Натрий бром электрофорез для детей: Электрофорез — ЛДЦ «Лечебно-диагностический центр»

Карта Ганы ( a ), показывающая регион Вольта со всеми его районами ( b ).Участки исследования (муниципалитет Кета, муниципалитет Хохо и западный район Крачи) показаны белыми стрелками.

Население муниципалитета Кета составляет примерно 147 618 человек, более половины из которых (53,3%) проживают в городских районах. Годовое количество осадков составляет менее 1000 мм, и он является одним из самых засушливых на побережье Ганы. Население муниципалитета Хохо составляет около 167 016 человек, из которых 52,6% проживают в городских районах. Годовое количество осадков составляет 1592 мм. В Западном округе Крачи проживает 49 417 человек, из них 81 человек.8% коренных жителей, проживающих в сельской местности. Показана карта региона с указанием участков (рис. 1).

Передача малярии в регионе Вольта отражает национальную модель передачи и отличается в трех основных биоэкологических зонах Ганы. Кета находится в прибрежной зоне кустарников, Хохо — в средней полосе с переходной лесной или полуолиственной зоной, а Крачи — в зоне саванн на севере Гвинеи. Передача низкая у Кета, средняя у Хохо, а у Крачи высокая передача [23].

Исследование было проведено в декабре 2018 г., и исследуемая популяция состояла из детей в возрасте от 1 до 12 лет, проживающих в отобранных общинах в 3 отобранных районах. Критериями включения были дети указанного возраста, родители / опекуны которых дали согласие на участие в исследовании и проживали в районе исследования. Исключались дети, которые были серьезно больны и нуждались в медицинской помощи, и дети с серьезными врожденными дефектами, а также те, чьи родители / опекуны не дали согласия на участие в исследовании.

Дизайн исследования и выборка

Использовались перекрестные опросы на уровне сообществ. Была использована многоэтапная выборка, в которой был получен список всех районов в каждой зоне, и из каждой зоны случайным образом был выбран один район. Три сообщества были случайным образом выбраны из каждого из 3 выбранных районов, в результате чего получилось девять сообществ. Однако в ходе опроса одна община не подтвердила свою готовность участвовать в исследовании, поэтому были посещены 8 общин из 9.Интервью проводились и записывались с использованием полуструктурированных анкет для сбора базовой демографической информации о детях. В каждом из отобранных сообществ были зачислены все дети, соответствующие критериям, и их родители / опекуны. Антропологические измерения и биологические образцы были собраны у 938 участников.

Сбор данных и выборка

Родители / опекуны детей были опрошены с использованием предварительно протестированной полуструктурированной анкеты.Пятна высушенной крови (DBS) собирали на фильтровальной бумаге Whatman № 5 (GE Healthcare, Англия) для генотипирования Hb и ПЦР. Блоты фильтровальной бумаги сушили на воздухе и хранили с осушителем при 4ºC до использования. Некоторые капли крови были также собраны на двух матовых предметных стеклах: одно для микроскопии малярии (толстые и тонкие пленки), а другое — для скринингового теста на серповидность.

Измерение антропометрической и подмышечной температуры

Рост измеряли с помощью нерастягивающейся ленты с точностью до 1 см в соответствии со стандартом Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).Измерение веса проводилось с минимальной одеждой и без обуви на весах с корректировкой нуля перед каждым измерением. Среднюю окружность плеча (MUAC) измеряли с точностью до 1 см с помощью нерастягивающейся ленты. Рост и состав тела исследуемой популяции оценивали с помощью Z-баллов антропометрических индексов роста к возрасту (HAZ), массы тела к возрасту (WAZ) и индекса массы тела к возрасту (BAZ). Программное обеспечение ВОЗ Anthroplus использовалось для преобразования, чтобы можно было сравнить участников исследования с эталонной популяцией [24].Поскольку рост стоя был измерен для всех детей из-за отсутствия соответствующего оборудования, для детей младше 24 месяцев (которые должны были измеряться в лежачем положении) программа добавляла 0,7 см к их росту, чтобы рассчитать примерную длину. Все Z-баллы, не соответствующие флагам ВОЗ, таким образом, WAZ — от 6 до + 5; ЗТВ — от 6 до +6; и БАЗ — от 5 до + 5 были исключены из набора данных. Подмышечную температуру измеряли с помощью бесконтактного инфракрасного термометра (UNIONCARE, модель: IT-122).

Клиническая классификация

Согласно протоколу исследования лихорадка определялась как подмышечная температура ≥ 37.5 ^◦ C. Задержка роста определялась как HAZ <-2SD, недостаточный вес как WAZ <-2SD, худоба как BAZ <-2SD, избыточный вес как BAZ> + 1SD и ожирение как BAZ> + 2SD (24). Все участники, которые были низкорослыми, с недостаточным весом, ожирением и худощавыми, были классифицированы как истощенные. Оперативное определение паразитемии было положительным при микроскопии, а клиническое определение малярии — любая паразитемия плюс лихорадка. Анемия была классифицирована с использованием Информационной системы ВОЗ о витаминах и минералах [25]. Классификация нарушений гемоглобина была разделена на нормальные (HbAA), серповидно-клеточные ((HbSS, HbSC, HbSF и HbSCF), серповидноклеточные признаки (HbAS) и «другие нарушения гемоглобина» (HbAC, HbAF, HbCC и HbACF), как показано. в дополнительном (Дополнительный файл 1: Таблица S1).В этом исследовании серповидно-клеточные признаки были сгруппированы отдельно от других серповидно-клеточных заболеваний, чтобы установить их индивидуальное влияние на анемию и малярию.

Определение уровня гемоглобина

Каплю крови укола пальца использовали для фотометрического определения уровня гемоглобина с помощью портативного анализатора гемоглобина (Hemocue, Швеция). Уровни гемоглобина были классифицированы с использованием Информационной системы ВОЗ по витаминам и минеральному питанию [25] с небольшими изменениями; все три различных классификации анемии; «Легкая», «Умеренная» и «Тяжелая» были объединены в одну группу «Анемия».

Скрининг-тест на серповидность и генотипирование гемоглобина

Участники исследования были проверены на серповидный статус с использованием метода метабисульфита натрия (Sigma Aldrich, США). Генотипирование гемоглобина выполняли с использованием метода электрофореза с изоэлектрическим фокусированием (IEF) на приборе для электрофореза Multiphor II (GE Healthcare, Литтл-Чалфонт, Англия). Контроли и образцы прогоняли при постоянной мощности 26 Вт (1200 В и 300 мА) в течение примерно 1 ч 30 мин. Пластинки с гелем фиксировали 10% трихлоруксусной кислотой, а затем помещали в лоток для промывки дистиллированной водой на ротационном шейкере на 12 мин.После 5 циклов стирки гель помещали в сушильный шкаф при 60 ° C. Затем полосы, образованные индивидуальным гемоглобином, сравнивали с полосами соответствующих контролей и записывали.

Паразитемия под микроскопом

И толстые, и тонкие мазки крови были приготовлены на одном матовом предметном стекле, высушены на воздухе и окрашены 10% Гимза (тонкая пленка, фиксированная метанолом) для обнаружения паразитов как бесполой, так и половой стадии с помощью микроскопии в масляной иммерсии. (100-кратное увеличение). Плотность паразитов оценивали путем подсчета 200 лейкоцитов, а затем пересчитывали в количество паразитов на микролитр крови, принимая стандартное количество лейкоцитов 8000 / мкл [26].Отрицательный слайд — это слайд, на котором паразиты не наблюдались после исследования не менее 200 полей.

