Электрофорез — что это? | Стоматология Доктора Манапова
2019-12-10
Электрофорез – это метод физиотерапевтического лечения, при котором в организм вводится лекарственный препарат посредством электрического тока малой силы. В основе данной процедуры лежит применение специальных лекарственных средств, которые способны распадаться на определенные ионы и под воздействием тока направленно проникать вглубь тканей даже через кожные покровы, но на небольшую глубину. Как правило, лекарство попадает в кровь и моментально разносится по всему организму. Кроме того, оно скапливается в органах, на которые непосредственно оказывается воздействие.
Основное показание к лечению электрофорезом – это инфицирование каналов зуба при пульпите, периодонтите, а также кистах и гранулемах. Благодаря целенаправленному введению лекарственного препарата происходит быстрое и эффективное восстановление зубных каналов, уменьшение болевого синдрома, удаление бактерий. После лечения проводится обязательная пломбировка каналов.
Противопоказания:
- аллергические реакции на вводимые препараты
- гнойные воспалительные процессы в организме
- наличие кардиостимулятора
- тяжелая форма бронхиальной астмы
- злокачественные новообразования
- острые заболевания сердечно-сосудистой системы.
Показания:
- кисты и гранулемы
- пульпит – инфицирование каналов зуба
- периодонтит
- болевые ощущения после лечения или удаления зубов
- альвеолит
- стоматит.
Электрофорез в стоматологии: технология
- специальная прокладка смачивается в лекарственном препарате и фиксируется на пораженном участке. Если требуется лечение пульпита, то препарат вводится внутрь зуба, предварительно обрабатываются каналы,
- при помощи специального аппарата, вырабатывающего ток, проводится воздействие на ткань полости рта через прокладку с лекарственным средством.
Длительность одной процедуры – 10-30 минут, проводить их рекомендуется ежедневно или через день. Весь курс занимает от 10 до 20 процедур.
Электрофорез в стоматологии: преимущества
- безболезненность проведения процедуры: возможно лишь незначительное покалывание и жжение,
- быстрое снятие воспалительных процессов внутри канала зуба или в тканях, окружающих его верхушку,
- уменьшение болевого синдрома во время и после лечения различных зубных заболеваний,
- бактерицидное воздействие на ткани,
- целенаправленное введение лекарственного средства, его скопление непосредственно в очаге воспаления,
- минимальный риск развития аллергических реакций на вводимый лекарственный препарат,
увеличение эффективности лекарственных средств: оно медленнее выводится и сохраняется в течение нескольких недель.
Электрофорез в стоматологии: недостатки
- большое количество противопоказаний для проведения лечения.
Электрофорез – это не самостоятельное средство лечения, а, как и любой метод физиотерапии – лишь дополнительный способ восстановления организма при наличии каких-либо заболеваний полости рта. Главное преимущество электрофореза в том, что введение лекарственного препарата в организм происходит целенаправленно, что гораздо более эффективно даже капельниц, внутривенного введения или приема медикамента внутрь. При необходимости возможно выведение лекарственного средства из организма также посредством электрического тока.
Электрофорез
Очень популярный метод физиотерапии с использованием электрического тока. Этот метод известен уже более 100 лет. Постоянный электрический ток оказывает терапевтическое воздействие на весь организм или местно, его назначают как с лекарственным препаратом, так и без, в зависимости от заболевания. Электрофорез полностью безопасен, а процедура безболезненна, так как силу тока подбирают индивидуально для каждого пациента ориентируясь на чувствительность организма.
Суть метода терапии электрофорезомСуть метода заключается в превращении лекарственного препарата в электрически заряженные частицы. Они проникают в кожу и распространяются через слизистые и кровеносную систему.
Одна часть препарата накапливается в необходимой области, а другая через ток крови распространяется по всему организму.
Преимуществом электрофореза является введение лекарственного препарата на прямую в пораженную область через слизистые, не нагружая печень и почки. Это означает, что для достижения необходимого эффекта требуется применять препарат в меньшей концентрации, а так же следует выделить — тот факт, что удерживается в тканях при таком введении препарат дольше, а значит и терапия этим методом имеет ярко выраженный пролонгированный эффект.
Основными терапевтическими свойствами лекарственного электрофореза являются:
- уменьшение воспаления, отеков, болей;
- расслабление мышц;
- улучшение микроциркуляции в тканях и их регенерации;
- активизация защитных сил организма и др.
В нашем центре физиотерапию электрофорезом проводит врач физиотерапевт — реабилитолог.
Врач физиотерапевт
Прием врача
Взрослые и дети 0+
Запись по телефону: 8-918-9-555-220 или через форму обратной связи на сайте.
Стоимость
- Физио процедура электрофорез от 550р
- Курс физио процедур электрофорез № 10 от 5000р
- Физио процедура электрофорез для детей до 12 лет от 350р
- Курс физио процедур электрофорез № 10 для детей до 12 лет от 3000р
Когда назначают процедуру электрофорез?
Благодаря своим свойствам электрофорез широко применяется в комплексной терапии при различных заболеваниях. Чаше всего электрофорез назначают врачи: невролог, отоларинголог, терапевт, гинеколог, хирург и конечно же педиатр.
Электрофорез в Краснодаре назначается при широком спектре заболеваний:
- ЛОР органов;
- дыхательной системы;
- желудочно-кишечного тракта;
- неврологических заболеваниях;
- заболеваниях сердечно-сосудистой системы;
- заболеваниях мочеполовой системы;
- эндокринной системы;
- заболеваниях опорно-двигательного аппарата и др.
Как проходит процедура?
Электрофорез, как и любая другая физиотерапевтическая процедура имеет некоторые противопоказания, поэтому перед процедурой врач физиотерапевт проведет осмотр и опрос пациента, свериться с направлением.
При отсутствии противопоказаний, врач проведет процедуру, которая занимает от 10 до 30 минут в зависимости от назначения. Пациента попросят снять одежду и лечь на кушетку, затем на область в соответствии с рекомендацией лечащего врача наложат специальные электроды с пропитанным лекарством прокладкой и зафиксируют для лучшего контакта и выставят силу тока и время. Аппарат для электрофореза будет подавать постоянный электрический импульс, что проявляется легким покалыванием.
Для грудничков, эта процедура проводиться на специальном столике с матрасиком и бортиками, а электроды фиксируются эластичной сеточкой.
Врачи назначают курс физиотерапии лекарственным электрофорезом от 5 до 15 процедур. Частота выполнения — ежедневно или через день, подбирается индивидуально и зависит не только от показаний, но и от самочувствия пациента.
Противопоказания к проведению лекарственного электрофореза
Новообразования, декомпенсация хронических заболеваний, острые лихорадочные состояния, гнойные процессы без оттока содержимого, индивидуальная непереносимость тока или лекарственного вещества, психические нарушения, чувствительные нарушения, общее тяжелое состояние пациента, афазия, выраженные изменения кожного покрова в области проведения процедуры, склонность к кровотечениям.
Где можно сделать электрофарез в Краснодаре
Мы принимаем по адресу: г. Краснодар, мкр-н Молодежный, ул. 2-я Целиноградская д.44 корпус 2, офис 45 (р-н Витаминкомбината)
Электрофорез. Где пройти лечение электрофорезом в Москве
Электрофорез
Электрофорез – это физиотерапевтическая процедура, обеспечивающая лечебный эффект с помощью сочетания локального воздействия постоянного электрического тока и лекарственных препаратов, вводимых при помощи тока. Под воздействием электрического поля лекарство в виде заряженных частиц (ионов) проникает в кожу через устья сальных и потовых желёз, волосяные фолликулы и межклеточные промежутки. Основная часть введенного лекарства остаётся в области, подвергаемой воздействию, некоторая часть с током крови и лимфы разносится по всему организму.
Электрофорез имеет широкую сферу применения. С помощью электрофореза может вводиться достаточно широкий перечень лекарственных препаратов. Данный вид физиотерапии используется в лечении многих заболеваний. Обычно курс состоит из 10 сеансов электрофореза, проводимых ежедневно или через день. Продолжительность одного сеанса — 10-15 минут.
Если вы ищете, где пройти лечение электрофорезом в Москве, обратитесь в АО «Семейный доктор». Оплатив весь курс процедур сразу, вы получаете скидку на последнюю процедуру. При единовременной оплате 5-ти процедур скидка на последнюю составит 50%, при оплате 7-ми — 70%. При оплате 10-ти процедур электрофореза последняя будет для вас бесплатной
Ниже вы можете уточнить стоимость лечения электрофорезом (цену процедуры), а также выбрать поликлинику, находящуюся в наиболее удобном для вас районе Москвы.
Уважаемые пациенты!
Окончательная стоимость приема может включать стоимость дополнительных услуг.
Необходимость оказания таких услуг определяется врачом в зависимости от медицинских показаний непосредственно во время приёма.
Электрофорез, аппарат электрофореза для детей и взрослых
Что такое электрофорез, при каких заболеваниях его назначают. Принцип работы, преимущества методики перед стандартным приемом препаратов, показания, противопоказания
Что такое электрофорез
Электрофорез – это один из методов физиотерапии. Он распространен в детской и взрослой практике, разрешен даже беременным, кормящим женщинам и малышам до 1 года. Метод применяют при лечении травм, воспалений, болевого синдрома, поражений нервной системы. Описывая, что такое электрофорез, физиотерапевты объясняют, что в его основе лежит местное действие постоянного электрического тока и лекарственных средств. Препараты проходят сквозь неповрежденные покровы (кожа, слизистые) и попадают в ткани с помощью магнитного поля. Электрический ток служит проводником и влияет на нервные и гуморальные механизмы регуляции.
Как проходит процедура электрофореза
В медицинском центре физиолечение проводится по записи, в специально оборудованном кабинете. В штате постоянно работают 2 специалиста с профильным образованием и опытом работы от 4 лет. Перед назначением процедур пациент получает рекомендации физиотерапевта: наличие показаний, длительность лечения, частота посещения.
Обычно курс состоит из 5-15 сеансов, которые проводят ежедневно или через день.
Процедуры электрофореза безболезненны. Возможен лишь некоторый дискомфорт, который пациенты описывают как покалывание, пощипывание. Средняя продолжительность сеанса составляет 20 минут, но может быть скорректирована с учетом особенностей поведения ребенка.
Показания и противопоказания к прохождению электрофореза
Процесс гальванизации лежит в основе работы прибора электрофореза. Слабый электрический ток (малой силы и напряжения) подводится к телу с помощью электродов с положительным и отрицательным зарядом. Он самостоятельно оказывает лечебное действие, раздражая нервные окончания, изменяя состояние крови и лимфы.
В месте контакта с телом электроды помещают в специальные гидрофильные прокладки из фланели. Усиление эффекта достигается за счет нанесения лекарственного средства на ткань. Под действием тока молекулы препарата диссоциируют на положительные и отрицательные ионы и легко проникают через кожные покровы или слизистую. Возможно одновременное введение нескольких медикаментов с разных электродов.
Электрофорез имеет определенные преимущества перед пероральным (таблетки, порошки, капли) или парентеральным (уколы, капельницы) введением лекарственных средств:
- Препарат поступает непосредственно в очаг. Так исключается потеря за счет биотрансформации в печени, практически отсутствует общее действие. Поэтому метод доступен детям, беременным или кормящим женщинам.
- Для достижения эффекта требуется меньшая дозировка средства, снижается вероятность нежелательного эффекта.
- Электрофорез не причиняет неудобство, родителям легче уговорить ребенка на такую процедуру, чем на прием таблеток, болезненные инъекции.
- Пролонгированное действие препарата: согласно исследованиям, ионы лекарств депонируются и удерживаются в месте введения до 2-3 недель. В течение этого времени препарат всасывается в кровь.
Метод эффективен для лечения местного воспаления в участках с нарушенным кровотоком – электрический ток способствует его рассасыванию, а ионы вещества проникают в очаг и работают в нем даже при нарушении микроциркуляции.
Показания к назначению процедур обширны. Среди них:
- органические поражения периферической, центральной нервной системы;
- невротические состояния, приступы мигрени;
- артриты, артрозы различной локализации, последствия травм суставов;
- воспаление слизистой полости рта, флюороз;
- болезни органов дыхания: поллиноз, ОРВИ, пневмония, астма;
- дисплазия тазобедренного сустава у малышей 1 года жизни;
- последствия ожогов, акне, фолликулитов;
- ишемическая болезнь сердца, атеросклероз;
- повышенное или пониженное артериальное давление;
- воспаления мочевыводящих путей;
- различные гинекологические заболевания.
