Электрофорез (phoresis — несение, перенесение, греч.) -перемещение в электрическом поле взвешенных в жидкости частиц, молекул. В физиотерапии — это метод введения в организм лекарственных веществ посредством постоянного электрического тока через кожные покровы или слизистые оболочки.
При этом имеется сочетанное воздействие постоянным электрическим током и лекарственным веществом.
Лекарственный электрофорез, это не просто сочетание эффектов гальванического тока и лекарственного вещества. В результате их взаимодействия усиливается влияние каждого из факторов, в результате этого наблюдается качественно новое воздействие. Ответная реакция зависит в первую очередь от фармакологических свойств лекарственного вещества.
Скорость движения лекарства через кожу в электрическом поле постоянного тока составляет около 1 см в час. За время процедуры лекарственное вещество проникает на небольшую глубину, образуя депо в коже, частично в подкожной клетчатке.
Метод лекарственного электрофореза имеет ряд особенностей и достоинств по сравнению с другими способами введения лекарств:
1) дает возможность создать в патологическом очаге, расположенном поверхностно, высокую концентрацию лекарства, осуществить локальное воздействие;
2) лекарственные вещества, введенные этим способом, реже вызывают побочные реакции по сравнению с введенными энтерально и парэнтерально;
3) метод лечения безболезненный, не вызывает деформации кожи нарушений в ней микроциркуляции, отсутствует раздражение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта;
4) вводятся ионы или отдельные инградиенты лекарственных веществ, на лечебное действие которых расчитывают. Лекарства в ионной форме проявляют свою максимальную активность;
Лекарственные вещества, не растворимые в воде и спирте, вводят на среде ДМСО (диметилсульфоксид, димексид), которая является универсальным растворителем. Для электрофореза ферментов (лидаза, ронидаза, трипсин, химотрипсин) применяются буферные растворы.
В настоящее время используют небольшие концентрации лекарственных веществ, в основном до 5%.
Для объяснения механизма действия на внутренние органы лекарственных веществ, введенных методом электрофореза, используют учение об ионных рефлексах, разработанные А.Е. Щербаком. Согласно этому учению рецепторы кожи раздражаются ионами лекарственного вещества и постоянным электрическим током. При местном воздействии на кожу ионы лекарства оказывают влияние через вегетативные нервные пути на внутренние органы. С учетом этого действия электроды следует располагать на участках кожи, связанных вегетативной иннервацией с внутренними органами.
При поверхностно расположенных патологических процессах методом электрофореза можно создать достаточно высокую концентрацию лекарства непосредственно в очаге поражения, не насыщая им организм.
При заболеваниях внутренних органов используется «внутритканевой электрофорез» — способ элиминации лекарственного вещества из крови с помощью гальванического тока. Лекарство вводится в кровяное русло (обычно внутривенно капельно). Через некоторое время от начала введения лекарства начинается гальванизация соответствующего органа или ткани. Происходит элиминация лекарства из крови, протекающей через пораженный орган или ткань.
Показания к применению определяются фармакологическими свойствами лекарственного вещества с учетом показаний к применению гальванизации. Лекарственные вещества выбираются по тем же принципам, что и в фармакотерапии.
Противопоказания к применению те же, что и к гальванизации. Дополнительным противопоказанием является индивидуальная непереносимость лекарственного вещества.
Дозировка осуществляется так же, как и при гальванизации.
Основными приборами в нашей стране являются: Поток-1 и Элфор. Это аппараты хорошо себя зарекомендовали в клинических условиях при работе с большим потоком людей.
Электрофорез — что это?
Лекарственный электрофорез – физиотерапевтический метод электротерапии, заключающийся в сочетанном воздействии на организм гальванизации (постоянного тока малой силы и напряжения) и лекарственных препаратов.
В ионотерапии, как по-другому называется электрофорез, несомненная польза гальванизации дополняется множеством плюсов сочетанного воздействия на организм лекарственных веществ и электрического поля.
Принцип действия электрофореза
Лечебные эффекты электрофореза
Общие: активизация иммунных, обменных и физико-химических процессов.
Терапевтические эффекты зависят от доминантного, на момент процедуры, электрода.
Катод (отрицательный электрод):
- расширение кровеносных и лимфатических сосудов;
- релаксация;
- нормализация обмена веществ;
- нормализация работы желез внутренней секреции;
- улучшение метаболизма клеток;
- стимуляция секреции биологически-активных веществ.
Анод (положительный электрод):
- выведение из организма лишней жидкости;
- уменьшение воспалительных процессов;
- обезболивание;
- седация.
Проведение процедуры электрофореза
Перед проведением процедуры необходимо удостовериться на ионы какого заряда диссоциирует выбранный раствор – если на положительно-заряженные (катионы) – его следует располагать под анодом, если на отрицательные (анионы)- под катодом для создания линии перемещения ионов к противоположному заряду.
Для проведения электрофореза используются различные методики в зависимости от наличия заболевания и необходимого результата.
Методики проведения процедуры можно разделить на общие и местные, а также выделить области воздействия электрическим полем: чрескожная методика, полостная, ванночковая и внутритканевая.
Расположение электродов может быть продольным (для поверхностного воздействия), поперечным (для воздействия на более глубокие очаги поражения) или сегментарным (для воздействия на определенные отделы позвоночника).
Во время процедуры используются 2 и более электродов, задействована одна и более зон.
Сила тока подбирается индивидуально в зависимости от чувствительности конкретного человека. Во время проведения процедуры целесообразно постепенно увеличивать силу тока для препятствия привыкания, что может быть причиной снижения эффективности процедуры.
Процедура длится от 10 до 40 минут, курсовое воздействие включает в себя от 5 до 20 процедур, проводимых ежедневно или через день.