Экстракция ДНК паразита

ДНК паразита экстрагировали из перфорированного DBS с использованием протокола Chelex®-сапонина, как описано в другом месте [27,28,29] с небольшими изменениями. Таким образом, 50 мкл 10% сапонина и 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS при pH 7,2) добавляли к каждому перфорированному DBS в пробирке Эппендорфа и оставляли на ночь при 4 ° C. Фильтровальную бумагу дважды промывали в 1 мл PBS, а затем нагревали до 100 ° C в 150 мкл стерильной дистиллированной воды и 50 мкл 20% Chelex®-100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 10 мин с периодическим встряхиванием.После заключительного этапа центрифугирования (13000 об / мин в течение 10 минут) экстрагированную ДНК переносили в 96-луночный планшет для ПЦР, покрывали герметиком для планшетов и хранили при -20 ° C для анализа ПЦР.

Молекулярное обнаружение паразитов

Plasmodium falciparum было обнаружено с помощью вложенной ПЦР-амплификации, как описано ранее [30] с минимальными модификациями. Первичная реакционная смесь составляла 15 мкл и содержала 2 мкл ДНК, по 0,20 мкМ каждого праймера rPLU5 и rPLU6 (Eurofins Genomics, Германия), 200 мкМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) (Promega Corporation, США), 3 мМ MgCl ₂ (Sigma-Aldrich, США) и 0.05 единиц / мкл ДНК-полимеразы Thermus aquaticus (Taq) (Sigma-Aldrich, США). Параметры цикла реакции включали начальную денатурацию при 94 ° C в течение 2 минут, денатурацию при 94 ° C в течение 1 минуты, отжиг при 55 ° C в течение 1 минуты 30 секунд (всего 30 циклов). Удлинение проводилось при 72 ° C в течение 3 минут, а окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 минут. Вторичная реакционная смесь была аналогична первичной. Однако 1 мкл первичного продукта ПЦР использовали в качестве матрицы ДНК и с набором праймеров rFal1 и rFal2, используемым при амплификации.Для реакции в гнезде 2 использовались следующие условия цикла: начальная денатурация при 95 ° C в течение 1 мин, затем денатурация при 94 ° C в течение 1 мин, отжиг при 55 ° C в течение 1 мин 30 с (все для 30 циклов). ). Удлинение проводилось при 72 ° C в течение 2 минут, а окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 минут. Продукты ПЦР хранили при 4 ° C до анализа. Положительные контроли и отрицательный контроль без матрицы ДНК были частью каждого набора реакций.

Молекулярное обнаружение

Обнаружение Plasmodium malariae было выполнено в соответствии с протоколом Padley и его коллег [31] с некоторыми небольшими изменениями.Один обратный праймер (Prv) с консервативными областями для всех четырех видов Plasmodium использовали с видоспецифическим прямым праймером для P. malariae (Pm-F). Реакционная смесь содержала 0,20 мкМ каждого олигонуклеотидного праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 3 мМ MgCl ₂ и 0,05 единиц / мкл ДНК-полимеразы Taq. В качестве матрицы использовали два микролита ДНК в общем реакционном объеме 15 мкл. Условия цикла были следующими: начальная денатурация при 95 ° C в течение 5 мин, денатурация при 95 ° C в течение 30 с, отжиг при 56.2 ° C в течение 30 с (35 циклов). Удлинение проводилось при 72 ° C в течение 1 минуты, а окончательное удлинение при 72 ^o C в течение 5 минут. Продукты ПЦР хранили при 4 ° C до анализа. Положительные контроли и отрицательный контроль без матрицы ДНК были частью каждого набора реакций.

Анализ продуктов ПЦР

продуктов ПЦР разделяли с использованием 2% агарозного геля, окрашенного с помощью электрофореза бромистого этидия 0,5 мкг / мл. Затем цифровые изображения анализировали с помощью Gel Dock (VILBER, Франция). Гелевые фотографии оценивали путем визуального сравнения фрагментов ДНК для отдельных образцов и оценивали с использованием лестничного маркера ДНК из 100 пар оснований (п.о.) (Promega Corporation, США).Образец считался положительным, если продукт размером 205 п.н. был обнаружен для P. falciparum и 412 п.н. обнаружен для P. malariae.

Статистический анализ

Собранные данные были дважды проверены перед вводом в Epi Data версии 3.1 (Оденсе, Дания). Затем они были экспортированы в Stata версии 15.0 (StataCorp LLC, Техас, США) для анализа. Частота получения различных результатов выражалась в процентах. Описательные данные были суммированы как средние или пропорциональные. Демографические характеристики (возрастная группа, пол, этническая принадлежность и район), маляриометрические и антропометрические параметры, а также анемия сравнивались между классификациями гемоглобина с использованием хи-квадрат или точных тестов Фишера (когда частота была меньше 5).Для проверки силы наблюдаемой связи были выполнены двоичные, а также многомерные логистические регрессии. Статистическая значимость была определена как p <0,05.

Эпидемиология и молекулярная идентификация сальмонеллезной инфекции у детей | Инфекционные болезни | JAMA Педиатрия

Цель Изучить роль пищевых продуктов и окружающей среды в развитии инфекции Salmonella у младенцев и детей.

Дизайн Обследование под контролем случая и использование гель-электрофореза в импульсном поле для определения структуры отпечатков пальцев ДНК.

Настройка Амбулаторные и госпитализированные пациенты в детской больнице.

Пациенты или другие участники Необходимо было обследовать последовательную выборку детей младше 4 лет, инфицированных Salmonella , и 3 контрольных группы соответствующего возраста на каждого пациента. Из 103 подходящих случаев сальмонеллеза в исследование были включены 90 случаев и 264 контрольных случая.

Анализ данных Одномерный анализ был выполнен с использованием теста Mantel-Haenszel χ ² или точного критерия Фишера. Поправка Бонферрони использовалась для множественных сравнений. Отпечатки ДНК проверяли на наличие идентичных полос.

Результаты Результаты продемонстрировали сходные диеты между пациентами и контрольной группой, за исключением большего потребления картофеля или макаронных салатов или капустного салата в контрольной группе ( P <0,001).Отпечатки ДНК Salmonella newport и Salmonella typhimurium показали, что все случаи были вызваны уникальными изолятами, за исключением 5 случаев с 12 пациентами. Семь из этих пациентов могут быть связаны географически.

Выводы Большинство случаев сальмонеллеза у детей младше 4 лет носит спорадический характер, и основной источник инфекции остается неустановленным. Для пациентов, инфицированных идентичными изолятами Salmonella , использование общего источника пищи не могло быть инкриминировано используемыми методами.Эти эпидемиологические данные свидетельствуют о загрязнении окружающей среды или других источниках Salmonella .

КАЖДЫЙ ГОД в Соединенных Штатах в Центры по контролю и профилактике заболеваний регистрируется более 40000 случаев сальмонеллеза среди людей, причем почти треть этих случаев касается детей младше 5 лет. ¹ Предыдущие данные из Арканзаса продемонстрировали, что уровень заболеваемости среди этих младенцев и детей превышает таковой в остальной части страны, и что большинство из этих случаев носят спорадический характер без установленного источника инфекции. ² Клиницисты по-прежнему склонны делать упор на зараженную пищу или пищу, приготовленную инфицированными людьми, как на основной источник инфекции для этих молодых пациентов, исходя из того, что понимается под взрослыми и сальмонеллезом. Однако недавние данные показали, что выводы, сделанные в результате расследований вспышек пищевых отравлений, должны иметь сомнительную ценность для объяснения эпидемиологии сальмонеллеза среди младенцев и детей раннего возраста. ³ Исследователи предположили, что, поскольку бактерия Salmonella настолько распространена в нашей среде, практически все младенцы и маленькие дети подвергаются заражению ежедневно.Предполагается, что это ежедневное загрязнение из окружающей среды в сочетании с факторами, влияющими на резистентность хозяина, может быть наиболее важными детерминантами инфекции. Таким образом, целью данного исследования было изучить роль пищевых продуктов и окружающей среды в развитии инфекций, вызываемых сальмонеллой Salmonella , у младенцев и детей.