Перечень функциональных, органических нарушений, при которых метод лечения помогает облегчить состояние пациента, обширен. Подробные рекомендации можно получить на консультации физиотерапевта.
Противопоказания к электрофорезу возникают при нарушении целостности кожи, слизистых, тяжелых соматических заболеваниях:
- дерматит, язвы, гнойные очаги в месте аппликации;
- аллергические реакции на препарат;
- наличие кардиостимулятора;
- острые инфекционные заболевания, лихорадка;
- тяжелая степень гипертонической болезни,
- декомпенсированная сердечная недостаточность;
- бронхиальная астма тяжелого течения;
- активный туберкулез;
- злокачественные новообразования.
Электрофорез для детей и взрослых в Хабаровске
Выбор способа введения лекарственного средства зависит от заболевания. Так при поражении нервных стволов применяют продольным методом наложения электродов: один из них располагают в области периферического участка, второй – в месте выхода корешка из спинного мозга. Такой способ эффективен при лечении и других поверхностных патологических очагов. При глубокой локализации процесса рекомендован поперечный метод, при котором электроды помещают на противоположных поверхностях (например, спина и живот).
Электрофорез подходит и для точечного воздействия. В таком случае в проекции очага располагают меньший электрод, а больший – на отдалении.
В клинике есть аппарат и для эндоназального электрофореза. Он подходит не только для детей, но и для взрослых. Слизистая полости носа пронизана мелкими сосудами — препарат лучше поступает к тканям, чем при накожном наложении электродов. Метод рекомендован для лечения:
- синдрома хронической усталости;
- неврастении;
- переутомления на фоне работы, учебы;
- последствий нарушения мозгового кровообращения.
Продолжительность процедуры составляет 10 минут, услуга доступна по предварительной записи.
Электрофорез – бережный и эффективный способ лечения и реабилитации. Он рекомендован не только пациентам с тяжелыми, хроническими заболеваниями, но и людям с проявлениями тревоги, напряженности, усталости. Включение процедур в комплекс терапии повышает эффективность всего курса реабилитации.
Электрофорез в санатории «Виктория»
Электрофорезом называется процедура введения лекарственных препаратов в кожу или слизистые оболочки с помощью электрического поля – безболезненно и без инъекций. В поверхностных тканях они частично депонируются, и из нее поступают в общий кровоток, оказывая необходимые эффекты.
Кроме действий, обусловленных воздействием вводимых препаратов, электрофорез производит сосудорасширяющий и обезболивающий эффекты, улучшает метаболизм клеток, уменьшает степень воспаления, стимулирует выработку биоактивных веществ, уменьшает выраженность отеков. Под влиянием электрического поля препарат можно ввести в кожу и создать в ней депо, откуда лекарство будет расходоваться постепенно, обеспечивая пролонгированность действия и исключая разрушение действующего вещества секретами желез. Медицинские средства можно вводить непосредственно в область воспаления, уменьшая их воздействие на организм.
Показания к электрофорезу:
- неврастения;
- мигрень;
- невроз;
- стенокардия;
- гипертоническая болезнь;
- синуситы;
- бронхиты;
- бронхиальная астма;
- атеросклероз сосудов;
- остеоартроз;
- рубцы;
- спаечная болезнь;
- гидросальпинкс;
- эрозия шейки матки;
- себорея;
- ювенильный ревматоидный артрит;
- гастрит;
- панкреатит;
- холецистит;
- воспалительные заболевания мочеполовой системы;
- воспалительные патологии глаз, кожи, полости рта.
Противопоказан электрофорез при сердечной недостаточности, психических нарушениях, тяжелом состоянии, болезни Бехтерева, недавно перенесенном инсульте, наличии кардиостимулятора, тяжелом течении астмы, нарушении свертываемости, непереносимости электрического тока.
Адрес санатория:Россия, Ставропольский край, г. Кисловодск, ул. Кирова, д.12
Отдел реализации путевок (г. Кисловодск):
Тел: 8 (800) 250-60-63
e-mail: [email protected]
Посмотреть на карте
ФИЗИОТЕРАПИЯ ДЛЯ КОСМЕТОЛОГИИ | Пансионат имени А.И. Майстренко
1.Лечение контрактур, келоидных, послеоперационных,
послеожоговых рубцов:
-Фонофорез с ферменколом или контратубексом или карипаин- кремом на область рубца. Контактно, лабильно.0,4-0,6 Вт/см2 ; на область лица 0,2-0,4 Вт/см2, режим непрерывный 15 минут, № 20
-Электрофорез Карипаина(+) 1 флакон Карипаина разводится в 5–10 мл физиологического раствора непосредственно перед процедурой. В раствор добавляется 2–3 капли Димексида. Раствор наносится на фильтровальную бумагу белого цвета, размещенную на прокладках электрода. Размеры электрода-прокладки 10 х 15 см. Сила тока 3-5 мА,Время 15-20 мин .Курс 20-30 процедур. В течении года 2-3 курса
-Электрофорез Лидазы(+) 64 Ед с кислотным буфером. Раствор наносится на фильтровальную бумагу белого цвета, размещенную на прокладках электрода. Сила тока 3-5 мА, Время 15-20 мин .Курс 20-30 процедур. В течении года 2-3 курса.
Между курсами рубец смазывается одним из дефиброзирующих средств.
-Лазеротерапия «РИКТА»
Для предупреждения образования рубцов, через 10 дней после снятия швов.
Обработка проводится на дистанции 0,5-1 см. Скорость сканирования 1 см в секунду. Начинать следует с воздействия на окружающие рану “здоровые” участки кожи, постепенно приближаясь к центру раны. Для усиления эффекта лечения лучше дополнительно проводить чрез кожное воздействие на кровь в регионе, максимально приближенном к зоне поражения.
Требуемое число процедур- до 7-10 на курс, по 1 процедуре в день. После каждой процедуры можно применять традиционные повязки. При неполном заживлении можно провести повторный курс с интервалом в 1 месяц.
2.ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЖИ:
-Дарсонвализация. Методика дистантная лабильная. Грибовидный электрод на расстоянии 1-2 см медленными круговыми движениями перемещают вдоль морщин в направлении ото лба к спинке и крыльям носа и нижней челюсти, огибая угол рта и уплотнения тканей. Используют искровой разряд средней мощности. Продолжительность процедуры 5-12 минут. Ежедневно. По мере привыкания интенсивность и продолжительность увеличивается. Курс 8-12 процедур. Повторный курс можно назначить через месяц.
-Лазеротерапия «Рикта».
Косметические процедуры в области лица и шеи проводятся сканирующим методом вдоль линий на частоте 50 Гц.
Воздействие в области лица проводится в течение 10 минут, в области шеи 5 минут. Начинать сканирование необходимо с задней поверхности шеи по направлению к плечам и в область лопаток.
Следует обратить внимание на то, что при имеющемся заболевании щитовидной железы процедуры в области шеи противопоказаны.
Необходимо отметить, что все косметические процедуры нужно проводить на чистой, сухой коже до наложения кремов.
Противопоказано одновременное проведение лечения заболеваний волос и кожных покровов лица и шеи, т.к. общее время воздействия в области головы не должно превышать 10 минут.
-Витамин Е— электрофорез на область морщин. Один электрод размером 4х6 см смоченный в 0,5 мл 2% р-ра витамина Е , растворенного в 25% растворе ДМСО, помещают в области морщин на лице и соединяют с анодом (+), катод (-) размещают на заднешейный отдел. Сила тока 1-2 мА. Время 20 минут. Курс до 30 процедур. 2-3 раза в год.
-Лидаза-электрофорез, используют полумаску Бергонье с вырезанной по форме фильтровальной бумагой. Смачивают раствором лидазы (+) (0,1 г на 30 мл дистиллированной воды ,подкисленной до рН 5,0-5,2) помещают на одну половину лица, под бумагу смоченную водой и отжатую прокладку. Сила тока 3-5 мА. Время процедуры 15 минут. На следующий день на другой половине лица. Курс 18-20 процедур.
3.ВЫПАДЕНИЕ ВОЛОС,АЛОПЕЦИЯ:
-Дарсонвализация волосистой части головы, Используют гребешковый электрод, контактно, лабильно от лба к затылку. Мощность малая. Ежедневно или через день. Курс 15-20 процедур.
-Электрофорез кальция хлорида 5% (+) на шейно-воротниковую зону. Катод (-) на поясничной области. Сила тока 3-5 мА, время 15 минут. №10-12 ежедневно.
—ЛАЗЕРОТЕРАПИЯ «Рикта»:
Лечение проводится сканирующими движениями со скоростью 1 см в секунду с максимальным приближением излучателя к поверхности кожных покровов волосистой части головы (1).
Оптимальным при этом является использование излучателя типа ДУШ-2 (лазерная расческа). На правление движений представлены на рисунке . Все время воздействия в области головы не должно превышать 10 минут. Частота воздействия 1000 Гц.
В качестве дополнительной терапии необходимо проводить неинвазивное воздействие на кровь в области пульсации сонных артерий (2) по 2 минуты с каждой стороны на частоте. Для достижения желаемого эффекта необходимо проведение 3-6 курсов терапии по 15 сеансов в каждом.
-Электрофорез никотиновой кислоты 1% (-) на шейно-воротниковую зону. Анод (+) на поясничной области. Сила тока 3-5 мА, время 15 минут. №10-12 ежедневно.
4. ПИОДЕРМИЯ,АКНЕ:
Не используют при остром и осложненном течении заболевания.
-КУФ — локальное облучение.С 1 биодозы +1/2 биодозы до 2 биодоз, № 5 через день.
-Лечение акне должно проходить параллельно с Универсальной Реабилитационной Программой (УРП), так как это заболевание чаще является следствием гормональной перестройки.
После проведения УРП осуществляется местное лечение сканирующим методом над пораженными участками на частоте 50 Гц. Время воздействия: лицо — до 10 минут, грудь — 10 минут, спина — 10 минут. Необходимо проводить от одного до трёх курсов по 10-12 сеансов.
Терминология. Что такое электрофорез ?
Под электрофорезом понимают процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Многие биологически важные молекулы (белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и др.) имеют в своем составе ионизирующие группы. Поэтому в биологических жидкостях (крови, лимфе и др.) они существуют в виде катионов и анионов. Помимо этого, молекулы имеющие примерно одинаковый заряд могут отличаться молекулярными массами и отношением заряда к массе. На этих различиях и основано разделение ионов при движении их в растворе под действием электрического поля.
Скорость перемещения зависит от величины заряда, а также в ряде случаев, от размера и формы молекул. Так как в большинстве случаев молекулы отличаются по своим физическим и химическим свойствам, то очень немногие из них имеют одинаковую электрофоретическую подвижность. Скорость движения частиц (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью.
В зависимости от способа проведения электрофореза его делят на свободный или фронтальный, когда электрофоретическое разделение осуществляется в водной фазе и зональный, т.е. электрофорез на поддерживающей среде, когда разделение осуществляется на каком-либо инертном носителе (бумага, асбестовые пластины, целлюлоза, агаровый, крахмальный и полиакриламидный гели и др.).
Суть зонального электрофореза заключается в том, что раствор смеси веществ, подлежащих разделению вводят на определенный участок носителя, пропитанного электролитом. Биологический материал, подлежащий электрофоретическому разделению, растворяют или суспензируют в буфере, чтобы обеспечить проведение электрического тока, этим же буфером насыщают и носитель. В растворе между электродами ток обусловлен ионами буфера и образца, в остальной части цепи — электронами. После снятия электрического поля ионы исследуемой смеси распределятся в соответствии с их электрофоретической подвижностью. В клинико-лабораторных исследованиях чаще используется зональный электрофорез на агаре или полиакриламидном геле. При наложении электрического поля частицы подлежащей разделению смеси придут в состояние направленного движения (будут двигаться к противоположно заряженному полюсу) и распределятся на носителе в виде отчетливых зон, которые легко обнаружить соответствующим аналитическим методом.