Особенности электрофореза лекарственного вещества
- ионы лекарственных препаратов вводятся через протоки потовых и сальных желез кожи;
- повышение чувствительности рецепторов кожного покрова к медицинским веществам;
- полное сохранение лекарствами своей фармакологической активности;
- равномерное распределение лекарственного вещества в клетках и межклеточной жидкости организма;
- депонирование препаратов от 1 до 15-20 дней;
- выраженное терапевтическое воздействие лекарств на организм при малых дозах введения;
- отсутствие побочных эффектов фармакологических препаратов, в отличие от других видов их введения;
- безболезненность введения лекарств;
- воздействие препаратом непосредственно на область патологического вещества, не подвергая воздействию других органов и тканей;
- сведение к минимуму возможности появления аллергических реакций на вводимое медицинское вещество;
- возможность введения комбинации лекарственных препаратов;
- расположение медицинских препаратов на электродах зависит от заряда ионов.
Требования к лекарственным препаратам
- для приготовления растворов используется дистиллированная вода, очищенный спирт, диметилсульфоксид или буферные растворы, в зависимости от растворимости вводимых веществ;
- раствор готовится непосредственно перед применением;
- вещество должно быть максимально простым по составу, без примесей;
- при курсовом воздействии во время всего курса полярность электродов менять нельзя, т.е. с первой процедуры и до последней на одну и ту же поверхность накладывается один и тот же, по полярности, электрод.
Количество поступающего в организм лекарственного препарата посредством электрофореза зависит от следующих факторов:
- индивидуальной особенности организма;
- возраста пациента;
- состояния кожного покрова;
- степени диссоциации препарата;
- количества вводимого вещества;
- площади используемого электрода;
- заданной силы и плотности тока;
- свойств растворителя;
- длительности процедуры.
Применяемые токи
Помимо гальванического тока в процедуре электрофореза используются другие его виды:
- синусоидальные модулированные токи;
- выпрямленные токи;
- диадинамические токи;
- флюктуирующие токи.
Показания
Электрофорез активно применяется в медицине и косметологии.Множество заболеваний поддается лечению электрическим полем. Рассмотрим некоторые из них по отдельным медицинским направлениям.
Неврология:
- воспалительные процессы;
- неврастения, мигрень, невроз;
- органические заболевания ЦНС.
Сердечно-сосудистая система:
- ИБС;
- атеросклероз сосудов;
- гипертоническая болезнь;
- гипотония.
ЛОР:
Пульмонология:
Хирургия:
- рубцовые и спаечные изменения тканей;
- контрактуры;
- ожоги.
Дерматология, косметология:
- себорея;
- телеангиоэктазия;
- постугревые рубцы.
Ревматология, ортопедия:
- деформирующий остеоартроз;
- посттравматические поражения суставов;
- воспалительные заболевания опорно-двигательного аппарата.
Стоматология:
- воспалительные процессы полости рта;
- поражения слюнных желез;
- заболевания зубов, в т. ч. флюороз.
Гинекология:
- эрозия шейки матки;
- хронические воспалительные заболевания;
- спаечные процессы;
- гипертонус матки при беременности;
- недостаточное кровообращение плаценты и матки при беременности.
Противопоказания при беременности: преэклампсия, эклампсия, рвота, угроза кровотечения, патология почек, свертывающей системы, плохое состояние плода.
Урология:
- воспалительные заболевания мочеполовой системы;
- спаечные процессы.
Педиатрия:
До 1 года – для лечения неврологических патологий, последствий родовой травмы, дисплазии тазобедренного сустава, врожденных вывихов и др. После года – ограничения могут быть вызваны только со стороны выбранного для процедуры препарата.
Противопоказания
Несмотря на обширный список показаний для данного метода физиотерапевтического воздействия необходимо помнить и о противопоказаниях, чтобы не нанести дополнительный вред пациенту. При следующих состояниях от электролечения следует отказаться.
Новообразования, декомпенсация хронических заболеваний, острые лихорадочные состояния, гнойные процессы без оттока содержимого, индивидуальная непереносимость тока или лекарственного вещества, психические нарушения, чувствительные нарушения, общее тяжелое состояние пациента, афазия, выраженные изменения кожного покрова в области проведения процедуры, склонность к кровотечениям.
Комплексный подход
Процедуру гальванизации и электрофореза целесообразно дополнять другими физиотерапевтическими воздействиями: лазеротерапией, магнитотерапией, светолечением, ультразвуком и т.д. для усиления лечебного эффекта, всестороннего воздействия на организм и профилактики множества заболеваний.
8.19. Электрофорез: принцип метода, назначение.
Электрофорез – процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Явление электрофореза было обнаружено Рейссом в 1809 г. Исследователь наблюдал направленное движение к одному из электрических полюсов частичек глины, суспензия которой была помещена внутрь стеклянной трубки. В 1937 г. Тизелиус сконструировал аппарат для электрофореза, позволявший разделять белки на фракции в одной фазе (электрофорез в ванне, или свободный электрофорез). Однако этот прибор был дорог и не совершенен (после снятия подаваемого на электроды напряжения фракции вновь перемешивались), а все исследование сложно; по этим причинам метод электрофореза по Тизелиуса не вошел в повседневную практическую работу клинико-диагностических лабораторий. Лишь в 50-х годах нашего столетия для электрофореза белков плазмы крови был применен введенный Даррумом, Виланом и Фишером метод разделения на бумаге, получивший впоследствии весьма хорошее распространение (зонный или зональный электрофорез – т.е. электрофорез на поддерживающих средах-носителиях).
Зонный электрофорез можно осуществить с использованием смоченных буферным раствором (рН=8.6) полосок хроматографической бумаги, ацетат целлюлозной пленки, агарового геля и других носителей.
Если на электроды электрофоретической камеры, в которой размещены полоски носителя, подать напряжение, то в созданном таким образом электрическом поле ионы буфера и частицы нанесенного на полосу субстрата (сыворотки или плазмы) придут в состоянии направленного движения.
При нанесении у катода 20-100 мкл сыворотки белки крови заряженные отрицательно, устремляются к аноду со скоростью, зависящей от величины приложенного к электродам напряжения, заряда белков, их молекулярной массы, ph и ионной силы буфера. Заряд белков при этом может быть образован первично или вторично (в результате взаимодействия с буфером).