Исследователи были проинформированы, когда у ребенка младше 4 лет было обнаружено Salmonella , выделенных из любого образца, представленного в клиническую микробиологическую лабораторию из амбулаторных клиник, отделения неотложной помощи или стационарной службы Детской больницы Арканзаса, Литл-Рок, с июля 1993 года по июнь 1995 года. .Решение о сдаче образцов на бактериальные культуры оставалось на усмотрение лечащего врача. Контакт по телефону или лично с одним из родителей или опекуном ребенка был установлен в течение 48 часов после уведомления о положительных результатах культурального исследования. После получения информированного согласия были собраны демографические данные и проведен анкетный опрос, касающийся образования и занятий родителей, государственной помощи (например, участие в программе «Женщины-младенцы-дети»), истории болезни пациента, больного сальмонеллезом, участия других членов семьи. при аналогичном заболевании приготовление и употребление продуктов, относящихся к группе повышенного риска, владение домашним животным и тип домашнего животного (рептилии против млекопитающих), курение в семье, уход за детьми в дневное время и доход семьи.Когда это было возможно, были включены вопросы, касающиеся приготовления и / или потребления смеси и кормления грудью. Трое сопоставимых по возрасту пациентов из общей педиатрической клиники, которые обратились за обычной медицинской помощью, кроме диареи, также были опрошены в тот же день, когда после получения информированного согласия случай был определен в качестве контрольной группы. Первые 3 пациента соответствующего возраста, которые были назначены на прием в клинику в день опроса, были выбраны в качестве контроля. Если они отказывались, проводилось интервью со следующим доступным пациентом, отвечающим критериям включения.Все интервью с случаями и контрольными случаями проводились одним обученным интервьюером (E.L.F.).

Изоляты Salmonella были классифицированы по серогруппе в лаборатории клинической микробиологии по схеме Кауфмана-Уайта и отправлены в Департамент здравоохранения штата Арканзас для серотипирования. Два наиболее распространенных серотипа подверглись дальнейшему исследованию с использованием анализа фрагментов рестрикции ДНК с использованием гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) для идентификации идентичных изолятов среди одинаковых серотипов.Структуры фрагментов ДНК оценивали визуально, и каждому отдельному образцу присваивали номер образца. Поскольку сравниваемые изоляты были одного и того же серотипа, они считались генетически разными, если в паттернах PFGE было более одной полосы вариации. ⁴ Эпидемиологическая информация, полученная от семьи пациентов, инфицированных идентичными серотипами Salmonella , была тщательно изучена в поисках связи, которая могла бы указывать на общий источник инфекции.

Данные были собраны с помощью вопросника, созданного для эффективной работы с Epi-Info (версия 5.0B). Все данные были дважды введены и проверены. Одномерный анализ проводили с использованием теста Mantel-Haenszel χ ² или точного критерия Фишера, в зависимости от того, что подходило на основе ожидаемого размера клеток. Поправка Бонферрони использовалась для оценки множественных сравнений.

Препарат ДНК, расщепление рестриктазой и pfge

Организмы Salmonella выращивали в течение ночи при 37 ° C в питательном бульоне, осаждали центрифугированием и промывали 100 ммоль / л трис-гидрохлоридом (pH 7.5), 100 ммоль / л ЭДТА и 150 ммоль / л хлорида натрия. Осадок смешивали с расплавленным 2% гелем агарозы с низкой температурой плавления (In Cert Agarose, FMC BioProducts, Rockland, Me), и суспензию добавляли в формы для пробок (Bio-Rad, Hercules, Калифорния). Блоки агарозного геля инкубировали в растворе, содержащем 6 ммоль / л трис-гидрохлорида (pH 7,5), 1 моль / л хлорида натрия, 100 ммоль / л EDTA, 0,5% полиоксиэтилен-20 цетиловый эфир (Brij 58, Sigma, St Louis , Mo), 0,2% дезоксихолата натрия, 0,5% саркозила и 1 мг / мл лизоцима в течение 15 часов при 37 ° C с последующим депротеинизированием в 0.4 моль / л ЭДТА (pH 9,3), 1% саркозила и 1 мг / мл протеиназы К при 50 ° C в течение 24 часов. Клеточный дебрис и протеиназу К удаляли многократным промыванием в буфере CHEF-TE (фиксированное гомогенное электрическое поле в буфере 0,1 моль / л Трис и 0,1 моль / л EDTA) — 100 ммоль / л Трис гидрохлорид (pH 7,5). —И 100 ммоль / л ЭДТА. Пробки ДНК хранили при 4 ° C в буфере CHEF-TE до расщепления рестрикционным ферментом.

Ограничение переваривания ферментов

Геномная ДНК была рестриктирована I Xba I (5′-TCTAGA-3 ‘) и Spe I (5′-ACTAGT-3′).Изоляты с аналогичными рисунками отпечатков пальцев с Xba I и Spe I подверглись последующему ограничению с помощью Nhe I (5′-GCTAGC-3 ‘), Avr II (5′-CCTAGG-3′), Ase I (5′-ATTAAT-3 ‘) или Not I (5′-GCGGCCGC-3′) (New England Bio Labs, Беверли, Массачусетс и Promega Co, Мэдисон, Висконсин). Блоки агарозного геля промывали в течение 3 часов при 4 ° C в буфере TM — 100 ммоль / л Трис-гидрохлорида (pH 8) и 5 ​​ммоль / л хлорида магния — с последующим уравновешиванием в соответствующем буфере рестрикционного фермента в течение 1 часа при 4 ° С.К пробкам добавляли свежий буфер, содержащий от 5 до 25 единиц выбранного фермента, и их инкубировали в течение 16 часов при 37 ° C. Ферментативную реакцию останавливали добавлением EDTA (pH 8) до конечной концентрации 1 моль / л.

Гель-электрофорез в импульсном поле

Гель-электрофорез в импульсном поле расщепленных образцов выполняли с помощью гомогенного электрического поля с фиксированным контуром на системе CHEF-DR II (Bio-Rad Laboratories, Ричмонд, Калифорния) в 1% гелях агарозы в 0.5-кратный буфер TBE — 0,1 моль / л Трис, 0,1 моль / л борная кислота, 0,2 ммоль / л ЭДТА (pH 8) в течение 14 или 24 часов при 200 В и 14 ° C. Время нарастания импульсов варьировалось в зависимости от фермента и составляло от 1 до 60 секунд. В качестве стандартов размера ДНК использовали лямбда-лестницу бактериофага, состоящую из конкатемеров, начинающихся с 48,5 пар оснований (Bio-Rad Laboratories, Ричмонд, Калифорния), а также маркер среднего уровня II с наименьшей полосой при 24 парах оснований (New England Bio Labs). Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали на УФ-трансиллюминаторе.

В течение периода исследования было выявлено 103 случая сальмонеллеза человека у подходящих пациентов. Тринадцать случаев были исключены, поскольку контакт не удалось установить в 8, 3 уже были включены в исследование, а 2 отказались от участия. Семьдесят процентов случаев произошли в период с апреля по сентябрь. Группы больных и контрольные группы не различались по возрасту, расе, полу или хроническим заболеваниям в анамнезе (таблица 1). В течение недели, предшествующей развитию болезни пациентов, не было различий в типах лекарств или количестве заболеваний у других членов семьи для случаев и контроля независимо от возраста.В частности, 17% случаев и 14% контрольной группы описали другого члена семьи с диареей. Для младенцев младше 3 месяцев в 29% случаев и 22% контрольной группы ( P > 0,2) был по крайней мере 1 другой член семьи с диареей. Также не было различий между группами в отношении владения домашними животными, курения в домашнем хозяйстве, посещения детских садов, образования родителей, занятости в птицеводстве и семейного дохода менее 10 000 долларов. Тем не менее, пациенты из контрольной группы с большей вероятностью получали поддержку в рамках программы «Женщины-младенцы-дети» (73% против 60%; P <.02) и Medicaid (63% против 43%; P <0,01), чем случаев.

Таблица 1.

