Нан кисломолочный 1 состав: Смесь NAN 1 кисломолочный 400г с 0мес

Смесь NAN 1 кисломолочный 400г с 0мес

NAN Кисломолочный 1 – кисломолочная смесь, предназначенная для здоровых детей с рождения в случаях, когда грудное вскармливание невозможно. За счет особой технологии BIO-ферментации NAN Кисломолочный 1 обеспечивает дополнительную защиту, способствует легкому пищеварению и профилактике кишечных инфекций.

• Улучшает процессы пищеварения, а также придает дополнительные защитные свойства в отношении риска развития кишечных инфекций.
• Дети быстро привыкают к приятному и мягкому кисломолочному вкусу.

BIO-ферментация – особая технология, в результате которой смесь приобретает дополнительные защитные свойства, помогая снизить риск кишечных инфекций. Это процесс биологической ферментации продукта с помощью живых молочнокислых бактерий.

Бифидобактерии BL – живые пробиотические культуры, которые помогают укрепить иммунитет вашего малыша.

Состав: Молоко обезжиренное, сыворотка молочная, лактоза, пальмовый олеин, крахмал картофельный, мальтодекстрин, масло рапсовое низкоэруковое, кокосовое масло, подсолнечное масло, цитрат калия, кукурузный крахмал, цитрат кальция, хлорид магния, эмульгатор (соевый лецитин), витамины (А, Д, Е, К, С, В1, В2, РР, В6, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, В12, биотин, холин), L-фенилалаланин, гидрофосфат кальция, хлорид кальция, хлорид натрия, таурин, сульфат железа, инозит, L-гистидин, сульфат цинка, L-карнитин, культура термофильных бактерий (не менее 107 КОЕ/г), культура бифидобактерий (не менее 106 КОЕ/г), сульфат меди, сульфат марганца, йодид калия, селенат натрия. Продукт упакован в модифицированной атмосфере с азотом.

Дата изготовления (MAN), годен до (EXP) и номер партии указаны на дне банки.

До и после вскрытия продукт хранить при температуре не выше 25 °С и относительной влажности воздуха не более 75 %. Содержимое банки должно быть использовано в течение 3 недель после вскрытия, не рекомендуется хранить в холодильнике

Важное примечание:

• Для питания детей раннего возраста предпочтительнее грудное вскармливание. Идеальной пищей для грудного ребенка является молоко матери. Грудное вскармливание должно продолжаться как можно дольше. Перед тем как принять решение об искусственном вскармливании с использованием детской смеси, обратитесь за советом к медицинскому работнику.
• Смесь следует готовить непосредственно перед кормлением. Точно следуйте инструкции по приготовлению. Оставшаяся после кормления разведенная смесь не подлежит хранению и последующему использованию. Во время кормления необходимо поддерживать ребенка, чтобы он не поперхнулся. Когда ребенок подрастет, переходите на кормление из чашки.

ВНИМАНИЕ! Товар представлен в старом и новом дизайнах упаковок, вариант в поставке не гарантирован!

Смесь Nan-1 кисломолочный — калорийность, полезные свойства, польза и вред, описание

Калории, ккал: 

519

Углеводы, г: 

57.0

В смеси Nan-1 кисломолочный абсолютно отсутствую генетически модифицированные ингредиенты, красители, консерванты и ароматизаторы.

Это хорошо сбалансированный продукт, состав которого максимально приближен к молоку матери. Он обладает нежным кисломолочным вкусом. Смесь Nan-1 кисломолочный подходит для кормления деток с самого рождения.

Калорийность смеси Nan-1 кисломолочный

Калорийность смеси Nan-1 кисломолочный составляет 519 ккал на 100 грамм продукта.

Состав смеси Nan-1 кисломолочный

Кисломолочная сухая смесь Nan 1 состоит из: сыворотки деминерализованной, лактозы, масел растительных, молока обезжиренного, крахмала, мальтодекстрина, цитрата кальция, соевого лецитина, цитрата калия, хлорида магния, витаминов, хлорида натрия, хлорида кальция, таурина, L-гистидина, сульфата железа, сульфата цинка, инозитола, L-карнитина, культуры бифидобактерий, сульфата меди, йодида калия, сульфата марганца, биотина, селената натрия.

Витаминный состав продукта следующий: А (ретинол), D (эргокалициферол), Е (токоферол), К (филлохинон), В1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В6 (пиридоксин), B5 (пантотеновая кислота), В12(цианокобаламин), В9 (фолиевая кислота), С (аскорбиновая кислота), B7 (биотин), B3 (ниацин). Присутствуют в нём и такие минеральные вещества, как натрий, калий, кальций, фосфор, хлор, магний, железо, цинк, медь, йод.

Полезные свойства смеси Nan-1 кисломолочный

Смесь Nan-1 кисломолочный показана к применению при:

• умеренно выраженных функциональных нарушениях пищеварения;
• профилактике развития диареи;
• восстановлении после перенесенной диареи;
• профилактике дисбактериоза кишечника.

То есть в питание детей её вводят для лечения и профилактики.

В составе смеси Nan-1 кисломолочный содержится уникальная комбинация защитных элементов («Первая защита»), содействующая укреплению и активизации детского иммунитета на начальном этапе жизни.

Функцию укрепления иммунитета, а также поддержания здоровой микрофлоры ЖКТ и защиты от кишечных инфекций выполняют бифидобактерии BL. Содействует этому и BIO ферментация смеси.

Присутствует в смеси и белок OPTI PRO 1, который за счёт оптимизации легко усваивается и обеспечивает рост и развитие.

Мальтодекстрин в составе смеси Nan-1 кисломолочный – это заменитель крахмала, который получен путём его ферментного расщепления (калоризатор). Его отличает сладковатый вкус, хорошая усвояемость и гипоаллергенность. Кроме того, он содействует лучшему усвоению витаминов и минералов.

Противопоказания смеси Nan-1 кисломолочный

Внимание, перед тем как переводить ребёнка на искусственное вскармливание обратитесь за консультацией к врачу. Помните, что идеальной пищей для малыша является грудное молоко.

Как использовать смесь Nan-1 кисломолочный

Для приготовления смеси Nan-1 кисломолочный необходимо в чистую стерилизованную бутылочку влить половину от требуемого объёма жидкости (кипячёной, остуженной до 37 градусов воды) и всыпать в неё необходимое количество сухого продукта (calorizator). Затем встряхивать содержимое бутылочки до полного растворения, влить вторую половину жидкости и повторно встряхнуть.

Температура готовой семи должна быть около 37 градусов, проконтролируйте её на внутренней стороне запястья. После этого можно приступать к кормлению.

Предлагайте ребёнку только свежеприготовленную смесь. Не используйте остатки готовой смеси от предыдущих кормлений.

Для определения необходимого количества ингредиентов используйте таблицу кормления.

Чтобы получить 100 мл. жидкой смеси требуется 90 мл. воды и 3 мерные ложки (без горки) сухого продукта.

Как хранить смесь Nan-1 кисломолочный

Смесь Nan-1 кисломолочный подлежит хранению в течение 18-ти месяцев. Вскрытый продукт следует использовать в течение 3-х недель.

Смесь NAN Кисломолочный 1 с рождения: отзывы, состав

ТАБЛИЦА ПИЩЕВОЙ ЦЕННОСТИ

Основные компоненты
Белки (казеин / белки молочной сыворотки 30/70)	1,33 г
Жиры	3,55 г
Углеводы	7,43 г
Лактоза (65,5% от общего количества углеводов)	4,9 г
Крахмал	1,3 г

Жирные кислоты
Линолевая кислота (15,5% от суммы ж.к.)	0,55 г
α-линоленовая кислота	67 мг

Минеральные вещества
Зола	0,25 г
Натрий	18 мг
Калий	62 мг
Хлориды	42 мг
Кальций	40 мг
Фосфор	21 мг
Магний	6,7 мг
Марганец	15,38 мкг
Селен	1,92 мкг
Железо	0,7 мг
Йод	14,7 мкг
Медь	0,05 мг
Цинк	0,69 мг

Витамины
Витамин А	227 МЕ/МО
Витамин А	68 мкг PE-экв ретинола
Витамин Д	40 МЕ/МО
Витамин Д	1 мкг
Витамин Е	1,55 МЕ/МО
Витамин Е	1,03 мг-экв
Витамин К	5,6 мкг
Витамин С	12,17 мг
Витамин B1	0,07 мг
Витамин B2	0,12 мг
Ниацин PP	0,54 мг
Витамин В6	0,04 мг
Фолиевая кислота	10 мкг
Пантотеновая кислота	0,4 мг
Витамин В12	0,15 мкг
Биотин	1,67 мкг
Холин	6,92 мг
Инозит	4,87 мг
Таурин	4,36 мг
L–карнитин	1,73 мг

Молоко обезжиренное, сыворотка молочная, лактоза, пальмовый олеин, крахмал картофельный, мальтодекстрин, масло рапсовое низкоэруковое, кокосовое масло, подсолнечное масло, цитрат калия, кукурузный крахмал, цитрат кальция, хлорид магния, эмульгатор (соевый лецитин), витамины (А, Д, Е, К, С, В1, В2, РР, В6, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, В12, биотин, холин), L-фенилалаланин, гидрофосфат кальция, хлорид кальция, хлорид натрия, таурин, сульфат железа, инозит, L-гистидин, сульфат цинка, L-карнитин, культура термофильных бактерий (не менее 107 КОЕ/г), культура бифидобактерий (не менее 106 КОЕ/г), сульфат меди, сульфат марганца, йодид калия, селенат натрия.

 

Пищевая ценность

 

В 100 мл готовой смеси:

• калорийность — 67 ккал;
• энергетическая ценность — 281 кДж.

Осмоляльность — 296 мОсм/кг.

NAN® Кисломолочный 1 Сухая кисломолочная смесь для детей с рождения, 400 г

Полное описание

NAN® Кисломолочный 1  — кисломолочная смесь, предназначенная для здоровых детей с рождения в случаях, когда грудное вскармливание невозможно. За счет особой технологии BIO-ферментации NAN® Кисломолочный 1 обеспечивает дополнительную защиту, способствует легкому пищеварению и профилактике кишечных инфекций. NAN® Кисломолочный 1 улучшает процессы пищеварения, а также придает дополнительные защитные свойства в отношении риска развития кишечных инфекций. Дети быстро привыкают к приятному и мягкому кисломолочному вкусу.

BIO-ферментация — особая технология, в результате которой смесь приобретает дополнительные защитные свойства, помогая снизить риск желудочно-кишечных инфекций. Это процесс биологической ферметации продукта с помощью живых молочнокислых бактерий.
Бифидобактерии Bl — живые пробиотические культуры, которые помогают укрепить иммунитет вашего малыша.

ВАЖНОЕ ПРИМЕЧАНИЕ
Идеальной пищей для грудного ребенка является молоко матери.  Грудное вскармливание должно продолжаться как можно дольше. Перед тем как принять решение об искусственном вскармливании с использованием детской смеси, обратитесь за советом к медицинскому работнику. Возрастные ограничения указаны на упаковке товаров в соответствии с законодательством РФ. 

Смесь предназначена для кормления здоровых детей с рождения в случаях, когда грудное вскармливание невозможно. Продукт изготовлен из сырья, произведенного специально отобранными поставщиками, без использования генетически модифицированных ингредиентов, консервантов, красителей и ароматизаторов. 

Состав: 

Молоко обезжиренное, сыворотка молочная, лактоза, пальмовый олеин, крахмал картофельный, мальтодекстрин, масло рапсовое низкоэруковое, кокосовое масло, подсолнечное масло, цитрат калия, кукурузный крахмал, цитрат кальция, хлорид магния, эмульгатор (соевый лецитин),  витамины (А, Д, Е, К, C, В1, В2, PP, В6, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, В12, биотин, холин), L-фенилаланин, гидрофосфат кальция, хлорид кальция, хлорид натрия, таурин, сульфат железа, инозит, L-гистидин, сульфат цинка, L-карнитин, культура термофильных бактерий (не менее 10⁶ КОЕ/г), культура бифидобактерий (не менее 10^7 КОЕ/г), сульфат меди, сульфат марганца, йодид калия, селенат натрия.

До и после вскрытия продукт хранить при температуре не выше 25 ℃ и относительной влажности не более 75 %. Содержимое банки должно быть использовано в течение 3-х недель после вскрытия, не рекомендуется хранить в холодильнике.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ
Смесь следует готовить непосредственно перед  кормлением. Точно следуйте инструкции по приготовлению. Оставшаяся после кормления разведенная смесь не подлежит хранению и последующему использованию. Во время кормления необходимо поддерживать ребенка, чтобы он не поперхнулся. Когда ребенок подрастет, переходите на кормление из чашки.  Использование некипяченой воды и непрокипяченных бутылочек, а также неправильное хранение, транспортировка, приготовление и кормление могут привести к неблагоприятным последствиям для здоровья ребенка.

Примечание: Для сохранения количества живых бактерий, вскипяченную воду следует остудить примерно до температуры тела (37 ℃) и затем добавить сухой порошок. Для приготовления смеси необходимо использовать приложенную мерную ложку, заполненную без горки. Разведение неправильного количества порошка — большего или меньшего по сравнению с количеством, указанным в  таблице — может привести к обезвоживанию организма ребенка или нарушению его питания. Указанные пропорции нельзя изменять без совета медицинского работника. В этом возрасте часто рекомендуют постепенно вводить в рацион ребенка каши, овощи, фрукты, мясо и рыбу. Ввиду индивидуальных различий в потребностях детей обратитесь за советом к медицинскому работнику. Если вашим врачом рекомендовано более раннее введение новых продуктов, уменьшите количество смеси в соответствии с рекомендациями.

До и после вскрытия продукт хранить при температуре не выше 25 ℃ и относительной влажности не более 75 %. Содержимое банки должно быть использовано в течение 3-х недель после вскрытия, не рекомендуется хранить в холодильнике.    

Срок годности: 18 мес. Дата изготовления (MAN), годен до (EXP) и номер партии указаны на дне банки.
Страна-производитель: Швейцария
Компания-производитель: Nestle Suisse S.A.

ВНИМАНИЕ! ТОВАР НЕ ПОДЛЕЖИТ ВОЗВРАТУ И ОБМЕНУ. 

Детское питание, питание для беременных и кормящих матерей НЕ ПОДЛЕЖИТ обмену/возврату. Закон РФ «О защите прав потребителей» от 07.02.1992 N 2300-1

Калорийность Смесь Nan-1 кисломолочный [Детское питание]. Химический состав и пищевая ценность.

Химический состав и анализ пищевой ценности

Пищевая ценность и химический состав

«Смесь Nan-1 кисломолочный [Детское питание]».

В таблице приведено содержание пищевых веществ (калорийности, белков, жиров, углеводов, витаминов и минералов) на 100 грамм съедобной части.

Нутриент	Количество	Норма**	% от нормы в 100 г	% от нормы в 100 ккал	100% нормы
Калорийность	519 кКал	1684 кКал	30.8%	5.9%	324 г
Белки	10.4 г	76 г	13.7%	2.6%	731 г
Жиры	27.7 г	56 г	49.5%	9.5%	202 г
Углеводы	57 г	219 г	26%	5%	384 г

Энергетическая ценность Смесь Nan-1 кисломолочный [Детское питание] составляет 519 кКал.

Основной источник: Интернет. Подробнее.

** В данной таблице указаны средние нормы витаминов и минералов для взрослого человека. Если вы хотите узнать нормы с учетом вашего пола, возраста и других факторов, тогда воспользуйтесь приложением «Мой здоровый рацион».

Смесь Nestle NAN 1 Кисломолочный 400 г

NAN® Кисломолочный 1 — полностью сбалансированная сухая кисломолочная смесь, которая обеспечит Вашего ребенка всеми нутриентами, необходимыми для его гармоничного развития. NAN® Кисломолочный 1 помогает нормализовать микрофлору, улучшить пищеварение и защитить от кишечных инфекций; способствует развитию и укреплению иммунитета малыша.

NAN® (НАН) Кисломолочный 1 Сухая адаптированная кисломолочная смесь с с бифидо- и лактобактериями для питания детей с рождения, 400 г

Преимущества продукта:

• Белок OPTIPRO® – это оптимизированный белковый комплекс, который обеспечивает необходимое количество белка для оптимального роста и развития малыша, не перегружая его еще незрелые органы; легко усваивается.
• Живые бифидобактерии BL помогают укрепить иммунитет Вашего малыша и поддерживают здоровую микрофлору кишечника. BIO ферментация смеси и живые бифидобактерии: — улучшают процессы пищеварения; — поддерживают здоровую микрофлору кишечника; — способствуют защите от кишечных инфекций.

Идеальной пищей для грудного ребенка является молоко матери. Грудное вскармливание должно продолжаться как можно дольше. Перед тем как принять решение об искусственном вскармливании с использованием детской смеси, обратитесь за советом к медицинскому работнику. Возрастные ограничения указаны на упаковке товаров в соответствии с законодательством РФ. Смесь предназначена для кормления здоровых детей с рождения в случаях, когда грудное вскармливание невозможно. Продукт изготовлен из сырья, произведенного специально отобранными поставщиками, без использования генетически модифицированных ингредиентов, консервантов, красителей и ароматизаторов.

Состав: Молоко обезжиренное, сыворотка молочная, лактоза, пальмовый олеин, крахмал картофельный, мальтодекстрин, масло рапсовое низкоэруковое, кокосовое масло, подсолнечное масло, цитрат калия, кукурузный крахмал, цитрат кальция, хлорид магния, эмульгатор (соевый лецитин), витамины (А, Д, Е, К, C, В1, В2, PP, В6, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, В12, биотин, холин), L-фенилаланин, гидрофосфат кальция, хлорид кальция, хлорид натрия, таурин, сульфат железа, инозит, L-гистидин, сульфат цинка, L-карнитин, культура термофильных бактерий (не менее 107 КОЕ/г), культура бифидобактерий (не менее 106 КОЕ/г), сульфат меди, сульфат марганца, йодид калия, селенат натрия.До и после вскрытия продукт хранить при температуре не выше 25 ℃ и относительной влажности не более 75 %.

Условия хранения: До и после вскрытия продукт хранить при температуре не выше 25 ℃ и относительной влажности не более 75 %. Содержимое банки должно быть использовано в течение 3-х недель после вскрытия, не рекомендуется хранить в холодильнике. Срок годности: 18 мес. Дата изготовления (MAN), годен до (EXP) и номер партии указаны на дне банки.»

Обращаем ваше внимание! Цена действительна в интернет-магазине votonia.ru и может отличаться от цены в розничных магазинах.

NAN® Кисломолочный 2 Сухая кисломолочная смесь для детей с 6 месяцев, 400гр

NAN® (НАН) Кисломолочный 2 Сухая адаптированная кисломолочная смесь с с бифидо- и лактобактериями для питания детей с 6 месяцев, 400 г.
Страна-производитель: Швейцария.

NAN® Кисломолочный 2  — полностью сбалансированная сухая кисломолочная смесь, которая обеспечит Вашего ребенка всеми нутриентами, необходимыми для его гармоничного развития.
NAN® Кисломолочный 2 помогает нормализовать микрофлору, улучшить пищеварение и защитить от кишечных инфекций; способствует развитию и укреплению иммунитета малыша.
Преимущества продукта:
Белок OPTIPRO® – это оптимизированный белковый комплекс,который обеспечивает необходимое количество белка для оптимального роста и развития малыша, не перегружая его еще незрелые органы; легко усваивается.
Живые бифидобактерии  BL помогают укрепить иммунитет Вашего малыша и поддерживают здоровую микрофлору кишечника.
BIO ферментация смеси и живые бифидобактерии:
— улучшают процессы пищеварения;
— поддерживают здоровую микрофлору кишечника;
— способствуют защите от кишечных инфекций.

Идеальной пищей для грудного ребенка является молоко матери. Грудное вскармливание должно продолжаться как можно дольше. Перед тем как принять решение об искусственном вскармливании с использованием детской смеси, обратитесь за советом к медицинскому работнику. Возрастные ограничения указаны на упаковке товаров в соответствии с законодательством РФ.

Смесь предназначена для кормления здоровых детей с 6 месяцев и является молочной составляющей рациона ребенка в период введения прикрорма. Смесь не может служить заменителем грудного молока в течение первых 6 месяцев жизни ребенка.Продукт изготовлен из сырья, произведенного специально отобранными поставщиками, без использования генетически модифицированных ингредиентов, консервантов, красителей и ароматизаторов.

Состав: Обезжиренное молоко, мальтодекстрин,  лактоза, сыворотка молочная, пальмовый олеин, крахмал картофельный, масло рапсовое низкоэруковое, кокосовое масло, подсолнечное масло, фосфат кальция, кукурузный крахмал, цитрат кальция, цитрат натрия, эмульгатор (соевый лецитин), хлорид калия, витамины (А, Д, Е, К, C, В1, В2, PP, В6, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, В12, биотин), сульфат железа, карбонат магния, культура термофильных бактерий (не менее 107 КОЕ/г), культура бифидобактерий (не менее 106 КОЕ/г), сульфат цинка, сульфат меди, йодид калия, селенат натрия.

До и после вскрытия продукт хранить при температуре не выше 25 ℃ и относительной влажности воздуха не более 75 %. Содержимое банки должно быть использовано в течение 3-х недель после вскрытия, не рекомендуется хранить в холодильнике.  Срок годности: 18 мес.  Дата изготовления (MAN), годен до (EXP) и номер партии указаны на дне банки.

Предупреждение. Смесь следует готовить непосредственно перед  кормлением. Точно следуйте инструкции по приготовлению. Оставшаяся после кормления разведенная смесь не подлежит хранению и последующему использованию. Во время кормления необходимо поддерживать ребенка, чтобы он не поперхнулся. Когда ребенок подрастет, переходите на кормление из чашки.  Использование некипяченой воды и непрокипяченных бутылочек, а также неправильное хранение, транспортировка, приготовление и кормление могут привести к неблагоприятным последствиям для здоровья ребенка.Примечание. Для сохранения количества живых бактерий, вскипяченную воду следует остудить примерно до температуры тела (37 ℃) и затем добавить сухой порошок. Для приготовления смеси необходимо использовать приложенную мерную ложку, заполненную без горки. Разведение неправильного количества порошка — большего или меньшего по сравнению с количеством, указанным в  таблице — может привести к обезвоживанию организма ребенка или нарушению его питания. Указанные пропорции нельзя изменять без совета медицинского работника. В этом возрасте часто рекомендуют постепенно вводить в рацион ребенка каши, овощи, фрукты, мясо и рыбу. Ввиду индивидуальных различий в потребностях детей обратитесь за советом к медицинскому работнику. Если вашим врачом рекомендовано более раннее введение новых продуктов, уменьшите количество смеси в соответствии с рекомендациями.

Негидролизованная кисломолочная смесь снижает пищеварительные и респираторные явления у младенцев с высоким риском аллергии

Цели

Основная цель этого многоцентрового рандомизированного двойного слепого контролируемого исследования заключалась в определении влияния молока HKBBST на частота сенсибилизации CMA и CM у детей с высоким риском атопии.

Вторичные цели заключались в определении влияния молока HKBBST на (i) частоту сенсибилизации и / или аллергии на другие аллергены, кроме CM, и (ii) частоту аллергических симптомов в течение периода исследования.

Субъекты

Здоровые дети мужского и женского пола с семейным анамнезом аллергии в одном из двух центров (отделение неонатологии, больница Сен-Винсент де Поль, Париж, Франция, или отделение внутренней медицины, клинической иммунологии и аллергологии, университетская больница Нанси) , Нанси, Франция) или у одного из 16 частных исследователей аллергологов. Дети были рандомизированы в последовательном порядке возрастания для получения стандартной детской смеси (SIF) или молока HKBBST. Список рандомизации был создан независимым статистиком (OPTIMED, Гренобль, Франция) и хранится в конфиденциальном порядке до получения одобрения исследования, которое будет разблокировано для анализа.Рандомизация проводилась после отбора (например, до конца пятого месяца беременности). Для контроля возможного эффекта грудного вскармливания женщины, желающие кормить грудью, были случайным образом распределены между группами. Размер выборки был рассчитан на основе первичного результата. Средний процент детей из группы риска, у которых действительно развиваются аллергические проявления, довольно неточен, от 6 до 20%, причем риск примерно разделен на два по пробиотикам (Saarinen et al., 1999; Exl and Fritsche, 2001; Kalliomaki et al., 2001). Основываясь на этих данных, для отклонения двусторонней нулевой гипотезы с ошибкой I типа 5% и ошибкой II типа 30% необходимо было включить не менее 62 детей в группу, всего 124 ребенка. Перед тем, как предпринимать какие-либо действия в рамках исследования, исследователь получил письменное согласие обоих родителей или законного представителя. Протокол был одобрен французским этическим комитетом, и исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией (пересмотренной в 2004 г.), нормативными положениями, применимыми во Франции, и надлежащей клинической практикой. Исследование было зарегистрировано на сайте www.clinicaltrial.gov под номером NCT00792090.