Важными характеристиками процесса зонального электрофореза являются градиент потенциала (В/см) и сила тока, приходящаяся на 1 см поперечного сечения полосы (плотность тока — мА/см). Под градиентом потенциала понимают падение напряжения на 1 см носителя, расположенного между электродами. В зависимости от градиента потенциала различают низковольтный электрофорез (5-15 В/см) и высоковольтный (более 50 В/см). Низковольтный электрофорез используется для разделения высокомолекулярных соединений типа белков, липопротеинов, гликопротеинов и др. Высоковольтный электрофорез используется для разделения низкомолекулярных веществ, типа аминокислот, их производных и др. Так как различие в заряде и молекулярной массе у таких веществ невелико, то нужен большой градиент потенциала, чтобы произошло эффективное разделение частиц. Так как при этом происходит значительное разогревание носителя, требуются специальные устройства для его охлаждения.
В зависимости от целей исследования электрофорез делят на аналитический и препаративный. В клинико-биохимических исследованиях используют обычно аналитический электрофорез, который позволяет работать с очень небольшими количествами исследуемого вещества и вести их количественное определение. В тех случаях, когда требуется получить большое количество изучаемого вещества, необходимого для дальнейших исследований используют препаративный вариант электрофореза. Капиллярный электрофорез предполагает быстрое разделение с исключительной эффективностью и разрешением для аналитических задач, особенно когда возникают трудности при использовании жидкостной хроматографии.
Система капиллярного электрофореза показывает беспрецедентную ВЭЖХ — подобную чувствительность для широкого ряда аналитических задач. Преимущество капиллярного электрофореза в том, что для проведения различных методов разделения используется один прибор. Это делает капиллярный электрофорез очень гибким инструментом для широкого ряда различных применений при решении задач разделения.
В настоящее время для анализа биологических смесей все шире используется капиллярный электрофорез, при котором электрофоретическое разделение проводится в тонких капиллярах диаметром 25-200 мкм и длинной 10-100 см, заполненных буферным раствором. Под действием электрического поля (электрофорез проводится при напряжении 10000-30000 В) в капилляре создается электроосмотический поток, направленный к отрицательному полюсу, вместе с которым перемешаются и компоненты, подлежащие разделению. В зависимости от заряда и массы скорость их движения будет различной, что приводит к фракционированию смеси. В концевой точке капилляра разделенные компоненты количественно определяют, используя различные оптические детекторы Близким к электрофорезу является метод изоэлектрического фокусирования, когда разделение белков и некоторых других анализируемых веществ идет в зависимости от величины их изоэлектрических точек.
Изоэлектрической точкой называют такое состояние белковой молекулы, при котором ее суммарный заряд равен нулю. В методе изоэлектрического фокусирования вначале между электродами устанавливают градиент рН с помощью веществ особой химической природы, получивших название амфолитов-носителей. Заряженные молекулы белков в ходе опыта будут двигаться в направлении противоположно заряженного электрода в соответствии с их действительным зарядом. Так как молекулы белков амфотерны, то при перемещении в градиенте рН их суммарный заряд будет меняться до тех пор, пока он не станет равным 0. Это произойдет в том месте, где величина рН будет равна изоэлектрической точке. Поэтому молекулы с одинаковой изоэлектрической точкой сконцентрируются в одной узкой зоне.
Электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК
Abstract
Электрофорез в агарозном геле — наиболее эффективный способ разделения фрагментов ДНК различного размера от 100 до 25 т.п.н. 1 . Агароза выделена из водорослей родов Gelidium и Gracilaria и состоит из повторяющихся субъединиц агаробиозы (L- и D-галактозы) 2 . Во время гелеобразования полимеры агарозы нековалентно связываются и образуют сеть пучков, размер пор которых определяет свойства молекулярного сита геля.Использование электрофореза в агарозном геле произвело революцию в разделении ДНК. До внедрения агарозных гелей ДНК в первую очередь разделяли с использованием центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, которое давало лишь приблизительный размер. Чтобы отделить ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, ДНК загружают в предварительно залитые лунки геля и прикладывают ток. Фосфатный остов молекулы ДНК (и РНК) заряжен отрицательно, поэтому при помещении в электрическое поле фрагменты ДНК будут мигрировать к положительно заряженному аноду.Поскольку ДНК имеет однородное отношение массы к заряду, молекулы ДНК разделены по размеру в агарозном геле в таком порядке, что пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму ее молекулярной массы 3 . Ведущей моделью движения ДНК через агарозный гель является «смещенная рептация», когда передний край движется вперед и тянет остальную часть молекулы вдоль 4 . Скорость миграции молекулы ДНК через гель определяется следующим: 1) размером молекулы ДНК; 2) концентрация агарозы; 3) конформация ДНК 5 ; 4) приложенное напряжение, 5) присутствие бромистого этидия, 6) тип агарозы и 7) буфер для электрофореза.После разделения молекулы ДНК можно визуализировать в ультрафиолетовом свете после окрашивания соответствующим красителем. Следуя этому протоколу, учащиеся должны уметь: 1. Понимать механизм, с помощью которого фрагменты ДНК разделяются в гелевой матрице 2. Понимать, как конформация молекулы ДНК будет определять ее подвижность через гелевую матрицу 3. Определить раствор агарозы подходящая концентрация для их нужд 4. Приготовьте агарозный гель для электрофореза образцов ДНК 5. Установите аппарат для гель-электрофореза и источник питания 6.Выберите подходящее напряжение для разделения фрагментов ДНК. 7. Понять механизм, с помощью которого бромид этидия позволяет визуализировать полосы ДНК. 8. Определите размеры разделенных фрагментов ДНК.
Ключевые слова: Genetics, Issue 62, гель-электрофорез, агароза , Разделение ДНК, бромид этидия
Протокол
1. Приготовление геля
Взвешивают соответствующую массу агарозы в колбу Эрленмейера. Гели агарозы готовят с использованием процентного соотношения вес / объем.Концентрация агарозы в геле будет зависеть от размеров разделяемых фрагментов ДНК, причем большинство гелей находится в диапазоне от 0,5% до 2%. Объем буфера не должен превышать 1/3 вместимости колбы.
Добавьте рабочий буфер в колбу с агарозой. Вращайте, чтобы перемешать. Наиболее распространенными буферами для прогрева геля являются ТАЕ (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА) и ТВЭ (45 мМ трис-борат, 1 мМ ЭДТА).
Расплавить смесь агарозы / буфера. Чаще всего это делается путем нагревания в микроволновой печи, но можно также сделать это и над пламенем Бунзена.С интервалами в 30 с снимают колбу и перемешивают содержимое, пока оно хорошо перемешивается. Повторяйте до полного растворения агарозы.
Добавьте бромид этидия (EtBr) до концентрации 0,5 мкг / мл. В качестве альтернативы, гель можно также окрашивать после электрофореза в рабочем буфере, содержащем 0,5 мкг / мл EtBr, в течение 15-30 минут с последующим обесцвечиванием в рабочем буфере в течение равного промежутка времени.
Примечание. EtBr является подозреваемым канцерогеном и должен быть утилизирован в соответствии с правилами учреждения.При работе с гелями, содержащими EtBr, всегда следует носить перчатки. Доступны альтернативные красители для окрашивания ДНК; однако EtBr остается самым популярным из-за его чувствительности и стоимости.
Дайте агарозе остыть либо на столе, либо путем инкубации на водяной бане с температурой 65 ° C. В противном случае поднос с гелем будет деформироваться.
Поместите лоток для геля в литейный аппарат. В качестве альтернативы можно также заклеить открытые края лотка для геля, чтобы создать форму.Поместите соответствующую гребенку в гелевую форму, чтобы создать лунки.
Вылейте расплавленную агарозу в гелевую форму. Дайте агарозе остыть при комнатной температуре. Снимите гребешок и поместите гель в коробку для геля. Кроме того, гель можно завернуть в полиэтиленовую пленку и хранить при 4 ° C до использования (, рис. 1, ).
2. Установка гелевого аппарата и разделение фрагментов ДНК
Добавьте краситель в образцы ДНК, которые необходимо разделить ( Рис.2 ). Краситель с гелевой загрузкой обычно изготавливается с 6-кратной концентрацией (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина). Загрузка красителя помогает отследить, как далеко прошел образец ДНК, а также позволяет образцу погрузиться в гель.
Запрограммируйте источник питания на желаемое напряжение (1-5 В / см между электродами).
Добавьте достаточное количество рабочего буфера, чтобы покрыть поверхность геля. Важно использовать тот же рабочий буфер, который использовался для приготовления геля.
Подсоедините провода коробки с гелем к источнику питания. Включите источник питания и убедитесь, что гелевый бокс и источник питания работают.
Снимите крышку. Медленно и осторожно загрузите образец (ы) ДНК в гель ( рис. 3, ). Маркер подходящего размера ДНК всегда следует загружать вместе с экспериментальными образцами.
Установите крышку на коробку с гелем. Катод (черные выводы) должен быть ближе к лункам, чем анод (красные выводы).Дважды проверьте, что электроды вставлены в правильные гнезда источника питания.
Включите питание. Наносите гель, пока краситель не переместится на необходимое расстояние.
3. Наблюдение за разделенными фрагментами ДНК
После завершения электрофореза выключите источник питания и снимите крышку контейнера с гелем.
Извлеките гель из коробки с гелем. Слейте лишний буфер с поверхности геля. Поместите лоток для геля на бумажные полотенца, чтобы впитать лишний буферный раствор.
Удалите гель из лотка для геля и подвергните гель воздействию ультрафиолета. Чаще всего это делается с помощью системы гель-документации ( рис. 4, ). Полосы ДНК должны отображаться как оранжевые флуоресцентные полосы. Сделайте снимок геля ( рис. 5, ).
Утилизируйте гель и рабочий буфер надлежащим образом в соответствии с правилами учреждения.
4. Типичные результаты
Рисунок 5 представляет собой типичный результат после электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР.После разделения полученные фрагменты ДНК видны в виде четко определенных полос. Стандарт ДНК или лестницу следует разделять до такой степени, чтобы можно было эффективно определять размеры полос образца. В показанном примере фрагменты ДНК размером 765 п.н., 880 п.н. и 1022 п.н. разделяют на 1,5% агарозном геле вместе с 2-логарифмической лестницей ДНК.
Рисунок 1. Затвердевший гель агарозы после удаления гребня.
Рис. 2. Студентка добавляет краситель к своим образцам ДНК.
Рис. 3. Студент загружает образец ДНК в лунку геля.
Рисунок 4. Пример системы документации геля.
Рисунок 5. Изображение после электрофореза в геле. EtBr добавляли к гелю перед электрофорезом до конечной концентрации 0,5 мкг / мл с последующим разделением при 100 В в течение 1 часа. Гель подвергали воздействию ультрафиолета и фотографировали с помощью системы документирования геля.
Обсуждение
Электрофорез в агарозном геле оказался эффективным и действенным способом разделения нуклеиновых кислот.Высокая прочность геля агарозы позволяет работать с гелями с низким процентным содержанием для разделения больших фрагментов ДНК. Молекулярное просеивание определяется размером пор, образованных пучками агарозы 7 в гелевой матрице. Как правило, чем выше концентрация агарозы, тем меньше размер пор. Традиционные агарозные гели наиболее эффективны при разделении фрагментов ДНК размером от 100 до 25 т.п.н. Для разделения фрагментов ДНК размером более 25 т.п.н. потребуется использовать гель-электрофорез 6 в импульсном поле, который включает приложение переменного тока с двух разных направлений.Таким образом, фрагменты ДНК большего размера разделяются скоростью, с которой они переориентируются при изменении направления тока. Фрагменты ДНК размером менее 100 п.н. более эффективно разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В отличие от агарозных гелей, матрица полиакриламидного геля образуется в результате химической реакции, управляемой свободными радикалами. Эти более тонкие гели имеют более высокую концентрацию, работают вертикально и имеют лучшее разрешение. В современном секвенировании ДНК используется капиллярный электрофорез, при котором капиллярные трубки заполняются гелевой матрицей.Использование капиллярных трубок позволяет применять высокие напряжения, тем самым обеспечивая быстрое разделение фрагментов ДНК (и определение последовательности ДНК).
Агароза может быть модифицирована для создания агарозы с низкой температурой плавления путем гидроксиэтилирования. Агароза с низкой температурой плавления обычно используется, когда требуется выделение разделенных фрагментов ДНК. Гидроксиэтилирование снижает плотность упаковки агарозных пучков, эффективно уменьшая размер их пор 8 . Это означает, что фрагменту ДНК того же размера потребуется больше времени, чтобы пройти через легкоплавкий агарозный гель, в отличие от стандартного агарозного геля.Поскольку пучки связываются друг с другом посредством нековалентных взаимодействий 9 , можно повторно расплавить гель агарозы после того, как он застынет.