Демография и хронические заболевания Salmonella Случаи и контроли *

Обзор данных о пищевых продуктах показал, что единственное отмеченное различие в потреблении пищи заключалось в том, что контрольная группа с большей вероятностью ела картофель, макароны, салат или салат из капусты (таблица 2). Также не было отмечено различий между случаями и контрольной группой для младенцев, все еще потребляющих смесь (Таблица 3).Среди тех пациентов, которые не кипятили воду перед смешиванием детской смеси, источник воды был одинаковым для случаев и контроля. В случаях, когда муниципальная вода использовалась в 24 (70%), колодезная или бутилированная вода использовалась в 5 (15%), в то время как для контроля муниципальная вода использовалась в 52 (81%), бутилированная вода — в 9 (14%) и колодезная вода в 3 (5%). Разница между случаями и контролем в отношении использования колодезной воды не была значительной.

Таблица 2.

Приготовление и потребление пищи за 1 неделю до интервью *

Таблица 3.

Привычки питания младенцев, все еще потребляющих смесь *

Salmonella была выделена из стула в 86 случаях, из крови в 3 случаях и из спинномозговой жидкости в 1 случае. Наиболее частым выделенным серотипом был Salmonella newport (n = 30), за ним следовали Salmonella typhimurium (n = 25), Salmonella javiana (n = 7), Salmonella heidelberg (n = 4), Salmonella ibadan (n = 3) и другие виды (n = 21).Оценка факторов риска по выделенному организму показала только то, что пациенты, инфицированные S typhimurium , имели тенденцию быть старше (средний возраст 20 месяцев; P <0,02) по сравнению с пациентами, инфицированными S newport (средний возраст 13 лет). месяцев), S javiana (средний возраст 11 месяцев) или других видов Salmonella (средний возраст 11 месяцев). В частности, при оценке данных на основе изолированного организма не было выявлено каких-либо заметных воздействий на окружающую среду или пищу.

Гель-электрофорез в импульсном поле был проведен на 29 изолятах S newport и 22 S typhimurium (рис. 1). Паттерны рестрикционного анализа эндонуклеазами S newport и S typhimurium , генерируемых PFGE после переваривания Xba I и Spe I, составили 12 и 9, соответственно, для изолятов S newport и 20 и 18, соответственно, для изолятов S typhimurium . Комбинация шаблонов Xba I и Spe I для S newport продемонстрировала 23 различных комбинации шаблонов.Девятнадцать из этих комбинаций представляли одиночных пациентов, в то время как 4 из идентичных моделей включали 10 пациентов. Образцы рестрикционных эндонуклеаз, созданные с помощью Nhe I, Avr I, Not I или Ase I, не помогли в дальнейшей дифференциации изолятов. Объединение результатов обоих ферментов для S typhimurium продемонстрировало 21 отдельную комбинацию, каждая из которых представлена ​​одним пациентом, за исключением одного общего рисунка отпечатков пальцев, который был отмечен у 2 пациентов.Паттерны рестрикционных эндонуклеаз, созданные с помощью Nhe I и Not I, не помогли в дальнейшей дифференциации изолятов S typhimurium .

Рис. 1.

Этот гель демонстрирует различные картины, полученные с помощью гель-электрофореза в импульсном поле с использованием Xba I и Salmonella typhimurium . Дорожка — это маркерная дорожка, в которой используется λ-лестница с парой 48,5 килобаз. Визуальный осмотр показывает, что рисунки на дорожках 3, 4 и 8 идентичны.

Были дополнительно проанализированы демографические данные пациентов, инфицированных изолятами, имеющими сходные ДНК-отпечатки пальцев (рис. 2). Средний возраст детей, включенных в эти кластеры, составлял 15,5 месяцев, что не отличалось от других 78 случаев (13,8 месяцев). Все пациенты, кроме 2 (1 с S newport , 1 с S typhimurium ) использовали городскую воду. Ни у одного из участвовавших в исследовании детей не было сходной диеты. Из 4 общих кластеров, включающих 10 пациентов с S newport , 2 кластера включали 5 пациентов, которые жили в том же городе или рядом с ним, что и другой пациент с тем же изолятом, хотя болезни могли разделяться на 3 месяца.В 1 паре идентичных образцов ДНК-отпечатков пальцев с участием S typhimurium 2 пациента были инфицированы с разницей в 7 месяцев и жили в разных городах и округах. Второй ребенок, однако, провел день в родном городе первого ребенка в течение 72 часов с момента начала их болезни. Никакого другого общего источника установить не удалось.

Рисунок 2.

Этот гель демонстрирует 2 идентичных ДНК-отпечатка пальца Salmonella typhimurium от пациентов на дорожках 2–7.Используемые рестрикционные ферменты включали Avr II (дорожки 2 и 3), Spe I (дорожки 4 и 5) и Xba I (дорожки 6 и 7). Образцы отпечатков ДНК идентичны для 2 изолятов Salmonella newport от 2 пациентов на дорожках с 9 по 14. Используемые рестрикционные ферменты включали Avr II (дорожки 9 и 10), Spe I (дорожки 11 и 12) и . Xba I (дорожки 13 и 14). Дорожки 1 и 15 представляют собой маркерные дорожки с использованием λ-лестницы из 48,5 килобаз пар.

Эпидемии сальмонеллеза среди людей обычно приписывают зараженным пищевым продуктам, но роль пищевых продуктов в развитии спорадических заболеваний у младенцев и детей не изучена.Данные, полученные в этом исследовании у младенцев и детей младшего возраста, позволяют предположить, что диетические привычки до развития инфекции между случаями и контрольной группой были удивительно похожими. Недавние данные свидетельствуют о том, что зараженные яйца остаются важным средством передачи Salmonella у взрослых даже в отсутствие признанных вспышек. ⁵ Такие данные для маленьких детей не подтверждаются текущим исследованием из-за недостаточного потребления яиц нашими пациентами, отсутствия инфекций из-за Salmonella enteritidis и того факта, что в Арканзасе не было проблем с заражением яиц. . ⁶

Факторы риска для младенцев, не употребляющих столовые продукты, определили использование смесей, обогащенных железом, и отсутствие грудного вскармливания как основные факторы риска развития болезней. ^{7 , 8} Хотя вопросы о содержании железа в смесях не добавлялись до второго года исследования, никаких различий между группами в использовании таких формул отмечено не было. Количество младенцев, кормящих грудью или использующих какое-либо грудное молоко в своем рационе в этом исследовании, было слишком небольшим, чтобы продемонстрировать защитный эффект, который был ранее описан в нашей популяции пациентов. ⁸ Хотя не было замечено статистических различий между группами в отношении использования колодезной воды, использование загрязненной колодезной воды все же могло сыграть роль в развитии заболевания в подгруппе пациентов. Загрязнение пресной воды сточными водами птицеперерабатывающих заводов обычно рассматривается местными врачами как основная причина случаев сальмонеллеза в Арканзасе. Salmonella typhimurium была связана с зараженной домашней птицей, и как S newport , так и S typhimurium могут быть извлечены из загрязненной пресной воды, ^{9 , 10} , но предыдущие экологические анализы не продемонстрировали корреляции между наличием птицеперерабатывающих предприятий или инкубаторий и уровень заболеваемости людей сальмонеллезом в Арканзасе. ² Роль загрязненной воды в развитии сальмонеллеза все еще остается под вопросом.

ДРУГИЕ ПРИЗНАННЫЕ факторы риска развития сальмонеллеза, такие как хронические заболевания или более низкий социально-экономический класс, в наших случаях не преобладали по сравнению с контрольной группой. Социально-экономический статус наших пациентов и контрольной группы был одинаковым. Тот факт, что больше детей из контрольной группы получали поддержку в рамках Medicaid и программы «Женщины-младенцы-дети», вероятно, был связан с тем, что контрольную группу составляли пациенты, которые получали обычную медицинскую помощь в нашей общей педиатрической клинике, где особое внимание уделялось включению соответствующих критериям пациентов в эти программы. существуют.При оценке наших пациентов и контрольной группы по абсолютному доходу не было отмечено различий между двумя группами. В частности, не было разницы между двумя группами относительно годового дохода менее 10 000 долларов. Попытка определить факторы риска для окружающей среды или пищевых продуктов на основе выделенных организмов также не увенчалась успехом. В предыдущих исследованиях было показано, что Salmonella newport и S typhimurium являются двумя наиболее распространенными изолятами в Арканзасе. ² Открытие того, что S typhimurium чаще заражает детей старшего возраста, представляет интерес, но в настоящее время его значение неясно.