Критерии включения

Критерии включения: беременность менее 6 месяцев и семья, подверженная риску атопии: как минимум два атопических члена, включая как минимум одного из родителей (например, мать и / или отец и / или как минимум один брат или сестра). Дети с известным или предполагаемым иммунодефицитом в семье не включались. Кроме того, поскольку фактическое использование формулы не могло быть определено у детей без известной даты отлучения от груди, они были исключены из анализа.

Вмешательства

Отбор включал осмотр аллерголога и собеседование с диетологом. Заполнялись медицинские и диетические анкеты, матерям объясняли, какую диету следует соблюдать до четвертого месяца после рождения, и давали рекомендации по предотвращению атопии. Матерям, желающим кормить грудью, рекомендуется делать это до шестого месяца после рождения. С пятого месяца беременности мать должна была принимать добавки с кальцием и избегать арахиса, орехов, яиц и кисломолочных продуктов, а также продуктов, содержащих пребиотики или пробиотики (разрешено коммерческое молоко).Фактическое включение было при рождении ребенка без дополнительных посещений. Затем родители должны были заполнить дневник, собирая данные об отлучении от груди и использовании молока или смеси. Каждый день от рождения до конца грудного вскармливания матери детей, вскармливаемых исключительно грудью, должны были выпивать не менее 500 мл молока, к которому их ребенок был рандомизирован. Диетолог проверил соблюдение диеты и ее переносимость матерями. Следующие посещения были через 4 месяца после рождения (± 2 недели), через 12 месяцев (± 2 недели) и 24 месяца (± 4 недели). Во время посещений аллерголог обследовал ребенка, заполнил демографические и медицинские анкеты, собрал информацию о нежелательных явлениях (НЯ) и ПААЭ и систематически провел кожные прик-тесты (СПТ).В случае подозрения на аллергию аллерголог мог провести тест на атопический пластырь (APT) или количественное определение специфического IgE в соответствии со стандартными процедурами. Диетолог объяснил, что диета следует соблюдать в течение следующих месяцев (постепенное разнообразие), и заполнил диетический опросник. По окончании грудного вскармливания дети постепенно переходили на смесь, на которую они были рандомизированы. Дети, находящиеся на частичном грудном вскармливании, с рождения получали те смеси, на которые их положили. Формулу нужно было использовать до 1 года.Родители посещали аллерголога каждый раз, когда появлялось клиническое проявление.

Изучаемые продукты

Контрольным был SIF (Галлия, Бледина, Франция). Формула HKBBST имела тот же питательный состав, что и SIF, но была ферментирована B. breve C50 (4,2 × 10 ⁹ бактерий на 100 г порошковой формулы) и S. thermophilus 065 (3,84 × 10 ⁷ бактерий. на 100 г порошковой формулы) в процессе производства, а затем нагревают для уничтожения ферментов (запатентованная технология, Blédina, Франция).Внешний вид, вкус и запах двух продуктов были похожи. Аллерголог, диетолог и мать не знали о назначенном продукте в течение всего исследования, вплоть до анализа данных последних результатов.

Измерение результатов

Считалось, что у детей была аллергия на CM и / или на другой пищевой аллерген, когда пероральная пища (OFC) была положительной. Дети считались сенсибилизированными к пищевому аллергену в случае положительных кожных тестов (SPT или APT) или положительных специфических IgE, независимо от аллергоподобных симптомов.

Собранные данные и проведенные тесты

Потенциально аллергические нежелательные явления

OFC, выполняемые только после 6 месяцев, врачей было предложено собрать AE и определить те, которые, как было показано, связаны с развитием аллергии в течение первых месяцев жизни (PAAE) (Vandenplas et al., 2007; Host et al., 2008; Kvenshagen et al., 2008) (Рисунок 1). ПААЭ были сгруппированы в три категории: (i) кожные симптомы включали атопический дерматит, крапивницу, ангионевротический отек, экзему, сухость кожи в сочетании с другим симптомом, сыпь и зуд, (ii) пищеварительные симптомы включали симптомы верхних отделов пищеварения (рвота и гастроэзофагеальный рефлюкс), симптомы нижнего пищеварительного тракта (острая диарея, колит, боль в животе, запор, вздутие живота и ректальное кровотечение) и связанные с ними общие симптомы (обморок или преходящая гипотония и задержка развития) и (iii) респираторные симптомы, включая хрипы, хрипы и бронхиты, а также спастические бронхиты. Тяжесть пищеварительных симптомов косвенно оценивалась с помощью кривой роста с появлением задержки развития. Каждый НЯ был аннотирован аллергологом и отмечен как незначительный, средний или тяжелый.

Рисунок 1

Дерево решений тестов, выполненных во время исследования. Количественная оценка IgE и тесты на атопические пластыри проводились только для CM и пищевых аллергенов.

Кожный укол

SPT были стандартизированы и систематически выполнялись при каждом посещении. Они были изготовлены по методу «укол в укол» (Дреборг, 1991).SPT к пищевым аллергенам включал CM, куриное яйцо, треску, пшеничную муку, соевую муку и жареный арахис. SPT к экстрактам аэроаллергенов включал Dermatophagoïdes pteronyssinus , перхоть кошек и собак, смесь пыльцы трав, пыльцы березы и Alternaria alterna (Allerbio Laboratories, Варен-ан-Аргон, Франция). Систематически выполняли положительный контроль (9% фосфат кодеина) и отрицательный контроль (растворитель, например, физиологический раствор). SPT считался положительным, если средний диаметр волдыря составлял> 75% волдыря в положительном контроле или ≥3 мм.

Тест на атопический пластырь

APT были стандартизированы и выполнялись с использованием камеры Финна, закрытой в течение 48 часов, в соответствии с методом, описанным Kekki et al. (1997). APT проводили с CM, куриным яйцом, треской, пшеничной мукой, соевой мукой и жареным арахисом. Чтение производилось через 72 часа.

APT был признан положительным в соответствии с критериями консенсусных совещаний Международной исследовательской группы по контактному дерматиту и Европейской целевой группы по атопическому дерматиту (Turjanmaa et al., 2006).

Обнаружение IgE

Кровь брали при подозрении на аллергию. Специфические IgE к CM или пищевому аллергену количественно оценивались с помощью ImmunoCap (Phadia, Uppsala, Sweden) и считались положительными при количестве баллов ≥0,35 kUI / л.

Проба с пероральной пищей

Дети с подозрением на CMA были отправлены в OFC-CM после 2 месяцев элиминационной диеты и исчезновения симптомов. Если OFC был отрицательным или сомнительным, проводили второй двойной слепой анализ OFC, сравнивая CM с плацебо (Neocate, Nutricia SHS International, Ливерпуль, Великобритания).

Критериями, рассматриваемыми для положительного результата OFC на CM, были начало, повторное появление или ухудшение экземы, крапивница, ангионевротический отек, анафилактический шок, изменение гемодинамики, обморок, кашель, одышка, свистящее дыхание, диарея, боль в животе, рвота и запор. По данным Garcia-Ara et al. (2001), которые ранее показали положительную прогностическую ценность аллергии на CM> 95% для детей <12 месяцев, когда специфический уровень IgE> 5 kU / l. OFC не выполняли, если SPT на CM был положительным, а специфические IgE были> 5 kUI / л.По этическим соображениям пероральное заражение не проводилось в случае анафилактического шока, отека гортани, тяжелой астмы или каких-либо опасных для жизни иммуноаллергических жалоб в анамнезе. Поскольку проявления пищевой аллергии с симптомами пищеварения могут длиться> 72 ч, за OFC иногда следовала провокация с домашним питанием. ОФК выполняли как можно раньше, но никогда в возрасте до 6 месяцев.

Статистический анализ

Тесты были двусторонними, и уровень значимости ( α ) был установлен на 0.05. χ ² и точные тесты Фишера использовались для качественных переменных (тест: положительный или отрицательный / наблюдаемый симптом: да или нет): тестирование кожи или IgE, кожные, пищеварительные, общие и респираторные симптомы. Представленные здесь результаты относятся к популяциям Per-Protocol, которые не показали существенных различий по сравнению с популяциями ITT. Статистический анализ проводился с использованием SAS, версия 8.2 (Институт SAS, Кэри, Северная Каролина, США).

Состав бактериальной микробиоты естественно ферментированного молока определяется как географическим происхождением, так и типом образца.

Натурально ферментированные молочные продукты содержат богатое микробное разнообразие.Это исследование было направлено на предоставление обзора биоразнообразия бактериальной микробиоты по 85 образцам, ранее собранным в большом регионе Китая, Монголии и России. Данные из этих 85 образцов, включая 55 йогуртов, 18 ферментированных естественным образом молока яка, 6 кумиссов и 6 сыров, были получены и коллективно проанализированы. Наиболее распространенными типами, общими для всех образцов, были Firmicutes , Proteobacteria , Bacteroidetes и Actinobacteria , которые вместе составляли 99% бактериальных последовательностей.Преобладающими родами были Lactobacillus , Lactococcus , Streptococcus , Acetobacter , Acinetobacter , Leuconostoc и Macrococcus , которые вместе соответствовали 96,63% бактериальных последовательностей. Дальнейший многомерный статистический анализ выявил значительные различия в структуре микробиоты в зависимости от географического происхождения и типа выборки. Во-первых, на графике основных координат выборки, представляющие 3 основных региона сбора образцов (Россия, Синьцзян и Тибет), в основном располагались соответственно в верхнем левом, нижнем правом и нижнем левом квадрантах, хотя имело место небольшое перекрытие.Напротив, образцы из второстепенных районов отбора проб (Внутренняя Монголия, Монголия, Ганьсу и Сычуань) преимущественно распределялись в нижнем левом квадранте. Эти результаты предполагают возможную связь между географическим происхождением образца и составом микробиоты. Во-вторых, структура бактериальной микробиоты была стратифицирована по типу образца. В частности, микробиота сыра сильно отличалась от других типов образцов из-за высокого содержания в нем Lactococcus и Streptococcus .Микробиота ферментированного молока яка больше всего напоминала йогурты. Образцы кумыса имели наименьшее микробное разнообразие и богатство. В заключение, как географическое происхождение, так и тип образца определяют микробное разнообразие естественно ферментированного молока.

Пробиотическая молочная композиция, пищевые и терапевтические аспекты

Otles и Cagindi: Kefir: A Probiotic Dairy-Composition

58

Ссылки

Akalin, S. and S. Ötles, 2002. Beslenmede

.Гида, 9: 70-74.

Аноним, 1992. Международная молочная федерация.

Общий стандарт идентификации для ферментированного молока

, 163: 4.

Арихара, К., Т. Тоба и С. Адачи, 1990.

Иммунофлуоресцентные микроскопические исследования

распределения L. kefiranofaciens и L. kefir в кефире

зерна. Int. J. Food Microbiol., 11: 127 — 34.

Cevikbas, A., E. Yemni, F. W. Ezzedenn и T. Yardimici,

1994. Противоопухолевые, антибактериальные и противогрибковые

активности кефира и кефирного зерна.Фито. Res., 8:

78-82.

Чайтов, Л. и Н. Тренев, 2002. Пробиотики. Наташа

Тренева Сайт. www. Natren.com

Дриссен, Ф. М. и Р. Бур, 1989. Ферментированное молоко с

отобранными кишечными бактериями: тенденция улучшения здоровья в новых продуктах

. Нет. Молочное молоко J., 43: 367-382.

Gilland, S. E., 1989. Молочные продукты Acidophilus: обзор

потенциальных преимуществ для потребителя. J. Dairy Sci., 72:

2483-2494.

Гончарова Г.И., Семенова Л.П., Козлова Е.П., А.М.

Лянная, К.С. Ладодо, Г.В. Яцык, В.И.

Чистякова, 1979. Влияние различных видов кормов

для новорожденных на микробиоценоз кишечника.

Вопр. Pitan., 6: 49-53.

Горбач С.Л., 1996. Открытие Л.Г. Питание

Сегодня 31: 2С — 4С.

Комаи, М. и М. Нанно, 1992. Микрофлора кишечника и продолжительность жизни

. В: Накадзава Ю., Хосоно, А. (Ред.),

Функции кисломолочного молока. Elsevier Applied

Science, Лондон, стр: 343.

Фернандес, К. Ф. , К. М. Шахани и М. А. Амер, 1987.

Терапевтическая роль диетических лактобактерий и

молочных продуктов, ферментированных лактобациллами. FEMS:

Microbiol. Rev., 46: 343-356.

Друг, Б. А. и К. М. Шахани, 1984. Пищевые и

терапевтические аспекты лактобацилл. J. Appl. Nutr., 36:

125-153.

Фуллер Р., 1989. Обзор: Пробиотики у человека и

животных. J. Appl. Бактериальные., 66: 365-378.

Фуллер Р., 1999. Пробиотики. В: Гибсон, Г. andNewsletter, №: 11.

Роберфроид, М. Б. (ред.), Colonic Microbiota Nutrition

и Health. Kluwer Academic publishers, London,

pp: 89-101.

Фурукава, Н., А. Мацуока и Ю. Яманака, 1990.

Влияние перорального йогурта и кефира на рост опухоли

у мышей.J. Япония. Soc. Nutr. Food Sci.,

43: 450-453.

Фурукава, Н., А. Мацуока, Т. Такахаши и Ю.

Яманака, 1991. Влияние ферментированного молока на реакцию гиперчувствительности замедленного типа

и выживаемость

дней у мышей, несущих Meth-A. Anim. Sci. Tec., 62:

579-585.

Hallé, C., F. Leroi, X. Dousset and M. Pidoux, 1994. Les

kéfirs: des association bactéries lactiques —

levures. В Руассар де Х., Люке, Ф. (Eds.),

Bactéries lactiques: Aspects fondamentaux et

technologiques. Vol. 2. Uriage, France, Lorica, pp:

169–182.

Хосоно, А., Т. Танабе и Х. Отани, 1990. Связывание

свойств молочнокислых бактерий, выделенных из кефирного

молока, с мутагенными пиролизатами аминокислот.

Milchwiss., 45: 647-651.

Karagozlu, C. and G. Kavas, 2000. Alkollü fermente süt

içecekleri: Kefir ve kimizin özellikleri ve insan

beslenmesindeki önemi.Гида, 6: 86-93.

Klupsch, H. J., 1985. Человек и микрофлора — Bioghurt,

Biogarde. S. Afr. J. Dairy Tec., 17: 153-156.

Королева Н.С., 1988. Технология кефира и кумыса.

IDF Bull. , 227: 96-100.29.

Крогер М., 1993. Кефир. Кисломолочные продукты. J., 28: 26-29.

Kurmann, J. A., J. Lj. Расич и М. Крогер, 1992.

Энциклопедия кисломолочных продуктов.

Ван Ностранд, Райнхольд, Нью-Йорк.

Libudzisz, Z.и А. Пяткевич, 1990. Производство кефира

в Польше. Молочная Инд. Инт., 55: 31-33.

Лилли, Д. М. и Р. Х. Стиллвелл, 1965. Пробиотики: факторы, способствующие росту

, продуцируемые микроорганизмами

Sci., 147: 747-748.

Мечников Э., 1907. В «Продление жизни»:

оптимистических исследования. К. Митчелл (ред.), Уильям

Хайнеманн, Лондон.

Мурофуши М., М. Шиоми и К. Айбара, 1983. Влияние полисахарида

, вводимого перорально из кефирного зерна

, на гиперчувствительность замедленного типа и рост опухоли у

мышей.Япония. J. Med. Sci. Биол., 36: 49-53.

Одет, Г., 1995. Ферментированное молоко. IDF Bull., 300: 98-100.

Osada, K., K. Nagira, K. Teruya, H. Tachibana, S.

Shirahata and H. Murakami, 1994. Повышение выработки интерферона-b

сфингомиелином из ферментированного молока

. Biother., 7: 115-123.

Renner, E. and Renz-Schaven, 1986. Nahrwerttabellen

für milch und milchprodukte. Верлаг Б. Реннер.

Кёнер К. Г. Гибен, Германия.

Salminen, S., C. Bouley и M. C. Boutron Ruault, 1998.

Наука о функциональном питании и желудочно-кишечном тракте

физиология и функции. Br. J. Nutr., 80: 147-71.

Saloff-Coste, C.J., 1996. Kefir. Danone World

Schaafsma, G., 1996. Состояние дел в отношении

штаммов пробиотиков в молочных продуктах. IDF Nutr. Newsl.,

5: 23-24.

Serot, T., X. Dousset, J. Zucca and N. Torcatis, 1990.

Mise en évidence et purification partielle de

веществ, антибактериальных продуцентов по

Leuconostoc mesenteroides et Lactobacillus plant dearins

.Microbiol. Алим.

Nutr. , 8: 71-76.

Шиоми, М., К. Сасаки, М. Мурофуши и К. Айбара, 1982 г.

Противоопухолевое действие у мышей, которым перорально вводили полисахарид

из кефирного зерна. Япония. J. Med. Sci.

Biol., 35: 75-80.

Питательные вещества | Бесплатный полнотекстовый | Многоликость кисломолочных продуктов на кефире: характеристики качества, химический состав аромата, пищевая ценность, польза для здоровья и безопасность

1. Введение

Кефир — кисломолочный напиток с кисловатым вкусом и кремообразной консистенцией, получаемый в результате бактериальной ферментации кефирных зерен.Термин кефир происходит от слова «кеф», что по-турецки означает «приятный вкус». Кефирные зерна являются естественной закваской для кефира и восстанавливаются после процесса ферментации. Зерна содержат смесь микроорганизмов (бактерий и дрожжей), которые сосуществуют и взаимодействуют, чтобы произвести уникальный ферментированный молочный продукт [1]. Кефир готовится из сырого коровьего, верблюжьего, козьего, овечьего или буйволиного молока, смешанного с кефирными зернами [2,3]. Химический состав кефира зависит не только от зерен закваски, но и от его географического происхождения, температуры и временных условий брожения, особенно от типа и объема используемого молока [1,4].Характерный запах и вкус кефира обусловлены летучими и нелетучими соединениями, образующимися при ферментации в результате липолиза, гликолиза и протеолиза. Физико-химические свойства кефира включают кислый pH 4,6, алкоголь 0,5–2%, кислый вкус и дрожжевой привкус. Кроме того, углекислый газ, продуцируемый дрожжевой флорой, способствует ее резкому кислому и дрожжевому привкусу [5]. Кефир предлагается в качестве одного из факторов, связанных с долгой продолжительностью жизни жителей Кавказа, благодаря его многочисленным преимуществам для здоровья, таким как -стрессовые свойства, иммуномодуляция [6], снижение холестерина [7], антиаллергенное [8], противоастматическое, противомикробное [9], противораковое действие [10] и химиопрофилактика рака толстой кишки [11], помимо его благоприятного воздействия на желудочно-кишечный тракт [12]. Такая польза для здоровья приписывается белку, витаминам, липидам, минералам, аминокислотам и микроэлементам кефира. Кроме того, процесс ферментации обогащает содержание витаминов B1, B12, K, фолиевой кислоты, кальция и аминокислот [13], что делает кефир еще более полезным для здоровья.

В этом обзоре основное внимание уделяется физико-химическому, сенсорному анализу и вкусовому составу кефира с точки зрения того, как различные методы производства и ингредиенты влияют на состав кефира и в конечном итоге влияют на его биологическую и пищевую ценность.

2. Пребиотики, добавки и методы производства, используемые при производстве кефира

Для производства кефира можно использовать несколько схем, основанных на одном и том же принципе. Кефир сначала готовят путем смешивания двух видов молока, например, кобыльего, козьего или овечьего [14], или путем добавления таких добавок, как нативный инулин, для улучшения его полезного действия и конечной текстуры [15]. Альтернативный способ производства кефира — использовать немолочные субстраты, такие как фрукты и патока, для производства сладкого кефира, который обладает уникальными сенсорными свойствами, такими как освежающий вкус из-за присутствия этанола, фруктовый аромат из-за присутствия сложных эфиров. и тело и текстура, приписываемые его содержанию глицерина [16].Традиционный метод приготовления кефира на молочной основе, используемый в домашних условиях, — это инкубирование молока с кефирными зернами. Зерна кефира инокулируют в стерилизованное молоко и ферментируют при 25 ° C до достижения pH 4,4. Затем в конце процесса ферментации зерно и молоко разделяются с помощью стерилизованного пластикового фильтра [17]. Напротив, водный кефир — это домашний ферментированный напиток на основе раствора сахарозы с различными сушеными и свежими фруктами. В традиционном процессе приготовления сладкого кефира зерна кефира помещают в раствор, содержащий 8% сахарозы, сухофрукты (обычно инжир) и несколько ломтиков лимона. Ферментация в течение одного или двух дней при комнатной температуре приводит к получению мутного, газированного напитка соломенного цвета, с низким содержанием сахара, слабым содержанием алкоголя и кислотой [18]. Backlopping — это метод, используемый при производстве ферментированных продуктов питания, таких как закваска, идли. , квашеная капуста, сухая колбаса, пиво, сыр и кефир [19]. Молоко сначала пастеризуется при 90 ° C в течение 15 минут, а затем охлаждается до 25 ° C для улучшения его микробиологического качества. Охлажденное молоко смешивают с 5% кефирными зернами и инкубируют при 18–24 ° C в течение 18 часов, а затем кефирные зерна отделяют через сито в асептических условиях.Затем кефир хранят при температуре 4 ° C (рис. 1). Стадия ферментации используется для ускорения действия микроорганизмов и метаболических изменений, происходящих в составе молока [20]. Для увеличения производства кефирных напитков используется стратегия отката, с 50-кратным увеличением выхода продукции при сохранении тех же характеристик кефира (физико-химическая, микробиологическая и пищевая ценность), что и у традиционного кефира, за исключением различий в популяции кефира lactobacillus (7,94 против 8,89). log КОЕ / мл) и снижение количества дрожжей (7.1 против 5,22 log КОЕ / мл) [17]. Этот метод считается дешевым и надежным, особенно в менее развитых странах, с некоторыми недостатками, наблюдаемыми в консистенции продукта и микробиологическом разнообразии. Производство кефира сталкивается с несколькими проблемами из-за уникальной и разнообразной микрофлоры кефирного зерна, типа молока, инкубации. время и условия хранения. Сенсорные, физико-химические свойства и качество кефирных продуктов препятствовали массовому производству кефира в промышленных масштабах [21].Такие ограничения могут быть связаны с микробным разнообразием и взаимодействием, которые влияют на качество конечного продукта. Необходимы дополнительные исследования для улучшения и стандартизации производства на промышленном уровне [22]. В связи с коротким сроком хранения кефира и высокими затратами на хранение и упаковку тенденция к использованию сухого кефира в виде порошка представляется оправданной. Как распылительная сушка, так и сублимационная сушка используются для производства порошкообразного кефира [23]. Распылительная сушка является наиболее распространенной техникой, применяемой в индустрии сухих молочных продуктов из-за ее низкой стоимости, быстрого времени сушки, эффективной сушки и эффективного удаления влаги.Однако при распылительной сушке некоторое снижение жизнеспособности микроорганизмов происходит одновременно с потерей аромата и вкуса. Факторы, которые влияют на выживаемость кефирных бактерий после сушки, включают температуру на входе и выходе распылительной сушки, тип распыления, направление воздушного потока и начальное количество микроорганизмов [24]. Сублимационная сушка известна как лучший процесс сушки и может поддерживать сенсорные свойства и жизнеспособность бактерий. Однако сублимационная сушка имеет высокую стоимость и более длительное время обработки, что ограничивает ее использование в пищевой промышленности [25,26].Для массового производства принята распылительная сушка для стабильности продукта; однако основным ограничением является потеря жизнеспособности микроорганизмов в процессе сушки [23].

В целом, эти результаты показывают, что на производство кефира влияет несколько факторов, включая сырье, технологию производства и условия хранения, которые необходимо оптимизировать параллельно для достижения наилучшего качества продукта.