EtBr — наиболее распространенный реагент, используемый для окрашивания ДНК в агарозных гелях 10 . Под воздействием ультрафиолетового излучения электроны в ароматическом кольце молекулы этидия активируются, что приводит к высвобождению энергии (света), когда электроны возвращаются в основное состояние. EtBr работает, внедряясь в молекулу ДНК в зависимости от концентрации.Это позволяет оценить количество ДНК в любой конкретной полосе ДНК на основе ее интенсивности. Из-за его положительного заряда использование EtBr снижает скорость миграции ДНК на 15%. EtBr является подозреваемым мутагеном и канцерогеном, поэтому следует проявлять осторожность при обращении с агарозными гелями, содержащими его. Кроме того, EtBr считается опасными отходами и должен утилизироваться надлежащим образом. Альтернативные красители для ДНК в агарозных гелях включают SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet и Methyl Blue.Из них метиловый синий и кристально-фиолетовый не требуют воздействия на гель ультрафиолетового света для визуализации полос ДНК, тем самым снижая вероятность мутации, если требуется извлечение фрагмента ДНК из геля. Однако их чувствительность ниже, чем у EtBr. SYBR gold и SYBR green являются высокочувствительными УФ-зависимыми красителями с меньшей токсичностью, чем EtBr, но они значительно дороже. Более того, все альтернативные красители либо не работают, либо не работают при прямом добавлении в гель, поэтому гель необходимо будет подвергнуть последующему окрашиванию после электрофореза.Из-за стоимости, простоты использования и чувствительности EtBr по-прежнему остается предпочтительным красителем для многих исследователей. Однако в определенных ситуациях, например, когда удаление опасных отходов затруднено или когда молодые студенты проводят эксперимент, может быть предпочтительнее менее токсичный краситель.
Краски, используемые в гель-электрофорезе, служат трем основным целям. Сначала они увеличивают плотность образца, позволяя ему погрузиться в гель. Во-вторых, красители придают цвет и упрощают процесс загрузки. Наконец, красители перемещаются через гель со стандартной скоростью, что позволяет оценить расстояние, на которое мигрировали фрагменты ДНК.
Точные размеры разделенных фрагментов ДНК можно определить, построив логарифм молекулярной массы для различных полос стандарта ДНК в зависимости от расстояния, пройденного каждой полосой. Стандарт ДНК содержит смесь фрагментов ДНК заранее определенного размера, которые можно сравнить с неизвестными образцами ДНК. Важно отметить, что разные формы ДНК проходят через гель с разной скоростью. Суперспиральная плазмидная ДНК из-за своей компактной конформации движется через гель быстрее всего, за ним следует линейный фрагмент ДНК того же размера, а открытая круглая форма движется медленнее всего.
В заключение, с момента принятия агарозных гелей в 1970-х годах для разделения ДНК, он оказался одним из самых полезных и универсальных методов в исследованиях биологических наук.
Гель-электрофорез нуклеиновой кислоты— краткий обзор и история | Thermo Fisher Scientific
Гель-электрофорез — это распространенный лабораторный метод в молекулярной биологии для идентификации, количественного определения и очистки нуклеиновых кислот. Благодаря своей скорости, простоте и универсальности этот метод широко используется для разделения и анализа нуклеиновых кислот.Используя гель-электрофорез, нуклеиновые кислоты в диапазоне приблизительно 0,1-25 т.п.н. могут быть разделены для анализа в течение нескольких минут или часов, а разделенные нуклеиновые кислоты могут быть извлечены из гелей с относительно высокой чистотой и эффективностью [1,2].
Метод включает приложение электрического поля к смесям заряженных молекул, чтобы заставить их мигрировать в зависимости от размера, заряда и структуры через гелевую матрицу. Фосфатные группы рибозо-фосфатных скелетов нуклеиновых кислот заряжены отрицательно при pH от нейтрального до основного (, рис. 1A, ).Таким образом, каждый нуклеотид несет чистый отрицательный заряд, что означает, что общий заряд молекулы нуклеиновой кислоты пропорционален общему количеству нуклеотидов или ее массе. Другими словами, молекулы ДНК или РНК несут постоянное отношение заряда к массе. В результате их подвижность при гель-электрофорезе определяется в основном на основе размера, когда они имеют сопоставимую структуру (узнайте больше о том, как структура нуклеиновой кислоты влияет на миграцию). Следовательно, под воздействием электрического поля нуклеиновые кислоты мигрируют от отрицательного электрода (катода) к положительному электроду (аноду), причем более короткие фрагменты перемещаются быстрее, чем более длинные, что приводит к разделению в зависимости от размера ( Рисунок 1B ).
Рис. 1. (A) Чистые отрицательные заряды, переносимые цепью нуклеиновой кислоты. (B) Разделение фрагментов нуклеиновой кислоты различной длины в гель-электрофорезе.
Кроме того, расстояния миграции нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе обычно показывают предсказуемую корреляцию с их размерами, что позволяет рассчитать размер нуклеиновых кислот в данном образце. Для линейных двухцепочечных фрагментов ДНК расстояние миграции обратно пропорционально логарифму молекулярной массы в определенном диапазоне ( Рисунок 2A ) [3].Для приблизительного определения размеров расстояния миграции обычно сравнивают с образцами, содержащими молекулы известных размеров (стандарты молекулярной массы, иногда называемые «лестницами»), которые часто включают в прогон геля. Широко принятая модель подвижности нуклеиновых кислот через гель — это «смещенная рептация» — миграция, смещенная в сторону приложенной электрической силы и включающая извилистое движение, когда передний край тянет за собой все остальное ( Рисунок 2B, ) [4,5]. Эта модель была визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии [6].
Рисунок 2. Подвижность нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе. (A) Корреляция размера и миграции линейных двухцепочечных фрагментов ДНК. (B) Модель предвзятого репортажа.
Top
Использование электрофореза для разделения нуклеиновых кислот началось в начале 1960-х годов. В то время нуклеиновые кислоты обычно фракционировали центрифугированием в градиенте плотности на основе скоростей седиментации, которые определяются размером и конформацией нуклеиновых кислот.Центрифугирование в градиенте плотности потребовало значительного времени, тяжелого оборудования и большого количества образцов. В качестве альтернативы исследователи начали изучать характеристики подвижности ДНК в ионных или электролитических растворах при приложении электрического поля — процесс, названный электрофорезом [7,8].
В течение нескольких лет электрофорез нуклеиновых кислот превратился в использование гелевой матрицы в качестве среды для разделения, заимствуя технику, уже применяемую в электрофорезе белков.Агар (углевод естественного происхождения), агароза (компонент агара), полиакриламид (синтетический гель) и составные гели агароза-акриламид оказались успешными в качестве матриц для электрофореза ДНК и РНК в середине-конце 1960-х годов [ 9-11]. Результаты фракционирования этих ранних экспериментов по гель-электрофорезу показали корреляцию с коэффициентами седиментации или значениями S , полученными центрифугированием в градиенте плотности, установленным в то время методом разделения нуклеиновых кислот.С лучшим пониманием и прогрессом в производстве агарозы в конце 1960-х годов агароза постепенно заменила агар в качестве предпочтительной среды для гель-электрофореза [12].
Рис. 3. Хронология раннего развития гель-электрофореза нуклеиновых кислот.
В 1970-х годах использование гель-электрофореза для разделения и анализа нуклеиновых кислот стало более распространенным с открытием рестрикционных ферментов и их применением в технологии рекомбинантных ДНК.Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, распространенный в то время метод разделения, включало громоздкие процессы и не могло адекватно отличить фрагменты ДНК аналогичного размера от рестрикционного переваривания. Вязкость раствора использовалась эмпирически как индикатор успеха рестрикционного переваривания, так как расщепление ДНК от более крупных к более мелким фрагментам приводит к получению менее вязких растворов [13]. Клонирование фрагментов ДНК произвело революцию в 1971 году, когда Данна и Натанс впервые сообщили о калибровке рестрикционно-переваренных фрагментов ДНК SV40 с помощью электрофореза в полиакриламидном геле [14].Хотя агарозный и агарозо-полиакриламидный гели использовались для разделения РНК и одноцепочечной ДНК в конце 1960-х годов [15,16], работа по анализу рестрикционно-переваренных фрагментов с помощью электрофореза в агарозном геле s не была опубликована до 1973 года ( Рисунок 3 ) [17,18].
1970-е годы также принесли прорыв в способ обнаружения нуклеиновых кислот с помощью гель-электрофореза. Ранние методы электрофореза основывались на радиоактивном мечении нуклеиновых кислот для визуализации разделенных молекул.Несмотря на высокую чувствительность, протоколы радиоактивной маркировки длинны и требуют обучения в области радиационной безопасности. В 1972 году две лаборатории независимо друг от друга описали окрашивание геля флуоресцентной молекулой бромид этидия (EtBr), которое стало распространенным и более простым методом обнаружения нуклеиновых кислот с чувствительностью в несколько нанограмм двухцепочечной ДНК [19-21]. Сегодня доступны флуоресцентные красители, которые более безопасны, чувствительны и специфичны, чем EtBr, улучшая обнаружение нуклеиновых кислот после гель-электрофореза.
Как и с появлением EtBr, гель-электрофорез стал более полезным с появлением «пластинчатых» гелевых форматов примерно в 1970 году, что привело к появлению вездесущего оборудования, которое мы видим сегодня. Ранее исследования с помощью гель-электрофореза проводились с использованием пробирок-гелей , отлитых в стеклянные пробирки диаметром 1–3 мм. Это был метод с очень низкой производительностью, поскольку каждая пробирка могла вместить только один образец (, рис. 4A, ). Вертикальные гели для пластин (, рис. 4B, ), которые были намного проще в приготовлении и позволяли проводить одновременный анализ большего количества образцов, были впервые введены для полиакриламида в конце 1960-х и усовершенствованы Studier в начале 1970-х [22-24] .Горизонтальные плоские гели для агарозы (, фиг. 4C, ), аналогичные формату, используемому до сих пор, были впервые описаны McDonell et al. в 1977 г. [25]. Сегодня мини-сборные, готовые к использованию гели доступны как в полиакриламиде, так и в агарозе для более безопасного, быстрого и простого электрофореза в геле. Кроме того, в некоторых системах для гель-электрофореза используются готовые безбуферные гели, которые можно запустить всего за 10 минут. Их также можно комбинировать с цифровой визуализацией и анализом разделенных нуклеиновых кислот для более эффективного и удобного рабочего процесса.
Рис. 4. Распространенные форматы гелей для электрофореза.
В целом гель-электрофорез стал универсальным методом разделения нуклеиновых кислот в молекулярной биологии. Этот аналитический и препаративный метод не только является неотъемлемой частью общих рабочих процессов, таких как молекулярное клонирование и ПЦР, но также играет важную роль для разделения и анализа нуклеиновых кислот в новых технологиях, таких как редактирование генома и секвенирование следующего поколения.
Начало
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Электрофорез в наноканалах: краткий обзор и предположения | Журнал нанобиотехнологий
Гарсия А.Л., Иста Л.К., Петцев Д.Н., О’Брайен М.Дж., Бисонг П., Маммоли А.А., Брюк С.Р.Дж., Лопес Г.П.: Электрокинетическое разделение молекул в наноразмерных жидкостных каналах. Лаборатория на чипе. 2005, 5 (11): 1271-1276. 10.1039 / b503914b.
CAS Статья Google Scholar
Stein D, Kruithof M, Dekker C: поверхностный перенос ионов в наножидкостных каналах. Письма с физическим обзором. 2004, 93 (3): 035901-10.1103 / PhysRevLett.93.035901.
Артикул Google Scholar
Pennathur S, Santiago JG: Электрокинетический перенос в наноканалах. 2. Эксперименты. Anal Chem. 2005, 77 (21): 6782-6789. 10.1021 / ac0508346.
CAS Статья Google Scholar
Pennathur S, Santiago JG: Электрокинетический перенос в наноканалах. 2. Эксперименты (том 77, стр. 6782, 2005 г.). Аналитическая химия. 2006, 78 (3): 972-972.
Google Scholar
Хибара А., Сайто Т., Ким Х. Б., Токеши М., Оои Т., Накао М., Китамори Т.: Наноканалы на микрочипе из плавленого кварца и исследование свойств жидкости с помощью измерений флуоресценции с временным разрешением. Аналитическая химия. 2002, 74 (24): 6170-6176. 10.1021 / ac025808b.