Анализ паттернов рестрикции хромосомной ДНК с помощью PFGE был выбран для нашего исследования, поскольку он широко доступен и, как было доказано, демонстрирует генетические вариации среди подобных серотипов Salmonella . ^{11 -15} В текущем исследовании было обнаружено достаточно разнообразия среди 44 (86%) паттернов отпечатков пальцев, поэтому использование Xba I и Spe I является полезным эпидемиологическим инструментом для S newport и S typhimurium .При использовании этих рестрикционных ферментов было обнаружено, что 2 наиболее распространенных серотипа имеют 44 различных комбинации отпечатков пальцев. Это указывает на то, что большинство изолятов не были клонально связаны, что согласуется с выводом о том, что большинство случаев носят спорадический характер. Дальнейшая оценка изолятов с идентичными паттернами с использованием других ферментов не помогла дифференцировать серотипы в 5 группах пациентов с подобными паттернами. Из-за разнообразия паттернов ДНК-отпечатков пальцев, полученных с использованием этих рестрикционных ферментов, появление идентичных паттернов предполагает либо наличие общего контаминирующего источника инфекции, либо ограниченное расхождение последовательностей в изолятах этих конкретных серотипов.

Однако наши эпидемиологические данные подтверждают первое. Семеро из детей жили или путешествовали в том же городе, что и другие, с идентичными изолятами. Поскольку эти младенцы и дети имели разную диету, источник их инфекции был более вероятен из их непосредственного окружения, а не напрямую от зараженных продуктов. Прошлые исследования показали, что посевы, взятые из семей инфицированных младенцев и детей, показали, что в грязи вокруг дома, на местной игровой площадке и в образцах из пылесосов или соломинки от метел из дома было обнаружено Salmonella . ^{16 , 17} Поскольку младенцы и дети очень любознательны, фиксируются на ротовой полости и постоянно изучают окружающую их среду, этот тип заражения будет иметь большое значение, но не может объяснить, как пациенты могут быть инфицированы идентичными организмами, разделенными длительным сроком службы. расстояния и время.

Однако зараженный человек, загрязняющий окружающую среду ребенка, может объяснить проблемы временем и расстоянием. Средняя продолжительность выведения Salmonella от всех инфицированных людей составляет примерно 5 недель, и хотя 90% взрослых перестают выделять микроорганизмы через 9 недель и только 1% выводятся через 1 год, 60% детей младше 5 лет выводятся через 20 недель и примерно 5% все еще выводятся из организма через 1 год после развития болезни. ¹⁸ В предыдущих бактериологических исследованиях домашних контактов младенцев и детей раннего возраста, больных сальмонеллезом, было отмечено, что примерно одна треть домашних контактов выделяет Salmonella , при этом примерно 50% протекают бессимптомно. ^{19 , 20} Младенцы и дети младшего возраста с большей вероятностью будут иметь более продолжительные или более интимные периоды обращения со стороны их опекунов, чем дети старшего возраста, что увеличивает их риск заражения, если опекун выделяет Salmonella .Наши данные, однако, показали, что у равного количества пациентов и контрольных семей были дома другие люди с диареей. Это также верно даже для пациентов моложе 3 месяцев, возраст, который был связан с внутрисемейным распространением. ²⁰ К сожалению, у нас не было метода выявления бессимптомных инфекций среди членов семьи; важность такого человека нельзя игнорировать.

В заключение, это исследование демонстрирует сложности определения источника сальмонеллеза человека у младенцев и детей.Для пациентов, инфицированных идентичными изолятами Salmonella , общий источник заражения пищи не был идентифицирован с помощью использованных методов, но загрязнение окружающей среды или другие источники Salmonella могут быть причиной этих инфекций. Для пациентов с уникальными изолятами основной источник инфекции остается неустановленным. Для адекватного подтверждения этих результатов потребуются дальнейшие обследования этих пациентов, включая бактериальные оценки их домов, контактов и продуктов питания.Однако, основываясь на этих данных, когда клиницисты сталкиваются с пациентами с сальмонеллезом в возрасте до 4 лет, время, потраченное на расспросы членов семьи об окружающей среде, окружающей пациента, а не на диетический анамнез, может дать более полезную информацию.

Принята к публикации 23 февраля 1998 г.

Это исследование спонсировалось основным грантом 93-34211-8360, субподрядчиком UA AES 93-102 Консорциума по безопасности пищевых продуктов при Министерстве сельского хозяйства США, выданным Университетом Арканзаса, сельскохозяйственной экспериментальной станцией, Фейетвилл.

Представлено в виде тезисов на 94-м общем собрании Американского общества микробиологов, Лас-Вегас, штат Невада, 27 мая 1994 г.

Авторы благодарят Келли Дж. Келлехер, MD, MPH, Медицинский центр Университета Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, за его полезные комментарии и критический обзор представления статистических результатов.

Примечание редактора: Моя итальянская этническая принадлежность помогает мне понять важность того, что исследовательская группа потребляет меньше салата из макарон, но капуста из капусты? — Catherine D.ДеАнгелис, Мэриленд

Отпечатки: Гордон Э. Шутце, доктор медицины, Детская больница Арканзаса, 800 Маршалл-стрит, Литл-Рок, AR 72202-3591 (электронная почта: [email protected]).

Дитрих Сальтамирано JVDownes Ф.П.Мартин R Молекулярная эпидемиология вспышки Salmonella poona в нескольких штатах.Выдержки из 94-го Общего собрания Американского общества микробиологов 26 мая 1994 г. Лас-ВегасНев. Абстракция C-421

На состав микробиоты двенадцатиперстной кишки у детей с активной глютеновой болезнью влияет степень энтеропатии.

Целиакия (ЦБ) — хроническое воспалительное заболевание тонкого кишечника, характеризующееся стойкой непереносимостью диетической глютена, встречающейся у генетически предрасположенных лиц.1 Это заболевание может возникать в любом возрасте и иметь множество клинических проявлений, но типичные случаи часто проявляются в раннем детстве. Пациенты с БК могут протекать бессимптомно, только с внекишечными симптомами или бессимптомными формами. В настоящее время диагноз БК с классическими желудочно-кишечными симптомами диагностируется при наличии атрофии ворсинок слизистой оболочки, гиперплазии крипт и инфильтрации интраэпителиальных лимфоцитов.

CD — это многофакторное заболевание, которое включает взаимодействие между генетическими факторами и факторами окружающей среды.Факторы окружающей среды включают воздействие глютена в раннем возрасте, непродолжительное грудное вскармливание, кишечные инфекции и изменения микробиоты.

Недавно научные данные показали изменения в составе кишечной микробиоты у этих пациентов2. До сих пор сообщалось о различиях в составе микробиоты и связанных метаболитов между пациентами с БК и здоровой контрольной группой (ХК) в основном в фекалиях. Также сообщалось о разнообразии и изменениях в нескольких бактериальных группах в микробиоте двенадцатиперстной кишки у педиатрических пациентов с БК.5-7 Тем не менее, другие исследования не смогли показать существенных различий в микробиоте между CD и HC. 8-10 Cheng et al.10 описывают схожий состав микробиоты слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки между CD и здоровыми детьми, но профиль подгруппы населения включает восемь Было обнаружено, что родоподобные бактериальные группы значительно различаются между исследуемыми группами, вероятно, с определенной ролью в разрушении эпителия при CD.