3. Физико-химические параметры кефира в контексте различных методов его производства

Типичный кефир состоит из 90% влаги, 3.0% белка, 0,2% липидов, 6,0% сахара, 0,7% золы, 1,0% молочной кислоты, 0,48% спирта и 201,7–277,0 мл / л CO ₂ , все это зависит от количества кефирного зерна [1] . Химический состав кефира в основном зависит от типа используемого молока, зерна или смеси культур, добавок и технологии, применяемой при его производстве. Рисунок 2 показывает схему этих переменных [27]. Состав сухого вещества, жиров, белков, углеводов и содержания золы зависит от типа молока.Было обнаружено, что кефир коровьего молока обогащен белком, жиром и лактозой по сравнению с кефиром, приготовленным из верблюжьего молока, при этом он имеет низкое содержание сухого вещества и золы [3]. Было обнаружено, что на уровень алкоголя, белка, жира и золы влияет уровень зерна кефира и pH ферментации. Например, использование 1% -ного кефирного зерна при pH 4,5 привело к снижению уровня алкоголя до 0,3% в кефире из козьего молока по сравнению с 1% -ным спиртом при использовании 5% -ного кефирного зерна при том же значении pH [28]. Такое снижение уровня алкоголя в кефире может быть благоприятным в определенных частях света, например.g., исламские страны, в которых запрещено употребление алкогольных напитков. Закваска, используемая при производстве кефира, оказывает значительное влияние на его вязкость и химический состав [22]. Микробное сообщество кефира включает сложную смесь молочнокислых бактерий (LAB) (Leuconostocs, Lactobacilli, Streptococci, lactococci, Enterobacter, Acinetobacter, Enterococcus и Pseudomonas spp.), Уксуснокислых бактерий и дрожжей (Kluyveromyces, Candisces, Rhodotorula и Zygosaccharomyces) (Таблица 1) [14,29].Дрожжи играют жизненно важную роль в создании среды, которая способствует росту кефирных бактерий, помимо выработки нескольких ключевых метаболитов, таких как пептиды, аминокислоты, витамины, этанол и CO ₂ , которые в конечном итоге способствуют вкусу и аромату кефира [ 30,31] и несколько преимуществ для здоровья. В Бразилии зерна кефира используются для закваски молока в частных домах. Бразильский кефир характеризуется наличием трех микробных популяций: дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), молочнокислых бактерий и грамотрицательных бактерий (Lactobacillus paracasei), которые дают кефир с молочной кислотой, спиртом и уксусной кислотой.Химический анализ показал, что самая высокая концентрация молочной кислоты (7,30 мг / мл), за которой следуют уксусная кислота (6,50 мг / мл) и яблочная кислота (4,00 мг / мл), наблюдается при ферментации кефира коровьего молока [32]. Было обнаружено, что увеличение популяции молочнокислых бактерий коррелирует с увеличением уровня молочной кислоты [33], и, помимо придания уникального вкуса кефиру, молочная кислота подавляет рост микроорганизмов из-за снижения pH, действуя как подкислитель-консервант. Напротив, дрожжи (S. cerevisiae) опосредуют производство аромата в кефире наряду с другими летучими сложными эфирами, такими как изопентилацетат, этилгексаноат, этилоктаноат, фенэтилацетат и этилдеканоат [34,35].Сложные эфиры известны своим характерным ароматом многих трав и, по-видимому, ответственны за преобладающий аромат кефира. Для тибетского кефира характерны семейства Lactobacillaceae, Streptococcaceae и Leuconostocaceae [36]. При производстве тибетского кефира используется комбинация различных видов микроорганизмов из Lactococcus lactis, Leuconosroc mesenteroides, Lactobacillus kefir, Lactobacillus casei и Kluyveromyces marxianus, которые производят диацетил, этанол и CO ₂ при 77.23 мг / л, 4259 мг / л и 2,12 г / л соответственно (Таблица 1) [37]. Во время ферментации сухого обезжиренного молока заквасочной культурой кефира летучие ароматические соединения кефира контролировались с помощью твердофазного -экстракционный (HS-SPME) метод. Было обнаружено восемь летучих ароматических соединений, включая этанол (39,3%), 2-бутанон (31,6%), этилацетат (8,9%), этилбутират (5,5%), ацетон (3,6%), 3-гидрокси-2-бутанон ( ацетоин, 3,3%), 2,3-бутандион (диацетил, 2,9%) и ацетальдегид (1,7%), представляющие классы спиртов, кетонов, сложных эфиров и альдегидов, соответственно (рис. 3).Кроме того, содержание ацетона, диацетила, этанола, ацетальдегида и этилацетата увеличивается во время ферментации [38]. Свободные жирные кислоты (СЖК), образующиеся в результате липолиза в молоке, отвечают за вкус и аромат некоторых кисломолочных продуктов, включая кефир (рис. 4). Действительно, было обнаружено, что ферментированное молоко содержит от 5 до 10 раз больше свободных жирных кислот, чем молоко. Например, инкубация овечьего молока, инокулированного кефирной культурой, привела к увеличению в 4,3 раза его свободных жирных кислот [39]. СЖК в кефире, приготовленном с использованием овечьего молока, инкубированного при двух температурах (23 ° C и 26 ° C, каждая в течение 16–18 часов), показали более высокое количество FFA при более низкой температуре, одновременно с более низкими уровнями ацетальдегида и диацетила [40].С сенсорной точки зрения кефир, полученный при более высокой температуре (26 ° C), был более желательным, чем кефир, полученный при 23 ° C. Было обнаружено, что соотношение полиненасыщенных жирных кислот в кефире из верблюжьего молока ниже, чем в кефире из коровьего молока, одновременно с более высоким содержанием Lactobacillus ssp. подсчитывают в кефире коровьего молока [3]. Низкое содержание микробов в верблюжьем молоке связано с пептидом бактериоцина, который проявляет противомикробный эффект, который еще предстоит определить. Что касается основных классов летучих веществ, влияющих на аромат кефира, алкоголь (например,г., этанол), кетон (например, 3-гидрокси-2-бутанон (ацетоин и 2-бутанон), сложный эфир (например, этилацетат) и альдегид (например, ацетальдегид) были обнаружены (Рисунок 3 и Рисунок 4). летучие вещества, образующиеся при производстве кефира, содержание 2-бутанона было стабильным во время ферментации в отличие от этанола. Уровни ацетоина зависели от pH и, как было обнаружено, значительно снижались при значениях pH от 4,6 до 5 [33,38]. предполагают, что ацетоин и алкоголь могут обеспечить лучшее считывание условий производства кефира, чем мониторинг только 2-бутанона.

Метаболомное профилирование — это аналитический инструмент, который имеет потенциал для дальнейшей идентификации компонентов кефира и мониторинга биохимических изменений, вызванных бактериальной активностью и / или более того при хранении.

4. Сенсорный анализ различных типов кефира

Кефир должен обладать приемлемым ароматом, вкусом и хорошими вкусовыми качествами для удовлетворения запросов потребителей, все из которых связаны с его реологическими свойствами. На эти характеристики в первую очередь влияет тип используемого молока и его влияние на свойства кефира (текстурные, реологические и органолептические свойства). Было обнаружено, что кефиры, полученные из верблюжьего, коровьего, козьего или овечьего молока, обладают схожими микробиологическими свойствами [58]. Добавление полисахарида (0,2% ксантана) или экстракта граната привело к увеличению стабильности кефира с лучшими реологическими и сенсорными свойствами [59,60]. Было изучено использование буйволиного или коровьего молока с кефирными зернами и заквасочными культурами, при этом было обнаружено, что буйволиный кефир демонстрирует более высокую вязкость и консистенцию с меньшими значениями модуля по сравнению с молоком, приготовленным из коровьего молока [61]. Кефир Buffalo имеет более высокое содержание дрожжей, что приводит к значительному увеличению уровня этанола.Наличие этанола придает экзотический освежающий аромат кефира из буйвола [61]. Эксперты оценили, что кефир из буйвола обладает улучшенными сенсорными и цветовыми свойствами по сравнению с кефиром из коровьего молока, предполагая, что сочетание буйволиного и коровьего молока может помочь улучшить общее качество кефира [61]. Добавление 2% кефирного зерна в козье молоко улучшило вкусовые качества; наблюдались белый цвет, типичный кефирный запах и некислотный вкус [62]. Когда вкусовые качества кефира, такие как кислый, сладкий, соленый, горький, сливочный, сырный, острый, газовый, алкогольный и металлический, были по сравнению, кефиры из верблюжьего и коровьего молока получили разные оценки.Образец кефира из верблюжьего молока оказался более кислым, сырным и имел более резкий аромат, чем кефир, приготовленный из коровьего молока, хотя его консистенция и внешний вид имели более низкую оценку, чем кефир из коровьего молока. Кефир из верблюжьего молока получил в целом лучшие оценки от экспертов, в основном из-за его более высокой кислинки [3]. Кефир, приготовленный с использованием неживотного молока, то есть соевого молока и 2% сахарозы, обладал приемлемыми вкусовыми и ароматическими соединениями. После двух недель хранения в холодильнике было отмечено снижение уровня этанола, ацетальдегида, диацетила и ацетоина [63]. Не было значительной разницы между использованием смеси коровьего и соевого молока и коровьего молока в отношении pH и значений кислотности или стабильности кислотности в течение периода хранения [5], в то время как добавление гранатового сока и меда влияло на его физико-химические свойства. реологические и сенсорные свойства. Добавление менее 5% гранатового сока снижает значение pH одновременно с увеличением вязкости, в то время как добавление более 5% гранатового сока существенно снижает концентрацию белка и кефрана.Органолептический анализ показал, что добавление меда на 2,5% снижает кислотность с увеличением вязкости и сладости [64], помимо множества преимуществ для здоровья самого меда. Образование полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в кефире из козьего и сообщалось о овечьем молоке. Было обнаружено, что ПНЖК значительно влияют на профиль аромата кефира. Повышение содержания ПНЖК привело к потере типичного аромата сыворотки (ароматические вещества, связанные с сухой сывороткой) в кефире из козьего молока, тогда как сливочный аромат (ароматические вещества, связанные с молочным жиром) стал более преобладать в случае кефира из овцы [2].Добавление загустителей, таких как инулин, во время производства кефира не оказало значительного влияния на его химический, микробный состав, запах или вкус, хотя он показал более высокое значение вязкости [15,61]. Загустители могут улучшить общую стабильность и / или срок хранения кефира, как в случае ацидофильного молока. Добавление 1% (мас. / Об.) Глюкозы и 10% зерна для верблюжьего молока привело к снижению содержания в нем белка, жира, лактозы, вязкости, золы, сухого вещества и титруемой кислотности по сравнению с верблюжьим молоком.Тем не менее, более высокий уровень холестерина (18,24 против 7,97 мг / 100 г) в кефире из верблюда может быть недостатком по сравнению с кефиром из коровы, если гиперлипидемия является ограничивающим фактором для потребителей [3]. Кобылье молоко и смесь кобыльего, козьего и овечьего молока были сквашены с использованием мезофильных LAB и дали кефир, который оказался более плотным, более плотным и вязким, чем одно кобылье молоко [14]. Функциональные свойства кефира из козьего молока предоставят дополнительное преимущество ежедневному рациону человека в виде высокого содержания белка, жира, общего количества твердых веществ, витаминов и минералов [65], подтверждая, почему включение более одного типа молока является предпочтительным для кефира. производство.

Таким образом, аромат, вкус и хорошее ощущение во рту, по-видимому, зависят от таких добавок, как кефирное зерно, инулин и сахароза, тогда как тип молока влияет на текстурные и реологические свойства кефира.

5. Пищевая ценность и польза кефира для здоровья

В последнее время количество ферментированных пищевых добавок на рынке увеличилось из-за повышения осведомленности о здоровье и изменений в образе жизни, поддерживающих (предположительно) здоровую пищу во всем мире [33]. Пищевая ценность кефира обусловлена ​​его богатым химическим составом, включающим минералы, сахара, углеводы, белки, пептиды, витамины и жиры (рис. 5).Помимо такого химического состава, именно процесс ферментации дополнительно увеличивает питательную ценность кефира за счет вторичных биоактивных ингредиентов, таких как катехин, ванилин, феруловая кислота и салициловая кислота. Последний был обнаружен в кефире, полученном из арахисового молока [66]. Кефир обогащен витаминами B1, B2, B5 и C, минералами и незаменимыми аминокислотами, которые имеют важное значение для улучшения физической формы, процесса заживления и гомеостаза. На витаминный состав кефира влияет тип молока и микробиологическая флора, используемая при его производстве.Propionibacterium peterssoni и Propionibacterium pituitosum продуцируют витамин B12, тогда как Freudenreichii subsp. Propionibacterium Shermanii способствовал увеличению выработки витамина B6 [67]. Кефир богат аминокислотами серин, треонин, аланин, лизин, валин, изолейцин, метионин, фенилаланин и триптофан, которые играют важную роль в центральной нервной системе. Кефир также содержит частично переваренные белки (например, казеины), которые способствуют его перевариванию и усвоению организмом [68]. Незаменимые аминокислоты, в изобилии содержащиеся в кефире, также регулируют метаболизм белков, глюкозы и липидов и оказывают положительное влияние на регулирование массы тела, поддержание иммунного ответа и энергетический баланс.Аминокислоты предотвращают инвалидность и продлевают продолжительность здоровой жизни пожилых людей [69,70], а аминокислоты с разветвленной цепью, которые также содержатся в кефире, улучшают когнитивное восстановление пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой [70]. Кефир обогащен кальцием, магнием, калием и натрием, которые помогают использовать углеводы, жиры и белки для роста клеток, поддержания их жизнедеятельности и получения энергии. Кефир также содержит микроэлементы, в том числе железо, цинк и медь, которые имеют особое значение для клеточного метаболизма и производства крови [71].Пептиды считаются уникальным и важным классом соединений, образующихся при ферментации молока, и на их долю приходится значительная часть преимуществ для здоровья кисломолочных продуктов. В Бразилии ферментированное овечье молоко является хорошим источником биоактивных пептидов, которые проявляют антиоксидантную и антимикробную активность [72]. Пептид F3 был очищен из тибетского кефира и проявлял антибактериальные свойства против Escherichia coli и Staphylococcus aureus [73]. В бычьем кефире, полученном в результате протеолиза β-казеина, было обнаружено 236 пептидов, которые проявляют антимикробное, антиоксидантное, ингибирующее, иммуномодулирующее и антитромботическое действие ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) [72].Amorim et al. идентифицировали 35 пептидов в кефире коровьего молока, которые проявляли антигипертензивный эффект, опосредованный ингибированием активности АПФ [74].

7. Молоко по сравнению с сахарным кефиром. Ограничения и безопасность

Хотя кефир хорошо известен своей потенциальной ценностью для здоровья как отличный источник пробиотиков, необходимо признать некоторые ограничения в его потреблении. Эти ограничения в основном связаны с высоким содержанием холестерина [125] и способностью вызывать аллергические реакции. Адаптация к немолочным субстратам может быть альтернативным способом получения положительного воздействия на здоровье от кефира, примером чего является сладкий кефир.Раствор коричневого сахара является основным альтернативным субстратом, используемым в настоящее время при ферментации кефира, и из него получается напиток, известный как сахарный кефир. Сахарный кефир обладает такой же микробной ассоциацией, что и традиционная ферментация молочного кефира, особенно молочнокислые бактерии и виды дрожжей, такие как Lactobacillus, Leuconostoc, Kluyveromyces pichia и Saccharomyces. Было обнаружено, что сахарный кефир более эффективен для улучшения липидного профиля у мышей, чем молочный кефир [125]. По структуре, ассоциированным микроорганизмам и продуктам, образующимся в процессе ферментации, зерна сахарного кефира очень похожи на зерна молочного кефира.Соки дыни, моркови, лука, томатов, фенхеля и клубники используются в качестве сбраживаемых субстратов для производства кефира, на котором могут расти LAB и дрожжи [16]. Среди этих субстратов микроорганизмы показали лучший рост на дынном соке. Сложные эфиры были основными летучими соединениями в луковом, дынном и клубничном соках, а терпеноиды были в большом количестве в фенхеле и моркови. Было обнаружено, что помимо улучшения аромата кефира, луковый, томатный и клубничный соки способствуют его сильному антиоксидантному эффекту [126].Для обзора микробиологических, биохимических и функциональных аспектов сахарного кефира в работе Fiorda et al. (2017) следует проконсультироваться [16].

Вопросы контроля качества и безопасности кефирного материала всегда были актуальны для молочной промышленности. Однако безопасному употреблению кефира уделяется мало внимания. В литературе содержится скудная информация о безопасных уровнях потребления кефира или количестве, которое необходимо употребить, и времени, необходимом для оказания положительного воздействия на здоровье.

Гемолиз является распространенным фактором вирулентности среди патогенов, при этом бактериальная гемолитическая активность является первым параметром безопасности, оцениваемым in vitro. Другой важной характеристикой безопасности является чувствительность к антибиотикам [127]. Лактобациллы — это микроорганизмы, которые используются в молочной технологии (сыр, йогурт и ферментированное молоко) и имеют долгую документированную историю употребления в пищу. Штаммы L. kefiri не вызывали α- или β-гемолиза и оказались чувствительными к тетрациклину, клиндамицину, стрептомицину, ампициллину, эритромицину, канамицину и гентамицину. Штаммы L. kefiri могут подавлять патогены как грамположительных, так и отрицательных бактерий. Модель на мышах, получавших пероральную дозу L.kefiri CIDCA 8348 daily (10 ⁸ КОЕ) не показывал признаков боли, летаргии, обезвоживания или диареи или различий в потреблении пищи и воды в течение 21 дня. Во время аутопсии не было обнаружено никаких признаков воспаления или повреждения ни в одном органе; различий в секреции провоспалительных цитокинов между обработанными и контрольными мышами не наблюдалось [52]. L. mali K8 продемонстрировал толерантность к pH 2,5 и противостоял повреждающему воздействию солей желчных кислот, пепсина и панкреатина, как и L. rhamnosus (эталонный штамм).Было обнаружено, что L. mali K8 чувствителен ко всем протестированным антибиотикам, кроме ванкомицина. На безопасность штамма L. mali K8 указывает отсутствие гемолитической активности и его чувствительность к пяти стандартным антибиотикам — хлорамфениколу, оксациллину, тетрациклину, пенициллину G и ципрофлоксацину [128]. Три штамма L. paracasei (MRS55, MRS59 и M1743), демонстрирующие нежелательную активность трипсина, α-химотрипсина и β-глюкуронидазы, не были обнаружены [127] в 32 различных штаммах LAB, выделенных из зерен бразильского кефира.Афлатоксин G1 (AFG1) является одним из основных токсичных загрязнителей орехов и потенциально опасен для здоровья. Следовательно, снижение AFG1 является одной из основных проблем безопасности пищевых продуктов. Использование кефирного зерна оказывает значительное влияние на обеззараживание AFG1 в фисташковых орехах. Оптимизированный метод биологической детоксикации с использованием обработанных 70 ° C зерен кефира может быть подходящим для рутинного удаления AFG1 [129] из фисташек. У крыс линии Wistar добавление кефира в нормальной дозе (0,7 мл / день / животное) и высокой дозе (3,5 мл / день / животное) в течение 4 недель не оказывало вредного воздействия на животных, что было определено по росту крыс, гематологии и химическому анализу крови. , а также потенциальная патогенность тканей.Эти данные ясно показывают, что как обычная, так и высокая доза кефира безопасны для употребления. Результаты подчеркивают, что, хотя из-за высокой потребляемой дозы кефира повреждений слизистой оболочки не наблюдалось, рекомендуется обычная доза из-за наиболее выраженных положительных эффектов [130]. ​​Штаммы Enterococcus durans могут подавлять различные патогены грамположительных и отрицательных бактерии. Эти штаммы смогли выжить в смоделированных желудочно-кишечных условиях и показали аналогичную способность к адгезии с муцинами.Примечательно, что штаммы E.durans проявляли противовоспалительные свойства, о чем свидетельствует значительное ингибирование индуцированного флагеллином ответа клеток Сасо-2. Результаты показали, что E. durans не представляет угрозы для здоровья потребителей и демонстрирует свой потенциал как в качестве функционального продукта питания, так и в качестве источника пробиотиков [131].

8. Заключительные замечания и направления развития кефира

Кефир — популярный этнический молочный продукт, который постоянно совершенствуется; различные ароматизаторы, типы молока, волокна, зерна и многое другое были изучены на рынке.Кефир изготавливается из различных видов молока (коровьего, козьего, верблюжьего, буйволиного или кобыльего) и обычно производится путем смешивания двух видов молока, чтобы усилить его полезные свойства, вкус и текстуру, и подвергается вторичной ферментации или добавлению добавки, такие как инулин, для улучшения свойств конечного продукта. Ферментация зерен кефира в растворе сахара-сырца или сахара из фруктов или овощей без использования молока — еще один способ производства кефира. Этот продукт называется сладким кефиром. Эти добавки и различные методы производства, помимо ухудшения вкусовых качеств, также влияют на физико-химические свойства и пользу для здоровья кефира.Во время производства следует контролировать тип используемого молока, зерно кефира и условия ферментации (время и температуру), поскольку любые изменения этих параметров могут повлиять на химический и микробиологический состав кефира.

Литература, собранная в этом обзоре, проливает свет на некоторые из наиболее примечательных компонентов, оцененных с помощью химического и сенсорного анализов. Представленные в этом обзоре исследования производства кефира в первую очередь определили влияние одной переменной на качество или состав продукта; взаимодействие между переменными полностью не изучено.Было бы необходимо одновременно исследовать влияние различных переменных на качество конечного продукта, используя статистический дизайн для оптимизации условий ферментации кефира. Другой рекомендуемый подход — применение расширенного анализа данных для разработки моделей для сравнения продуктов, определения наиболее эффективных добавок и лучшего достижения оптимальных свойств кефира. Метаболомика, как стратегия определения детального состава ферментированного молока и регистрации биохимических изменений, вызванных бактериальной активностью во время процесса ферментации и хранения, может быть легко применена для прогнозирования сенсорных, питательных свойств и мер безопасности кефира.Кефир содержит множество макро- и микроэлементов, включая белки, липиды, аминокислоты и витамины. Эти компоненты определяют антибактериальные, иммунологические, химиопрофилактические и гипохолестеринемические эффекты кефира, а также объясняют, почему кефир можно употреблять людям с непереносимостью лактозы.

Большинство из этих последствий для здоровья основаны на биохимических или лабораторных анализах и должны быть подтверждены исследованиями на животных и людях, чтобы быть более убедительными. Кроме того, мониторинг изменений в микробиоме кишечника человека после приема различных пробиотиков, содержащихся в кефирных продуктах, может дать лучшее понимание его многочисленных преимуществ для здоровья.

Границы | Состав и разнообразие естественных бактериальных сообществ в мабиси, традиционно ферментированном молоке

Введение

В природе существует множество разнообразных экосистем, в которых доминируют микробные сообщества. Было замечено, что сходные системы обладают сходными сообществами с точки зрения видового разнообразия, и что это обусловлено отбором из-за как биотических, так и абиотических факторов, процесса, который также получил название «сортировка видов» (Langenheder and Székely, 2011; Székely and Лангенхедер, 2014).Хотя этот процесс широко признан, существует мало экспериментальных работ, посвященных тому, как отбор может формировать видовые сообщества. К ним относятся микробные сообщества в почве, кишечнике человека, а также в ферментированных продуктах (de Vries and Griffiths, 2018; Rowland et al., 2018; Anal, 2019). Ферментированные продукты представляют собой естественную среду смешанных сообществ сосуществующих микробов.

Ферментированные молочные продукты популярны во всем мире и важны для доставки питательных веществ, для обеспечения полезных микробов, способствующих сбалансированной микробиоте кишечника и для придания пищевых продуктов желательным органолептическим свойствам (Sybesma et al., 2015; Сингх и др., 2017; Анал, 2019). К распространенным кисломолочным продуктам на мировом рынке относятся сыр, йогурт, кефир и многие другие. Большинство этих продуктов получают свои рецепты в результате кустарных или традиционных процессов, которые включают самопроизвольную ферментацию сложными микробными сообществами (Smid, 2015). В Африке существует множество традиционных ферментированных (молочных) продуктов, производимых на уровне домашних хозяйств, рецепты и технологии производства которых передаются из поколения в поколение, то есть от матери к дочери или от отца к сыну. Эти методы производства различаются в зависимости от региона / страны, и это может иметь отношение к микробному составу соответствующих продуктов. Чтобы получить больше информации о таких продуктах и ​​понять, могут ли различия в методах производства или географическом положении оказывать давление отбора, ведущее к вариациям в микробном составе, мы взяли мабиси в качестве примера.