CAS Статья Google Scholar
Лю С.Р., Пу QS, Гао Л., Корзеневский С., Мацке С.: От усиления протонной проводимости, индуцированной наноканалом, к топливному элементу на основе наноканала.Нано-буквы. 2005, 5 (7): 1389-1393. 10.1021 / nl050712t.
CAS Статья Google Scholar
Plecis A, Schoch RB, Renaud P: Явления ионного переноса в наножидкости: экспериментальное и теоретическое исследование эффекта исключения-обогащения на чипе. Нано-буквы. 2005, 5 (6): 1147-1155. 10.1021 / nl050265h.
CAS Статья Google Scholar
Ван Ю.К., Стивенс А.Л., Хан Дж.Й.: Концентрирование белков и пептидов в миллион раз с помощью наножидкостного фильтра.Аналитическая химия. 2005, 77 (14): 4293-4299. 10.1021 / ac050321z.
CAS Статья Google Scholar
Mijatovic D, Eijkel JCT, van den Berg A: Технологии для наножидкостных систем: сверху вниз или снизу вверх — обзор. Лаборатория на чипе. 2005, 5 (5): 492-500. 10.1039 / b416951d.
CAS Статья Google Scholar
Burgreen D, Nakache FR: Электрокинетический поток в ультратонких капиллярных щелях.Журнал физической химии. 1964, 68 (5): 1084-1091.
Артикул Google Scholar
Hildreth D: Электрокинетический поток в тонких капиллярных каналах. Журнал физической химии. 1970, 74 (9): 2006-2015. 10.1021 / j100704a031.
CAS Статья Google Scholar
Rice CL, Whitehead R: Электрокинетический поток в узком цилиндрическом капилляре.Журнал физической химии. 1965, 69 (11): 4017-4024.
CAS Статья Google Scholar
Левин С., Марриотт Дж., Нил Г., Эпштейн Н.: Теория электрокинетического потока в тонких цилиндрических капиллярах при высоких дзета-потенциалах. Журнал коллоидной и интерфейсной науки. 1975, 52 (1): 136-149. 10.1016 / 0021-9797 (75)
-0.Артикул Google Scholar
Левин С., Марриотт Дж. Р., Робинсон К. Теория электрокинетического потока в узком канале с параллельными пластинами. Журнал Химического общества — Труды Фарадея II. 1975, 71 (1): 1-11. 10.1039 / f29757100001.
CAS Статья Google Scholar
Zheng Z, Hansford DJ, Conlisk AT: Влияние многовалентных ионов на электроосмотический поток в микро- и наноканалах. Электрофорез. 2003, 24 (17): 3006-3017. 10.1002 / elps.200305561.
CAS Статья Google Scholar
Tessier F, Slater GW: Эффективная длина Дебая в закрытых наноскопических системах: конкуренция между двумя масштабами длины. Электрофорез. 2006, 27 (3): 686-693. 10.1002 / elps.200500457.
CAS Статья Google Scholar
van der Heyden FHJ, Stein D, Dekker C: Потоковые токи в одном наножидкостном канале.Письма с физическим обзором. 2005, 95 (11): 116104-10.1103 / PhysRevLett.95.116104.
Артикул Google Scholar
Петерсон Н., Алари Дж. П., Рэмси Дж. М.: Транспорт полиэлектролита в наноконфликтных каналах: 2003; Скво-Вэлли, Калифорния, под редакцией: Нортруп А. 2003, Kluwer Academic, 1:
Google Scholar
Хантер Р.Дж .: Дзета-потенциал в принципах и приложениях коллоидной науки.ZETA POTENTIAL COLLO. Под редакцией: Press A. 1981, 400-
Google Scholar
Ajdari A, Bontoux N, Stone HA: Гидродинамическая дисперсия в мелких микроканалах: влияние формы поперечного сечения. Аналитическая химия. 2006, 78: 387-392. 10.1021 / ac0508651.
CAS Статья Google Scholar
Рассел В. Б., Сэвилл Д. А., Шовальтер В. Р.: Коллоидные дисперсии.1989, Кембридж; Нью-Йорк, Cambridge University Press, 525-
Глава Google Scholar
Газ Б, Стедри М., Кенндлер Э: Уширение пиков при электрофорезе капиллярной зоны. Электрофорез. 1997, 18 (12-13): 2123-2133. 10.1002 / elps.1150181203.
CAS Статья Google Scholar
Датта Р., Котамарти В.Р .: Электрокинетическая дисперсия в капиллярном электрофорезе.Журнал Айче;. 1990, 36 (6): 916-926. 10.1002 / aic.6
CAS Статья Google Scholar
Ghosal S: Гидравлическая механика электроосмотического потока и ее влияние на уширение полосы при капиллярном электрофорезе. Электрофорез. 2004, 25 (2): 214-228. 10.1002 / elps.200305745.
CAS Статья Google Scholar
Schure MR, Lenhoff AM: Последствия адсорбции стенки в капиллярном электрофорезе — теория и моделирование.Аналитическая химия. 1993, 65 (21): 3024-3037. 10.1021 / ac00069a015.
CAS Статья Google Scholar
Мартин М., Гиошон Дж .: Осевая дисперсия в открытой капиллярной жидкостной хроматографии с электроосмотическим потоком. Аналитическая химия. 1984, 56 (4): 614-620.
CAS Статья Google Scholar
Мартин М., Гиошон Г., Уолбройл И., Йоргенсон Дж. У.: Уширение пика в открытой трубчатой жидкостной хроматографии с электроосмотическим потоком.Аналитическая химия. 1985, 57 (2): 559-561. 10.1021 / ac50001a052.
CAS Статья Google Scholar
Holzwarth G: Изменение толщины канала может ухудшить разрешение при электрофорезе. Электрофорез. 1996, 17 (10): 1587-1589. 10.1002 / elps.1150171016.
CAS Статья Google Scholar
Ленхофф AM: Вклад свойств поверхности в электростатические свойства грубых коллоидных частиц.Коллоиды и поверхности a-Физико-химические и инженерные аспекты. 1994, 87 (1): 49-59. 10.1016 / 0927-7757 (94) 02738-2.
CAS Статья Google Scholar
Ajdari A, Prost J: Электрофорез в свободном потоке с захватом поперечным неоднородным полем. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 1991, 88 (10): 4468-4471. 10.1073 / pnas.88.10.4468.
CAS Статья Google Scholar
Васидзу М., Сузуки С., Куросава О., Нисизака Т., Шинохара Т.: Молекулярный диэлектрофорез биополимеров. Ieee транзакции в отраслевых приложениях. 1994, 30 (4): 835-843. 10.1109 / 28.297897.
CAS Статья Google Scholar
Leinweber FC, Pfafferodt M, Seidel-Morgenstern A, Tallarek U: Электрокинетические эффекты на транспорт заряженных аналитов в бипористых средах с дискретными ионно-селективными областями. Аналитическая химия.2005, 77 (18): 5839-5850. 10.1021 / ac050609o.
CAS Статья Google Scholar
Pu QS, Юн Дж.С., Темкин Х., Лю С.Р .: Эффект ионного обогащения и ионного истощения наноканальных структур. Нано-буквы. 2004, 4 (6): 1099-1103. 10.1021 / nl0494811.
CAS Статья Google Scholar
Smeets RMM, Keyser UF, Krapf D, Wu MY, Dekker NH, Dekker C: Солевая зависимость ионного транспорта и транслокации ДНК через твердотельные нанопоры.Нано-буквы. 2006, 6 (1): 89-95. 10.1021 / nl052107w.
CAS Статья Google Scholar
Pennathur S, Santiago JG: Электрокинетический перенос в наноканалах. 1. Теория. Anal Chem. 2005, 77 (21): 6772-6781. 10.1021 / ac050835y.
CAS Статья Google Scholar
Pennathur S, Santiago JG: Электрокинетический перенос в наноканалах. 1. Теория (том 77, стр. 6772, 2005).Аналитическая химия. 2006, 78 (3): 972-972.
Google Scholar
Pennathur S, Baldessari F, Kattah M, Utz PJ, Santiago JG: Электрофорез в наноканалах: 17-20 июля 2006 г .; Майами, Флорида. Совместное американско-европейское летнее совещание по инженерии жидкостей ASME; 17-20 июля 2006 г .; Майами, Флорида. 2006,
Google Scholar
Viovy JL: Электрофорез ДНК и других полиэлектролитов: Физические механизмы.Rev Mod Phys. 2000, 72 (3): 813-872. 10.1103 / RevModPhys.72.813.
CAS Статья Google Scholar
Остин Р. Х., Броуди Дж. П., Кокс Э. К., Дюк Т., Волькмут В. Гены растяжения. Физика сегодня. 1997, 50 (2): 32-38.
CAS Статья Google Scholar
Чан Э.Ю.: Достижения в технологии секвенирования. Мутационные исследования. 2005, А / Я 211, 1000 AE, АМСТЕРДАМ, НИДЕРЛАНДЫ, ELSEVIER SCIENCE BV, 573 (1-2): 13-40.
Google Scholar
Коллинз Ф.С., Морган М., Патринос А: Проект генома человека: уроки крупномасштабной биологии. Наука. 2003, 1200 NEW YORK AVE, NW, WASHINGTON, DC 20005 USA, AMER ASSOC ADVANCEMENT SCIENCE, 300 (5617): 286-290. 10.1126 / science.1084564.
Google Scholar
Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, Smith HO, Yandell M, Evans CA, Holt RA, Gocayne JD, Amanatides P, Ballew RM, Huson DH, Wortman JR , Zhang Q, Kodira CD, Zheng XQH, Chen L, Skupski M, Subramanian G, Thomas PD, Zhang JH, Miklos GLG, Nelson C, Broder S, Clark AG, Nadeau C, McKusick VA, Zinder N, Levine AJ, Робертс Р.Дж., Саймон М., Слейман С., Хункапиллер М., Боланос Р., Делчер А., Дью I, Фасуло Д., Фланиган М., Флореа Л., Халперн А., Ханненхалли С., Кравиц С., Леви С., Мобарри С., Райнерт К., Ремингтон К., Абу-Трейде Дж., Бизли Э., Биддик К., Бонацци В., Брэндон Р., Каргилл М., Чандрамулисваран И., Чарлаб Р., Чатурведи К., Денг З. М., Ди Франческо В., Данн П., Эйлбек К., Евангелиста К., Габриэлиан А. Э., Ган В. , Ge WM, Gong FC, Gu ZP, Guan P, Heiman TJ, Higgins ME, Ji RR, Ke ZX, Ketchum KA, Lai ZW, Lei YD, Li ZY, Li JY, Liang Y, Lin XY, Lu F, Merkulov GV, Milshina N, Moore HM, Naik AK, Narayan VA, Neelam B., Nusskern D, Rusch DB, Salzberg S, Shao W., Shue BX, Sun JT, Wang ZY, Wang AH, Wang X, Wang J, Wei MH, Wides R, Xiao CL, Yan CH, Yao A, Ye J, Zhan M, Zhang WQ, Zhang HY, Zhao Q, Zheng LS, Zhong F, Чжун В.Й., Чжу SPC, Чжао С.Ю., Гилберт Д., Баумхуэтер С., Спир Дж., Картер С., Кравчик А., Вудедж Т., Али Ф., Ан Х. Дж., Трепет А., Болдуин Д., Баден Х, Барнстед М., Барроу I, Бисон К. , Busam D, Carver A, Center A, Cheng ML, Curry L, Danaher S, Davenport L, Desilets R, Dietz S, Dodson K, Doup L, Ferriera S, Garg N, Gluecksmann A, Hart B, Haynes J, Haynes C, Хайнер С., Хладун С., Хостин Д., Хоук Дж., Хауленд Т., Ибегвам С., Джонсон Дж., Калуш Ф., Клайн Л., Кодуру С., Лав А., Манн Ф., Мэй Д., МакКоули С., Макинтош Т., МакМаллен И., Мой М., Мой Л., Мерфи Б., Нельсон К., Пфаннкоч К., Праттс Е., Пури В., Куреши Х., Рирдон М., Родригес Р., Роджерс Ю. Х., Ромблад Д., Руфель Б., Скотт Р., Ситтер С., Смоллвуд М., Стюарт И. , Strong R, Suh E, Thomas R, Tint NN, Tse S, Vech C, Wang G, Wetter J, Williams S, Williams M, Windsor S, Winn-Deen E, Wolfe K, Zaveri J, Zaveri K, Abril JF , Guigo R, Кэмпбелл MJ, Sjo посадочный модуль KV, Karlak B, Kejariwal A, Mi HY, Lazareva B, Hatton T, Narechania A, Diemer K, Muruganujan A, Guo N, Sato S, Bafna V, Istrail S, Lippert R, Schwartz R, Walenz B, Yooseph S , Аллен Д., Басу А., Баксендейл Дж., Блик Л., Каминья М., Карнес-Стайн Дж, Колк П., Чианг Ю. Х., Койн М., Дальке С., Мейс А. Д., Домброски М., Доннелли М., Эли Д., Эспархам С., Фослер С. , Гир Х, Глановски С., Глассер К., Глодек А., Горохов М., Грэм К., Гропман Б., Харрис М., Хейл Дж., Хендерсон С., Гувер Дж., Дженнингс Д., Джордан С., Джордан Дж., Каша Дж., Каган Л., Крафт C, Левицкий А., Льюис М., Лю XJ, Лопес Дж., Ма Д., Майорос В., МакДэниэл Дж., Мерфи С., Ньюман М., Нгуен Т., Нгуен Н., Ноделл М., Пэн С., Пек Дж., Петерсон М., Роу В., Сандерс Р., Скотт Дж., Симпсон М., Смит Т., Спраг А., Стоквелл Т., Тернер Р., Вентер Э, Ван М., Вэнь М.Ю., Ву Д., Ву М., Ся А., Зандие А., Чжу XH: последовательность человека геном.Наука. 2001, 291 (5507): 1304-1351. 10.1126 / science.1058040.