Изменения микробиоты двенадцатиперстной кишки были описаны у пациентов с глютеновой болезнью, взрослых и детей, с активным заболеванием5,9,11 и когда они также соблюдали безглютеновую диету.12 Wacklin et al.13 обнаружили различия в разнообразии и составе кишечной микробиоты у взрослых с классическими кишечными симптомами CD и внекишечными симптомами; это указывало на то, что состав микробиоты слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки пациентов различался в зависимости от проявлений CD.

Это исследование было разработано, чтобы установить, различается ли микробиота слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки у детей с активной CD и контрольной группы по составу и биоразнообразию, чтобы объяснить различия в микробиоте педиатрических пациентов с CD и HC.

Биопсии двенадцатиперстной кишки были взяты у детей с впервые установленным диагнозом БК, соблюдающих нормальную глютеносодержащую диету, и у детей с ГК. Группу HC составили дети, которых обследовали на предмет функциональных кишечных расстройств не-CD происхождения. Все пациенты с HC имели как отрицательную серологию целиакии, так и нормальную слизистую оболочку тонкой кишки (Марш 0) .14 пациентов с CD имели как положительные серологические маркеры целиакии (антитела к тканевой трансглутаминазе IgA, антитела к дезамидированному глиадину IgG и антитела против эндомизия IgA), так и гистологические поражения в биопсия двенадцатиперстной кишки.

Это исследование было проведено в соответствии с руководящими принципами, установленными в Хельсинкской декларации в соответствии с Руководством по надлежащей клинической практике ЕЭС (документ 111/3976/88, июль 1990 г.), а также в соответствии с руководящими принципами действующего испанского законодательства, регулирующего клинические исследования на людях (Royal Постановление 561/1993). Протокол исследования был одобрен Комитетом по этической практике CSIC и больницы.

Письменное информированное согласие было получено от родителей детей, включенных в исследование.Ни один из пациентов, включенных в исследование, не получал лечения антибиотиками в течение 2 месяцев до завершения эндоскопии. У каждого пациента было взято четыре биопсии слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Два образца из каждого случая были отправлены на гистологическое исследование с использованием шкалы Марша, а два других образца были немедленно заморожены при -20 ° C и сохранены до обработки для бактериологического исследования. Их собирали с помощью 1 мл PBS и центрифугировали при 1000 × g в течение 5 минут.

Тотальную ДНК экстрагировали из каждого образца, как описано Martínez et al., 15 с некоторыми модификациями, как сообщили Tapia-Paniagua et al. 16 Двадцать микролитров ДНК обрабатывали 2 мкл 3М ацетата натрия и 46 мкл изопропанола. Образцы центрифугировали 12000 × g в течение 6 минут. Гранулы очищали 70% этанолом и центрифугировали 12000 × g в течение 6 минут. Гранулы сушили и ресуспендировали в воде.

Чтобы сравнить образцы DGGE микробиоты двенадцатиперстной кишки, ДНК амплифицировали с использованием праймеров, специфичных к бактериальному домену 16S рДНК 968-GC-F и 1401-R.Эти праймеры использовали для амплификации областей V6-V8 16S рДНК. Смеси для ПЦР и условия для проведения ПЦР были такими, как описано ранее.12 Конкретные ампликоны также использовались для рода Lactobacillus (Таблица 1). Смеси для ПЦР (50 мкл) содержали 1,25U полимеразы Taq (Life Technologies Gaithersburg, Мэриленд, США), 20 мМ трис-HCl (pH 8,5), 50 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 5 пмоль праймеров, 1 мкл ДНК-матрицы. , и вода, стерилизованная ультрафиолетом. ПЦР выполняли в термоциклере T1 (Whatman Biometra, Геттинген, Германия), используя 1 цикл при 94 ° C в течение 2 минут, 35 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд, 56 ° C в течение 40 секунд и 72 ° C в течение 1 минуты, а затем 1 цикл 72 ° C в течение 5 мин.Аликвоты (5 мкл) анализировали электрофорезом в 1,5% (мас. / Об.) Агарозных гелях, содержащих бромид этидия, для проверки размера и количества продукта.

Полученные ампликоны разделяли с помощью DGGE в соответствии со спецификациями Muyzer et al.17, используя систему Dcode TM (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Электрофорез проводили в 8% полиакриламидных гелях (37,5: 1 акриламид – бисакриламид; размеры 200 мм × 200 мм × 1 мм) с использованием 30–55% денатурирующего градиента для разделения продуктов ПЦР.Гели содержали 30–55% градиент мочевины и формамида, возрастающий в направлении электрофореза. 100% денатурирующий раствор содержал 7 М мочевину и 40% (об. / Об.) Деионизированного формамида. Образцы ПЦР наносили на гели аликвотами по 13 мкл на дорожку. Гели подвергали электрофорезу в течение 16 часов при 85 В в буфере 0,5 × TAE (20 мМ трис ацетат [pH 7,4], 10 мМ ацетат натрия, 0,5 мМ Na2-EDTA) при постоянной температуре 60 ° C, а затем окрашивали AgNO3. 18.

Был проведен анализ DGGE, и образцы полос были проанализированы с использованием программного обеспечения FPQuest версии 4.0 (Прикладная математика BVBA, Синт-Мартенс-Латем, Бельгия). Матрица сходства для денситометрических кривых рисунков полос была рассчитана с использованием основанного на полосах коэффициента Пирсона, а кластеризация шаблонов DGGE была достигнута путем построения дендрограмм с использованием метода невзвешенных парных групп с использованием средних арифметических значений (UPGMA). Значения коэффициентов Пирсона, полученные для каждого лечения, сравнивали с использованием множественных тестов на сходство по диете. Для определения структурного разнообразия микробного сообщества, соответствующего рисунку полос DGGE, были рассчитаны несколько параметров: (1) удельное богатство (r) рассчитывалось на основе общего количества полос; (2) индекс Шеннона (H ′) был рассчитан по функции: H ′ = — ΣPilogPi, где Pi определяется как (ni / N), ni — поверхность пика каждой полосы, а N — сумма всех поверхности пиков всех полос; (3) взвешенное по диапазону богатство (Rr), рассчитанное как общее количество полос, умноженное на процент денатурирующего градиента, необходимый для описания общего разнообразия анализируемого образца, в соответствии со следующей формулой: Rr = (N2 × Dg), где N представляет собой общее количество полос в шаблоне, а Dg — денатурирующий градиент, заключенный между первой и последней полосой в шаблоне.19

Для определения основных бактерий преобладающие полосы в гелях DGGE были извлечены для секвенирования с помощью стерильных наконечников пипеток, помещены в 100 мкл бидистиллированной воды (ddh3O) и инкубированы при 4 ° C в течение ночи. Объемы 5 мкл использовали в качестве матрицы в реакции амплификации ПЦР, выполняемой, как описано выше. Продукт повторно запускали на DGGE, чтобы подтвердить его положение, и далее подвергали циклическому секвенированию с праймерами 968-без зажима GC (5′-AACGCGAAGAACCTTAC-3 ‘) и 1401-R и (5′-ACG’GCTACCTTGTTACGACTT-3’ ).ПЦР выполняли в термоциклере T1 (Whatman Biometra, Геттинген, Германия), используя один цикл 94 ° C в течение 2 минут, 28 циклов 95 ° C в течение 30 секунд, 56 ° C в течение 40 секунд и 72 ° C в течение 1 минуты, а затем один цикл. цикл 72 ° C в течение 5 мин. Продукты очищали с использованием набора для очистки High Pure Spin Kit PCR (Roche). Секвенирование ампликонов выполняли на секвенаторе ABI PRISM 377 (Perkin-Elmer). Последовательность считывали с обоих направлений с праймерами RV-M и M13-47 соответственно. Полученные последовательности (~ 500 п.н.) сравнивали с последовательностями из Национального центра биотехнологической информации (NCBI) или базы данных последовательностей ДНК Greengenes с использованием алгоритма последовательности BLAST21.Последовательности из базы данных, показывающие наивысшую идентичность, были использованы для вывода идентичности. Хотя высокое разрешение DGGE не исключает возможности того, что две разные последовательности 16S рДНК могут мигрировать в одно и то же положение, все последовательности, которые мигрировали в одно и то же положение, были секвенированы. Химерные последовательности были идентифицированы с помощью программы CHECK CHIMERA проекта Ribosomal Database Project.22