Mabisi — замбийское традиционное ферментированное молоко, получаемое путем самопроизвольной ферментации сырого молока при температуре окружающей среды в течение 2 дней или более (Schoustra et al., 2013; Moonga et al., 2019). Этот продукт популярен и широко употребляется с основной кукурузной кашей (ншима), а также с другими видами продуктов, такими как рис, сладкий картофель, тыква и фрукты (Moonga et al., 2019). Замбия — большая страна (752 000 км, ² ) с населением, состоящим из различных этнических групп [Центральное статистическое управление (CSO) и ICF International, 2014], и производство мабиси традиционно практикуется в регионах или провинциях с большим поголовьем крупного рогатого скота. Однако спрос на продукт в городах неуклонно растет.Предыдущее исследование Moonga et al. (2019) показали, что существует семь способов производства мабиси: тонга, илла, беклэппинг, сливочный, вареный, бароце и толстый тонга, распространенные по всей стране, причем тип тонга является наиболее популярным и широко практикуемым во всех регионах и всеми. этнические группы. В этом исследовании также выделяются ключевые производственные параметры, такие как температура, тип контейнеров для ферментации, сезон, откат, а также альтернативное удаление сыворотки и добавление сырого молока. Однако существует ограниченное количество исследований микробов, участвующих в этой спонтанной традиционной ферментации.

Самопроизвольная ферментация мабизи зависит от микробов из окружающей производственной среды: сырого молока, производственной посуды (емкости и ведра), рук производителей и воздуха. Исследование Schoustra et al. (2013) показали, что образцы мабизи, собранные в южной и центральной частях Замбии, содержат 6–8 видов молочнокислых бактерий (LAB) и уксуснокислых бактерий (AAB). Однако это исследование было ограничено по количеству проанализированных образцов и не охватывало все регионы производства мабиси, представляющие все вариации методов производства в стране.Как и во всех сообществах естественных видов в природе, микробные сообщества в продуктах естественного брожения формируются как абиотическими, так и биотическими факторами (Domínguez-Manzano et al., 2012; Bokulich et al., 2016). С учетом различных производственных практик в стране мы предполагаем, что состав микробного сообщества варьируется в зависимости от региона производства, производителя, типа емкости для ферментации и типа мабизи. Исследования на африканском континенте показали различия в микробном составе традиционных кисломолочных продуктов от страны к стране (Akabanda et al., 2010; Освик и др., 2013; Parker et al., 2018), но они не были связаны с вариациями в производственной практике или месте отбора проб, которые могут оказывать ключевое давление отбора на микробную экосистему, влияя на их видовой состав и динамику. Это побудило нас исследовать состав микробных сообществ образцов мабизи по всей стране в Замбии с использованием высокопроизводительных методов секвенирования ДНК.

В этом исследовании мы изучили состав бактериального сообщества мабизи в провинциях Замбии, а затем определили ключевые факторы, которые определяют ожидаемое разнообразие в составе бактериального сообщества.Мы использовали независимые от культуры методы и сосредоточились на составе бактериального сообщества, поскольку более ранние исследования показали, что дрожжи редко выявлялись у мабизи (Schoustra et al., 2013). Мы считаем, что это исследование даст представление о типах микробов, участвующих в ферментации мабизи, и о факторах, которые формируют структуру их сообщества. Эта информация важна для понимания экологии этих микробных сообществ и станет основой для более фундаментальных исследований того, как силы отбора могут влиять на динамику и функциональность микробов. С практической точки зрения, он дает обзор потенциальных микробов-кандидатов для использования в разработке заквасок, что будет иметь решающее значение для оптимизации продукта, чтобы удовлетворить спрос как сельских, так и городских потребителей.

Материалы и методы

Сбор проб

В период с мая по август 2016 г. в восьми провинциях Замбии было собрано 168 проб мабизи (Таблица 1) (Рисунок 1).

Таблица 1. Количество проб мабизи, собранных в каждом месте отбора проб.

Пробы были собраны в сухое и холодное время года, когда надои молока низки, и в результате в некоторых регионах с меньшим количеством животноводческих хозяйств было меньше образцов. Образцы были собраны у фермеров, торговцев на местных рынках и в центрах сбора молока (ЦМК) фермерских кооперативов. Однако для целей настоящего исследования последние двое рассматривались как трейдеры. Фермеры, предоставившие образцы, были идентифицированы через их кооперативы при содействии персонала Министерства рыболовства и животноводства (MFL) правительства Замбии и были частью опрошенных в ходе исследования методов производства мабиси, проведенного Moonga et al.(2019). Для всех собранных проб была записана следующая информация: место отбора проб (провинция и район), метод производства, возраст мабизи (продолжительность ферментации в днях), тип используемых контейнеров для ферментации (калебас, пластик или металл) и тип производителя (фермеры). , трейдеры или МСС). Собранные образцы мабизи были получены с использованием пяти производственных методов: тонга, обратная швабра, бароце, сливочный и толстый тонга мабиси, о которых сообщают Moonga et al. (2019).

образцов мабизи были собраны с использованием стерильных пластиковых бутылок емкостью 500 мл, которые немедленно хранили на льду в холодильнике, чтобы остановить ферментацию, и доставлены в лабораторию, где были выполнены физико-химический анализ и выделение ДНК.По прибытии в лабораторию пищевой химии Департамента пищевых наук и питания Университета Замбии образцы были проанализированы на pH и титруемую кислотность (TTA). Перед этими анализами образцы для микробиологического анализа были разделены. Анализ бактериального сообщества проводили с помощью методов, не зависящих от культуры, которые включали выделение ДНК и высокопроизводительное секвенирование ампликона 16S рРНК. Для этого образцы мабизи помещали в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл и центрифугировали (12000 об / мин) в течение 2 минут, после чего супернатант сливали и осадок замораживали при -20 ° C для последующей экстракции ДНК.

Физико-химические свойства

pH для образцов мабизи был проанализирован с помощью калиброванного цифрового pH-метра, а ТТА был проанализирован в соответствии с официальными методами AOAC (AOAC, 2005).

Секвенирование ампликонов

Замороженные гранулы образца мабизи оттаивали, и ДНК экстрагировали и очищали, как описано Schoustra et al. (2013). Выделенную ДНК впоследствии отправили на секвенирование парных концов ампликона бактериального гена 16S рРНК гипервариабельной области V4 (341F – 785R) на платформе MiSeq Illumina, выполненное LGC genomics (Берлин, Германия).

Для дальнейшей обработки данных и статистики используется конвейер QIIME (Caporaso et al., 2010), модифицированный Bik et al. (2016). Чтения с парным концом были объединены с помощью join_paired_ends.py (с минимальным перекрытием 10 пар оснований), после чего последовательности были обрезаны и отфильтрованы с помощью cutadapt [v1.11 –q 20, –m 400, (Martin, 2011)] с использованием известных последовательностей праймеров CCTACGGGNGGCWGCAG и GACTACHVGGGTATCTAAKCC для обрезки обеих сторон последовательности. Эти обрезанные последовательности затем проверяли на наличие химер с помощью uchime [v4.2.20, база данных gold, (Edgar et al., 2014)], были сохранены последовательности с более низкой оценкой химеры, чем 0,28. Последовательности были отфильтрованы скриптом Qiime (split_libraries_fastq.py, значение смещения phred: 33), а затем сгруппированы в Операционные таксономические единицы (OTU) с 97% сходством последовательностей с использованием справочной базы данных SILVA (версия 132; Quast et al. , 2013) и UCLUST (Эдгар, 2010) с использованием скрипта Qiime «pick_open_reference_otus.py». Для присвоения таксономической классификации был проведен анализ BLAST (со значением по умолчанию e ) по базе данных SILVA (Altschul et al., 1990; версия 132). Весь последующий анализ проводился в R (R Development Core Team, 2008).

Статистический анализ и анализ данных

Данные были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) на уровне значимости 95%, а сравнения средних значений были выполнены с помощью теста Турции на уровне значимости 95% с использованием SPSS версии 22. Взаимосвязь между разнообразием бактериального сообщества, местоположением и методами производства мабизи. был проанализирован с использованием неметрического многомерного шкалирования (NMDS).Кроме того, анализ сходства (ANOSIM) и пермутационный многомерный дисперсионный анализ (тест Адониса) были выполнены в R версии 3.6.0 (R Development Core Team, 2008) с использованием phyloseq (McMurdie and Holmes, 2013) и веганского (Oksanen et al. al., 2019) для исследования влияния различных категориальных переменных (например, метода производства, емкости для ферментации и типа производителя, географического положения, продолжительности ферментации) на бактериальные сообщества в мабизи. Кроме того, был проведен тест Мантеля для определения корреляции между структурой бактериального сообщества и pH.Разнообразие бактериального сообщества измерялось индексом Шеннона и богатством.

Результаты

Образцы мабизи были проанализированы на предмет физико-химических свойств: pH и TTA, а также на состав бактериального сообщества с использованием секвенирования ампликона 16S рРНК. Все 168 образцов мабизи, собранные по всей стране, были классифицированы в соответствии с различными выявленными факторами производства: методом производства, продолжительностью ферментации (возрастом), типом используемых контейнеров для ферментации и типом производителей (Рисунок 2). Мы обнаружили, что большинство собранных образцов было произведено с использованием метода производства тонга, конечный продукт которого называется «тонга мабизи» (76%), а наименее производимым типом продукта было «сливочное мабизи» (2%). Самым популярным контейнером для брожения был пластиковый контейнер (86%). Большая часть образцов была произведена фермерами (83%), а обычная продолжительность ферментации составляла 1 день (47%).

Рисунок 2. Данные о периодичности производственных параметров: (A) Метод производства мабизи, (B) время ферментации в днях (возраст), (C) тип контейнера для ферментации и (D ) тип производителя.

Физико-химические свойства

проб Мабиси, собранных в Восточной провинции, имели самый высокий средний уровень pH, в то время как образцы из Западной провинции имели самый низкий, но оба они значительно отличались от образцов из остальных провинций (Рисунок 3A). Что касается типов мабизи, у баротсе мабизи было значительно более низкое среднее значение pH, чем у остальных. Мабизи с обратным движением также имел более низкий pH, чем тонга, сливочный и толстый тонга мабизи, но разница не была значительной (рис. 3В).Торговцы производили мабизи с более низким средним pH по сравнению с мабизи, произведенным фермерами или МКЦ, в то время как мабизи, ферментированный в калабашах, имел самый низкий средний pH по сравнению с мабизи, ферментированным в пластиковых или металлических контейнерах (рисунки 3D, E). Среднее значение pH образцов мабизи, ферментированных в течение 1 дня, было самым высоким, а самые низкие значения pH наблюдались в образцах мабизи, ферментированных в течение 4 дней (рис. 3C).

Рис. 3. Среднее значение pH образцов мабиси. pH мабизи от разных: (A) провинции, (B) методы производства, (C) время ферментации , (D) контейнер для ферментации и (E) производителей.Столбики с разными буквами для каждого среднего значения pH указывают на статистически значимые различия ( p <0,05).

Состав бактериального сообщества

В составе бактериального сообщества мабизи преобладали виды, принадлежащие к типам Firmicutes и Proteobacteria (рис. 4A). К другим типам, вошедшим в десятку самых распространенных бактерий, относятся ацидобактерии, актинобактерии, Bacteriodetes, Cyanobacteria, Fusobacteria, Patescibacteria, Deinococcus-thermus и Gemmatimonadetes.

Рис. 4. Состав бактериального сообщества 10 наиболее распространенных бактерий в мабизи на уровне: (A) тип , род (B) и (C) вид . Каждая полоса представляет собой отдельный образец. Показаны два основных региона: традиционный регион производства мабиси (TMPR), представленный Западной, Южной и Центральной провинциями, и регион, не входящий в TMPR.

Когда данные всех отобранных образцов мабизи объединены, Lactococcus является родом с самой высокой относительной численностью.Другие роды, которые составляют 10 самых распространенных родов, включают Lactobacillus , Streptococcus , Kluyvera, Klebsiella , Enterobacter , Citrobacter , Buttiauxella , Aeromonas и Acinetobacter 4Б). Мабизи традиционно производят в Западной, Южной и некоторых частях Центральной провинции, которые в данном исследовании могут быть в совокупности названы «регионами традиционного производства мабиси (TMPR)».В составе бактериального сообщества мабизи из этого региона преобладали LAB родов Lactococcus , Lactobacillus и Streptococcus . В пределах TMPR у мабизи из Западной провинции была большая доля Lactobacillus , чем у остальных, как в случае с мабизи из Южной провинции для Streptococcus . Образцы мабизи из регионов Восточной, Северо-западной, Мучинговой и Северной провинций, не относящихся к TMPR, имели более сложный состав бактериального сообщества, в котором коллективно доминировали не-LAB, хотя Lactococcus присутствовали во всех образцах. Из не-TMPR только в образцах мабизи из провинции Коппербелт преобладали Lactococcus , но все еще высока доля Enterobacter .

В десятку самых распространенных видов мабизи входят Lactococcus lactis , Streptococcus salivarius , Lactobacillus helveticus , Lactobacillus delbrueckii , Kluyvera intermedia , Klebsiella sp. Enterobacter asburiae , Citrobacter sp.и Aeromonas caviae (Рисунок 4C). В 20 и 30 самых массовых видов (дополнительный рисунок S1) входят некоторые виды LAB, о которых сообщают Schoustra et al. (2013), которые отсутствуют в топ-10 самых массовых видов.

Разнообразие бактерий

Альфа-разнообразие (т.е. среднее видовое разнообразие) сообщества бактерий мабизи было проанализировано с помощью богатства и индекса Шеннона (рисунки 5, 6). Результаты показывают, что тонга мабизи был богаче и разнообразнее по составу бактериального сообщества, чем другие типы мабизи (рис. 5A, B).Кроме того, когда мы рассматриваем все образцы тонга мабизи из всех участков отбора проб (провинций), мы видим, что образцы из не относящихся к TMPR провинций Восточная, Мучинга, Северная, Коппербелт были богаче и разнообразнее, чем TMPR Западной и Южной провинций ( Рисунки 5А, Б). Сливочный мабизи был богаче, чем мабизи бэкслэнд, бароце и толстый тонга мабизи, но мабизи бэкслэнд имел более разнообразный состав бактериального сообщества, чем три других (Рисунки 5A, B).

Рисунок 5. Бактериальное альфа-разнообразие мабизи в соответствии с методом производства (A) индекс Шеннона и (B) Насыщенность и период ферментации (C) индекс Шеннона и (D) Насыщенность.

Рисунок 6. Разнообразие бактерий мабизи по производителю (A) индекс Шеннона и (B) Богатство и тип контейнера (C) индекс Шеннона и (D) насыщенность.

Тонга мабиси была богаче разнообразием (№видов) для образцов, которые ферментировались в течение 1, 2 и 3 дней (рис. 5D) по сравнению с образцами, ферментированными в течение более длительных периодов времени. Те, что ферментировались в течение 1 дня, показали большее разнообразие, чем те, которые ферментировались в течение 2 и 3 дней (Рисунок 5C). Кроме того, образцы тонга мабизи, ферментированные в течение 1, 2 и 3 дней, были более разнообразными, чем другие типы мабизи.

Образцы тонга мабизи были богаче разнообразием бактериального сообщества, чем другие типы мабизи, но не было больших различий в разнообразии бактериального сообщества между образцами, произведенными фермерами и торговцами, которые продают свою продукцию на местных рынках (Рисунок 6B).В Тонга мабизи было больше образцов с более высоким разнообразием, чем у других типов мабиси, но только толстый тонга мабиси показал существенные различия между производителями: фермеры производили мабизи с более высоким разнообразием по сравнению с торговцами (Рисунок 6A). Образцы тонга мабизи, ферментированные в стеклянной бутылке, были богаче с точки зрения разнообразия бактериального сообщества, чем образцы, ферментированные в пластиковых, металлических контейнерах и контейнерах из тыквы (рис. 6D). И бутылки, и образцы тонга мабизи, ферментированные из калебаса, имели немного большее разнообразие, на что указывает индекс Шеннона, чем образцы, ферментированные в металлических и пластиковых контейнерах (Рисунок 6C).

Взаимосвязь между разнообразием бактериальных сообществ, местонахождением и методом производства мабиси

Образцы мабизи были проанализированы с помощью NMDS для определения связи между типом / местонахождением мабизи и таксонами. На рис. 7А показаны два основных кластера филы Firmicutes и Proteobacteria, а также более мелкий кластер актинобактерий. В кластере Firmicutes преобладают образцы мабизи из западных и южных провинций, а также образцы мабизи типа бароце и тонга, тогда как в кластере Proteobacteria преобладают образцы из не-TMPR, и в основном мабизи типа тонга.

Рис. 7. График неметрической многомерной шкалы (NMDS) взаимосвязи между таксонами и местоположением и методом производства на уровне типа (A) и уровне рода (B) .

На уровне рода (рис. 7В) мы смогли выделить четыре больших кластера, в которых доминируют Lactobacillus , Lactococcus , Enterobacter и Aeromonas , и два меньших кластера, в которых доминируют Streptococcus и Klebsiella .Кластер Lactobacillus был связан с barotse mabisi и образцами в основном из западных провинций и нескольких из южных и центральных провинций. Lactococcus имел самый большой кластер, который включал все типы мабизи и провинции, но был наиболее заметным в TMPR. Меньший кластер Streptococcus был связан с типами мабизи тонга, обратным откосом и баротце из TMPR. Кластеры не-LAB родов Aeromonas , Enterobacter и Klebsiella были в основном связаны с тонга мабизи, произведенным в не-TMPR, однако другие типы мабизи из TMPR также имели некоторые образцы с этими бактериями. на более низких уровнях изобилия.

Был проведен иерархический кластерный анализ бактериальных сообществ во всех образцах мабизи, в результате чего были выделены три основных кластера: A, B и C (Рисунок 8). В кластере A преобладали образцы из TMPR (65%), в то время как кластеры B и C были заполнены в основном образцами из не-TMPR (> 75%) и TMPR (> 80%) соответственно. Что касается типов мабизи, в кластере A были тонга, бароце и сливочный мабиси, в кластере B — в основном тонга мабизи, а в кластере C — все типы: тонга, бароце, густой тонга, сливочный и обратный мабизи.

Рисунок 8. Кластерный анализ бактериальных сообществ всех образцов мабизи. Буквы (A – C) обозначают три основных кластера.

Влияние каждого фактора на состав бактериального сообщества анализировали с помощью ANOSIM и теста Адониса. Мы обнаружили, что метод производства, географическое положение (провинция и район) и продолжительность ферментации существенно влияли на структуру бактериального сообщества, в то время как тип контейнера для ферментации и производитель — нет (Таблица 2). Кроме того, каминный тест показал, что существует значительная корреляция между pH и структурой бактериального сообщества ( r = 0,2807, p <0,001).

Таблица 2. ANOSIM и пермутационный MANOVA категориальных эффектов на бактериальные сообщества в мабизи.

Обсуждение

Целью данного исследования было определение состава бактериального сообщества мабизи, его видового разнообразия и факторов, влияющих на состав сообщества.Результаты показывают, что мабизи состоит в основном из бактерий двух типов (Firmicutes и Proteobacteria), причем наиболее доминирующими родами LAB являются Lactococcus , Lactobacillus и Streptococcus , а в не-LAB преобладают Enterobacter , Aeromonas. и Klebsiella (рисунок 4). Роды LAB, обнаруженные в этом исследовании, также были описаны Schoustra et al. (2013) для меньшего количества образцов мабизи, собранных только в двух провинциях, Южной и Центральной, которые являются частью TMPR.Эти виды LAB доминируют на всей территории TMPR, которая также включает Западную провинцию. Однако наши результаты также выявили некоторые роды, не относящиеся к LAB (в основном грамотрицательные виды), которые доминируют над не-TMPR, и о некоторых из них сообщалось в других африканских традиционных ферментированных молочных продуктах (Osvik et al., 2013). TMPR — это регионы (Таблица 1) с большим количеством крупного рогатого скота и молока (Musika, 2017; MFL, 2018; Moonga et al., 2019), и, таким образом, производство мабиси имеет более длительную историю и осуществляется в более крупных масштабах. масштаб в этих регионах.Напротив, не-TMPR — это регионы с меньшим количеством крупного рогатого скота и низким производством молока, хотя в Восточной провинции в этом регионе высока поголовье крупного рогатого скота, но низкое производство молока и, следовательно, низкое производство мабиси. Более того, потребление мабиси для некоторых этнических групп в этой провинции не является обычным явлением.

Интересно, что Lactococcus был самым доминирующим родом, присутствующим во всех образцах мабизи, и можно предположить, что он управляет процессом ферментации. Lactobacillus был специфическим для региона и продукта, в основном обнаружен в TMPR, в частности, в бароце и мабиси, которые в основном производились торговцами. Lactobacillus был более доминирующим в образцах мабизи с низким pH (pH <4), что объясняет его преобладание в образцах мабизи из Западной провинции, а также в образцах мабизи бароце и обратном сдвиге (рис. 3). Это происходит главным образом потому, что Lactobacillus sp. в целом более устойчивы к кислотам, чем виды Lactococcus (Axelsson, 2004). Streptococcus sp. были также обнаружены в TMPR, но имели высокую относительную численность в пробах, собранных в южной провинции, особенно в одном районе.

В первую десятку входят четыре LAB, пять non-LAB и неклассифицированные виды бактерий (рис. 4). Самый распространенный вид — это Lactococcus lactis , который встречается во всех образцах мабизи. Этот вид необходим для ферментации всех видов мабизи. Это хорошо известная гомоферментативная молочнокислая бактерия, используемая во многих ферментированных молочных продуктах, таких как сыр и творог (Murtaza et al., 2014; Farkye, 2017). Однако разные виды мабизи содержат разные бактерии, ответственные за ферментацию.Например, в Тонга Мабиси всегда присутствует Lactococcus sp. особенно для тонги мабизи из не-TMPR, но один из TMPR будет в дополнение к видам Lactococcus также иметь Streptococcus salivarius и в некоторых случаях Lactobacillus delbrueckii и Lactobacillus helveticus , что также относится к толстому язычку. мабиси. Тем не менее, у бароце и обратного мабизи присутствуют все три рода, среди которых Lactobacillus имеет более высокую относительную численность, чем у других типов мабизи.Это говорит о том, что для хорошо разработанной заквасочной культуры мабизи мы должны выбрать правильную комбинацию LAB, а также принять во внимание конкретные производственные практики, которые могут влиять на эти бактерии, чтобы получить продукт с желаемыми органолептическими свойствами. Известно, что микробы оказывают специфическое влияние на органолептические свойства молочных продуктов (Leroy and De Vuyst, 2004; Lucey, 2004; Smid and Kleerebezem, 2014). Следовательно, влияние различного состава бактериального сообщества на органолептические свойства мабизи требует дальнейшего изучения.Кроме того, с растущим интересом к кустарным продуктам эта информация также может иметь решающее значение при разработке «автохтонных» заквасок, способных имитировать спонтанную ферментацию для производства мабизи, также называемого «третьим способом» (Capozzi et al., 2020; Таманг и др., 2020). В связи с этим дальнейшая работа могла бы конкретно рассмотреть влияние вариаций обратного воздействия на состав микробного сообщества и связанные с ним атрибуты продукта.

С точки зрения разнообразия бактериального сообщества мабизи, продуцируемые в TMPR, были менее разнообразными и в основном преобладали роды LAB по сравнению с теми, которые продуцировались в не-TMPR, которые имели более сложный и разнообразный состав.Существует связь между конечным pH и микробным разнообразием: чем ниже pH, тем меньше разнообразие бактериального сообщества. Это особенно наблюдалось в образцах из Западной провинции, где преобладали вида Lactococcus и вида Lactobacillus . И наоборот, образцы с высоким pH показали большее разнообразие, о чем свидетельствуют образцы из Восточной провинции. В последней провинции был мабизи с самым высоким средним значением pH, вероятно, потому, что большинство фермеров, предоставивших образцы, редко готовили мабизи из-за низкого количества молока, производимого в сухой сезон, которое часто потреблялось свежим.Более того, приготовление мабиси некоторыми этническими группами в этой провинции не является культурным. Следует также отметить, что спонтанная ферментация может представлять потенциальные микробиологические риски (Capozzi et al., 2017). В этом исследовании мабизи с высоким pH (pH выше 4,5), особенно из не-TMPR, будет представлять более высокий риск. Проверка этого потребует дальнейшего изучения. Однако наши обсуждения с переработчиками и потребителями в рамках сбора образцов для этого исследования не выявили случаев заболеваний, связанных с потреблением мабизи.