Для характеристики процесса электрофореза на носителе принято использовать понятия: падение напряжения на 1 см полосы (градиент потенциала) – В/см и силы тока, приходящаяся на 1см поперечного сечения полосы (плотность тока),- мА/см.
Под падением напряжения (градиентом потенциала) следует понимать распределение величины приложенного к электродам напряжения на всем расстоянии между электродами. Находится оно делением величины выходного напряжения (регистрируемого вольтметром источника постоянного напряжения) на расстояние между электродами, точнее – тот путь (в см), который преодолевают электрически заряженные частицы (ионы, электроны) от электрода к электроду. Так, если он составляет 30 см, а напряжение между электродами –150 В, то падение напряжения (градиент потенциала ) окажется равным частному от деления 150 на 30 , т.е. 5 В/см.
В зависимости от используемой величины падения напряжения различают: низко- (5-15), средне- (обычно 20-40) и высоковольтный ( превышающий 50 В/см) электрофорез .
Для расчета силы тока, приходящейся на 1 см поперечного сечения полосы, значение, «снимаемое» по показаниям миллиамперметра, делят на общую ширину всех полос носителя (ацетат-целлюлозной пленки, геля хроматографической бумаги).
Для создания идентичных условий разделения при проведении электрофореза на различных приборах, отличающихся размерами электрофоретической камеры, создают одинаковые величины градиента потенциала и плотности силы тока.
Высоковольтный электрофорез используется для разделения низкомолекулярных веществ, таких как аминокислоты и их производные, например конечные продукты разрушения катехоламинов и серотонина – ванилин-миндальная, гомованилиновая и 5-гидроксииндолуксусная кислоты. Различие в разряде и молекулярной массе подобных соединений слишком мало, чтобы при небольшом градиенте потенциала могло бы произойти эффективное разделение частиц. Однако высоковольтный электрофорез, примененный с выходным напряжением до 100 000 В, делает возможным фракционирование и таких соединений. Вследствие отмечаемого при высоковольтном электрофорезе значительного разогревания полос он требует специальных устройств и приспособлений для охлаждения бумажных лент. В случае использования высоковольтного электрофореза необходимо применение летучих буферов (растворов муравьиной, уксусной кислот, гидроксида аммония, пиридина и др.), которые при испарении не дают остатков солей(выкристаллизовавшиеся соли способствуют сгоранию полос), а также систем охлаждения , достигаемого либо охлаждением пластины, на которой лежат полосы, либо погружением полос бумаги в органический растворитель. Важно также исключить реофорез, который наиболее выражен при данном виде электрофореза.
Под реофорезом понимают перемещение по носителю анализируемых фракций белков, вызываемое испарением буферного раствора вследствие разогревания полос за счет выделений «джоулевого» тепла. Это испарение наиболее выражено в середине полосы, что и вызывает движение буферного раствора со стороны кюветных отделений к ее середине. Поскольку применяемая для электрофореза бумага является хроматографической, одни из белков более, другие менее прочно сорбируются поверхностью волоконец бумаги, в силу чего и происходит хромотографическое разделение. Было бы ошибочно полагать, что от реофореза следует всегда избавляться как от нежелательного явления. В конструкциях некоторых электрофоретических камер оно с успехом используется, повышая качество разделения фракций электрофоретическим методом.Но при применении высоковольтного электрофореза от реофореза всегда избавляются- прежде всего устранением того пространства, куда мог бы испаряться буферный раствор. С этой целью поверх полосок хроматографической бумаги укладывают полиэтиленовую пленку, а поверх её – тяжелую пластину, прижимающую бумагу к поверхности , охлаждаемой током воды.
Если бумага в электрофоретической камере располагается горизонтально, говорят о горизонтальном электрофорезе, а если вертикально или под углом к вертикали(горизонтали) – то о вертикальном электрофорезе.
Помимо аналитического электрофореза следует выделять электрофорез препаративный, предназначающийся для получения отдельных белковых фракций с целью последующего изучения их состава и свойств. В клинической химии обычно используется зонный аналитический электрофорез. К настоящему времени предложено множество различных систем для электрофореза. Несмотря на различие в конструкции и используемых носителях, общие требования к приборам и процессу проведения электрофореза одни и те же: описание их приведено в разделе, посвященном электрофорезу белков сыворотки крови.
Низковольтный электрофорез в отличие от высоковольтного используется для разделения высокомолекулярных соединений (белков, липопротеинов, гликопротеинов и других аналогичных).
Электрофорез на ацетатцеллюлозной пленке (см. примеры диагностики ЦГБ №6 ниже) проводится аналогично процедуре низковольтного электрофореза на бумаге. В настоящее время этот вид фракционирования (предложенный Коном, 1958) достаточно широко используется для исследования белкового спектра сыворотки крови пациентов.
Ацетатцеллюлозная пленка как носитель обладает рядом существенных преимуществ перед хроматографической бумагой: она химически однородна, имеет равномерную пористость, лишена эндоосмоса, быстро и хорошо смачивается водными растворами; ее волоконца, в отличие от хроматографической бумаги, не обладают способностью к адсорбции белковых молекул, что предотвращает появление «хвостов» и «размывание» промежутков между отдельными белковыми фракциями. Для постановки исследования достаточно 1-3 мкл сыворотки крови, время электрофороза по сравнению с фракционированием на хроматографической бумаге значительно сокращено.
Электрофорез на агаре. Гель агара, обладая меньшими сорбционными свойствами по отношению к белкам плазмы, чем бумага, создает лучшие возможности для их передвижения и фракционирования. При электрофорезе на агаре отчетливо выделяется множество различных фракций. Впервые этот вид электрофореза был предложен Гордоном с соавт. (1949).