CAS Статья Google Scholar
McDonell MW, Simon MN, Studier FW: Анализ рестрикционных фрагментов ДНК T7 и определение молекулярных масс электрофорезом в нейтральных и щелочных гелях. Журнал молекулярной биологии. 1977, 110 (1): 119-146. 10.1016 / S0022-2836 (77) 80102-2.
CAS Статья Google Scholar
Лин Ю.В., Хуанг М.Ф., Чанг Х.Т .: Наноматериалы и наноструктуры на основе чипов для капиллярного электрофоретического разделения ДНК. Электрофорез. 2005, 26 (2): 320-330. 10.1002 / elps.200406171.
CAS Статья Google Scholar
Хан Дж., Крейгхед Х.Г.: Разделение длинных молекул ДНК в микроизготовленном массиве энтропийных ловушек. Наука. 2000, 288 (5468): 1026-1029. 10.1126 / science.288.5468.1026.
CAS Статья Google Scholar
Мутукумар М, Баумгартнер А: Влияние энтропийных барьеров на динамику полимеров. Макромолекулы. 1989, 22 (4): 1937-1941. 10.1021 / ma00194a070.
CAS Статья Google Scholar
Turner SWP, Cabodi M, Craighead HG: Энтропийная отдача одиночных молекул ДНК в наножидкостной структуре, вызванная ограничением свободы. Письма с физическим обзором. 2002, 88 (12): 128103-10.1103 / PhysRevLett.88.128103.
CAS Статья Google Scholar
Cabodi M, Chen YF, Turner SWP, Craighead HG, Austin RH: Непрерывное разделение биомолекул с помощью латерально асимметричной диффузионной матрицы с вводом пробы вне плоскости. Электрофорез. 2002, 23 (20): 3496-3503. 10.1002 / 1522-2683 (200210) 23:20 <3496 :: AID-ELPS3496> 3.0.CO; 2-9.
CAS Статья Google Scholar
Пател П.Д., Шакфе ESG: компьютерное исследование разделения ДНК в редких неупорядоченных и периодических массивах столбиков.Журнал химической физики. 2003, 118 (6): 2941-2951. 10.1063 / 1.1532729.
CAS Статья Google Scholar
Хаммонд Р. В., Бадер Дж. С., Хенк С. А., Дим М. В., Макдермотт Г. А., Бустилло Дж. М., Ротберг Дж. М.: Дифференциальный перенос ДНК с помощью устройства исправленного броуновского движения. Электрофорез. 2000, 21 (1): 74-80. 10.1002 / (SICI) 1522-2683 (20000101) 21: 1 <74 :: AID-ELPS74> 3.0.CO; 2-K.
CAS Статья Google Scholar
Huang LR, Cox EC, Austin RH, Sturm JC: Непрерывное отделение частиц посредством детерминированного бокового смещения. Наука. 2004, 304 (5673): 987-990. 10.1126 / science.1094567.
CAS Статья Google Scholar
Chou CF, Bakajin O, Turner SWP, Duke TAJ, Chan SS, Cox EC, Craighead HG, Austin RH: Сортировка по диффузии: асимметричная полоса препятствий для непрерывного молекулярного разделения. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1999, 96 (24): 13762-13765. 10.1073 / pnas.96.24.13762.
CAS Статья Google Scholar
Huang LR, Tegenfeldt JO, Kraeft JJ, Sturm JC, Austin RH, Cox EC: ДНК-призма для высокоскоростного непрерывного фракционирования больших молекул ДНК. Природа Биотехнологии. 2002, 20 (10): 1048-1051. 10.1038 / nbt733.
CAS Статья Google Scholar
Меллер А., Нивон Л., Брантон Д.: Управляемые напряжением транслокации ДНК через нанопоры.Письма с физическим обзором. 2001, 86 (15): 3435-3438. 10.1103 / PhysRevLett.86.3435.
CAS Статья Google Scholar
Хенриксон С.Е., Мисакян М., Робертсон Б., Касьянович Дж. Дж.: Управляемый транспорт ДНК в асимметричную пору нанометрового масштаба. Письма с физическим обзором. 2000, 85 (14): 3057-3060. 10.1103 / PhysRevLett.85.3057.
CAS Статья Google Scholar
Сунг В., Пак П.Дж.: Транслокация полимера через поры в мембране. Письма с физическим обзором. 1996, 77 (4): 783-786. 10.1103 / PhysRevLett.77.783.
CAS Статья Google Scholar
Кумар К.К., Себастьян К.Л.: перемещение цепной молекулы через поры с помощью адсорбции. Physical Review E. 2000, 62 (5): 7536-7539. 10.1103 / PhysRevE.62.7536.
Артикул Google Scholar
Чуанг Дж, Кантор Й, Кардар М: Аномальная динамика транслокации. Physical Review E. 2002, 65 (1): 011802-10.1103 / PhysRevE.65.011802.
Артикул Google Scholar
Fu JP, Mao P, Han JY: Чип матрицы нанофильтров для быстрого разделения биомолекул без геля. Письма по прикладной физике. 2005, 87 (26): 263902-10.1063 / 1.2149979.
Артикул Google Scholar
Улучшенный электрофорез ДНК в условиях, благоприятствующих полиборатам и комплексообразованию с кислотой Льюиса
Abstract
Пространственная компрессия между более длинными фрагментами ДНК происходит во время электрофореза ДНК в агарозном и неагарозном гелях при использовании определенных ионов в проводящем буфере, нарушая диапазон размеров фрагментов, хорошо разрешаемых в одном геле.Замены с использованием различных полигидроксильных анионов подтверждают лежащий в основе феномен комплексообразования кислот Льюиса с ДНК. Мы наблюдали значительные улучшения при использовании условий (катионы бората лития, 10 мМ, pH 6,5), способствующих образованию боратных полианионов и имеющих более низкую проводимость и джоулева нагрев, замедленное исчерпание электролита, более высокую скорость электрофоретического анализа и более четкое разделение полос ДНК от 100 пар оснований до 12. kb за один проход.
Образец цитирования: Singhal H, Ren YR, Kern SE (2010) Улучшенный электрофорез ДНК в условиях, благоприятствующих образованию полиборатов и комплексов с кислотой Льюиса.PLoS ONE 5 (6): e11318. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011318
Редактор: Ричард Кордо, Университет Пуатье, Франция
Поступила: 9 апреля 2010 г .; Одобрена: 7 июня 2010 г .; Опубликован: 25 июня 2010 г.
Авторские права: © 2010 Singhal et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения CA62924 и исследовательской стипендией Марджори Ковлер. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: SEK регулируется политикой в отношении конфликта интересов Медицинской школы Университета Джона Хопкинса. Раскрытие информации автором вытекает из прав, которые он может иметь в отношении интеллектуальной собственности, касающейся электрофоретических проводящих сред, и как владелец компании Faster Better Media LLC, которой эти права были переданы.Некоторые электрофоретические среды описаны в патентах США No. 7,163,610. Этот конфликт не влияет на соблюдение авторами всех политик PLoS One в отношении обмена данными и материалами.
Введение
ДНК-электрофорез, возможно, является наиболее часто выполняемым молекулярным анализом за последние пятьдесят лет. Это полезно для картирования рестрикционных ферментов, анализа последовательностей, подтверждения конструирования плазмид и продуктов ПЦР, разделения для саузерн-блоттинга и различных других «последующих» методик.
Этот метод изначально был заимствован из методов белков и РНК, а не был разработан в первую очередь путем разработки оптимизированных методов [1]. Обычно в нем используются неоптимальные буферы, имеющие высокую ионную силу, проводимость и напряженность электрического поля. Чрезмерный джоулев нагрев ограничивает допустимое приложенное напряжение и скорость электрофоретического разделения.
Недавние модификации электрофореза ДНК исключили ЭДТА натрия и заменили трис катионами щелочных металлов.Литий был предпочтительнее других катионов щелочных металлов из-за его большой гидратной оболочки и низкой электрокинетической подвижности, которые обеспечивали более низкую проводимость, улучшенную устойчивость к приложенному напряжению, меньшее тепловыделение и улучшенное качество разделения. По сравнению с трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) среда с ионами щелочных металлов снижает проводимость, снижает конечную рабочую температуру и сокращает время электрофоретического разделения [2].
Эти системы еще не оптимальны, так как улучшения за счет анионных замен еще не исследовались.Большинство анионов при обычных концентрациях генерируют чрезмерный ток и тепло и окисляются на аноде, нарушая целостность буфера. Кроме того, для любого конкретного аниона свойства ДНК-электрофореза варьируются в зависимости от диапазона разделяемых длин фрагментов ДНК [1]. Например, в обычных пластинчатых гелях с использованием 1% агарозы в однородном электрическом поле ацетат-анион разделяет полосы ДНК в диапазоне от 1 до 12 т.п. К сожалению, ацетатные гели имеют неприемлемо плохое разделение и нечеткие полосы в диапазоне менее 500 п.н., причем эта тенденция ухудшается с более мелкими фрагментами в этом диапазоне.С другой стороны, моноборат-анион подходящим образом разрешает полосы ДНК ниже 1,5 т.п.н., но вызывает сжатие фрагментов ДНК выше примерно 1,5 т.п.н., недостаток, который прогрессивно ухудшается при большей длине. Сочетание ацетата с боратом сохраняет недостатки обоих. Механизм сжатия пока неясен, хотя его связывают с образованием борат-образующих комплексов с фосфодиэфирным остовом ДНК [3]. Это подтверждается наблюдениями за уменьшением компрессии ДНК при капиллярном электрофорезе с использованием очень высоких концентраций бората, а также известными комплексами, образованными между гидроксилированными частицами бора и вицинальными (соседними) гидроксильными группами на углеводах [4] — [6].Поскольку такое сжатие воздействует на гели, образованные из агарозы (содержащей вицинальные гидроксильные группы, взаимодействующие с боратами [5], [6]) и неагарозных гелей, таких как полиакриламид (без таких гидроксилов), вицинальные гидроксилы молекулы ДНК подозреваются как первичный реагент, когда борат не является ограничивающим (как в «подводном» гель-электрофорезе и когда гели предварительно прогоняются в избыточном буфере). Сообщается, что в условиях ограниченного содержания бората (капиллярный электрофорез) агароза конкурирует за связывание, делая взаимодействие с агарозой доминирующим над взаимодействием с ДНК [6].В идеале можно предпочесть корректирующую альтернативу, применяемую как к гелю, так и к ДНК.