Результаты анализа состава бактериального сообщества также демонстрируют четкую характеристику типа давления отбора, действующего на ферментирующее молоко. В этом случае мы рассматриваем мабизи как экосистему, которая подвергается давлению отбора в виде производственных практик, географического положения, использования конкретных контейнеров для ферментации, влияния обработки производителями и продолжительности ферментации. Это исследование показало, что географическое положение оказывает значительное влияние ( P <0.001) о составе бактериального сообщества, о чем свидетельствует разница в структуре бактериального сообщества для двух основных идентифицированных регионов: TMPR и не-TMPR. Образцы, не относящиеся к TMPR, демонстрировали более сложное сообщество, вероятно, из-за низкого масштаба и частоты производства, в основном ограниченного одним методом производства, тогда как сообщества в образцах мабизи из TMPR были менее сложными и в основном преобладали LAB. Это может быть связано с использованием большего количества методов производства, более частое и крупномасштабное производство мабизи в этом регионе, возможно, привело к длительному совместному культивированию LAB, что привело к этому конкретному результату.

Технологии производства, возможно, также способствовали сдвигам в составе бактериального сообщества, метод производства типа тонга — это серийное производство в течение 1–3 дней, и продукт обычно потребляется в течение этого периода. Метод типа бароце включает поочередное удаление сыворотки и добавление сырого молока, и на его производство уходит 4–7 дней (Moonga et al., 2019). С другой стороны, метод обратного хода предполагает использование части партии мабизи в качестве стартера для следующей, и этот процесс отката может продолжаться несколько циклов. Результаты, полученные в этом исследовании, показывают, что существуют различия в составе бактериального сообщества этих продуктов (Рисунок 7B). В Tonga mabisi преобладают видов Lactococcus и другие роды, не относящиеся к LAB, в то время как в barotse mabisi преобладает большее количество родов LAB, в частности, Lactococcus вида и Lactobacillus вида, а у второстепенного мабизи, кроме того, Streptococcus вида. Густая тонга и сливочный мабиси были похожи на тонга мабизи из TMPR по составу бактериального сообщества.Хотя для некоторых видов мабизи было меньше образцов, статистический анализ показывает значительные различия ( P <0,001). Таким образом, очевидно, что каждый метод производства оказывает определенное давление отбора на бактериальные сообщества мабизи, что приводит к различному составу сообществ. Формальные эксперименты по составу бактериального сообщества при различных методах производства мабизи подтверждают эти выводы (Moonga, 2019).

Влияние происхождения образцов мабизи, полученных либо непосредственно от производителей (фермеров), либо от торговцев, на состав бактериального сообщества наблюдалось в несколько более высоком богатстве и разнообразии бактериального сообщества в образцах, собранных у фермеров, по сравнению с образцами, собранными от трейдеров, но не был значительным (Рисунки 6A, B).Сравнение OTU мабизи, полученного в разных контейнерах для ферментации, также не оказало значительного влияния на состав бактериального сообщества, но на продолжительность ферментации оказало влияние. Последнее может влиять на конечный pH мабизи, что также оказывает значительное влияние на состав бактериального сообщества. К сожалению, отбор образцов не дал равного количества образцов для каждого типа продукта, производителя, местоположения, емкости или продолжительности ферментации. Это означает, что для дальнейшего изучения этого вопроса необходимо провести определенные эксперименты с элементами управления, чтобы получить более существенные результаты по каждому фактору. Следует также отметить, что собранные образцы представляли собой конечные образцы ферментации мабизи на разных этапах, которые были интерпретированы на основе информации, предоставленной производителями по их соответствующим образцам.

В заключение, в бактериальном сообществе мабизи преобладают четыре рода LAB и пять родов, не относящихся к LAB. Бактериальный состав образцов мабизи, собранных в не TMPR, более разнообразен, чем TMPR, с более длительной историей производства и более широким разнообразием типов производимых мабизи.Не-TMPR, в первую очередь продуцируемый тонга мабизи, доминировали Lactococcus и виды, не относящиеся к LAB, тогда как в TMPR преобладали Lactococcus , Lactobacillus и Streptococcus с гораздо меньшей долей видов, не относящихся к LAB. Следовательно, для создания любой заквасочной культуры мабизи потребуется отбор штаммов этих видов LAB для конкретных типов продуктов мабизи.

Географическое положение, метод производства, продолжительность ферментации и pH оказали значительное давление отбора на микробы в мабизи, которые сформировали результат структуры микробного сообщества.

Однако необходимо провести эксперименты, чтобы установить влияние каждого из этих факторов и определить оптимальные условия производственного процесса, так как этот продукт уже присутствует на рынке, и по мере создания большего количества ЦМК стандартизированные производственные протоколы обеспечат производство стабильное и качественное мабиси, отвечающее потребностям потребителей.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, находятся в открытом доступе.Эти данные можно найти здесь: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/647247.

Авторские взносы

HM: концептуализация, курирование данных, формальный анализ, получение финансирования, исследование, методология, проверка, визуализация, роли / написание — исходный черновик, и написание — просмотр и редактирование. SS и ES: концептуализация, получение финансирования, методология, администрирование проекта, ресурсы, программное обеспечение, надзор и написание — обзор и редактирование. JH: курирование данных, программное обеспечение, проверка и написание — просмотр и редактирование.AL: концептуализация, получение финансирования, методология, ресурсы, надзор и написание — обзор и редактирование. МС: курирование данных, формальный анализ, программное обеспечение, проверка, визуализация и написание — просмотр и редактирование. JS: концептуализация, получение финансирования, методология, администрирование проекта, ресурсы, надзор и написание — обзор и редактирование. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Мы благодарим за финансовую поддержку Нидерландскую организацию научных исследований, NWO-WOTRO Science for Global Development, которая предоставила SS, грант номер W 08.250.103. Это исследование было частью докторской диссертации. исследовательский проект «Оптимизация продукта мабиси».

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить сотрудников министерств рыболовства и животноводства (MFL) и сельского хозяйства правительства Республики Замбия, Молочную ассоциацию Замбии (DAZ) и участвующих молочных кооперативов и центров сбора молока за содействие в сборе проб из фермеры.Мы также хотим выразить благодарность участвующим фермерам, предоставившим образцы мабизи, а также команде технической поддержки: Джудит Уолкерс-Рооджакерс, Мозесу Банде, Виктории Симанеле, Джерри Банда, Аните Мувово, Мвимба Сичилима, а также Хаджая Мвула и Бенсон Чишала, Винсенту Ньяу и Мвитве Чаншике из Университета Замбии за материально-техническую поддержку.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: //www.frontiersin.org / article / 10.3389 / fmicb.2020.01816 / full # additional-material

РИСУНОК S1 | Верхние 20 (A) и 30 (B) наиболее распространенных видов бактериального сообщества.

Список литературы

Акабанда Ф., Овусу-Квартенг Дж., Гловер Р. и Тано-Дебрах К. (2010). Микробиологические характеристики традиционного ганского кисломолочного продукта Nunu. Nat. Sci. 8, 178–187.

Google Scholar

Альтшул, С. Ф., Гиш, В., Миллер У., Майерс Э. У. и Липман Д. Дж. (1990). Базовый инструмент поиска локального выравнивания. J. Mol. Биол. 215, 403–410.

Google Scholar

Анал, А. К. (2019). Качественные ингредиенты и проблемы безопасности традиционных ферментированных продуктов и напитков из Азии: обзор. Ферментация 5: 8. DOI: 10.3390 / ферментация5010008

CrossRef Полный текст | Google Scholar

AOAC (2005). Официальные методы анализа Международной ассоциации химиков-аналитиков.Гейтерсбург. Мэриленд. МА: AOAC International.

Google Scholar

Аксельссон, Л. (2004). Молочнокислые бактерии: классификация и физиология. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Марсель Деккер.

Google Scholar

Бик, Э. М., Костелло, Э. К., Свитцер, А. Д., Каллахан, Б. Дж., Холмс, С. П., Уэллс, Р. С. и др. (2016). Морские млекопитающие обладают уникальными микробиотами, сформированными, но отличными от моря .. Nat. Commun. 7: 10516.

Google Scholar

Бокулич, Н.A., Collins, T. S., Masarweh, C., Allen, G., Heymann, H., Ebeler, S. E., et al. (2016). Связь между микробиомом винограда, метаболомом и ферментационным поведением предполагает микробный вклад в региональные характеристики вина. мБио 7: e00631-16.

Google Scholar

Caporaso, J. G., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F. D., Costello, E. K., et al. (2010). QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Nat. Методы 7: 335.

Google Scholar

Капоцци В., Фрагассо М., Романиелло Р., Бербегал К., Руссо П. и Спано Г. (2017). Самопроизвольные ферментации пищевых продуктов и потенциальные риски для здоровья человека. Ферментация 3:49. DOI: 10.3390 / ферментация3040049

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Капоцци, В., Фрагассо, М., и Руссо, П. (2020). Микробиологическая безопасность и управление микробными ресурсами в пищевых продуктах и ​​напитках кустарного производства: необходимость трансдисциплинарной оценки для согласования фактических тенденций и предотвращения рисков. Микроорганизмы 8: 306. DOI: 10.3390 / микроорганизмы8020306

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Центральное статистическое управление (ЦСУ) и ICF International (2014). Обзор демографии и здравоохранения Замбии, 2013–2014 гг. Роквилл, Массачусетс: Центральное статистическое управление.

Google Scholar

де Фриз, Ф. Т., и Гриффитс, Р. И. (2018). «. Глава пятая — Воздействие изменения климата на микробные сообщества почвы и их функционирование », в Developments in Soil Science , Vol.35, ред. У. Р. Хорват и Ю. Кузяков (Амстердам: Elsevier), 111–129. DOI: 10.1016 / b978-0-444-63865-6.00005-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Домингес-Манзано, Х., Олмо-Руис, К., Баутиста-Гальего, Х., Арройо-Лопес, Ф. Н., Гарридо-Фернандес, А., и Хименес-Диас, Р. (2012). Образование биопленки на абиотических и биотических поверхностях во время брожения зеленых столовых оливок в испанском стиле. Внутр. J. Food Microbiol. 157, 230–238. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2012.05.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эдгар, Г.Дж., Стюарт-Смит, Р. Д., Уиллис, Т. Дж., Кининмонт, С., Бейкер, С. К., Бэнкс, С. и др. (2014). Результаты глобального сохранения зависят от морских охраняемых территорий с пятью ключевыми характеристиками. Природа 506: 216.

Google Scholar

Фарке, Н. Ю. (2017). «Глава 43 — творог, кваркоподобные продукты и концентрированные йогурты», в Cheese , 4th Edn, eds PLH McSweeney, PF Fox, PD Cotter, and DW Everett (Сан-Диего, Калифорния: Academic Press), 1103–1110 . DOI: 10.1016 / b978-0-12-417012-4.00043-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лангенхедер, С., Секели, А. Дж. (2011). Сортировка видов и нейтральные процессы важны во время начальной сборки бактериальных сообществ. ISME J. 5, 1086–1094. DOI: 10.1038 / ismej.2010.207

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лерой, Ф., и Де Вюист, Л. (2004). Молочнокислые бактерии как функциональные заквасочные культуры для пищевой ферментационной промышленности. Trends Food Sci. Technol. 15, 67–78. DOI: 10.1016 / j.tifs.2003.09.004

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Люси, Дж. А. (2004). Кисломолочные продукты: обзор их свойств гелеобразования и текстуры. Внутр. J. Dairy Technol. 57, 77–84. DOI: 10.1111 / j.1471-0307.2004.00142.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мартин, М. (2011). CUTADAPT удаляет последовательности адаптеров из операций чтения с высокой пропускной способностью. Бари: EMBnet Stichting.

Google Scholar

Мак-Мерди, П. Дж., И Холмс, С. (2013). Phyloseq: пакет R для воспроизводимого интерактивного анализа и графики данных переписи микробиома. PLoS One 8: e61217. DOI: 10.1371 / journal.pone.0061217

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МФЛ (2018). Годовой отчет 2017 MFL – Департамент развития животноводства 4-5. Ченнаи: MLF, 16–17.

Google Scholar

Moonga, H.Б. (2019). Оптимизация продукта замбийского традиционного кисломолочного молока – Мабиси. к.т.н. докторская диссертация, Университет Вагенингена, Вагенинген.

Google Scholar

Moonga, H. B., Schoustra, S. E., Linnemann, A. R., Kuntashula, E., Shindano, J., and Smid, E. J. (2019). Искусство производства мабизи: традиционное кисломолочное молоко. PLoS One 14: e0213541. DOI: 10.1371 / journal.pone.0213541

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Муртаза, м.А., Ур-Рехман, С., Анджум, Ф. М., Хума, Н., и Хафиз, И. (2014). Созревание и характеристика вкуса сыра Чеддер: обзор. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 54, 1309–1321.

Google Scholar

Музыка (2017). Обзор состояния животноводства и животноводства в Замбии Musika. Замбия: заставить сельскохозяйственные рынки работать для Замбии.

Google Scholar

Оксанен, Дж., Бланше, Ф. Г., Киндт, Р., Лежандр, П., Минчин, П.Р., ОХара, Р. Б. и др. (2019). « Vegan: Пакет для защиты окружающей среды». R Версия пакета 2.5-5.

Google Scholar

Освик, Р. Д., Зигмунд, С., Ева, Б., Харейде, М., Эллинор, Х., Жак, Г. и др. (2013). Бактериальное разнообразие aMasi, кисломолочного продукта из Южной Африки, определено с помощью библиотеки клонов и анализа денатурирующего градиентного гель-электрофореза. Afr. J. Microbiol. Res. 7, 4146–4158.

Google Scholar

Паркер, М., Зобрист С., Донахью К., Эдик К., Мансен К., Заде М. Х. и др. (2018). Натуральное ферментированное молоко из северного Сенегала: состав бактериального сообщества и обогащение пробиотиками Lactobacillus rhamnosus. Фронт. Microbiol. 9, 2218–2218.

Google Scholar

Quast, C., Pruesse, E., Yilmaz, P., Gerken, J., Schweer, T., Yarza, P., et al. (2013). Проект базы данных генов рибосомных РНК SILVA: улучшенная обработка данных и веб-инструменты. Nucleic Acids Res. 41, D590 – D596.

Google Scholar

Основная группа разработчиков

R (2008 г.). R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд R для статистических вычислений.

Google Scholar

Роуленд И., Гибсон Г., Хейнкен А., Скотт К., Суонн Дж., Тиле И. и др. (2018). Функции кишечной микробиоты: метаболизм питательных веществ и других компонентов пищи. Eur. J. Nutr. 57, 1–24. DOI: 10.1007 / s00394-017-1445-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schoustra, S.E., Kasase, C., Toarta, C., Kassen, R., and Poulain, A.J. (2013). Структура микробного сообщества трех традиционных замбийских ферментированных продуктов: мабиси, чибванту и мункойо. PLoS One 8: e6394. DOI: 10.1371 / journal.pone.0063948

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх Р. К., Чанг, Х.-В., Ян Д., Ли, К. М., Укмак, Д., Вонг, К. и др. (2017). Влияние диеты на микробиом кишечника и последствия для здоровья человека. J. Trans.Med. 15:73.

Google Scholar

Шмид, Э., Клеребезем, М. (2014). Производство ароматических соединений при молочнокислых ферментациях. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 5, 313–312.

Google Scholar

Смид, Э. Дж. (2015). Ферментированные продукты: продукты науки и мастерства. Вагенинген: Университет Вагенингена.

Google Scholar

Sybesma, W., Kort, R., and Lee, Y.-K. (2015). Пробиотики местного производства — следующая возможность для развивающихся стран? Trends Biotechnol. 33, 197–200. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2015.01.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Секели, А. Дж., И Лангенхедер, С. (2014). Важность сортировки видов различается между специалистами по средам обитания и специалистами по бактериальным сообществам. FEMS Microbiol. Ecol. 87, 102–112. DOI: 10.1111 / 1574-6941.12195

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Таманг, Дж. П., Коттер, П. Д., Эндо, А., Хан, Н.С., Корт, Р., Лю, С. К. и др. (2020). Ферментированные продукты в эпоху глобализации: Восток встречается с Западом. Понимание. Rev. Food Sci. Безопасность пищевых продуктов 19, 184–217. DOI: 10.1111 / 1541-4337.12520

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Анализ на основе секвенирования бактериального и грибкового состава кефирных зерен и молока из различных источников

Abstract

Кефир — это напиток на основе ферментированного молока, которому приписывают ряд полезных для здоровья свойств.Микробы, ответственные за ферментацию молока для производства кефира, состоят из сложной ассоциации бактерий и дрожжей, связанных в полисахаридной матрице, известной как кефирное зерно. Последовательность этой микробной популяции и той, которая присутствует в полученном напитке, была предметом ряда предыдущих, почти исключительно основанных на культуре, исследований, которые выявили различия в зависимости от географического положения и условий культивирования. Однако исследования идентификации на основе культур ограничены в силу выявления только видов, способных расти на конкретной используемой среде, и, таким образом, независимые от культуры, молекулярные методы предлагают потенциал для более всестороннего анализа таких сообществ.Здесь мы описываем подробное исследование микробной популяции кефира, как бактериальной, так и грибковой, с использованием высокопроизводительного секвенирования для анализа 25 видов кефирного молока и связанных зерен, полученных из 8 географически различных регионов. Это первый случай, когда эта технология была использована для исследования грибкового компонента этих популяций или для выявления микробного состава такого большого количества кефирных зерен или молока. В результате было выявлено несколько родов и видов, ранее не идентифицированных в кефире.Наш анализ показывает, что в бактериальных популяциях кефира преобладают 2 типа: Firmicutes и Proteobacteria. Также было установлено, что в грибных популяциях кефира преобладают роды Kazachstania , Kluyveromyces и Naumovozyma , но существует также и изменчивая субдоминирующая популяция.

Образец цитирования: Марш А.Дж., О’Салливан О., Хилл С., Росс Р.П., Коттер П.Д. (2013) Анализ на основе секвенирования бактериального и грибкового состава кефирных зерен и молока из различных источников.PLoS ONE 8 (7): e69371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371

Редактор: Колин Дейл, Университет Юты, Соединенные Штаты Америки

Поступило: 24 марта 2013 г .; Одобрена: 7 июня 2013 г .; Опубликован: 19 июля 2013 г.

Авторские права: © 2013 Marsh et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Центр пищевых фармакологий — это исследовательский центр, финансируемый Ирландским научным фондом (SFI) в рамках Национального плана развития правительства Ирландии. Авторы и их работа поддержаны грантом SFI CSET, грантом APC CSET 2 07 / CE / B1368. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Кефир — это кисломолочный напиток. Это вязкий, самогазированный, кислый напиток с низким содержанием алкоголя, который, как полагают, возник в горах Кавказа около 2000 лет назад. Молоко ферментируется твердой полисахаридной матрицей, похожей на цветную капусту, известной как кефирное зерно, которую повторно используют для начала последующих ферментаций. Зерно в основном состоит из кефирана, производимого бактериями [1], который содержит в себе сложный консорциум бактерий и дрожжей, которые работают в симбиозе для ферментации молока [2].

Считается, что микробный состав кефира и кефирных зерен варьируется в зависимости от географических, климатических и культурных условий, а также от разнообразия местных видов диких дрожжей и бактерий. Анализ культур показывает, что бактерии составляют большинство, до 90% популяции зерна [3]. Такие культуральные исследования также показали, что бактериальный состав кефира преимущественно состоит из молочнокислых бактерий (LAB) Lactobacillus , Lactococcus , Leuconostoc и Streptococcus , а также уксуснокислых бактерий из рода Acetobacter. [4], [5], [6].Бактерии способствуют выработке молочной кислоты, которая сохраняет молоко, и продуцирует различные противомикробные и ароматизирующие соединения (например, ацетальдегид) в дополнение к другим метаболитам (например, внеклеточным полисахаридам), свободным аминокислотам и витаминам [7]. Другие исследования показали, что дрожжевой компонент кефира состоит из Kluyveromyces , Saccharomyces , Candida и Torulaspora [3], [8], [9], [10], [11]. Другие дрожжи, которые реже ассоциируются с кефиром, включают Pichia / Issatachenkia [9], [12], Brettanomyces / Dekkera [8], [13], Zygosaccharomyces [4] и Yarrowia [10], тогда как недавние молекулярные исследования обнаружили присутствие Kazachstania [14], [15], [16].Дрожжи выполняют жизненно важную роль в производстве алкоголя и углекислого газа в молоке и вырабатывают метаболиты, которые считаются важными с точки зрения ощущения во рту и вкуса [17]. В конечном счете, после 24-часовой ферментации подходы, основанные на культуре, показывают, что лактококки / стрептококки присутствуют в 10 ⁸ –10 ⁹ мл ^-1 , Leuconostoc в 10 ⁷ –10 ⁸ мл ⁻¹ , уксуснокислые бактерии при 10 ⁵ –10 ⁶ мл ⁻¹ , лактобациллы при 10 ⁵ –10 ⁶ мл ⁻¹ и дрожжи при 10 ⁶ –10 ⁷ мл ^-1 [18], [19].

Несмотря на несомненную ценность вышеупомянутых исследований, анализы на основе культур ограничены в силу выявления только видов, способных расти на конкретной используемой среде. Таким образом, независимые от культуры методы могут обеспечить более точный и глубокий анализ. Хотя независимые от культуры методы, такие как секвенирование по Сэнгеру [12], [16], [20], [21] и DGGE [14], [15], [22], использовались для изучения популяции кефира, применение высоких Особо важным достижением стало высокопроизводительное секвенирование ДНК для исследования таких микробных экосистем.Эта стратегия использовалась для изучения микробного состава ряда ферментированных пищевых сред, таких как сыр [23], [24], ферментированная рыба [25], [26], ферментированные овощи [27], рисовые отруби [28] и суспензия жемчужного проса [29]. Действительно, недавно было также использовано высокопроизводительное секвенирование ДНК, чтобы получить более полное представление о бактериальной популяции одного ирландского кефирного зерна и молока и трех бразильских кефирных зерен [30], [31].

Преимущества более полного понимания микробного состава кефира и кефирных зерен связаны с тем фактом, что история кефира уже давно связана с его предполагаемой пользой для здоровья.Предварительные исследования показали, что кефир уменьшает симптомы непереносимости лактозы, стимулирует иммунную систему, снижает уровень холестерина и обладает антимутагенными и антиканцерогенными свойствами [7]. Поэтому неудивительно, что в последние годы кефир как функциональная молочная пища стал объектом повышенных исследований. Хотя некоторые из преимуществ для здоровья, которые, как считается, связаны с потреблением кефира, могут быть связаны с биохимическими изменениями, происходящими в молоке, такими как производство органических кислот, биоактивных пептидов и т. Д., присутствующие виды микробов также могут иметь свойства, способствующие укреплению здоровья. В частности, роды, к которым отнесены многие штаммы с полезными для здоровья или пробиотическими свойствами, такие как Lactobacillus , Bifidobacterium , Enterococcus , Bacillus и Streptococcus , были выделены из кефира в прошлом [20] , [32]. С точки зрения грибков, в клинических испытаниях было установлено, что штаммы дрожжей Saccharomyces boulardii обладают полезными для здоровья свойствами [33], [34], [35].Штаммы Saccharomyces cerevisiae , а также Kluyveromyces lactis / Candida kefyr , обычно связанные с кефиром, также обладают потенциалом в этом отношении [36], [37], [38]. Однако, наоборот, было показано, что Candida kefyr вызывает эсфагит у пациента с плоскоклеточным раком [39].

Помимо выявления потенциально здоровых популяций, коммерциализация производства кефира может выиграть от получения подробного понимания связанных микробных популяций.Также существует потребность в оценке неоднородности этих популяций по большому количеству зерен и, в частности, в использовании молекулярных подходов для лучшей характеристики ассоциированных популяций дрожжей. В свете этих требований целью данного исследования было использование высокопроизводительных методов секвенирования для обеспечения углубленного анализа микробного консорциума из 25 различных зерен кефира и молока, полученных из множества различных источников, с целью минимизировать любые географические предубеждения. это может повлиять на флору.Это исследование является первым случаем, когда эта технология была применена к такому большому количеству образцов кефира, и первым исследованием такого рода, которое выявило грибковый компонент кефира.