В настоящее время метод электрофореза на агаре широко применяется при фракционировании белков и липопротеинов, для чего используют оборудование и расходные материалы фирмы «Бекман», а также поставляемые в Беларусь СП «Кормей-ДиАна» (система для электрофореза DS-2 и другие аналогичные). Процедура электрофоретического разделения принципиально не отличается от таковой на хроматографической бумаге и ацетатцеллюлозной пленке.
Иммуноэлектрофорез. Иммуноэлектрофорез, введенный Грабаром и Вильямсом в 1953 г., представляет собой своеобразную комбинацию электрофоретического и иммунологического фракционирования белков.
После завершения процедуры электрофореза белков в геле агара в узкий желобок, сформированной вблизи края его полосы (перпендикулярно разделенным фракциям) вносят антисыворотку к определенному виду белка и дают ей возможность диффундировать в геле агара. В месте контакта антисыворотки с электрофоретически разделенными белками образуются преципитационные дуги (вследствие образования комплекса «антиген-антитело»), характерные для отдельных видов белков.
При помощи этого метода удалось обнаружить более 25 различных фракций белков сыворотки крови.
В 1966 г. Laurell разработал усовершенствованный метод электроиммунодиффузии, получивший также название «ракетного» электрофореза за форму, которую приобретает преципитат в результате реакции «антиген-антитело», проходящей в геле.
Метод сходен с радиальной иммунодиффузией в том, что в нем также используют гель, содержащий антитела. Вдоль кромки слоя геля делают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал, например диск из фильтровальной бумаги диаметром 4 мм, обильно пропитанный кровью, после чего проводят электрофорез. При этом в слое геля создается электрическое поле, благодаря которому антиген входит в гель. Поскольку антигены обычно движутся значительно быстрее, чем антитела, но в одном направлении, реактанты продвигаются в геле вместе. Это позволяет пренебречь различиями в относительной молекулярной массе веществ и конфигурации неправильной формы, подобно тому, что происходит в ходе радиальной иммунодиффузии. Высота «ракеты», образующейся в ходе такой реакции, прямо пропорциональна концентрации антигена, она измеряется от верхней границы лунки до высоты пика.
Метод электроиммунодиффузии зарекомендовал себя как удобная и надежная система для определения альфа-фетопротеина в амниотической жидкости.
С помощью электроиммунодиффузии можно исследовать содержание разнообразных белков; однако одни из них требуют особых условий для вхождения в гель, другие – для образования видимого преципитата. Для усиления четкости проявления полос преципитации полоски геля помещают в растворы фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой кислоты.
Методу электроиммунодиффузии присущи и некоторые недостатки, типичные для многих методик электрофоретического фракционирования, в том числе большая длительность процедуры (составляющая от 2 до18 часов), малое количество исследований, выполняемых на полосе геля.
Капиллярный электрофорез. В настоящее время капиллярный электрофорез становится одним из наиболее распространенных аналитических инструментов фракционирования веществ в растворе.
Используемое для этой цели оборудование производится фирмами США («Эпплайд Биосистемс», «Спектрофизикс», «Бекман», «Био-Рад»), Франции, Швеции, Японии и некоторыми другими. Выпуск системы капиллярного электрофореза «Капель-103» освоен НПФ «Люмэкс» (г. С.-П.).
Процедура разделения веществ методом капиллярного электрофореза базируется на явлении миграции заряженных частиц в электрическом поле. [2, 4, 9, 16]
Электрохимические методы основаны на использовании электрохимических процессов, происходящих при взаимодействии электродов и электролитов. В электрохимических методах используется зависимость электрических параметров от концентрации, природы и структуры вещества, участвующего в электродной реакции или электрохимическом процессе переноса зарядов между электродами.
Электрохимические методы анализа используют либо для прямых измерений(изменение силы тока, напряжения или сопротивления в зависимости от состава раствора), либо для идентификации конечной точки титрования. Они позволяют определить концентрацию вещества в широком интервале(1- 10-9моль/л) с достаточной точностью и могут быть легко автоматизированы.
Электрохимические методы анализа, совокупность методов качественного и количественного анализа, основанных на электрохимических явлениях, происходящих в исследуемой среде или на границе раздела фаз и связанных с изменением структуры, химического состава или концентрации анализируемого вещества. Э. м. а. делятся на пять основных групп: потенциометрию, вольтамперометрию, кулонометрию, кондуктометрию и диэлектрометрию.
Потенциометрия – метод определения различных физико-химических величин, основанный на измерении электродвижущей силы(разность электродных потенциалов) обратимых гальванических элементов. По данным потенциометрии вычисляют константы равновесия, константы диссоциации кислот и оснований, произведение растворимости, водородный показатель. Практическое применение – определение рН раствора со стеклянным электродом, определение концентраций ионов с помощью ионоселективных электродов. Достоинства метода – высокая точность и чувствительность, возможность проводить титрования в более разбавленных растворах, неподдающихся визуальным методам. Также этим методом можно определять несколько веществ в одном растворе без предварительного разделения и титрование мутных растворов и окрашенных сред. Потенциометрия объединяет методы, основанные на измерении эдс обратимых электрохимических цепей, когда потенциал рабочего электрода близок к равновесному значению (см. Электродный потенциал). Потенциометрия включает редоксметрию (см. Оксидиметрия), ионометрию и потенциометрическое титрование.
Вольтамперометрия основана на исследовании зависимости тока поляризации от напряжения, прикладываемого к электрохимической ячейке, когда потенциал рабочего электрода значительно отличается от равновесного значения (см. Поляризация электрохимическая). По разнообразию методов вольтамперометрия — самая многочисленная группа из всех Э. м. а., широко используемая для определения веществ в растворах и расплавах (например, полярография, амперометрия). Вольтамперометрия основана на изучении поляризационных кривых (кривые зависимости силы тока от напряжения), которые получаются, если при электролизе раствора анализируемого вещества постепенно повышать напряжение и фиксировать при этом силу тока.