Анализ главных компонентов (PCA) — математическая процедура, которая использует ортогональное преобразование для преобразования набора наблюдений возможно коррелированных переменных в набор значений линейно некоррелированных переменных.Он использовался для обобщения профилей ПДРФ.23 В настоящем исследовании он применялся для корреляции различных, таких как экологические параметры (H ‘, R и Rr), гистологические параметры и доля ДНК каждого вида микробов, обнаруженных в кишечнике. микробиота, проанализированная с микробиотой кишечника этих пациентов. PCA проводился с использованием программы LXSTAT 2012 (Addinsoft, Испания), рассчитанной с помощью программы MS excel XLSTAT 2012.1.01; Addinsoft Влияние переменных в PCA определялось расстоянием каждой переменной от центра оси d ≥√2 / n, где n — количество переменных.Для определения количества ДНК использовали интенсивности, полученные для каждой из полос DGGE.

Данные, выраженные как среднее значение и стандартное отклонение, анализировали с помощью SPSS (Статистический пакет для социальных наук для Windows, версия 15.0, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Экологические индексы анализировали с помощью теста Краскела – Уоллиса с использованием программного обеспечения Statgraphics Plus 5.0 (Statgraphics Corporation, Роквилл, Мэриленд, США). Различия считались статистически значимыми при p≤0.05.

образца биопсии двенадцатиперстной кишки было взято у 11 детей с впервые диагностированной БК, соблюдающих нормальную глютеносодержащую диету и 6 ГК (таблица 2).

Значения богатства, разнообразия и взвешенного по диапазону богатства не показали значительных различий между субъектами HC и пациентами с CD (таблица 3), тогда как три значения были значительно ниже для CD по сравнению с HC, когда Был проанализирован род Lactobacillus (таблица 3).

Кроме того, к DGGE-образцам микробиоты двенадцатиперстной кишки был применен кластерный анализ.Это привело к высокому проценту внутригруппового сходства (98%) у пациентов, у которых гистология была связана с типом Marsh 3c. Остальные пациенты показали сходство от 80% до 30%, и группа не была основана на других характеристиках (рис. 1).

Вторая дендрограмма была сделана только с ампликонами рода Lactobacillus, показывающими два отдельных кластера с 40% сходства приблизительно, но группы не были основаны на какой-либо анализируемой характеристике. (Данные не показаны.)

Полосы, показывающие более высокую интенсивность в гелях DGGE образцов биопсий, секвенировали и сравнивали с эталонами BLAST на основании филогенетической взаимосвязи частичной последовательности 16S рДНК размером ~ 500 п.н. (Таблица 4).Полосы были в основном связаны с такими видами, как Streptococcus, Bacteroides и Escherichia coli у пациентов с CD, тогда как в HC преобладающими полосами были Bifidobacterium, Acinetobacter и Lactobacillus. Другие группы, такие как Streptococcus (17–13%) или Bacteroides (16–11%), были второстепенными.

PCA показывает, что два фактора (F1 и F2) могут объяснить 83,44% вариабельности, обнаруженной между микробиотой и другими переменными, изученными у пациентов и контрольной группы. Примечательно, что переменные, относящиеся к богатству, разнообразию и обитаемости рода Lactobacillus, меняются с обратного на другие переменные, используемые рассматриваемым F1.Также F1 разделяет обе оси, HC и пациентов с CD, так что F1 является фактором, связанным с наличием или отсутствием заболевания (рис. 2).

Структурное разнообразие микробного сообщества, соответствующее полосам DGGE, не показало значительных различий между HC и CD. Анализ DGGE с универсальными праймерами не показал более высокого бактериального разнообразия, связанного с микробиотой тонкого кишечника CD, но экологические параметры (H ‘, R и Rr) были значительно ниже для CD по сравнению с HC при анализе рода Lactobacillus.

Nadal et al., 5 провели бактериологический анализ образцов биопсии двенадцатиперстной кишки, взятых у педиатрических пациентов с CD. Их результаты показали, что у пациентов с активным CD было значительно больше общих бактерий, особенно грамотрицательных бактерий, по сравнению с бессимптомными пациентами и здоровыми субъектами, а также соотношение Lactobacillus-Bifidobacterium к Bacteroides-E. coli была ниже у пациентов с БК. Nistal et al.9 проанализировали секвенирование бактериального гена 16S рРНК ДНК, экстрагированной из биопсии двенадцатиперстной кишки, и показали, что разнообразие микробиоты двенадцатиперстной кишки значительно различается между леченными и нелеченными взрослыми с CD.

В нашем исследовании пациенты с поражением Marsh 3c были сгруппированы отдельно в PCA профилей DGGE. Другие пациенты с Marsh 3a и Marsh 3b и один случай Marsh 2 имели другую микробиоту по сравнению с более тесно сгруппированными пациентами с Marsh 3c. Это указывало на то, что состав микробиоты двенадцатиперстной кишки различается в зависимости от степени поражения кишечника.

Вероятно, условия кишечной среды в случаях тяжелой атрофии ворсинок вызывают глубокие изменения в микробном сообществе.Некоторые изменения в микробном составе двенадцатиперстной кишки могут быть связаны с паттерном деструктивных воспалительных последствий, наиболее очевидным при атрофии ворсинок слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. В этих случаях воспалительное действие на кишечник, оказываемое глютеном, может дополнительно активировать воспаление кишечника, что является следствием деструктивного характера атрофического поражения, связанного с типом Marsh 3c. Мы предполагаем, что наиболее интенсивная атрофия слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки при нелеченом CD, такая как Marsh 3c, способствует колонизации слизистой оболочки, аналогичной у этих пациентов.

Необходимы дополнительные исследования, чтобы понять взаимодействие микробиоты и хозяина и выяснить значение конкретной микробиоты, чтобы определить, является ли она просто следствием ЭК или вовлечена в вариабельность и различные степени энтеропатии заболевания. В этом отношении это недавно было связано с изменениями кишечной микробиоты, такими как уменьшение микробного разнообразия, с устойчивыми симптомами при лечении CD. 24

Мы ожидаем дальнейших исследований, чтобы найти бактериологические маркеры в микробиоте двенадцатиперстной кишки для CD в диагностических и терапевтических целях.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Метилирование ДНК промоторов лептина и адипонектина у детей снижается за счет сочетанного наличия ожирения и инсулинорезистентности

Первое сообщение о врожденной или детской катаракте при нарушенном метаболизме протеогликанов с высвобождением ксилозы

Врожденная или детская катаракта связана с врожденными аномалиями метаболизма, такими как галактоземия, 1-4 и маннозидоз.5 Галактоземия, вызванная галактозо-1-фосфатуридилтрансферазой (EC: 2.7.7.12) 1 или галактокиназой (EC: 2.7.1.6) 3 4 6 недостаток был хорошо задокументирован многими рабочими. Связь фрагментов гликозаминогликана (ГАГ) или ксилозы, пентозного сахара, с врожденной катарактой до сих пор не сообщалась. Это исследование устанавливает связь фрагментов ГАГ и ксилозы с врожденной или детской катарактой.

Протеогликаны — важные компоненты внеклеточного матрикса соединительных тканей (хрящей, сухожилий и костей).Они представляют собой полианионные вещества с высокой молекулярной массой и содержат много различных типов гетерополисахаридных повторяющихся единиц, ковалентно связанных с основной цепью полипептидной цепи. Полисахаридные группы протеогликанов ранее назывались мукополисахаридами, но теперь предпочтительным является название гликозаминогликан (ГАГ), поскольку все они содержат производные глюкозамина или галактозамина. В настоящее время известно шесть основных классов ГАГ: гиалуроновая кислота, хондроитин-4-сульфат (CSA), хондроитин-6-сульфат (CSC), дерматансульфат (CSB), кератансульфат и гепарансульфат (HS).

