.
Все данные исследования включены в основной текст и приложение SI .
Благодарности
Мы благодарим Шашуан Чжан, Лей Дин, Ру Фэн, Лэй Чен, Гоцзюнь Цюй, Бин Су, Шо Хан, Юэ-сю Цзянь, Уильяма Ван Треурена и Курта Фишера за полезные обсуждения и техническую помощь, а также Центр химического анализа метаболитов ChEM-H Стэнфордского университета.Это исследование было поддержано грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (SQ2018YFA0
-01), Национального фонда естественных наук Китая (82071852, 81771739), Программы для профессоров специальных назначений (восточных ученых) Шанхайских институтов Комитет по высшему образованию и технологиям муниципалитета Шанхая (18JC1414100, 20410713800 — FW), HHMI и Институт иммунотерапии рака (MMD).