Материалы и методы

Поддержание культуры

9 ирландских кефирных зерен были повторно культивированы из хранилища -80 ° C в Коллекции культур Teagasc путем ферментации в 10% восстановленном обезжиренном молоке (RSM), которое было стерилизовано при 115 ° C в течение 15 минут. Первоначально они были приобретены у домохозяек по всей стране [18] и для целей данного исследования были обозначены как IR1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 и 10.Еще 16 зерен были получены от индивидуальных и коммерческих поставщиков из ряда различных мест (Таблица S1) и выращены в одинаковых условиях. Образцы из Соединенного Королевства были обозначены как UK1 — UK5, а образцы из США — как US1, 2, 3 и 5. Другие зерна кефира были получены из Испании (Sp1), Франции (Fr1), Италии (It1), Канады (Ca1). ) и Германии (Ger1 и Ger2). Культуры поддерживали при комнатной температуре и вносили в свежее молоко 3 раза в неделю в течение минимум 4 месяцев до экстракции.

Метагеномная экстракция ДНК

100 мл 10% RSM инокулировали 1 г кефирного зерна и ферментировали при 25 ° C в течение 24 часов, времени, при котором кефир готовят чаще всего. Для извлечения ДНК из кефира 1,8 мл ферментированного молока центрифугировали для получения осадка, который суспендировали в 450 мкл лизирующего буфера P1 из набора для выделения микробной ДНК Powerfood (MoBio Laboratories Inc, США). Ресуспендированный осадок подвергали ферментативному расщеплению ферментами мутанолизином (100 Ед / мл) и лизоцимом (50 мкг / мл) при 37 ° C в течение 1 часа с последующим расщеплением протеиназой K (250 мкг / мл) при 55 ° C в течение 1 часа. час.Экстракцию оптимизировали 10-минутной инкубацией при 70 ° C [40] перед механическим лизисом с использованием Qiagen TissueLyser II (Retsch ® ). Затем использовали набор для выделения микробной ДНК Powerfood в соответствии с инструкциями производителя. Чистую ДНК элюировали стерильной водой для ВЭЖХ. ДНК из кефирного зерна выделяли с помощью модифицированной процедуры экстракции на основе фенол-хлороформа [22].

Амплификация ДНК и пиросеквенирование

Экстракты

метагеномной ДНК использовали в качестве матрицы для амплификации ПЦР с BioMix red (Биолайн), которая имеет зарегистрированную частоту ошибок 2 × 10 ⁵ ошибок / п.н. [41].ПЦР-амплификацию вариабельной области V4 – V5 (408 п.н.) гена 16S рРНК проводили с использованием универсальных праймеров V1 (5′-AYTGGGYDTAAAGNG) и обратного V5 (5′-CCGTCAATTYYTTTRAGTTT) для облегчения исследования бактериального компонента микробные популяции [42]. Адаптеры с уникальным мультиплексным идентификатором длиной 8 п.н. были прикреплены между 454 последовательностями адаптеров и прямыми праймерами для облегчения объединения и последующей дифференциации образцов [43]. Меченые универсальные праймеры также использовали для амплификации ДНК грибов из вариабельной области рРНК ITS-1 [44].В этом случае прямой праймер ITS1F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) и обратный ITS2 (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC) генерировали продукты ПЦР размером примерно 410 п.н. Условия ПЦР, используемые для амплификации 16S: денатурация 94 ° C в течение 2 минут, 35 циклов 94 ° C в течение 1 минуты (денатурация), 52 ° C в течение 1 минуты (отжиг) и 72 ° C в течение 1 минуты (удлинение) с последующим последние 72 ° C в течение 2 минут. Условия ПЦР, используемые для ITS-амплификации: денатурация при 94 ° C в течение 4 минут, 35 циклов при 94 ° C в течение 30 секунд (денатурация), 50 ° C в течение 1 минуты (отжиг) и 72 ° C в течение 1 минуты и 30 секунд ( расширение).Был проведен последний этап отжига при 72 ° C в течение 10 минут. Вся ДНК подвергалась 10-минутному горячему запуску при 94 ° C перед амплификацией ПЦР. Ампликоны, полученные из трех реакций ПЦР / матричной ДНК, объединяли и очищали с использованием системы очистки Agencourt AMPure ® (Beckman Coulter Genomics, Takeley, UK). Очищенные продукты количественно определяли с использованием флуороспектрометра Nanodrop 3300 (Thermo Scientific) и набора для анализа дцДНК Quant-iT ™ Picogreen ® (Invitrogen). Объединяли равные концентрации ампликонов 16S или ITS, AMPure очищали и оценивали с помощью биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies), чтобы определить чистоту и убедиться в отсутствии димеров праймеров.Секвенирование ампликонов 16S рРНК V4 – V5 и ITS1 рДНК проводили с использованием 454 Genome Sequencer FLX Titanium System (Roche Diagnostics Ltd) в Центре исследований пищевых продуктов Teagasc, Moorepark, согласно 454 протоколам.

Анализ данных пиросеквенирования

необработанных последовательностей были качественно обрезаны и отфильтрованы с использованием набора инструментов Qiime Suite [45]; любые считывания, не отвечающие критериям качества минимальной оценки качества 25 и длины последовательности короче 150 бит / с для считывания ампликона 16S и 200 бит / с для считывания ампликона ITS, отбрасывались.Максимальный предел гомополимеров был увеличен до 10 для ITS-ампликонов, поскольку известно, что ITS-последовательности содержат длинные гомополимерные серии. Урезанные последовательности fasta оценивали с помощью анализа BLAST по базе данных SILVA (версия 100) для считываний 16S [46]. Специфическая база данных ITS-1, ITSoneDB, использовалась для BLAST всех последовательностей ITS [47]. Выходные данные BLAST анализировались с использованием MEGAN [48] с битовой оценкой 86, использовавшейся для данных рибосомной последовательности 16S, и битовой оценкой 35 использовалась для данных ITS-последовательности. Набор программ QIIME использовался для расчета альфа-разнообразия, включая богатство Chao1, разнообразие Шеннона, индекс Симпсона, филогенетическое разнообразие и наблюдаемые виды [45].Глубину секвенирования оценивали с помощью анализа разрежения. QIIME также использовался для создания взвешенных матриц расстояний UniFrac, невзвешенных UniFrac и Брея-Кертиса. Графики главного координатного анализа, основанные на этих матрицах расстояний, были созданы с помощью Qiime и визуализированы с помощью King [49]. Статистически значимые различия между комбинированными зернами кефира и комбинированным ферментированным молоком определяли с помощью непараметрического теста Манна-Уитни с использованием статистического пакета Minitab ® .Прочтения были депонированы в базе данных SRA под инвентарным номером ERP002650.

Результаты

Бактериальная популяция кефирного молока более стабильна и менее разнообразна, чем в соответствующих зернах

Фильтрация пост-качества, осталось 106 235 и 136 815 отсчетов для 23 зерен и соответствующих 23 пробы молока соответственно, что составляет в среднем 4619 отсчетов для каждой пробы зерна и 5 949 отсчетов на пробу молока.

Были рассчитаны значения

Chao1 (отражающие OTU / видовое богатство), индексы Шеннона и Симпсона (для определения видового разнообразия), а также числа филогенетического разнообразия и наблюдаемых видов (таблица S2).Кривые разрежения, рассчитанные при 97% сходстве, приближаются параллельно оси x для всех образцов, что указывает на то, что было получено достаточное количество считываний для адекватной оценки популяции (Рисунок S1). Анализ прямоугольной диаграммы показывает, что популяция бактерий в кефирном молоке, как правило, менее разнообразна, чем в кефирных зернах (рис. S2), где среднее значение (черная полоса) для молока было ниже по всем показателям, за исключением критерия Шеннона. индекс. Единственное существенное различие между зерном и молоком заключалось в филогенетическом разнообразии ( p <0.001).

Графики

главного координатного анализа были сгенерированы на основе невзвешенной матрицы расстояний UniFrac (рис. 1AB), единственной древовидной метрики. Из этого анализа было очевидно, что не было кластеризации среди популяций кефира из разных стран (рисунок 1AB), и это коррелировало с другими матрицами расстояний (данные не показаны). Анализ Прокруста показал, что ординации кефирных и кефирных зерен не связаны друг с другом ( M ² = 0.924, p = 0,644, рисунок 2A). Сходство между кефирными зерновыми сообществами было не таким, как сходство между кефирными сообществами.

Рис. 1. Графики главного координатного анализа (PCoA), основанные на невзвешенных матрицах расстояний UniFrac, показывают разнообразие в популяциях бактерий из зерен кефира (A) и кефирного ферментированного молока (B), а также популяций грибов (C) и молока (D) .

Зеленый = ирландский кефир, Апельсин = бельгийский кефир, Светло-коричневый = испанский кефир, Красный = немецкий кефир, Серый = американский кефир, Розовый = итальянский кефир и Фиолетовый = британский кефир.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371.g001

Рис. 2. Прокрустовое изображение невзвешенных дистанционных матриц UniFrac подчеркивает разнообразие бактериального компонента 16S (A) и грибкового компонента (B) различных кефиров. образцы.

Два разных типа образцов связаны полосой (белый цвет представляет флору зерна; красный цвет представляет флору молока). Направление каждой оси произвольно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371.g002

Альфа-разнообразие популяций грибов в кефирном молоке и зернах различается, но бета-разнообразие кефирных зерен больше, чем у молока

Фильтрация пост-качества. Всего было сгенерировано 118 879 и 118 976 считываний, соответствующих 23 зернам и соответствующим 23 популяциям молока, соответственно. Это соответствует среднему числу считываний 5 167 и 5 173 на зерно и образец молока соответственно.

Значения разнообразия альфа установили, что разнообразие зерен кефира и молока естественно низкое (Таблица S3).Анализ прямоугольной диаграммы индексов Chao1, наблюдаемых видов и филогенетического разнообразия показывает, что разнообразие больше в кефирном молоке, чем в зернах (Рисунок S3). Однако статистическая разница между ними ограничивалась филогенетическим разнообразием (p <0,001). Кривые разрежения для всех образцов приближаются параллельно оси x, что свидетельствует о достаточной глубине секвенирования (рисунок S4).

Для измерения бета-разнообразия были сгенерированы графики главного координатного анализа на основе невзвешенных матриц расстояний UniFrac (рис. 1CD), но кластеризации не было.Анализ Прокруста двух PCoA снова показывает, что сходства между кефирными зернами и кефирным молоком не были одинаковыми в отношении популяций грибов ( M ² = 0,855, p = 0,139, рис. 2B).

В кефирных зернах и связанном с ними кефирном молоке преобладает относительно небольшое количество бактериальных родов

В кефирном зерне обнаружено четыре бактериальных типа. Это были Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria.Из них Bacteroidetes не были идентифицированы среди молочных бактерий и были обнаружены только в 9 зернах. Как в зерне, так и в молоке, двумя доминирующими типами были Firmicutes и Proteobacteria. Действительно, большинство образцов зерна содержали большинство (> 50%) Firmicutes, за исключением Ir6, который содержал 69,14% Proteobacteria. В зернах Ca1, Ir9 или UK3 протеобактерии не обнаружены. Среди образцов молока Ir1, Ir5, Ir10, US1 и Ir8 также были необычными, поскольку содержали бактериальную популяцию с преобладанием Proteobacteria, которая в случае Ir8 достигала 90.4%. В молоке, соответствующем Fr1 и UK3, протеобактерии отсутствовали. Не было очевидного последовательного перехода (увеличения или уменьшения) популяций протеобактерий с кефирного зерна на кефирное молоко (Таблица S4; Таблица S5). Бактерии, соответствующие филуму Actinobacteria, были обнаружены только в двух зернах: Ir9 (5,87%) и UK2 (0,24%). Относительно высокий процент актинобактерий в Ir9 может объяснить, почему соответствующее кефирное молоко было единственным образцом, в котором были обнаружены актинобактерии (0,26%). Среди всего зерна было значительно большее количество неназначенных типов, чем среди всего молока ( p <0.001).

На уровне семейства очевидно большее бактериальное разнообразие (с точки зрения количества различных семейств) в зерне. Только пять семейств бактерий были обнаружены в молоке, тогда как двенадцать были идентифицированы в пробах зерна (Таблицы S4 – S5). Зерна преимущественно состояли из Lactobacillaceae , что составляло> 50% популяций во всем, кроме зерна Ir6. Другим крупным семейством были протеобактерии Acetobacteraceae .Среди других обнаруженных семейств были Streptococcaceae (19 зерен), Leuconostocaceae (4 зерна), Lachnospiraceae (16 зерен), Ruminococcaceae (8 зерен), Bifidobacteriaceae (2 зерна), Clostridia grains (2 зерна), Clostridia ), Propionibacteriaceae (2 зерна), Bacteroidaceae (2 зерна), Enterococcaceae (1 зерно) и Rikenellaceae (1 зерно) (Таблица S4). Среди других семейств Streptococcaceae были обнаружены в 19 из 23 зерен с самыми высокими пропорциями, обнаруженными в UK2 (5.12%). Leuconostocaceae были обнаружены только в четырех образцах зерна (Bel1, 0,31%; Fr1, 0,13%; UK1, 0,29%; UK2, 0,51%). Lachnospiraceae были обнаружены в 16 зернах, от наибольшего содержания в Ir9 (0,51%) до самого низкого в US2 (0,09%). Ruminococcaceae были обнаружены в 8 образцах, от 8,21% в Bel1 до 0,08% в UK2. Bifidobacteriaceae присутствовали только в 2 зернах (0,81% в Ir9 и 0,10% в UK2), как и Clostridiaceae (Ger1, 0.39% и US2, 0,12%), Propionibacteriaceae (Ir9, 4,94% и UK2, 0,13%) и Bacteroidaceae (UK2 и UK3, 0,08%). Enterococcaceae (Ir9, 0,22%) и Rikenellaceae (US2, 0,07%) присутствовали только в одном зерне каждое. В популяциях бактерий в молоке преобладали Streptococcaceae , которые были обнаружены в большей пропорции в кефирном молоке, чем в зернах ( p <0,001), и составляли доминирующую популяцию (> 50%) в 13 образцах.Ir3, Ir8 и US1 были заметными исключениями, поскольку содержали 10,16%, 2,87% и 10,91% Streptococcaceae соответственно. Вместо него Ir3 имеет самые высокие доли Lactobacillaceae при 60,51%, тогда как Ir8 и US1 имеют две самые высокие доли Acetobacteraceae с 90,41% и 77,06% соответственно. Однако в целом доли Lactobacillaceae были значительно ниже в молоке, чем в соответствующих зернах ( p <0.001). Общая средняя доля Acetobacteraceae существенно не изменилась от зерна к соответствующему молоку, несмотря на то, что значительное увеличение было очевидным в одних и тех же случаях (то есть вышеупомянутых Ir8 и US1, а также Ir1 и Ir5). Доля Leuconostocaceae была обнаружена во всех образцах кефирного молока (в отличие от всего 4 образцов зерна), что отражает значительное общее увеличение ( p <0,001). Propionibacterineae был обнаружен в одном образце молока Ir9 при 0.22%, что меньше 4,94% в соответствующем зерне. Доля неназначенных считываний была <1% почти во всем зерне и молоке, за исключением 1,02% в зерне Ca1 (Таблица S4; Таблица S5).

Картина распределения на уровне родов очень похожа на ту, которая наблюдается на уровне семьи, при этом один род часто соответствует всем прочтениям, относящимся к этому семейству (рис. 3). Lactobacillus ( p <0,001) является доминирующим родом в зерне с долей Lactococcus и Leuconostoc , что значительно выше в кефирном молоке ( p <0.001). И снова различия в пропорциях и распределении Acetobacter (из семейства Acetobacteraceae ) в зерне и молоке были численными, но не статистическими.

Секвенирование ITS дает подробное представление о грибковом составе кефирных зерен и связанного с ними молока, ферментированного кефиром

Единственным грибным типом, присвоенным зерну, был Ascomycota, самый крупный тип грибного царства. Также было показано, что аскомикота преобладает в кефирном молоке: от 100% в Ger1 до минимума 89.38% в Ir10 (Таблица S6; Таблица S7). Basidiomycota, другой тип, принадлежащий к субцарству Дикария, был обнаружен в 9 образцах молока с относительно низким числом считываний. 9 образцов молока также содержали следы некультивируемых грибов. Более низкое разнообразие зерна снова очевидно на уровне семейства, где все, кроме одного образца (Sp1), содержат> 99% Saccharomycetaceae . Общая средняя доля Saccharomycetaceae значительно ниже в молоке ( p <0.001), но по-прежнему соответствуют> 99% считываний в 16 из 23 выборок. Грибковый состав кефирного молока Sp1 был необычным, поскольку содержал 34,27% Pichiaceae . Напротив, следующая по величине доля Pichiaceae составила 0,48% (в молоке UK3). Другими семействами грибов, обнаруженными как в кефирном молоке, так и в зернах, были Davidiellaceae и Trichocomaceae . Herpotrichiellaceae , Teratosphaeriaceae , Valsaceae , Debaryomycetaceae , Phaffomycetaceae , Malasseziaceae , Bondarzewiaceae , Dermataceae Goremusic, Кроме того, Wallemiomycetes были обнаружены только в молоке, тогда как Dothioraceae были обнаружены только в зернах.

Самый распространенный вид грибов как в кефирном молоке, так и в зерновых — Kazachstania (Рисунок 4). Этот род обнаружен во всех образцах, кроме зерна кефира Ger1. Учитывая, что соответствующее молоко содержало Kazachstania в пропорции 5,68%, вполне вероятно, что это зерно действительно содержало Kazachstania на уровнях ниже предела обнаружения для данного исследования.Доли Kazachstania были> 50% в 11 зернах и в 13 видах молока и были самыми высокими в зернах Ir2 и US1 (99,40% и 99,25% соответственно) и молоке Ir2 и US3 (99,20% и 98,07%. , соответственно). Напротив, доли зерна Bel1 и UK3 (0,24% и 0,39% соответственно) и молока UK2 и US5 были низкими (0,44% и 0,89% соответственно). Наумовозима был вторым по распространенности видом грибов, он присутствовал в 16 зернах и 10 образцах молока, что составляет 13.Считывает 09% всего зерна и 9,98% всего молока. Пропорции Наумовозима варьировались от доминирующего в Ir9 (96,02%, зерно; 81,87%, молоко) и Ir4 (57,56%, зерно; 59,41%, молоко) до субдоминантного в Ger2 (2,46%, зерно; 0%, молоко) и US1 (0,18%, зерно; 1,81%, молоко), среди других. Примечательно, что хотя Наумовозима не был обнаружен в зерне Fr1, этот род стал доминирующим в полученном кефирном молоке (59,3%), что снова указывает на присутствие Наумовозима в зерне ниже порога обнаружения.Третьим наиболее часто определяемым родом был Kluyveromyces , который был обнаружен в 17 зерновых и 18 молочных продуктах, что составляет 7,6% и 7,32% от общего количества прочтений зерна и молока соответственно. Хотя Kluyveromyces присутствовал в молоке Bel1 в количестве 50,16%, этот род чаще присутствовал в субдоминантных пропорциях с обнаруженным минимумом 0,05% в молоке Ir1. На уровне рода многие чтения, соответствующие Saccharomycetaceae , не могли быть надежно отнесены.Это соответствовало> 50% считываний, соответствующих зернам Bel1, Fr1, Ger1, Ger2, It1, UK1, UK3, UK4 и UK5 и молоку Ger1, It1, UK2 и US5. Вероятно, это результат такого высокого сходства между ITS-последовательностями, что они не могут быть надежно разделены и отнесены. Несмотря на численные различия в пропорциях различных родов грибов, присутствующих в кефирных зернах и молоке, единственное существенное различие связано с более высокой долей Dekkera в молоке, чем в зернах ( p = 0.004). Кефирное молоко также содержало большее количество различных родов, часто в следовых количествах, которые не были обнаружены в соответствующих зернах. В их число входят Zygosaccharomyces , Wallemia , Eurotium , Microdochium , Cryptococcus , Teratosphaeria , Debaromyces , Cyberlindnera , Malassezia , 900of82 Heterobasa Ganoderma , Mycena и Dioszegia . Penicillium и Aureobasidium были обнаружены только в одном случае, то есть в зерне кефира Sp1 (0,13%) и зерне UK3 (0,09%) соответственно.

В отличие от считываний 16S, которые подвержены высокому уровню гомологии последовательностей, считывания ITS были достаточно разнородны, чтобы можно было отнести их к уровню вида. В таблице 1 показано общее количество идентифицированных различных видов и была ли ранее связь с кефиром. Профиль популяции на уровне вида полностью отражает профиль на уровне рода.Самый распространенный вид, Kazachstania unispora , присутствовал в 20 зернах и во всем молоке. Все чтения из родов Kluyveromyces и Naumovozyma были отнесены к видам Kluyveromyces marxianus и Naumovozyma castelli соответственно (Таблица S6; Таблица S7). Хотя род Saccharomyces был идентифицирован в небольших количествах в ряде зерновых и молока, только те, которые содержатся в Ir5, были отнесены к видовому уровню (к Saccharomyces cerevisiae ).

Обсуждение

Это исследование представляет собой наиболее полное на сегодняшний день исследование микробной популяции кефира (как зерна, так и молока). Этому анализу способствовало высокопроизводительное секвенирование 16S рРНК (бактерии) и, впервые, ампликонов ITS (грибов), полученных из значительно большей коллекции образцов, чем использовалось до сих пор. Количество считываний хорошо сравнивается с предыдущими исследованиями, например, Dobson и др. . сгенерировали в совокупности 17 416 V4 16S рРНК (4883 чтения для внутреннего зерна, 3455 чтения для внешнего зерна и 9 078 чтения для молочного ферментата; [30]), в то время как Leite et al .сгенерировал в общей сложности 14 314 чтения 16S рДНК (2641, 2690 и 8 983 чтения для трех секвенированных зерен, соответственно [31]). В каждом индексе значения альфа-разнообразия отражали естественное низкое разнообразие и однородность между образцами кефира по сравнению с другими анализами окружающей среды, а модели разрежения соответствовали результатам предыдущих исследований кефира [30], [31].

Профилирование 16S рРНК показало, что бактериальная популяция тестируемого кефирного молока состоит из актинобактерий, фирмикутов и протеобактерий, причем в зерне также обнаруживаются бактерии Bacteroidetes.В зернах кефира преобладали Lactobacillaceae / Lactobacillus , что свидетельствует о том, что эта закономерность, которая ранее была отмечена в исследованиях на основе высокопроизводительного секвенирования гораздо меньшего количества кефиров [3], [30], является последовательной. Напротив, в кефирном молоке преобладают Streptococcaceae . В частности, преобладают лактококки, так как другие роды из этого семейства не обнаружены. Это контрастирует с подмножеством предыдущих исследований, в которых было идентифицировано Streptococcus видов [3], [31], [50].Следующими по распространенности LAB были Leuconostoc sp .; Leuconostoc был связан с кефиром в ряде предыдущих случаев [9], [19], [51], [52], но представленные здесь данные впервые показывают, что пропорции этого рода значительно увеличиваются в молока по сравнению с зерном, где они могут значительно повлиять на сенсорный профиль кефиров. Acetobacteraceae (род Acetobacter ) также были идентифицированы как основные компоненты бактериальной популяции многих зерен, несмотря на то, что они были идентифицированы в некоторых [19], [53], но не во всех предыдущих исследованиях кефира.Однако, учитывая, что кефирное молоко, в котором бактерии уксусной кислоты присутствовали только на очень низких уровнях (например, Bel1, Ir2, UK1) или не были обнаружены (например, Fr1, UK3), подверглось успешной ферментации, что определялось снижением pH и молоком. коагуляция через 24–48 часов (данные не показаны), возможно, уксуснокислые бактерии не являются строго обязательными для процесса ферментации, а скорее вносят свой вклад каким-то другим образом. Наши дальнейшие исследования будут сосредоточены на выяснении точного вклада конкретных групп населения в консистенцию кефирного молока.Тот факт, что Lachnospiraceae и Ruminococcaceae присутствуют в нескольких зернах, но не обнаруживаются в образцах молока, означает плохую способность к размножению в молочной среде. Бифидобактерии были обнаружены только в двух зернах (Ir9, 0,81% и UK2, 0,10%). Эти результаты в сочетании с предыдущими исследованиями показывают, что бифидобактерии составляют лишь незначительную часть консорциума кефирных зерен. Кроме того, его плохая стойкость в кефирном молоке предполагает, что его нужно будет добавлять в инкапсулированной или другой подобной форме, если кефир будет использоваться в качестве носителя для добавок Bifidobacterium [54].Высокопроизводительное секвенирование также эффективно выявило присутствие ряда других редких популяций в зернах кефира, которые составляли <1% от общей популяции большинства кефиров. Из них Faecalibacterium , Allistipes , Rickenellaceae , Allobaculum и Enterococcus ранее не обнаруживались в кефире и обычно связаны с популяциями кишечных микробов. В отличие от этого, Pseudomonas spp., Идентифицированные в следовых количествах среди других высокопроизводительных операций по секвенированию, не были идентифицированы в этих кефирах [30], [31].