Кулонометрия объединяет методы анализа, основанные на измерении количества вещества, выделяющегося на электроде в процессе электрохимической реакции в соответствии с Фарадея законами. При кулонометрии потенциал рабочего электрода отличается от равновесного значения. Различают потенциостатическую и гальваностатическую кулонометрию, причём последняя включает прямой и инверсионный методы, электроанализ и кулонометрическое титрование.
Кондуктометрия – метод определения различных физико-химических величин, основан на измерении электропроводности. Электропроводность – способность растворов электролитов проводить эл.ток под действием внешнего эл.поля.
К кондуктометрии относятся методы, в которых измеряют электропроводность электролитов (водных и неводных растворов, коллоидных систем, расплавов, твёрдых веществ). Кондуктометрический анализ основан на изменении концентрации вещества или химического состава среды в межэлектродном пространстве; он не связан с потенциалом электрода, который обычно близок к равновесному значению. Кондуктометрия включает прямые методы анализа (используемые, например, в солемерах) и косвенные (например, в газовом анализе) с применением постоянного или переменного тока (низкой и высокой частоты), а также хронокондуктометрию, низкочастотное и высокочастотное титрование.
Диэлектрометрия объединяет методы анализа, основанные на измерении диэлектрической проницаемости вещества, обусловленной ориентацией в электрическом поле частиц (молекул, ионов), обладающих дипольным моментом. Методы диэлектрометрии применяют для контроля чистоты диэлектриков, например для определения малых количеств влаги. Диэлектрометрическое титрование используют для анализа растворов.
Электрофорез – движение заряженных коллоидных частиц в постоянном эл.токе к противоположно заряженному электроду. Электрофорез основан на разделении ионов(частиц), отличающихся отношением заряда к массе при движении в растворе под действием эл.поля. Скорость движения молекул в эл.поле возрастает с увеличением суммарного эл.заряда. На электрофоретическую активность белков влияют:
— форма и величина молекул белков
— электрическое поле(сила тока, напряжение, сопротивление)
— характер буфера(конц. 0,005 – 0,1 моль/л) и его ионная сила
— природа носителя(на бумаге, в геле)
Электрофорез на бумаге — самый простой из форетических методов, носитель – хроматографическая бумага, после фореза белки высушивают и красят. Но бумага не являетя абсолютно инертным носителем и может адсорбировать некоторые вещества, что нежелательно. Поэтому в качестве носителя стали применять ацетат целлюлозы – менее гидрофильный и удерживает меньшее количество буферного раствора, правда он дороже бумаги. Данный метод целесообразно применять для разделения малых количеств веществ.
Электрофорез в гелях (крахмальный, агаровый, полиакриламидный гели) – отличается большой разрешающей способностью, движение молекул зависит от размера пор в геле, ценен для разделения смесей молекул с одинаковыми зарядами, но различающихся по массе.
ПААГ – имеет большие преимущества: прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен. Получают путем полимеризации акриламида и метиленбисакриламида, чем больше концентрация второго, тем более плотным получается гель. Достоинства электрофореза в ПААГе – можно менять размер пор, исследовать растворы разной концентрации, проводить разделение бастро, в течение 60-70мин, ПААГ имеет очень небольшую адсорбцию, не поглощает УФ – можно рассматривать процесс разделения. Имеется несколько вариантов проведения электрофореза в ПААГе (вертикальный горизонтальный, в трубках и на пластинах). Чаще используется вертикальный – сочетает 2 системы полиакриламидных гелей: верхний (крупнопористый) – происходит отделение клеточного материала, нижний (мелкопористый) – разделение белков.
Оптимальное количество белка, вносимое в одну колонку – от 10 до 100 мкг. После нанесения белков, колонки заполняют трис-глициновым буфером. Электрофорез проводят в специальных кюветах с закрепленными электродами. После разделения гелевые колонки окрашивают, для фиксации зон разделения белков гелевые колонки помещают в раствор уксусной кислоты, а потом отмывают от красителя и смотрят результаты разделения.
Применяется: диагностика заболеваний (изучение белков и ферментов органов и тканей в норме и при патологии), разделение белков сыворотки крови, выявление мутаций и тд.
Q.5. (c) Объясните Электрофорез, его принцип и факторы, управляющие им
Ответ 5. (c) Электрофорез: метод, используемый для разделения и иногда очистки макромолекул — особенно белков и нуклеиновых кислот — которые различаются по размеру, заряду или конформации. Как таковой, он является одним из наиболее широко используемых методов в биохимии и молекулярной биологии.
Электрофорез определяется как миграция заряженных ионов в электрическом поле. В металлических проводниках электрический ток переносится движением электронов, в основном вдоль поверхности металла. В растворах электрический ток протекает между электродами и переносится ионами. Ионы, которые мигрируют к аноду из-за их анодной миграции, называются «анионами». Ионы, которые будут мигрировать на катод, называются «катионами».
Принцип: Когда заряженные молекулы находятся в электрическом поле, они мигрируют к положительному или отрицательному полюсу в соответствии с их зарядом.В отличие от белков, которые могут иметь как суммарный положительный, так и суммарный отрицательный заряд, нуклеиновые кислоты имеют постоянный отрицательный заряд, передаваемый их фосфатным остовом, и мигрируют к аноду.
Ион, помещенный в такое электрическое поле, будет испытывать силу:
, где,
F = электрофоретическая сила,
K = постоянная,
q = суммарный заряд белка (атомные заряды / молекула белка),
Эта сила заставит белок ускоряться к катоду или аноду, в зависимости от знака его заряда.Конечно, есть и другие силы, такие как сила трения, когда ионы движутся в электрическом поле. Их влияние не может быть легко понято по формуле, поэтому мы ее опускаем.
Электрофорез использует тот факт, что разные ионы имеют разную подвижность в электрическом поле и поэтому могут быть разделены таким образом.
Белки и нуклеиновые кислоты подвергаются электрофорезу в матрице или «геле». Чаще всего гель отливают в форме тонкой плиты с лунками для загрузки образца.Гель погружают в буфер для электрофореза, который обеспечивает ионы для переноса тока и некоторый тип буфера для поддержания рН на относительно постоянном уровне.