В настоящее время существуют недостатки различных расширенных методов, используемых в агарозных гелях для лучшего разрешения полос ДНК. Электрофорез с инверсией поля требует специального оборудования и занимает много времени. Специальные гелевые матрицы, такие как полиакриламид и химически модифицированная агароза, предлагают ограниченные улучшения для особых ситуаций, улучшая оптические качества, лучше рассеивая джоулев нагрев, фокусируя происхождение ДНК и позволяя более короткие прогоны.Варьируя содержание агарозы в геле, достигается лучшее разрешение только для ограниченного диапазона размеров фрагментов, с ухудшением разрешения в других диапазонах размеров. Увеличение концентрации борат-иона было исследовано в капиллярном электрофорезе для насыщения родственных партнеров бората в комплексообразовании [3]; было показано, что он снижает эффект сжатия капиллярных разделений на основе TBE, но приводит к нежелательному увеличению проводимости и джоулева нагрева. Такие подходы непрактичны для плоских гелей по сравнению с капиллярным электрофорезом, поскольку плоские гели имеют относительно меньшую площадь поверхности для рассеивания тепла.
Основы наших экспериментов
Гидроксильные группы в фосфодиэфирном остове ДНК действуют как основание Льюиса общего типа и образуют комплексы кислоты Льюиса с электронодефицитными атомами в анионных соединениях. Другими словами, гидроксильные группы (кислотные основания Льюиса) имеют электронные пары, доступные для передачи электронно-желательным химическим соединениям (кислотам Льюиса), что дает возможность для образования новых комплексов между ДНК и другими растворенными компонентами раствора. По сравнению с более мелкими фрагментами ДНК, более крупные фрагменты ДНК с большей вероятностью участвуют в переходных внутримолекулярных комплексах между видами бора и не вицинальными фосфатными группами (возможно, расположенными далеко друг от друга вдоль основной цепи ДНК), таким образом изменяя вторичную структуру ДНК так, чтобы она имитировала меньшая кажущаяся длина во время отделения геля, рис. 1A и 1B.Такие искаженные фрагменты ДНК будут мигрировать быстрее, чем линейные, вызывая сжатие полос ДНК с более высокой молекулярной массой, которое наблюдается в этих гелях. Любые улучшения, связанные с взаимодействием вицинальных гидроксильных групп ДНК с другими видами (такими как растворенные анионы, которыми можно легко манипулировать), вероятно, аналогичным образом улучшат взаимодействия с аналогичными гидроксильными группами агарозных матриц (которые было бы труднее модифицировать напрямую, но имели большое значение в различных гелевых составах).Таким образом, мы отслеживали улучшения в электрофорезе ДНК с использованием гелей агарозных пластин.
Рис. 1. Основные предпосылки экспериментов и сравнения различных полиборатов.
(a) Образование внутримолекулярного комплекса кислоты Льюиса между борными частицами и невицинальными фосфатными группами, расположенными далеко друг от друга на основной цепи ДНК, приводит к меньшей кажущейся длине геля. Структурная диаграмма области одной нити дуплексной ДНК и уменьшенная схематическая иллюстрация двух дуплексных фрагментов ДНК иллюстрируют молекулярные и топологические последствия комплексообразования.Дополнительные комплексы, не изображенные здесь, образуются за счет гидроксильных групп в агарозных матрицах; в таких гелях ожидаются комплексы ДНК-борат-агароза. (b) Насыщение основной цепи ДНК частицами бора предотвращает внутримолекулярное комплексообразование с кислотой Льюиса. (c) Полибораты образуются при высоких концентрациях борной кислоты. Отношение массы к заряду увеличивается, а электромобильность уменьшается (обозначено стрелкой вверх) с увеличением количества боратов в каждом комплексе.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011318.g001
Результаты
Относительное расстояние между полосой 12 т.п.н. и полосами среднего диапазона, например полосой 1,6 или 4 т.п.н., было больше для всех испытанных слабых кислот Льюиса по сравнению с различными сильными кислотами Льюиса. Соответственно, относительное разделение между полосой от 1 до 200 пар оснований было меньше для слабых кислот Льюиса, фигура 2A. Качество разделения количественно оценивали с помощью коэффициентов сжатия (определенных в разделе «Материалы и методы»), рисунок 3A. Более высокие коэффициенты подразумевали большее сжатие.
Рисунок 2. Доказательства комплексообразования с кислотой Льюиса и улучшенный боратный электрофорез при pH 6,5.
Фрагменты ДНК размером 4 т.п.н., 1 т.п.н. и 200 п.н. отмечены стрелками, приближающимися к передним краям полос, а полоса 12 т.п.н. отмечена в центре отстающей кромки. Размеры всех фрагментов лестницы были: 100, 200, 300, 400, 500, 650, 850, 1000, 1650 и от 2000 до 12000 с шагом 1000 bp. (а) Электрофоретическое разделение анионов с различным характером кислоты Льюиса.(b) Разделение с использованием боратов при различных pH, учитывая постоянную миграцию полосы 200 п.н. (c) Разделение (в 2% агарозе) полос от 100 до 1000 пар оснований в борате с pH 6,5.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011318.g002
Рис. 3. Коэффициенты сжатия для протестированных анионов и сравнение боратных буферов при различных значениях pH.
(a) Степени сжатия для различных анионов и боратов при разном pH. Для аналогичных соединений германия наклон над их данными показывает, что гидроксид, как ожидается, будет иметь более сильный характер кислоты Льюиса.Для серии карбоновых кислот с возрастающей линейной цепью (формиат, ацетат, пропионат) кривые над их данными аналогичным образом показывают, что формиат имеет наивысший, а ацетат — второй по величине ожидаемый характер кислоты Льюиса среди этой серии. Линейные изменения не относятся к другим данным гистограммы. (b) Проводимость буфера как функция времени, измеренная как ток при постоянном напряжении 350 В. (c) Температура в анодной камере как функция времени. (d) Скорость электрофоретической обработки, представленная как расстояние, пройденное от скважины на 12 kb и 1.Полосы 6 kb за 80 минут.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011318.g003
В надежде, что лучшие электрофоретические свойства бората (гидроксида бора) могут быть разделены между несколькими растворимыми анионными гидроксидами соседних элементов в В периодической таблице мы исследовали коммерчески доступные окисленные соединения углерода, германия и фосфора при различных значениях pH. Неорганические анионы были теоретически привлекательными из-за их химической стабильности (органические анионы, такие как ацетат, будут разлагаться окислительно при контакте с анодом, в то время как простые неорганические гидроксиды в целом, как ожидается, останутся неизменными).Формиат имел более высокую степень сжатия (= 4,1) по сравнению с ацетатом (= 3,6), которая, в свою очередь, была выше, чем у пропионата (= 3,3). Тетраметоксид германия, Ge (OCH 3 ) 4 , имел улучшенное разделение со степенью сжатия (= 5,75) ниже, чем гидроксид германия, Ge (OH) 4 (= 12). Фосфатный буфер имел разделение, сравнимое с формиатом (= 4,2), но, к сожалению, имел умеренно высокую проводимость и быстрое джоулева нагревание. Характеристики большинства буферов не претерпели заметных изменений при исследовании при различных значениях pH или концентрации (часть данных представлена на рисунках).Исключение составлял борат, поэтому для бората была предоставлена дополнительная глубина исследования.
Не наблюдалось увеличения проводимости при добавлении борной кислоты для снижения pH боратных буферов. (Этот результат может показаться нелогичным. Борная кислота, будучи электрически нейтральной в порошкообразной форме, может ионизироваться с образованием проводящих ионов при растворении. Тем не менее, общая концентрация борат-аниона обязательно была ограничена; она должна оставаться электрически сбалансированной с концентрацией катиона лития, который остался неизменным на уровне 10 мМ.Примечательно, однако, что боратный буфер при pH 6,5 имел на 21% более низкую начальную проводимость и на 34% более низкую конечную проводимость, чем те же концентрации ионов при pH 8,5, рисунок 3B. Кроме того, более низкая проводимость приводит к меньшему тепловыделению, конечная температура буфера с pH 6,5 после эксперимента составляет 56 ° C, что на 10 ° C ниже, чем температура для pH 8,5, рисунок 3C. Гели, работающие в боратных буферах с различным pH, представлены на рисунке 2B. Для сравнения также включен ацетатный гель, который обычно имеет минимальное сжатие ДНК с более высокой молекулярной массой.Степени сжатия для боратных буферов с различным pH сравниваются на рисунке 3A. Несмотря на меньшее тепловыделение, боратная среда при pH 6,5 обеспечивала более высокую электрокинетическую скорость ДНК. В ходе 80-минутного прогона геля относительно лунки полоса 12 т.п.н. переместилась на 3,4 см при рН 6,5 по сравнению с 2,2 см при рН 8,5, а полоса 1,6 т.п.н. переместилась на 5,2 см при рН 6,5 по сравнению с 3,3 см при рН 8,5 ( рисунок 3D). Резкое разделение произошло для фрагментов ДНК размером менее 500 п.н. даже в боратном буфере с pH 6,5, рисунок 2C.
Во время электрофореза с литий-боратным буфером изменения pH не наблюдалось.Боратные буферы при всех изученных значениях pH задерживали исчерпание буфера на 100 минут, что делало боратные буферы подходящими для длительных электрофоретических прогонов.
Боратный буфер с pH 6,5 был совместим с процедурами гелевой элюции Qiagen, SpinX и Geneclean II. Кроме того, рестрикционное переваривание элюированной ДНК было успешным (данные не показаны).
Обсуждение
Сжатие высокомолекулярных полос ДНК размером более 4 т.п.н. наблюдалось со всеми протестированными анионами кислоты Льюиса, а именно с боратом, гидроксидом германия и тетраметоксидом германия.Напротив, электрофоретическое сжатие полос с более высокой молекулярной массой не наблюдалось с анионами, лишенными электронодефицитного атома (следовательно, являющимися слабыми кислотами Льюиса), такими как ацетат, салицилат, цитрат, пропионат и формиат; такие анионы, однако, не приводили к приемлемому разделению более мелких фрагментов ДНК. Сжатие снова появилось при добавлении борной кислоты к электрофорезу с ацетат-анионами, дополнительно подтверждая образование комплекса с кислотой Льюиса как основную причину (данные не показаны). Кроме того, сжатие из-за боратов исчезло при более низком pH, предположительно из-за насыщения основной цепи ДНК избытком нейтральных борных частиц (таких как мономерная борная кислота, которая не несет электрического заряда, или борная кислота в комплексе с анионными боратами, что не обеспечит дополнительная плата нетто).Это было достигнуто снижением pH буфера бората лития до pH 6,5 при добавлении борной кислоты.
Из-за большего положительного индуктивного эффекта метоксигруппы, чем гидроксильной группы, тетраметоксид германия является более слабой кислотой Льюиса по сравнению с гидроксидом германия. Аналогичным образом мы предполагаем, что из-за положительного индуктивного эффекта трех метильных групп пропионат является более слабой кислотой Льюиса, чем ацетат, который, в свою очередь, слабее, чем формиат, рис. 3а. В качестве дополнительного подтверждения гипотезы более слабые кислоты Льюиса имели более низкие степени сжатия, чем их соответственно более сильные аналоги кислот Льюиса.
Метоксид бора является более слабой кислотой Льюиса по сравнению с боратами, и можно ожидать, что он будет демонстрировать меньшее сжатие, чем бораты. Однако известный гидролиз метоксида бора до боратов и метанола не позволил провести однозначные испытания.
Из-за того, что фосфатная группа сильно отрицательна с тремя отрицательными зарядами, образование комплекса фосфатов с кислотой Льюиса с фосфодиэфирным остовом ДНК предположительно затруднено из-за электростатического отталкивания. Таким образом, фосфат-анион мог служить как теоретическим, так и биологически интуитивным отрицательным контролем.Несмотря на наличие нескольких кислородных групп и ожидаемую кислоту Льюиса (электронно-дефицитный атом фосфора, связанный с четырьмя атомами кислорода), фосфат давал степени сжатия, аналогичные другим слабым кислотам Льюиса. Телеологически это удачное свойство могло даже благоприятствовать фосфатным полидиэфирам, а не другим легкодоступным растворимым полидиэфирам для исследования биологических полинуклеотидов в процессе эволюции.