После исследования применения нескольких баз данных, специфичных для ITS, таких как UNITE (http://unite.ut.ee/index.php), было обнаружено, что ITSoneDB, который состоит из исчерпывающего набора хорошо аннотированных и филогенетически- классифицированные последовательности ITS1, полученные из Genbank и расположенные на дереве таксономии NCBI, дали наилучшие уровни распределения [47]. Состав популяции связанных с кефиром дрожжей был предметом некоторого внимания [2], [55], которому не помогли трудности, связанные с номенклатурой, и на сегодняшний день полагаться на исследования, основанные на культуре. Saccharomycetaceae имеют плохо определенную групповую морфологию, и такая основа для классификации может привести к ненадежному отделению видов от близких родственников. Более того, многие дрожжи Ascomycota и Basidiomycota обладают половым (телеоморфным) и бесполым (анаморфным) состояниями размножения, что иногда приводит к классификации видов под двумя названиями. Было предложено, чтобы в 2013 г. грибы назывались только их телеоморфными названиями, за исключением смягчающих обстоятельств [56].Изучение литературы показывает, что ранее было показано, что Candida kefyr составляет до 90% дрожжевой популяции в кефирном молоке [57] и обычно выделяется из кефира [4], [57], [58]. Несмотря на значительное присутствие в базе данных ITS, в этом исследовании не было обнаружено Candida . Примечательно, однако, что ряд прочтений, которые демонстрировали сходство с C. kefyr , вместо этого были отнесены к соответствующему телеоморфу, Kluyveromyces marxianus , в силу более высокого процента сходства. Kluyveromyces marxianus ранее ассоциировался с кефиром [10], [12], [16].

Доминирующими дрожжами, обнаруженными в этом исследовании, были дрожжи Kazachstania , состоящие из Kazachstania barnetti и Kazachstania unispora. К . unispora ранее была известна как Saccharomyces unipsorus [59], которая была обнаружена в кефире [10], [12], [14], [15], [16] и была связана с другими ферментированными напитками [60] ], [61].Похоже, что K. unispora особенно хорошо адаптирована к среде молочного животноводства, поскольку это наиболее распространенный вид, превосходящий конкурирующие виды, включая K. barnetti . Это первый случай, когда K. barnetti , обнаруженный в зерне, но не в молоке, был обнаружен в среде кефира. Naumovozyma — это род, который очень похож на Saccharomyces и Kazachstania , а идентифицированный здесь вид Naumovozyma castellii был переклассифицирован из Saccharomyces castellii в прошлом [62].Хотя ранее он не был связан с кефиром, единственным другим видом в этом роде был Naumovozyma dairenensis (ранее Saccharomyces dairenensis ) [63]. В отличие от значительного присутствия вышеупомянутых видов грибов, относительное отсутствие Saccharomyces сначала поражает, учитывая его историческую связь с кефиром. Скорее всего, это отражает реклассификацию Наумовозы и Казахстан .Несмотря на это, примечательно, что предыдущие исследования показали, что Saccharomyces cerevisiae довольно часто встречается в кефире [3], [16], [52], тогда как здесь этот род был обнаружен всего в трех зернах и трех видах молока и в следовых количествах. . Возможно, что этот род не так широко распространен, как предполагали предыдущие данные, или, возможно, был неправильно отнесен к предыдущим исследованиям. В качестве альтернативы, Saccharomyces может чаще встречаться в кефирах из географических регионов, не включенных в это исследование.Происхождение зерна также могло иметь значение для идентификации Pichia kudriavzevii (ранее известного как Issatchenkia orientalis ) на уровнях, которые были атипично высокими по сравнению с другими образцами в испанском кефире (зерно, 0,57%). ; молоко 34,27%). Примечательно, что Latorre-Garcia и др. определили Issatchenkia orientalis как один из наиболее представительных видов испанского кефира [12], и до недавнего времени [16] он не был обнаружен среди кефирных зерен или молока других производителей.Что касается других видов, было также примечательно, что Torulaspora delbreuckii не был обнаружен в этом исследовании, несмотря на то, что как он [10], [11], так и его анаморфная форма, Candida colliculosa , ранее были обнаружены в кефире. [8]. Также было много случаев, когда мы идентифицировали виды, ранее не обнаруженные в кефирном молоке, например, когда Dekkera anomala (анаморф: Brettanomyces anomalus ) был выделен из кефира [8], Dekkera bruxellensis (анаморф: Brettanomyces bruxellensis bruxellensis). ) до сих пор не выделяли из кефира (но были обнаружены в традиционном ферментированном монгольском и зимбабвийском молоке [64], [65]).Другие виды, которые ранее не были обнаружены, но присутствовали в меньшей численности, и несколько (часто только одна) проб молока (ов) включали Cryptococcus sp. Vega 039, Zygosaccharomyces lentus , Penicillium sp. Vega 347 , Wallemia sebi , Ganoderma lucidum , Cyberlindnera jadinii , Eurotium amstelodami , Heterobasidion annosum , Peziza campestris , Teratospies Hungrymatosis и Teratosphosphaeria82zedia 9 Cryptococcus и Zygosaccharomyces были обнаружены в кефире раньше [4], но это первая идентификация соответствующего вида, Cryptococcus sp. Vega 039 и Z. lentus . Cryptococcus — это широко распространенные базидиомикотические дрожжи, которые ранее были идентифицированы в кефире, который был заморожен и рекультивирован. Этот момент отмечен как молоко, ассоциированное с Cryptococcus , описанное в текущем исследовании, полученное из двух зерен кефира, Ir8 и Ir9, которые были рекультивированы из хранилища -80 ° C. Z. lentus считается организмом, вызывающим порчу пищевых продуктов, связанным с напитками с низким pH, и может расти при низких температурах [66]. C. jadinii используется в пищевых добавках для животных и человека и является хорошим источником витаминов, минералов, белков и незаменимых аминокислот [67]. Несмотря на то, что он не был выделен из кефира, его использовали для увеличения производства одноклеточного белка с помощью кефира [68]. Кроме того, E. amstelodami часто выделяют из хлебопекарных продуктов [69]. H. annosum , P. campestris , T. knoxdaviesii и D. hungarica — все они считаются экологическими грибами. H. annosum является возбудителем корневой и стыковой гнили сосен [70], Peziza связан с ростом сапрофитных грибов на гнилой древесине [71], Teratosphaeria были описаны как возбудители эвкалипта [72] ] и D. hungarica было показано, что они обитают в арбускулярных микоризных грибах [73]. M. pachydermatis , обнаруженный в Ir9, является известным патогеном, который угрожает новорожденным и связан с домашними собаками [74]. Наконец, в нескольких выборках (Bel1, Fr1, Ger1, Ger2, It1 и UK1-5) многие чтения, ассоциированные с Saccharomycetaceae , не могли быть отнесены к родовому уровню и были обозначены как «другие» (рис. 4). Ожидается, что по мере депонирования большего количества грибковых последовательностей виды, соответствующие этим считываниям, могут быть обнаружены. Графики PCoA, визуализирующие микрофлору кефира, не показывают какой-либо явной кластеризации между различными кефирами, показывая разнообразие между популяциями кефира независимо от их источника.

Тот факт, что натуральный кефир способен содержать несколько организмов, связанных со здоровьем, предполагает, что его теоретически можно изменить, чтобы включить в него предварительно установленные и сертифицированные штаммы пробиотиков с минимальным сенсорным воздействием. Действительно, конечным применением кефира может быть потенциальная система доставки жизнеспособных организмов, способствующих укреплению здоровья, в кишечник [75]. Однако тот факт, что зерно еще не было произведено из чистой культуры [76], предполагает, что еще многое предстоит понять в отношении динамики популяции кефирных зерен.

В заключение, исследование представляет собой наиболее полное на сегодняшний день исследование микробного состава кефирных зерен и молока. В нем представлена ​​важная информация, которая может облегчить восстановление зерен кефира для создания специально подобранных зерен кефира и молока, в то время как дальнейшее исследование определенных идентифицированных компонентов может выявить их вклад в структуру зерен кефира и полезный для здоровья аспект связанных напитков.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Еву Росберг-Коди и Фиону Криспи за техническую помощь в высокопроизводительном секвенировании.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: AJM CH RPR PDC. Проведены эксперименты: AJM. Проанализированы данные: AJM OO. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: AJM OO. Написал статью: AJM.

Ссылки

1. 1. La Riviere JW, Kooiman P (1967) Кефиран, новый полисахарид, производимый в кефирном зерне Lactobacillus brevis. Archiv fur Mikrobiologie 59: 269–278.
2. 2. Фарнворт Э. (2005) Кефир — сложный пробиотик.Бюллетень пищевой науки и технологий 2: 1–17.
3. 3. Симова Е., Бешкова Д., Ангелов А., Христозова Т., Френгова Г. и др. (2002) Молочнокислые бактерии и дрожжи в кефирных зернах и кефире из них. Журнал промышленной микробиологии и биотехнологии 28: 1–6.
4. 4. Witthuhn RC, Schoeman T, Britz TJ (2005) Характеристика микробной популяции на разных этапах производства кефира и выращивания кефирной зерновой массы. Международный молочный журнал 15: 383–389.
5. 5. Chen HC, Wang SY, Chen MJ (2008) Микробиологическое исследование молочнокислых бактерий в зернах кефира с помощью культурально-зависимых и независимых от культуры методов. Пищевая микробиология 25: 492–501.
6. 6. Кесмен З., Качмаз Н. (2011) Определение молочной микрофлоры кефирных зерен и кефирного напитка с использованием культурально-зависимых и культурально-независимых методов. Журнал пищевой науки 76: M276–283.
7. 7. Гузель-Сейдим З. Б., Кок-Тас Т., Грин А. К., Сейдим А. С. (2011) Обзор: функциональные свойства кефира.Критические обзоры в области пищевой науки и питания 51: 261–268.
8. 8. Wyder MT, Spillmann H, Puhan Z (1997) Исследование дрожжевой флоры в молочных продуктах: тематическое исследование кефира. Пищевая технология и биотехнология 35: 299–304.
9. 9. Lin CW, Chen HL, Liu JR (1999) Идентификация и характеристика молочнокислых бактерий и дрожжей, выделенных из кефирных зерен на Тайване. Австралийский журнал молочных технологий 54: 14–18.
10. 10. Loretan T, Mostert JF, Viljoen BC (2003) Микробная флора, связанная с южноафриканским домашним кефиром.Южноафриканский научный журнал 99: 92–94.
11. 11. Angulo L, Lopez E, Lema C (1993) Микрофлора, присутствующая в кефирных зернах Галисийского региона (северо-запад Испании. Журнал исследований молочных продуктов 60: 263–267.
12. 12. Latorre-Garcia L, del Castillo-Agudo L, Polaina J (2007) Таксономическая классификация дрожжей, выделенных из кефира, на основе последовательности их генов рибосомной РНК. Всемирный журнал микробиологии и биотехнологии 23: 785–791.
13. 13.Pintado ME, DaSilva JAL, Fernandes PB, Malcata FX, Hogg TA (1996) Микробиологические и реологические исследования португальских зерен кефира. Международный журнал пищевой науки и технологий 31: 15–26.
14. 14. Zhou JZ, Liu XL, Jiang HH, Dong MS (2009) Анализ микрофлоры в зернах тибетского кефира с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза. Пищевая микробиология 26: 770–775.
15. 15. Magalhaes KT, Pereira GVD, Campos CR, Dragone G, Schwan RF (2011) Бразильский кефир: структура, микробные сообщества и химический состав.Бразильский журнал микробиологии 42: 693–702.
16. 16. Гао Дж, Гу Ф., Абделла Н.Х., Руан Х., Хе Дж. (2012) Исследование культивируемой микрофлоры в зернах тибетского кефира из разных районов Китая. Журнал пищевой науки 77: M425–433.
17. 17. Квак Х.С., Парк С.К., Ким Д.С. (1996) Биостабилизация кефира с помощью дрожжей, не ферментирующих лактозу. Журнал молочной науки 79: 937–942.
18. 18. Реа М.К., Леннартссон Т., Диллон П., Дринан Ф.Д., Ревилл В.Дж. и др.(1996) Ирландские кефироподобные зерна: их структура, микробный состав и кинетика ферментации. Журнал прикладной бактериологии 81: 83–94.
19. 19. Гарроте Г.Л., Абрахам А.Г., Де Антони Г.Л. (2001) Химическая и микробиологическая характеристика кефирных зерен. Журнал молочных исследований 68: 639–652.
20. 20. Tas TK, Ekinci FY, Guzel-Seydim ZB (2012) Идентификация микробной флоры в зернах кефира, произведенных в Турции, с помощью ПЦР. Международный журнал молочных технологий 65: 126–131.
21. 21. Wang SY, Chen HC, Liu JR, Lin YC, Chen MJ (2008) Идентификация дрожжей и оценка их распределения в тайваньских заквасках с кефиром и вили. Журнал молочной науки 91: 3798–3805.
22. 22. Garbers IM, Britz TJ, Witthuhn RC (2004) Электрофоретическая типизация денатурирующего градиентного геля на основе ПЦР и идентификация микробного консорциума, присутствующего в зернах кефира. Всемирный журнал микробиологии и биотехнологии 20: 687–693.
23. 23.Куигли Л., О’Салливан О., Бересфорд Т.П., Росс Р.П., Фицджеральд Г.Ф. и др. (2012) Высокопроизводительное секвенирование для обнаружения субпопуляций бактерий, ранее не связанных с домашними сырами. Прикладная и экологическая микробиология 78: 5717–5723.
24. 24. Масуд В., Такамия М., Вогенсен Ф. К., Лиллеванг С., Абу аль-Суд В. и др. (2011) Характеристика бактериальных популяций в датских сырых молочных сырах, приготовленных из различных заквасок, с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза и пиросеквенирования.Международный молочный журнал 21: 142–148.
25. 25. Коянаги Т., Киёхара М., Мацуи Х., Ямамото К., Кондо Т. и др. (2011) Пиросеквенирование микробного разнообразия «наредзуси», архетипа современных японских суши. Письма по прикладной микробиологии 53: 635–640.
26. 26. Roh SW, Kim KH, Nam YD, Chang HW, Park EJ и др. (2010) Исследование разнообразия архей и бактерий в ферментированных морепродуктах с использованием пиросеквенирования со штрих-кодом. Журнал ISME 4: 1–16.
27. 27. Пак EJ, Chun J, Cha CJ, Park WS, Jeon CO и др. (2012) Анализ бактериального сообщества во время ферментации десяти репрезентативных видов кимчи с пиросеквенированием со штрих-кодом. Пищевая микробиология 30: 197–204.
28. 28. Сакамото Н., Танака С., Сономото К., Накаяма Дж. (2011) Исследование бактериального сообщества на основе пиросеквенирования 16S рРНК в нукадоко, засолке из ферментированных рисовых отрубей. Международный журнал пищевой микробиологии 144: 352–359.
29. 29.Humblot C, Guyot JP (2009) Пиросеквенирование ампликонов меченого гена 16S рРНК для быстрой расшифровки микробиомов ферментированных пищевых продуктов, таких как суспензии жемчужного проса. Прикладная и экологическая микробиология 75: 4354–4361.
30. 30. Добсон А., О’Салливан О., Коттер П.Д., Росс П., Хилл С. (2011) Высокопроизводительный анализ бактериального состава кефира и связанного с ним кефирного зерна на основе последовательностей. Письма о женской микробиологии 320: 56–62.
31. 31. Leite AM, Mayo B, Rachid CT, Peixoto RS, Silva JT, et al.(2012) Оценка микробного разнообразия зерен бразильского кефира с помощью ПЦР-DGGE и анализа пиросеквенирования. Пищевая микробиология 31: 215–221.
32. 32. Parvez S, Malik KA, Ah Kang S, Kim HY (2006) Пробиотики и их ферментированные пищевые продукты полезны для здоровья. Журнал прикладной микробиологии 100: 1171–1185.
33. 33. Czerucka D, Piche T, Rampal P (2007) Дрожжи как пробиотики — Saccharomyces boulardii. Пищевая фармакология и терапия 26: 767–778.
34. 34. Desreumaux P, Neut C, Cazaubiel M, Matthieu P, Fanny P и др. (2011) Saccharomyces Cerevisiae CNCM I-3856 уменьшает дискомфорт при пищеварении и боль в животе у субъектов с синдромом раздраженного кишечника: рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое испытание. Гастроэнтерология 140: S50 – S50.
35. 35. Foligne B, Dewulf J, Vandekerckove P, Pignede G, Pot B (2010) Пробиотические дрожжи: противовоспалительный потенциал различных непатогенных штаммов при экспериментальном колите у мышей.Всемирный гастроэнтерологический журнал: WJG 16: 2134–2145.
36. 36. Этьен-Месмин Л., Ливрелли В., Приват М., Дени С., Кардо Дж. М. и др. (2011) Влияние нового пробиотического штамма Saccharomyces cerevisiae на выживаемость Escherichia coli O157: H7 в динамической модели желудочно-кишечного тракта. Прикладная и экологическая микробиология 77: 1127–1131.
37. 37. You SJ, Cho JK, Ha CG, Kim CH, Heo KC (2006) Пробиотические свойства кефира Candida, выделенного из кефира. Журнал зоотехники 84: 310–310.
38. 38. Kumura H, Tanoue Y, Tsukahara M, Tanaka T, Shimazaki K (2004) Скрининг штаммов молочных дрожжей для применения пробиотиков. Журнал молочной науки 87: 4050–4056.
39. 39. Listemann H, Schulz KD, Wasmuth R, Begemann F, Meigel W (1998) Эзофагит, вызванный Candida kefyr. Микозы 41: 343–344.
40. 40. Куигли Л., О’Салливан О., Бересфорд Т.П., Росс Р.П., Фицджеральд Г.Ф. и др. (2012) Сравнение методов, используемых для извлечения бактериальной ДНК из сырого молока и сырого молочного сыра.Журнал прикладной микробиологии 113: 96–105.
41. 41. Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MWW, Short JM, Sorge JA, et al. (1991) Высокоточная амплификация с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из Pyrococcus-Furiosus. Gene 108: 1–6.
42. 42. Клаэссон М.Дж., Ван К., О’Салливан О., Грин-Диниз Р., Коул Дж. Р. и др. (2010) Сравнение двух технологий секвенирования следующего поколения для определения очень сложного состава микробиоты с использованием тандемных вариабельных участков гена 16S рРНК.Исследование нуклеиновых кислот 38: e200.
43. 43. Коул Дж. Р., Ван К., Карденас Э., Фиш Дж., Чай Б. и др. (2009) Проект базы данных рибосом: улучшенное выравнивание и новые инструменты для анализа рРНК. Исследование нуклеиновых кислот 37: D141–145.
44. 44. Буи М., Райх М., Мюрат С., Морин Э., Нильссон Р. Х. и др. (2009) 454 Пиросеквенирование лесных почв выявило неожиданно высокое разнообразие грибов. Новый фитолог 184: 449–456.
45. 45. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, et al.(2010) QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Природные методы 7: 335–336.
46. 46. Pruesse E, Quast C, Knittel K, Fuchs BM, Ludwig W и др. (2007) SILVA: всеобъемлющий онлайн-ресурс для проверенных и согласованных данных о последовательностях рибосомных РНК, совместимых с ARB. Исследование нуклеиновых кислот 35: 7188–7196.
47. 47. Сантамария М., Фоссо Б., Консильо А, Де Каро Дж., Грилло Дж. И др. (2012) Справочные базы данных для таксономической классификации в метагеномике.Брифинги по биоинформатике 13: 682–695.
48. 48. Huson DH, Auch AF, Qi J, Schuster SC (2007) МЕГАН-анализ метагеномных данных. Исследование генома 17: 377–386.
49. 49. Chen VB, Davis IW, Richardson DC (2009) KING (Kinemage, Next Generation): универсальная интерактивная программа молекулярной и научной визуализации. Белковая наука: публикация Protein Society 18: 2403–2409.
50. 50. Юксекдаг З.Н., Беятли Ю., Аслим Б. (2004) Определение некоторых характеристик кокковидных форм молочнокислых бактерий, выделенных из турецких кефиров с натуральным пробиотиком.Lebensmittel-Wissenschaft Und-Technologie-Food Science and Technology 37: 663–667.
51. 51. Mainville I, Robert N, Lee B, Farnworth ER (2006) Полифазная характеристика молочнокислых бактерий в кефире. Систематическая и прикладная микробиология 29: 59–68.
52. 52. Motaghi M, Mazaheri M, Moazami N, Farkhondeh A, Fooladi MH и др. (1997) Производство кефира в Иране. Всемирный журнал микробиологии и биотехнологии 13: 579–581.
53. 53. Мигель МГДП, Кардосо П.Г., Лаго Л.Д., Шван Р.Ф. (2010) Разнообразие бактерий, присутствующих в зернах молочного кефира, с использованием методов, зависимых от культуры и независимых от культуры.Food Research International 43: 1523–1528.
54. 54. Gonzalez-Sanchez F, Azaola A, Gutierrez-Lopez GF, Hernandez-Sanchez H (2010) Жизнеспособность микрокапсулированных Bifidobacterium animalis ssp lactis BB12 в кефире при хранении в холодильнике. Международный журнал молочных технологий 63: 431–436.
55. 55. Lopitz-Otsoa F, Rementeria A, Elguezabal N, Garaizar J (2006) Кефир: симбиотическое сообщество дрожжей-бактерий с предполагаемыми здоровыми способностями. Revista iberoamericana de micologia 23: 67–74.
56. 56. Хоксворт Д.Л. (2011) Новая заря для присвоения названий грибам: влияние решений, принятых в Мельбурне в июле 2011 г., на будущую публикацию и регулирование названий грибов. Гриб IMA: глобальный микологический журнал 2: 155–162.
57. 57. Kwon CS, Park MY, Cho JS, Choi ST, Chang DS (2003) Идентификация эффективных микроорганизмов из кефирного ферментированного молока. Пищевая наука и биотехнология 12: 476–479.
58. 58. Engel G, Krusch U, Teuber M (1986) Микробиологический состав кефира.1. Дрожжи. Milchwissenschaft-Milk Science International 41: 418–421.
59. 59. Курцман К.П. (2003) Филогенетическое определение Saccharomyces, Kluyveromyces и других представителей Saccharomycetaceae, а также предложение новых родов Lachancea, Nakaseomyces, Naumovia, Vanderwaltozyma и Zygotorulaspora. Исследование дрожжей FEMS 4: 233–245.
60. 60. Montanari G, Zambonelli C, Grazia L, Kamesheva GK, Shigaeva MK (1996) Saccharomyces unisporus как основной микроорганизм спиртового брожения традиционного кумыса.Журнал молочных исследований 63: 327–331.
61. 61. Las Heras-Vazquez FJ, Mingorance-Cazorla L, Clemente-Jimenez JM, Rodriguez-Vico F (2003) Идентификация видов дрожжей из апельсиновых фруктов и сока с помощью RFLP и анализ последовательности гена 5.8S рРНК и двух внутренних транскрибируемых спейсеров. Исследование дрожжей FEMS 3: 3–9.
62. 62. Kurtzman CP, Robnett CJ (2003) Филогенетические отношения между дрожжами «комплекса Saccharomyces», определенные на основе анализа мультигенных последовательностей.Исследование дрожжей FEMS 3: 417–432.
63. 63. Мартини А.В., Курцман С.П. (1988) Связь дезоксирибонуклеиновой кислоты между видами Saccharomyces-Sensu-Lato. Микология 80: 241–243.
64. 64. Gadaga TH, Mutukumira AN, Narvhus JA (2001) Рост и взаимодействие дрожжей и молочнокислых бактерий, выделенных из зимбабвийского естественно ферментированного молока в UHT-молоке. Международный журнал пищевой микробиологии 68: 21–32.
65. 65. Миямото М., Сето Ю., Накадзима Х., Буренджаргал С., Гомбоджав А. и др.(2010) Анализ денатурирующего градиентного гель-электрофореза молочнокислых бактерий и дрожжей в традиционном монгольском ферментированном молоке. Исследования пищевых продуктов и технологий 16: 319–326.
66. 66. Стали Х, Джеймс С.А., Робертс И.Н., Стратфорд М. (1999) Zygosaccharomyces lentus: новые существенные осмофильные, устойчивые к консервантам порчи дрожжей, способные расти при низкой температуре. Журнал прикладной микробиологии 87: 520–527.
67. 67. Ли Б.К., Ким Дж.К. (2001) Производство биомассы Candida utilis на патоке в различных типах культур.Инженерия аквакультуры 25: 111–124.
68. 68. Кутинас А.А., Атанасиадис И., Бекатороу А., Иэкономопулу М., Блекас Г. (2005) Технология кефирных дрожжей: расширение производства SCP с использованием молочной сыворотки. Биотехнология и биоинженерия 89: 788–796.
69. 69. Abellana M, Benedi J, Sanchis V, Ramos AJ (1999) Влияние активности воды и температуры на прорастание и рост изолятов Eurotium amstelodami, E-chevalieri и E. herbariorum из хлебобулочных изделий. Журнал прикладной микробиологии 87: 371–380.
70. 70. Asiegbu FO, Adomas A, Stenlid J (2005) Корневая и стыковая гниль хвойных, вызванная Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. s.l. Молекулярная патология растений 6: 395–409.
71. 71. Hansen K, LoBuglio KF, Pfister DH (2005) Эволюционные отношения рода Peziza и Pezizaceae чашеобразных грибов, выведенные из нескольких ядерных генов: RPB2, бета-тубулина и рДНК LSU. Молекулярная филогенетика и эволюция 36: 1–23.
72. 72. Hunter GC, Crous PW, Carnegie AJ, Wingfield MJ (2009) Teratosphaeria nubilosa, серьезный возбудитель болезни листьев Eucalyptus spp.в родных и интродуцированных областях. Молекулярная патология растений 10: 1–14.
73. 73. Renker C, Blanke V, Borstler B, Heinrichs J, Buscot F (2004) Разнообразие дрожжей Cryptococcus и Dioszegia (Basidiomycota), населяющих корни или споры арбускулярной микоризы. Исследование дрожжей FEMS 4: 597–603.
74. 74. Чанг Х.Дж., Миллер Х.Л., Уоткинс Н., Ардуино М.Дж., Эшфорд Д.А. и др. (1998) Эпидемия Malassezia pachydermatis в отделении интенсивной терапии, связанная с колонизацией домашних собак медицинских работников.Медицинский журнал Новой Англии 338: 706–711.
75. 75. Иванова Г., Момчилова М., Румян Н., Атанасова А., Георгиева Н. (2012) Влияние добавки дрожжей Saccharomyces boulardii на вкусовые и ароматические свойства кефира. Журнал Университета химической технологии и металлургии 47: 59–62.
76. 76. Chen TH, Wang SY, Chen KN, Liu JR, Chen MJ (2009) Микробиологические и химические свойства кефира, произведенного захваченными микроорганизмами, изолированными из зерен кефира.Журнал молочной науки 92: 3002–3013.
77. 77. Chen MJ, Liu JR, Lin CW, Yeh YT (2005) Изучение микробных и химических свойств кефира из козьего молока, полученного путем инокуляции зерен тайваньского кефира. Азиатско-Австралазийский журнал наук о животных 18: 711–715.