Сам гель состоит из агарозы или полиакриламида, каждый из которых имеет свойства, подходящие для конкретных задач.
Факторы, влияющие на электрофорез:
Движение белков зависит от различных аспектов. Внутри геля молекулы должны проходить, когда они движутся от одного полюса к другому.Меньшие молекулы могут легче вплетаться и выходить из матрицы геля по сравнению с более крупными молекулами. Как правило, молекулы движутся быстрее, если они имеют больший суммарный заряд, имеют форму шара и более короткий диаметр
1) Буфер pH
Это повлияет на направление и быструю миграцию белка.
Движение белков зависит от различных аспектов; Одним из них является заряд на белках. Белки представляют собой последовательность аминокислот, которые могут быть ионизированы в зависимости от их кислотного или основного характера.Чистый электрический заряд белка представляет собой сумму электрических зарядов, обнаруженных на поверхности молекулы, в зависимости от окружающей среды.
Скорость миграции будет зависеть от силы их суммарных поверхностных зарядов: белок, который несет больше + 5 зарядов, будет двигаться к катоду с большей скоростью. Напротив, белок, который несет больше зарядов, будет двигаться к аноду с большей скоростью. В связи с этим белки могут быть разделены на основе их электрических зарядов.
В зависимости от рН буфера белки в образце будут нести разные заряды.В pI (изоэлектрическая точка) специфического белка молекула белка не несет суммарного заряда и не мигрирует в электрическом поле. При pH выше pI белок имеет отрицательный заряд и мигрирует к аноду. При pH ниже pI белок получает чистый положительный заряд на своей поверхности и мигрирует к катоду.
2) Буферная ионная сила
Он влияет на долю тока, переносимого белками
При низкой ионной силе белки будут переносить относительно большую долю тока и, следовательно, будут иметь относительно быструю миграцию.При высокой ионной силе большая часть тока будет переноситься буферными ионами, и поэтому белки будут мигрировать относительно медленно. Аналогия может быть полезна для визуализации этого эффекта ионной силы. Представьте себе банк, в котором есть два счетчика — один для депозитов на аноде и один для вывода (= катод), в котором деньги являются электронами. Ионы могут рассматриваться как клиенты, ожидающие обслуживания на любом прилавке, который можно представить как находящийся на противоположных концах банковского зала.
Следовательно, при электрофорезе предпочтительной является низкая ионная сила, так как она увеличивает скорость миграции белков. Низкая ионная сила также является предпочтительной, поскольку она дает более низкое тепловыделение. При условии постоянного напряжения, если ионная сила увеличивается, электрическое сопротивление уменьшается, но ток увеличивается. Поэтому буфер с высокой ионной силой приведет к большему выделению тепла, поэтому предпочтительной является низкая ионная сила.
3) Градиент напряжения
Скорость миграции будет зависеть от градиента напряжения: в электрическом поле больше градиента напряжения, белок будет двигаться к аноду (или катоду) с большей скоростью.
4) Электроосмос
Относительное движение жидкости в твердой среде в электрическом поле называется электроосмосом. В приложенном электрическом поле электроосмос искажает поток пробы и ограничивает разделение. Например, бумажный электрофорез имеет плохое разрешение из-за электроосмоса. Поверхность бумаги имеет -e, поэтому буфер имеет + e, полученный из ионов водорода из-за электростатической индукции.
Затем, когда электрический ток направляет буфер к катоду, эти потоки искажают электрофоретическую миграцию образца, вызывая различное время пребывания.Таким образом, образец будет двигаться больше или меньше, чем обычно.
ПРИСОЕДИНИТЕСЬ К ФАРМАТУТОРАМ ТЕСТОВОЙ СЕРИИ
Подписаться на оповещения о вакансиях Pharmatutor по электронной почте
,
SDS-PAGE — это аналитическая методика для разделения белков на основе их молекулярной массы.
Принцип
Когда белки разделяются с помощью электрофореза через матрицу геля, меньшие белки мигрируют быстрее из-за меньшей устойчивости от матрицы геля. Другие факторы, влияющие на скорость миграции через матрицу геля, включают структуру и заряд белков.
В SDS-PAGE использование додецилсульфата натрия (SDS, также известного как лаурилсульфат натрия) и полиакриламидного геля в значительной степени устраняет влияние структуры и заряда, и белки разделяются исключительно на основании длины полипептидной цепи.
SDS является детергентом с сильным денатурирующим действием и связывается с белковой основой в постоянном молярном соотношении. В присутствии SDS и восстановителя, который расщепляет дисульфидные связи, необходимые для правильного сворачивания, белки разворачиваются в линейные цепи с отрицательным зарядом, пропорциональным длине полипептидной цепи.
Полимеризованный акриламид (полиакриламид) образует сетчатую матрицу, подходящую для разделения белков типичного размера. Сила геля позволяет легко обрабатывать. Электрофорез в полиакриламидном геле белков, обработанных SDS, позволяет исследователям разделять белки на основе их длины простым, недорогим и относительно точным способом.
Процедура
| Пошаговая процедура | |
|---|---|
| Добавьте буфер для образцов к пробам и перемешайте, щелкая пробирку. Нагревают образцы при 100 ° С в течение 3 минут в тепловом блоке. Центрифуга при 15000 об / мин в течение 1 минуты при 4 ° C и использование супернатанта для SDS-PAGE. |
| Пошаговая процедура | |
|---|---|
| Снимите зажимы для связующего, проставку и гребень с гелевого блока и установите гель в устройство для электрофореза, используя зажимы для связующего. Налейте рабочий буфер в верхнюю и нижнюю ч. |
Главная »Иммунология» Иммуноэлектрофорез: принцип, методика, результаты и применение, преимущества и ограничения
Последнее обновление: Sagar Aryal
- Иммуноэлектрофорез относится к осаждению в агаре в электрическом поле.