Таким образом, мы отметили, что кислотный характер аниона Льюиса, по-видимому, определяет образование нежелательных структур, таких как сжатие фрагментов ДНК с более высокой молекулярной массой.При исследовании раствора с использованием этой подсказки было обнаружено, что широкий спектр анионов вызывает чрезмерную проводимость и джоулев нагрев при одинаковых концентрациях и условиях работы. Однако борат-анионы можно модифицировать для улучшения электрофореза, понижая pH за счет добавления нейтральных бороновых соединений. Высокая концентрация борной кислоты способствует образованию полиборат-анионов, которые имеют более низкую подвижность из-за более высокого отношения массы к заряду [7], [8], рисунок 1C. Борат с pH около 6,5 имел несколько преимуществ по сравнению с обычным pH 8.0–8,5 СМИ. Во-первых, образование полиборат-анионов приводит к более низкой проводимости и меньшему тепловыделению, а также к более высоким рабочим напряжениям. Во-вторых, он позволял несжатое отображение полос от менее 100 п.о. до более 12 т.п.н. за один прогон с гелем. В-третьих, это привело к более высокой скорости работы электрофоретического геля и, следовательно, к меньшему требуемому времени работы.
Материалы и методы
ДНК-лестницу (1 Кб плюс, Invitrogen) и 1% агароза с низким EEO типа I (Sigma) были использованы для всех экспериментов.Гели длиной 10 см / толщиной 5 мм были приготовлены с использованием той же среды, что и в резервуаре (см. Рис. 3 и текст ниже для списка протестированных сред). Горизонтальные гели (MGU-500, Del Mar, CA) использовались для большинства экспериментов, за исключением исследования компрессии ленты (см. Ниже). Резервуарная среда объемом 750 мл использовалась для экспериментов, посвященных проводимости и нагреву, создавая буферный слой толщиной 2 мм, физически объединяющий анодный и катодный резервуары. Электропроводность среды регистрировали как измеренный ток при постоянном напряжении.Подразумевается, что тепловыделение связано с повышением температуры, измеренной в резервуаре. pH водоемов измеряли в начале и в конце экспериментов. Постоянное напряжение 350 В в течение 40 минут использовалось с установленной защитной крышкой.
Для исследований исчерпания буфера использовался уменьшенный (600 мл) общий объем среды, чтобы избежать наложения буфера, обеспечивая физическое разделение объемов резервуара при сохранении последовательного электрического пути через гель. Электрофорез прекращали, когда ток уменьшался до 50% от исходного значения.
Эксперименты по измерению сжатия ДНК проводили в вертикальных гелях (SE 600, Hoefer, CA). Гели имели длину 16 см / толщину 3 мм. Эксперименты проводились при постоянном напряжении 350 В и заканчивались при максимальной миграции полосы 200 п.н. Качество разделения полос с более высокой молекулярной массой оценивали количественно с использованием степени сжатия, определяемой как отношение расстояния, разделяющего полосы размером 200 п.о. и 1 кб, к расстоянию, разделяющему полосы 4 кб и 12 кб (соответственно, области наименьшего и наибольшая компрессия в обычном боратном геле по сравнению с ацетатным гелем).Бромид этидия отсутствовал во время электрофореза, и ДНК подвергали последующему окрашиванию.
Все тестовые среды содержали 10 мМ катион лития и различные анионы, выбранные с учетом их кислотного характера Льюиса. Мы тестировали бораты, анион гидроксида германия, анион тетраметоксида германия и фосфат, которые считались сильными кислотами Льюиса из-за их электронодефицитных центральных атомов. Мы также протестировали ацетат, салицилат, цитрат, формиат и пропионат, чтобы представить слабые кислоты Льюиса. Обычно мы получали щелочной раствор, содержащий 200 мМ иона лития; 4.79 г гидроксида лития (х.ч., Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) растворяли при добавлении деионизированной воды до конечного объема 1 литр при перемешивании при комнатной температуре. 50 мл 200 мМ гидроксида лития титровали до желаемого pH (# 476436, pH-электрод Pinnacle, Nova Analytics, Woburn, MA) и доводили до объема 1 литр (создавая концентрацию иона лития 10 мМ) путем добавления кислой формы раствора. желаемый анион (гидроксид германия, тетраметоксид германия, уксусная кислота, салициловая кислота, лимонная кислота, муравьиная кислота или пропионовая кислота) и деионизированная вода при перемешивании при комнатной температуре.Боратные среды с различным pH были приготовлены путем создания буферов для кислотных и щелочных партнеров с концентрацией 10 мМ иона лития каждый. К 50 мл 200 мМ гидроксида лития добавляли порошок борной кислоты (степень чистоты для реагентов, Sigma-Aldrich) и воду при перемешивании при 75 ° C до тех пор, пока pH не опустился ниже 6,0 и объем не составил 1 литр; этому кислому буферу давали остыть. Щелочной раствор партнера, содержащий 10 мМ иона лития, был получен путем разбавления щелочного 200 мМ раствора иона лития или, альтернативно, разбавления 200 мМ буфера бората лития / борной кислоты (LB20-1®, Faster Better Media LLC, Hunt Valley, MD) .Кислые и щелочные растворы партнеров (каждый из которых содержит 10 мМ иона лития) смешивали при комнатной температуре для достижения желаемого pH каждого тестового буфера. Аналогичным образом, фосфатные буферы были изготовлены путем объединения 10 мМ растворов ионов лития одноосновного и двухосновного фосфата лития до желаемого значения pH.
Элюцию геля проводили с помощью спин-колонки на основе диоксида кремния (№ по каталогу 28706, Qiagen), центробежного фильтра из ацетата целлюлозы (Spin-X, Costar) и стекломолока (Geneclean II, QBiogen) с последующим рестрикционным расщеплением Xba I.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: SK. Проведены эксперименты: HS YRR. Проанализированы данные: СК. Написал бумагу: HS SK.
Ссылки
- 1. Brody JR, Kern SE (2004) История и принципы проводящих сред для стандартного электрофореза ДНК. Анальный Биохим 333: 1–13.
- 2. Brody J, Kern SE (2004) Агарозный электрофорез ДНК и РНК с высоким разрешением с использованием проводящих сред с низкой молярностью.Биотехники 37: 598–602.
- 3. Stellwagen N, Bossi A, Gelfi C, Righetti PG (2000) ДНК и буферы: существуют ли невзаимодействующие нейтральные буферы pH? Анальная биохимия 287: 167–75.
- 4. Хашимото Ю., Мори И., Кимура М. (1952) Бумажная электромиграция флавиноидов и сахаров с использованием постоянного тока высокого напряжения. Природа 170: 975–76.
- 5. Смит С.С., Гилрой Т.Е., Феррари Ф.А. (1983) Влияние сродства агарозной ДНК на электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозных гелях.Анальная биохимия 128: 138–51.
- 6. Stellwagen NC, Gelfi C, Righetti PG (2000) ДНК и буферы: скрытая опасность комплексообразования. Биополимеры 54: 137–42.
- 7. Ингри Н. (1963) Исследование равновесия полианионов. Acta Chem Scand 17: 581–9.
- 8. Маеда М.Дж. (1978) Рамановские спектры полиборат-ионов в водном растворе. Inorg Nucl Chem 41: 1217–20.
Протоколы электрофореза нуклеиновых кислот и введение
Окрашивание геля и просмотр
Гели, содержащие бромид этидия:
- После электрофореза перенесите гель в УФ-трансиллюминатор и получите изображение геля.
- Образцы будут отображаться в виде ярких полос.
Гели, не содержащие бромистого этидия:
- Осторожно промойте гель в дистиллированной воде, не содержащей РНКазы, в течение 10 минут, чтобы удалить формальдегид.
- Перенесите гель после электрофореза в краситель с зеленой нуклеиновой кислотой SYBR ® (1: 10 000) или раствор для окрашивания бромистым этидием 0,5 мкг / мл на 15-30 мин.
- Если используется краситель с зеленой нуклеиновой кислотой SYBR ® , изображение геля может быть получено сразу после окрашивания.
- При использовании бромистого этидия гель необходимо удалить в дистиллированной воде на 10-30 мин, убедившись, что гель полностью погружен в воду.
- Перенесите гель в УФ-трансиллюминатор и получите изображение геля.
- Образцы будут отображаться в виде ярких полос.
Электрофорез в полиакриламидном геле для определения ДНК
Полиакриламидные гели образуются в результате реакции акриламида и бис-акриламида (N, N’-метиленбисакриламида), что приводит к образованию гелевой матрицы с высокой степенью сшивки.Акриламидные гели могут разделять фрагменты ДНК, различающиеся по длине даже на 0,2%. Хотя белки необходимо денатурировать с помощью SDS перед разделением на полиакриламиде, отрицательно заряженные молекулы ДНК денатурировать не нужно. По сравнению с агарозными гелями, полиакриламидные гели могут вместить большее количество образцов и обеспечить высокое разрешение фрагментов ДНК.
Хотя обычно используются готовые гели для электрофореза в полиакриламидном геле для ДНК, их стоимость высока, если PAGE является регулярной процедурой в лаборатории.Квалифицированный техник может приготовить гели PAGE с небольшими усилиями за небольшую часть стоимости готовых гелей. Гели PAGE, приготовленные собственными силами, обеспечивают лучшее разрешение и помогают в достижении стабильных результатов.
Протокол: электрофорез в полиакриламидном геле для определения ДНК
Необходимые материалы и реагенты
Вертикальная камера для электрофореза с источником питания, стеклянными пластинами, распорками и гребнями
- 30% раствор полиакриламида (фильтровать через фильтр 0,45 мМ и хранить в темноте при 4 ° C):
29 г Акриламида
1 г бис-акриламида
100 мл бидистиллированной воды - 10% раствор персульфата аммония
- ТЕМЕД
- Буфер для электрофореза:
1X TBE, приготовленный в дистиллированной воде:
89 мМ Трис (pH 7.6)
89 мМ борная кислота
2 мМ ЭДТА - 5X буфер для загрузки геля:
80% глицерин 75%
Бромфеноловый синий (B5525) 0,25%
Ксилолцианол (X4126) 0,25%
1M Трис (pH 7,4) 10 мМ
5 М NaCl 10 мМ
0,5 М ЭДТА 10 мМ
10% SDS 0,1% - Бромид этидия 0,5 мкг / мл
- Трансиллюминатор
ВАЖНО : Акриламид и бис-акриламид нейротоксичны по своей природе.Все действия следует выполнять в перчатках без пудры.
Процедура
- Очистите стеклянные пластины и прокладки блока для литья геля деионизированной водой и этанолом.
- Установите пластины с распорками на устойчивой поверхности.
- Приготовьте гелевый раствор, используя следующие объемы (для 12 мл) в зависимости от требуемого процента геля.
Гель-электрофорез ДНК
Гель-электрофорез ДНКЧто такое электрофорез?
Электрофорез — это метод, используемый в лаборатории, который приводит к разделению заряженных молекул.В этой CyberLab мы разделяем молекулы ДНК, полученные из Restriction Digestion . ДНК представляет собой отрицательно заряженную молекулу и перемещается под действием электрического тока через матрицу из агарозы . Щелкните изображение слева, чтобы увидеть увеличенное изображение типичного оборудования, используемого для электрофореза.Что такое агароза?
Нажмите на изображение ниже, которое, по вашему мнению, представляет агарозу.А. Б.
Вам может быть интересно, что такое гель и какое отношение он имеет к агарозе.Давайте узнаем, «сделав» гель. Очищенная агароза находится в порошкообразной форме и нерастворима в воде (или буфере) при комнатной температуре. Но растворяется в кипятке. Когда он начинает остывать, он подвергается так называемой полимеризации . Вместо того, чтобы оставаться растворенными в воде или выходить из раствора, полимеры сахара сшиваются друг с другом, в результате чего раствор «загустевает» в полутвердую матрицу, очень похожую на «Желе», только более твердую. Чем больше агарозы растворяется в кипящей воде, тем плотнее будет гель.Пока раствор еще горячий, мы заливаем его в форму, называемую «лоток для литья», чтобы он принял желаемую форму по мере полимеризации (в противном случае он просто затвердеет на дне колбы, тратя впустую дорогую агарозу). Просмотрите последовательность изображений ниже, чтобы узнать, как приготовить гель.
Представьте, что вы — молекула ДНК. Если бы вы были внутри агарозного геля, ваше окружение напоминало бы очень плотную паутину. Если вы небольшой фрагмент, вы можете легко проползти через промежутки между паутиной (они слишком жесткие, чтобы их можно было просто вытащить).Но по мере того, как вы увеличиваете длину, вам становится все труднее и труднее проходить сквозь пространство. Если бы это была гонка между вами и другой молекулой ДНК, кто бы победил? Как вы думаете, справедливо ли то же самое для любой заряженной молекулы?
Теперь пора взять ДНК, которую мы переварили в эксперименте 1, и нанести ее на только что приготовленный гель.