Реферат

1. Введение

Сырое молоко (RM) и полученные из него молочные продукты богаты питательными веществами и микроорганизмами, а их микробный состав был обнаружен в предыдущих исследованиях с помощью традиционных методов, зависящих от культуры и не зависящих от культуры [1,2] .Микробные различия в RM связаны со многими факторами, такими как источники животного происхождения и географическое положение. Во флоре 14 пастбищ ведущими родами бактерий были Enterococcus, Bacillus, Acinetobacter и Lactococcus, но только на нескольких фермах крупного рогатого скота были обнаружены только Staphylococcus aureus и Shigella [3]. В ослином молоке было обнаружено, что доминирующими бактериальными типами являются Proteobacteria и Firmicutes, а доминирующими родами являются Pseudomonas, Ralstonia и Acinetobacter [4]. В козьем молоке среди 354 родов доминирующими были протеобактерии и энтеробактерии [5].

Как правило, наиболее доминирующими видами бактерий в молочных продуктах являются лактобациллы, лактококки, стрептококки и лейконостоки Firmicutes, и они влияют на вкус и зрелость молочных продуктов ферментации [6, 7]. Например, молочнокислые бактерии играют важную роль в процессе ферментации, в котором они гетерогенно ферментируются с образованием этанола, диоксида углерода, ацетальдегида, ацетона, ацетоина, диацетила и других летучих ароматических соединений, способствуя формированию хорошего вкуса пищи [8]. .Ферментированные дрожжевые молочные продукты, такие как кефир, кумыс и моцарелла, представляют собой типичные кисломолочные продукты со спиртами, которые вносят важный вклад в аромат и аромат вина [9]. Было обнаружено, что Geotrichum Candidum вносит основной вклад в созревание сыра камамберти и обладает способностью метаболизировать горькие аминопептиды и усиливать вкус серы [10].

Хотя традиционные методы выращивания и молекулярные технологии позволили нам получить предварительное представление о микробном составе молочных продуктов [11,12], полученная информация не всегда точна, а детали микробного разнообразия этих продуктов остаются неуловимыми.Основная причина заключается в том, что большое количество видов микробов не может быть успешно культивировано [13].

В последние годы, с взаимным проникновением генетики, биоинформатики и других дисциплин, все больше и больше бескультурационных технологий стали использоваться в исследованиях микробного разнообразия [14]. Метагеномика [15] — это быстрый и эффективный метод, который использует высокопроизводительное секвенирование для одновременного секвенирования миллионов молекул ДНК и конструирует метагеномную библиотеку, обнаруживая последовательности генетического материала вариабельных областей в микроорганизмах, исследуя разнообразие видов микробов и структуру сообщества. .Эта технология позволяет избежать непредсказуемости микробов с низкой численностью культивирования и низкой численности, а также объективно восстанавливает структуру сообщества и соотношение численности, максимизируя развитие микробных ресурсов. Этот подход широко используется в медицине и науке об окружающей среде [16, 17] и постепенно используется в науке о продуктах питания [18].

С помощью метагеномики было обнаружено разнообразие микроорганизмов, доминирующей флоры и метаболического потенциала мексиканского сыра Котия [19]. Это указывает на то, что Lactobacillus, Leuconostoc и Weissella были основной доминирующей флорой, микробная метаболическая активность, связанная с образованием множества вкусов, в основном включала метаболизм аминокислот с разветвленной цепью и свободных жирных кислот, а также были обнаружены некоторые гены, связанные с производством бактериоцина и иммунитет.Shewanella, Acinetobacter, Pelomonas, Dysgonomonas, Weissella и Pseudomonas были впервые обнаружены в зернах тибетского кефира [20]. Было обнаружено, что в зернах турецкого кефира сообщества в двух образцах показали высокую стабильность. Lactobacillus, включая L. kefiranofaciens, L. buchneri и L. helveticus, были самым многочисленным родом [21]. Разнообразие грибов во французском сыре Tomme d’Orchies было интересным. Результаты показали, что он содержит Yarrowia lipolytica и Galactomyces geotrichum, а также были обнаружены некоторые редкие микроорганизмы, такие как Clavis-poralusitaniae, Kazachstania unispora и Cladosporium cladosporioides [22].

Микробное разнообразие ферментированных молочных продуктов, таких как кумыс [23], джуке [24], тараг [25] и айраг [26], было широко исследовано, но было немного сообщений о ферментированных молочных продуктах в провинции Синьцзян, Китай [27], особенно на юге Синьцзяна. Сайрам Кеттеки (Словакия), традиционная и популярная ферментированная еда ручной работы, была произведена местной уйгурской крестьянкой в ​​провинции Синьцзян в Китае. Для производства СК в качестве сырья используется коровье молоко, а небольшое количество йогурта, оставшееся в предыдущей партии, действует как стартер брожения.Из-за того, что йогурт постоянно производится, закваски для брожения в некоторых семьях даже насчитывают десятилетия. После брожения в фарфоровых недрах при 10-25 ℃ около 6-8 часов, получают продукты молочно-белого цвета, эластичные, кисло-сладкие на вкус с легким содержанием алкоголя. СК был типичным алкогольным кисломолочным продуктом. В нескольких исследованиях изучались молочнокислые бактерии и дрожжи в SK с использованием метода культивирования и молекулярно-биологической идентификации. Сообщалось, что доминирующими штаммами SK были L.Bulgaricus, Streptococcus thermophilus и Saccharomyces cerevisiae [28]. Но некоторые другие исследования показали, что преобладали L. helveticus, Streptococcus thermophilus и Kluyveromycus marxianus [29]. Хотя есть некоторые связанные исследования [30], механизм его образования аромата до сих пор неясен. Несомненно, формирование аромата во многом связано с микроорганизмами, поэтому очень необходимо раскрыть разнообразие микробного сообщества SK и ее сырья.

В текущем исследовании для изучения разнообразия видов микробов и микробного состава в RM и SK были собраны 30 образцов RM и 30 самодельных йогуртов, выполнено метагеномное секвенирование.Путем биоинформатического анализа было обнаружено, что количество микроорганизмов в обоих типах молочных продуктов было различным. Здесь мы сообщаем результаты.

2. Материалы и методы 2.1. Сбор образцов и выделение ДНК Китай, где в конце июля 2019 года средняя температура составляла 27 ° C. Образцы RM были названы буквой «X» (X1, X2… X34), а образцы SK — буквой «S» (S1, S2… S34). ), соответственно.Каждый образец RM и каждый образец SK были соответствующими, потому что они происходили из одной семьи. Эти собранные образцы хранили при -20 ℃ для дальнейшего использования.

Каждый образец центрифугировали при 10000 об / мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок оставляли. Суммарную микробную ДНК экстрагировали из осадка 500 мг для каждого образца с использованием набора DNeasy Power Soil Kit (QIAGEN, Нидерланды) в соответствии с инструкциями производителя и хранили при -20 ° C перед будущим анализом.Количество и качество экстрагированной ДНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 и электрофореза в 0,8% агарозном геле.

2.2 ПЦР-амплификация 16SrDNA и ITS последовательностей

Бактериальный V3-V4 гена 16SrRNA был амплифицирован, использованные праймеры были следующими: 338F: 5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGCA-3 ‘(вперед) и 806R: 5’ -GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3 ‘(реверс). Для анализа грибкового сообщества ген внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) амплифицировали с использованием праймеров: ITS5F: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3 ‘(вперед) и ITS1R: 5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3 ‘(реверс).В экспериментах ПЦР термоциклирование состояло из начальной денатурации при 98 ° C в течение 5 минут, 25 циклов денатурации при 98 ° C в течение 30 секунд, отжига при 52 ° C в течение 30 секунд и удлинения при 72 ° C в течение 1 мин с последующим окончательным удлинением при 72 ° C в течение 5 мин.

ПЦР-продуктов измеряли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, и целевые фрагменты собирали с использованием набора для выделения геля (AXYGEN, Далянь, Китай). Что касается предварительных количественных результатов электрофореза, полученные продукты были количественно определены с помощью флуоресценции и в соответствии с количественными результатами и требованиями к объему секвенирования для каждого образца.Затем каждый образец смешивали в соответствующей пропорции и проводили секвенирование парных концов 2 × 300 п.н. с использованием платформы Illumina MiSeq с набором реагентов MiSeq Reagent Kit v3 от Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Шанхай, Китай).

2.3 Контроль качества последовательности

Чтобы выполнить требования последующих анализов, все показания были проверены и отфильтрованы с использованием программного обеспечения Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (V1.8.0) [31]. Вкратце, необработанные считывания с точным совпадением со штрих-кодами были назначены соответствующим образцам и идентифицированы как действительные последовательности.Последовательности низкого качества, которые были менее 150 п.н., средние значения Phred менее 20, неоднозначны и содержали мононуклеотидные повторы более 8 п.н., отбрасывали. Чтения с парным концом были собраны с использованием FLASH [32]. После обнаружения химер оставшиеся высококачественные последовательности были сгруппированы в рабочие таксономические единицы (OTU) с 97% идентичностью последовательностей с UCLUST [33]. Наивысшая последовательность была принята в качестве репрезентативной последовательности OTU. Таксономическая классификация OTU была проведена с помощью поиска BLAST и сопоставления последовательностей прокариот с базой данных Greengenes [34] и последовательностей эукариот с базой данных Unite [35].В соответствии с количеством последовательностей, включенных в каждую выборку каждой OTU, был построен файл матрицы численности OTU в каждой выборке.

2.4Биоинформатика и статистический анализ

Анализ данных последовательностей в основном проводился с использованием пакетов QIIME и R (V3.2.0). Индексы альфа-разнообразия на уровне OTU, такие как индекс богатства Chao1 и ACE, индекс разнообразия Шеннона и Симпсона, были рассчитаны с использованием таблицы OTU в QIIME. Кривые ранжированной численности на уровне OTU были сгенерированы для сравнения богатства и равномерности OTU среди выборок.Анализ бета-разнообразия был проведен для изучения структурных вариаций микробных сообществ в образцах, визуализированных с помощью анализа главных компонентов (PCA). Состав таксономии и численность визуализировали с помощью GraPhlAn [36], а корреляции с | RHO | > 0,6 и P <0,01 были визуализированы как сеть совместной встречаемости с помощью Cytoscape. Микробные функции были предсказаны PICRUSt (Филогенетическое исследование сообществ путем реконструкции ненаблюдаемых состояний) [37].

3.Результаты 3.1 Богатство и разнообразие последовательностей бактерий и грибов

После фильтрации мы получили 4 092 576 высококачественных считываний бактерий в диапазоне от 60 078 до 75 419 со средним значением 68 210 ± 4393 считывания последовательностей на образец. Между тем, для сообщества грибов было создано 4 056 820 считываний последовательностей ITS в диапазоне от 60 253 до 75 925 со средним значением 67 614 ± 4665 считываний последовательностей на образец. Число уникальных и поддающихся классификации репрезентативных последовательностей OTU для бактерий и грибов составляло 2221 и 4062 соответственно.

16SrRNA бактерий из SK имела наибольшее количество последовательностей, за ней следовало количество ITS-последовательностей грибов из RM и 16S рРНК бактерий из RM, а количество ITS-последовательностей грибов из SK было наименьшим (Таблица 1) . По индексу Chao1 наибольшая численность бактерий была в образцах RM, затем следовали бактерии SK, грибы RM, а наименьшая численность была грибов SK. По индексу Шеннона наибольшее разнообразие было у грибов RM, за ними следовали бактерии RM и грибы SK, а бактерии SK имели наименьшее разнообразие.Результаты числа OTUS соответствовали результатам разнообразия, которые указывали на то, что виды грибов в RM были наибольшими, а виды бактерий в SK — наименьшими.

biorxiv; 2021.03.15.435442v1 / TBL1T1tbl1 Таблица 1: Значения альфа-разнообразия в образцах

Кривые разрежения, которые могут предсказать общее количество видов и относительную численность каждого вида в образце на заданной глубине секвенирования, показали, что когда прокариотический Объем секвенирования составлял 40 000, бактериальная последовательность каждого образца не вступила в период плато (рис. 1A), а кривая индекса Шеннона (рис. 1B) показывала, что все образцы все еще секвенировались.Когда количество достигло 10 000, все OTU были насыщены. Хотя продолжение секвенирования может обнаружить новые филотипы, на этом уровне бактериальное разнообразие в образце уже было зафиксировано. Все последовательности эукариот на уровне 10 000 вошли в мягкое состояние, что указывает на то, что объем секвенирования этого эксперимента действительно может отражать разнообразие грибов в образцах (рис. 1C).

biorxiv; 2021.03.15.435442v1 / FIG1F1fig1Fig 1.

Кривые разрежения бактерий (A), разнообразия Шеннона (B) и разрежения грибов (C) популяций шестидесяти образцов.Линии разного цвета представляют разные образцы.

3,2 Сравнение структуры бактериальных и грибных сообществ между RM и SK

Доли вкладов первого основного компонента бактерий и грибов в выборке составляли 61,86% и 37,29%, соответственно, а доли вкладов второго основного компонента составляли 10,4%. и 21,3% (рис. 2). Чем ближе расстояние между образцами на диаграмме PCA, тем ближе состав двух микробных сообществ. Образцы SK и RM были разделены с обеих сторон, демонстрируя значительную разницу в структуре бактериальной группы между SK и RM.Образцы SK были уложены почти по прямой линии, что указывает на то, что эти образцы имели очень похожую бактериальную флору (рис. 2A). Одновременно рассеянное распределение бактериальных сообществ в образцах РМ показало, что между образцами имеются большие различия. Образцы грибов (рис. 2В) показали большую агрегацию и небольшую дисперсию. Большинство образцов RM и SK были сильно агрегированы и перекрывались, что позволяет предположить, что эти образцы могли иметь сходное грибное сообщество, и небольшая часть образцов SK была разбросана.Это указывало на то, что среди этих образцов было различие в грибковом сообществе.

biorxiv; 2021.03.15.435442v1 / FIG2F2fig2Fig 2.

Анализ главных компонентов (PCA) бактериального (A) и грибкового (B) сообществ. Красный кружок и зеленый треугольник представляют образцы Сайрам Кеттеки и сырого молока соответственно.

3.3 Бактериальный и грибной состав RM и SK

Всего в 60 образцах было обнаружено 15 типов бактерий. Firmicutes (68,50%), Proteobacteria (29,50%) и Deinococcus-Thermus (1.10%) были доминирующими типами, составляя 99,1% от общего числа ОТЕ, в то время как Bacteroidetes, Actinobacteria, Cyanobacteria, Planctomycetes, Fusobacteria, Acidobacteria, Patescibacteria, Armatimonadetes, Verrucomicrobia, Elusimicrobia и Epsilonbacteraeota наблюдались одновременно были очень низкими, составляя всего 0,001–0,006% от общего количества (рис. 3A).

biorxiv; 2021.03.15.435442v1 / FIG3F3fig3Fig 3.

Относительная численность бактерий на уровнях типа (A) и рода (B) в каждом образце и иерархическая древовидная карта GraPhlAn (C).

Всего было обнаружено 218 родов бактерий, и было 11 родов с численностью более 1%, включая Lactobacillus (45,30%), Streptococcus (8,00%), Macrococcus (7,70%), Acinetobacter (6,70%), Pseudomonas (6,00%), Lactococcus (5,60%), Enterobacter (4,50%), Klebsiella (1,60%), Ochrobactrum (1,40%), Brevundimona (1,10%) и Ralstonia (1,00%) (рис. 5B). Более того, было выявлено, что Macrococcus, Acinetobacter, Pseudomonas и Lactococcus были доминирующими родами в RM с долей 15.3%, 13,1%, 11,9% и 11,15% соответственно. Lactobacillus и Streptococcus в SK были доминирующими бактериальными родами, составляя 98,1% (Таблица 2 и Рис. 3C). Содержание Lactobacillus в этих образцах колебалось от 36,4% до 99,7%, что может быть тесно связано с местом отбора образцов, условиями обработки и другими факторами. Содержание OTU Lactobacillus и Streptococcus значительно увеличилось после обработки, в то время как у других 18 видов бактерий резко снизилось. Например, содержание OTU Staphylococcus упало с 1.66% до 0, если предположить, что стафилококк полностью погиб после тепловой обработки.

biorxiv; 2021.03.15.435442v1 / TBL2T2tbl2 Таблица 2.

Анализ OTU Процент верхних 20 родов

Всего было успешно обнаружено 12 типов грибов (рис. 4A). Абсолютно доминировали Ascomycota (79,90%), Basidiomycota (10,20%) и Mucoromycota (3,40%) со средним значением численности более 1%, составляя 93,5% от общего числа, в то время как Mortierellomycota, Rozellomycota, Olpidiomycota, Entomophthoromycomycota, Chytridiota , Glomeromycota, Zoopagomycota, GS19 и другие неустановленные типы содержали очень мало, составляя только 0.1% -0,5% от общего числа OTU. Было обнаружено 495 родов грибов, и было 18 родов со средним значением численности более 1%, включая Candida (21,20%), Kluyveromyces (7,60%), Aspergillus (5,10%), Lecanicillium (3,90%), Mucor (2,90%). %), Penicillium (1,90%), Clavispora (1,90%), Malassezia (1,80%), Yarrowia (1,80%), Cladosporium (1,70%), Thermoascus (1,70%), Simplicillium (1,50%), Verticillium (1,30%), Suillus (1,20%), Pichia (1,20%), Cutaneotrichosporon (1,20%), Trichosporon (1,00%) и Rhodotorula (1.00%) (рис. 4В). Это указывает на то, что Candida имеет самое высокое содержание в двух типах образцов (Таблица 2 и Рис. 4C). После ферментации содержание родов Candida и Kluyveromyces значительно увеличилось. Содержание OTUS в Mucor, Clavispora, Yarrowia и Pichia незначительно увеличилось, а у других 14 родов грибов значительно уменьшилось.

biorxiv; 2021.03.15.435442v1 / FIG4F4fig4Fig 4.

Относительная численность грибов на уровнях типа (A) и рода (B) в каждом образце и иерархической древовидной карте GraPhlAn (C).

В целом, мы обнаружили, что OTU преобладающих бактериальных родов в SK были выше и очевидны, а OTU грибных родов были относительно однородными и небольшими в обоих двух типах молочных продуктов (Таблица 2).

3.4 Анализ ассоциативной сети Спирмена взаимодействия доминантных родов

Ассоциативная сеть доминантных бактерий была построена с использованием Cytoscape, и большинство бактериальных отношений были положительными (рис. 5). Lactococcus положительно коррелировал с более чем 20 видами бактерий, например Klebsiella, Staphylococcus, Enterobacter и так далее, в то время как Lactobacillus отрицательно коррелировал с более чем 20 видами бактерий, такими как Enterococcus, Lactococcus и Streptococcus.Было высказано предположение, что молочнокислые бактерии могут ферментировать лактозу с образованием молочной кислоты, которая создает кислую среду. Кислотостойкость Lactobacillus была выше, чем у других бактерий, особенно Lactococcus. Это также объясняет высокое содержание Lactobacillus в йогурте и более высокое содержание Lactococcus в RM.

biorxiv; 2021.03.15.435442v1 / FIG5F5fig5 Рис. 5.

Доминант на сетевой диаграмме ассоциации топ-50 родов бактерий. Красная и зеленая линии указывают на положительные и отрицательные отношения соответственно.

3.5 Прогнозирование функции метаболизма флоры

Используя PICRUSt, прогнозирование метаболических функций бактерий может быть достигнуто путем сравнения существующих данных секвенирования гена 16SrRNA с базой данных эталонного генома микробов с известными метаболическими функциями. Состав двухуровневой информации функционального прогнозирования KEGG, полученной от RM и SK, был в основном похож, но численность явно различалась (рис. 6A).

Бактериальное сообщество с более высоким содержанием RM участвовало в двух классификациях метаболизма углеводов и метаболизма аминокислот.SK обладает самым большим разнообразием флоры для метаболизма углеводов. Диаграмма Венна общих функциональных групп показала, что, хотя были очевидные различия в составе микробного сообщества, функциональные группы в каждом типе образцов были в основном похожи (рис. 6B).

Рис. 6. PICRUSt спрогнозировал карту распределения второго уровня KEGG (A) и диаграмму Венна общих функциональных групп (B).

4. Обсуждение

Множественное разнообразие микроорганизмов и видов существует в РМ [38] и традиционных ферментированных молочных продуктах [39, 40], и они играют решающую роль в формировании вкуса.Исследования показали, что основным источником ароматического вещества ацетальдегида в йогурте является синтез треонина треонин альдолазой, секретируемой подвидом Болгарии, а Streptococcus thermophilus может метаболизировать лимонную кислоту с образованием диацетила во время ферментации и хранения йогурта [41, 42]. В сельской местности Синьцзяна есть различные и популярные молочные продукты ферментации, такие как Курут, Шубат, поэтому нет сомнений в том, что их особый вкус во многом связан с микробным полиморфизмом.Однако микробное разнообразие этих молочных продуктов остается неуловимым. SK — один из самых любимых йогуртов, и его микробное разнообразие еще не изучено, поэтому в текущем исследовании впервые изучается его микробный полиморфизм.

Предыдущие исследования показали, что Lactobacillus является основной флорой коровьего молока [43, 44]. В текущем исследовании Macrococcus, Acinetobacter, Pseudomonas и Lactococcus были доминирующими родами бактерий в RM, составляя 51,5% от общего числа последовательностей, но доля каждого образца разная.Lactobacillus и Streptococcus были доминирующими родами бактерий в SK, что аналогично другим исследованиям [45]. На уровне грибов Candida был абсолютно выгодным родом для обоих двух типов молочных продуктов, в то время как Aspergillus и Kluyveromyces были последующими доминантными родами в образцах RM и SK, которые отличались от других исследований [46].