- Это процесс сочетания иммуно-диффузии и электрофореза.
- Смесь антигенов сначала разделяют на составные части с помощью электрофореза, а затем проверяют двойной иммуно-диффузией.
- Антигены помещают в лунки, вырезанные в геле (без антител), и подвергают электрофорезу. Затем в гель, в который помещают антитела, нарезают желоб.
- Антитела диффундируют в боковом направлении, встречая диффундирующие антигены, и происходит образование решетки и осаждение, позволяющее определить природу антигенов.
- Термин «иммуноэлектрофорез» был впервые введен Грабаром и Уильямсом в 1953 году.
Принцип иммуноэлектрофореза
Когда электрический ток подается на предметное стекло, наслоенное гелем, смесь антигенов, помещенная в лунки, разделяется на отдельные компоненты антигена в соответствии с их зарядом и размером. После электрофореза отделенные антигены вступают в реакцию со специфической антисывороткой, помещенной в желоба, параллельные электрофоретической миграции, и допускается диффузия. Антисыворотка, присутствующая в впадине, движется в направлении компонентов антигена, что приводит к образованию отдельных линий преципитации через 18-24 часа, каждая из которых указывает на реакцию между отдельными белками с его антителом.
Процедура иммуноэлектрофореза
- Агарозный гель готовят на предметном стекле, помещенном в горизонтальное положение.
- Используя образец шаблона, скважины осторожно переносятся в зону применения.
- Образец разбавляют 2: 3 раствором белкового разбавителя (20 мкл раствора антигена + 10 мкл разбавителя).
- Используя 5 мкл пипетки, 5 мкл контроля и образца наносят на каждую соответствующую щель (контрольная щель и щель для образца).
- Гель помещают в камеру электрофореза с образцами на катодной стороне, и электрофорез длится 20 минут / 100 вольт.
- После завершения электрофореза 20 мкл соответствующей антисыворотки добавляют во впадины во влажной камере и инкубируют в течение 18-20 часов при комнатной температуре в горизонтальном положении.
- Агарозный гель помещают в горизонтальное положение и сушат промокательной бумагой.
- Гель в солевом растворе замачивают в течение 10 минут, затем сушку и промывку повторяют дважды.
- Гель сушат при температуре менее 70 ° С и могут окрашивать белковым окрашивающим раствором в течение примерно 3 минут с последующей обесцвечиванием геля в течение 5 минут в ваннах с растворимым раствором.
- Гель сушат и результаты оценивают.
Результаты иммуноэлектрофореза
- Наличие эллиптических дуг преципитации представляет взаимодействие антиген-антитело.
- Отсутствие образования осадка предполагает отсутствие реакции.
- Различные антигены (белки) могут быть идентифицированы на основе интенсивности, формы и положения линий осаждения.
Применение иммуноэлектрофореза
- Тест помогает в идентификации и приблизительном квантовании различных белков, присутствующих в сыворотке.Иммуноэлектрофорез создал прорыв в идентификации белков и в иммунологии.
- Иммуноэлектрофорез используется у пациентов с подозрением на моноклональные и поликлональные гаммопатии.
- Метод используется для обнаружения нормальных, а также аномальных белков, таких как белки миеломы в сыворотке человека.
- Используется для анализа сложных белковых смесей, содержащих различные антигены.
- Использование в медицинской диагностике имеет значение, когда есть подозрение, что определенные белки отсутствуют (например,например, гипогаммаглобулинемия) или перепроизводится (например, множественная миелома).
- Этот метод полезен для контроля чистоты антигена и антигена-антитела и для идентификации одного антигена в смеси антигенов.
- Иммуноэлектрофорез является более старым методом для качественного анализа М-белков в сыворотке и моче.
- Иммуноэлектрофорез помогает в диагностике и оценке терапевтического ответа при многих болезненных состояниях, влияющих на иммунную систему.
Преимущества иммуноэлектрофореза
- Иммуноэлектрофорез — это мощный аналитический метод с высокой разрешающей способностью, поскольку он сочетает в себе разделение антигенов с помощью электрофореза и иммунодиффузию против антисыворотки.
- Основным преимуществом иммуноэлектрофореза является то, что в сыворотке крови можно идентифицировать ряд антигенов.
Ограничения иммуноэлектрофореза
- Иммуноэлектрофорез медленнее, менее чувствителен и труднее для интерпретации, чем иммунофиксационный электрофорез.
- IEP не может обнаружить некоторые небольшие моноклональные М-белки, поскольку наиболее быстро мигрирующие иммуноглобулины, присутствующие в самых высоких концентрациях, могут скрывать присутствие небольших М-белков.
- Использование иммуноэлектрофореза в анализе пищевых продуктов ограничено наличием специфических антител.
Список литературы
- Lydyard, P.M., Whelan, A., & Fanger, M.W. (2005). Иммунология (2-е изд.). Лондон: BIOS Scientific Publishers.
- Parija S.C. (2012). Учебник по микробиологии и иммунологии. (2-е изд.). Индия: еще Индия.
- http://www.hellabio.com/E89B86BA.en.aspx
- Актер, J.K. (2014). Оценка иммунных параметров и иммунодиагностика .Вводная иммунология. Страницы 135-152
- Sastry A.S. & Bhat S.K. (2016). Основы медицинской микробиологии. Нью-Дели: издательство Jaypee Brothers Medical.
Иммуноэлектрофорез — принцип, методика, результаты и применение, преимущества и ограничения
Категории Иммунология, Метки инструментовки Электрофорез, Иммуноэлектрофорез, Преимущества иммуноэлектрофореза, Применение иммуноэлектрофореза, Ограничения иммуноэлектрофореза, Принцип иммуноэлектрофореза, Процедура иммуноэлектрофореза, Результаты иммуноэлектрофореза Почтовая навигация ,
Последнее обновление: Sagar Aryal
- Ракетный иммуноэлектрофорез — это адаптация радиальной иммунодиффузии, разработанная Лореллом. Он также известен как электроиммунологический анализ или электроиммунодиффузия.
- Это называется «электрофорезом в ракете» из-за появления полос преципитации в форме конусообразных структур (внешний вид ракеты) в конце реакции.
- При ракетном иммуноэлектрофорезе антиген мигрирует в электрическом поле в слое агарозы, содержащей соответствующее антитело.
- Миграция антигена в сторону анода приводит к образованию осадков в форме ракеты. Площадь под ракетой пропорциональна концентрации антигена.
Цели ракетного иммуноэлектрофореза
- Для обнаружения комплексов антиген-антитело.
- Определите концентрацию антигена в неизвестном образце.
Принцип Ракетного Иммуноэлектрофореза
Ракетный иммуноэлектрофорез — это количественный одномерный метод электроиммунодиффузии. В этом способе антитело вводят в гель при значении рН, при котором антитела остаются по существу неподвижными. Антиген помещают в лунки, вырезанные в геле. Затем электрический ток пропускается через гель, что облегчает миграцию отрицательно заряженных антигенов в агар. Когда антиген выходит из лунки и попадает в агарозный гель, он соединяется с антителом, образуя иммунный комплекс, который становится видимым.На начальном этапе наблюдается значительный избыток антигена над антителом, и видимых осадков не происходит. Однако, когда образец антигена мигрирует дальше через агарозный гель, встречается все больше молекул антител, которые взаимодействуют с антигеном с образованием иммунного комплекса. Это приводит к образованию линии преципитации, которая имеет коническую форму, напоминающую ракету.
Чем больше количество антигена, загруженного в лунку, тем больше антиген должен будет пройти через гель, прежде чем он сможет взаимодействовать с достаточным количеством антитела для образования осадка.Таким образом, высота ракеты, измеренная от скважины до вершины и площади, прямо пропорциональна количеству антигена в образце.
Материалы, необходимые для ракетного иммуноэлектрофореза
Агароза, Антиген, Антисыворотка, Буфер для анализа, Аппарат для электрофореза, Стеклянные предметные стекла
Процедура Ракетного Иммуноэлектрофореза
- Готовят около 15 мл 1% агарозного геля.
- Раствор охлаждают до 55-60 o С и 250 мл антисыворотки добавляют к 13 мл раствора агарозы.Хорошо перемешивается для равномерного распределения антител.
- Раствор агарозы, содержащий антисыворотку, выливают на обезжиренную стеклянную пластину, расположенную на горизонтальной поверхности, и гель оставляют на 30 минут.
- Стеклянная пластинка находится на шаблоне и в лунках перфорирована с помощью гель-перфоратора.
- В лунки добавляют 10 мл образцов стандартного антигена и тестируемого антигена.
- 1X TBE-буфер заливают в емкость для электрофореза так, чтобы он просто покрывал гель.
- Электрофорез проводится при 80-120 вольт и 60-70 мА, пока антиген не пройдет 3-4 см от скважины.
- Стеклянную пластинку инкубируют во влажной камере в течение ночи при 37 o С и результаты интерпретируют.
- В случае положительной реакции, концы пиков преципитации отмечены, и высота пика измерена от верхнего края скважины до кончика пика.
- График зависимости высоты ракеты (по оси Y) от концентрации антигена (по оси X) на полулогарифмическом графике.Концентрация неизвестного определяется из графика путем нахождения концентрации против высоты ракеты.
Результат Интерпретация Ракетный иммуноэлектрофорез
- «Ракета» осаждения, распространяющаяся из загрузочной скважины, указывает на положительную реакцию или специфическую реакцию антиген-антитело из-за присутствия антитела, специфичного к антигену.
- Отсутствие осадков указывает на отсутствие реакции или отсутствие какого-либо соответствующего антитела — антигена.
- Высота ракеты и ее площадь прямо пропорциональны количеству антигена в образце, то есть высота пика преципитации зависит от концентрации антигенов, загруженных в соответствующие лунки.
Применения Ракетного Иммуноэлектрофореза
- Ракетный электрофорез используется в основном для количественной оценки антигена в сыворотке крови.
- Этот метод использовался для количественного определения сывороточных белков человека до того, как стали доступны автоматизированные методы.
- Определение концентрации конкретного белка в белковой смеси.
- При оценке активности иммуноглобулиновой протеазы.
- Исследования, касающиеся антигенных отношений между организмами.
- В ферментативной активности электрофореза.
Преимущества ракетного иммуноэлектрофореза
- Простой, быстрый и воспроизводимый метод.
- Несколько неизвестных образцов могут быть проанализированы на одной пластине.
- Концентрации белков всего 1 мкг / мл могут быть измерены, требуя всего 20 нг белка для загрузки в лунку.
Ограничения ракетного иммуноэлектрофореза
- Эти методы позволяют проводить количественный анализ антигенов, но не применимы к сложным смесям.
Связанные методы
Иммуноэлектрофорез с плавкой ракетой представляет собой модификацию одномерного количественного иммуноэлектрофореза, используемого для детального измерения белков во фракциях из экспериментов по разделению белков.
Двумерный иммуноэлектрофорез является вариантом ракетного электрофореза.Тест представляет собой двухэтапную процедуру. На первом этапе антигены в растворе разделяются электрофорезом. На втором этапе снова проводят электрофорез, но перпендикулярно таковому первого этапа, чтобы получить осадки, похожие на ракеты.
Список литературы
- Walker JM (1984). Ракетный иммуноэлектрофорез. Методы Мол Биол. (1): 317-23
- http://himedialabs.com/TD/HTI006.pdf
- Lydyard, P.M., Whelan, A., & Fanger, M.W. (2005).Иммунология (2-е изд.). Лондон: BIOS Scientific Publishers.
- Parija S.C. (2012). Учебник по микробиологии и иммунологии. (2-е изд.). Индия: еще Индия.
- Састры А.С. & Bhat S.K. (2016). Основы медицинской микробиологии. Нью-Дели: издательство Jaypee Brothers Medical.
,