Небольшие количества сахара (ксилозы), кроме тех, которые составляют повторяющиеся единицы сахаров амино и уроновой кислоты, обнаружены в некоторых протеогликанах, таких как CS и HS; они расположены в областях связывания, соединяющих полисахаридные цепи с пептидным фрагментом основного белка. Разложение полисахаридных цепей осуществляется гиалуронидазой и β-глюкуронидазой. Гиалуронидаза действует на гиалуроновую кислоту и хондроитинсульфат с образованием тетрасахаридов. β-Глюкуронидаза осуществляет дальнейший катаболизм тетрасахаридов.Помимо тетрасахаридов, его субстраты включают дерматансульфат, гепарансульфат, хондроитинсульфат и гиалуроновую кислоту. В случаях наследственной недостаточности β-глюкуронидазы у человека соединения дерматансульфата, гепарансульфата и хондроитинсульфата выделяются с мочой.

Материалы и методы

ПАЦИЕНТОВ

Критерии включения были следующими: (i) дети с двусторонней тотальной мягкой катарактой; (ii) катаракта, которая является врожденной или возникшей; (iii) возрастная группа от рождения до 12 лет; (iv) взяты представители обоих полов; (v) дети без галактоземии; (vi) скрининговые тесты на краснуху, цитомегаловирус, токсоплазму, Treponema pallidum и вирус простого герпеса (ВПГ) дали отрицательный результат.

Критериями исключения были: (i) случаи с известной или предполагаемой причиной катаракты, например, травмы или лекарства; (ii) случаи врожденных проблем со зрением, таких как гомоцистинурия, спиральная атрофия и синдром Марфана.

Контрольные группы были нормальными как физически, так и офтальмологически. Они были детьми посоха Шанкары Нетралая. В исследуемой группе образцы мочи и крови были проанализированы натощак задолго до операции (по крайней мере, за 1 неделю до операции). Аспират хрусталика собирали во время линзэктомии.В опытной и контрольной группах образцы крови и мочи собирали натощак. Протокол исследования был одобрен комитетом исследовательской группы Vision Research Foundation и исследовательским подкомитетом внешних экспертов.

Ксилоза, хондроитинсульфат, гепарансульфат, глюкоза, галактоза и другие химические вещества тонкой очистки для стандартов были от Sigma Chemical Company, США. Все остальные химические вещества и растворители были аналитической чистоты.

ТЕСТЫ НА ВНУТРЕННИЕ ОШИБКИ МЕТАБОЛИЗМА

Образцы свежей мочи центрифугировали и анализировали на врожденные нарушения метаболизма следующим образом: динитрофенилгидразиновый тест на альфа-кетокислоты; цианид-нитропруссид тест на гомоцистин и цистин; тест на хлорид железа на фенилпировиноградную кислоту; Тест Миллона на тирозин, 7 тест Молиша на углеводы, 8 и тест Бенедикта на снижение сахара.Образцы мочи также проверялись на билирубин и белки, чтобы исключить дисфункцию печени или почек.

БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Это было выполнено с использованием фильтровальной бумаги Whatman № 1 и н-бутанол: уксусная кислота: вода в качестве подвижной фазы в соотношении 4: 1: 1. Бумагу после пробега в течение ночи сушили на воздухе и окрашивали гидроксалатом анилина (0,9 мл дистиллированного анилина в 100 мМ щавелевой кислоте). Окрашенную бумагу выдерживали в сушильном шкафу с горячим воздухом при 90 ° C в течение 15 минут. Розовое пятно с тем же R _f , что и стандартная ксилоза, показало присутствие ксилозы.9

ОЦЕНКА ГАГА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЕЙ

Это было сделано с использованием метода Gold10 с микрограммами GAG после образования растворимых комплексов с красителем альциановым синим. Метод основан на различных спектрах поглощения красителя и комплекса краситель-ГАГ. Образцы объемом 0,1 мл смешивали с 1,2 мл свежеприготовленного раствора красителя альцианового синего (1,4 мг / мл в 0,5 М ацетате натрия) и измеряли оптическую плотность при 480 нм. Для количественного определения использовали стандартную кривую с использованием 5–60 мкг хондроитинсульфата.

ИСПЫТАНИЕ НА БРОМИД ЦЕТИЛ ТРИМЕТИЛ АММОНИЯ

Пять мл свежей мочи добавляли к 1 мл раствора цетилтриметиламмонийбромида (цетавилон) (50 г / л в цитратном буфере (1 M) с pH 6,0). Тяжелый осадок указывал на присутствие мукополисахаридов.11 Хотя 47 детей в контрольной группе выделяли мочу с отрицательным результатом теста Молиша, все же считалось желательным выяснить, имел ли место ненормальный метаболизм протеогликана, поскольку низкие уровни ГАГ не могут быть обнаружены с помощью тест Молиша.Таким образом, вместе с детьми тестовой группы также были изучены 50 контрольных.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ФРАГМЕНТОВ ЗАБОРКИ

Образцы мочи центрифугировали, и 25–50 мкл прозрачного супернатанта наносили на клин полоски на площади 1 см. Электрофорез выполняли в течение 1 часа при 10 В / см с 0,15 М ацетатом цинка в качестве буфера. После электрофореза полоски окрашивали 0,25% альциановым синим в метаноле, уксусной кислоте, воде (50: 5: 45) и для обесцвечивания использовали 5% уксусную кислоту.Стандартные хондроитинсульфат и гепарансульфат по 2,5 мкг в 25 мкл также подвергали электрофорезу аналогичным образом12.

КОЛОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КАТИОНООБМЕННОЙ СМОЛЫ AMBERLITE IR 120

Стеклянная колонка 10 × 2 дюйма была заполнена смолой Amberlite IR 120, промыта и уравновешена деионизированной водой. Через смолу медленно пропускали пять мл центрифугированной прозрачной мочи. Фракции по 3 мл собирали и анализировали с помощью бумажной хроматографии на присутствие ГАГ и свободной ксилозы.Одна из фракций показала только одно розовое пятно с R _f , соответствующее стандартной ксилозе в хроматографии. Эту фракцию дополнительно анализировали с помощью орцинолового теста Биала, специфичного для пентоз. Для этого аликвоту той же фракции обрабатывали реактивом орцинола (0,3% в HCl) в присутствии хлорида железа. Он давал зеленый цвет, показывая присутствие пентозы, которая была идентифицирована как ксилоза с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

АНАЛИЗ ВЭЖХ

ЛКБ 4.0 × 250 нм, Spherisorb ODS2,5 мкм. Колонку с октадецилсиланом с дистиллированной водой для ВЭЖХ в качестве подвижной фазы использовали со скоростью потока 1 мл / мин и детектированием при 188 нм, УФ 0,02AUFS.13 Объем 250 мкл фракции колоночной хроматографии, которая была положительной для орцинола Биала. тест вводили через колонку. Его элюировали через 9 минут. Стандартная ксилоза (Sigma) также имела такое же время удерживания.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭКСТРАКТА ФЕРМЕНТОВ

Лимфоциты собирали из 5 мл гепаринизированной крови по методу Бергера 14 и выращивали в течение 72 часов в минимальной основной среде с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и фитогемагглютинина.Собранные клетки обрабатывали ультразвуком при 60 килоциклах в течение 30 секунд для экстракции фермента.

АНАЛИЗ ФЕРМЕНТОВ

Этот анализ является модификацией метода Kawai и Anno.15 Реакционная смесь содержала 0,4 мкМ p -нитрофенил-β-d-глюкуронид и фермент в ацетатном буфере при pH 4,5, инкубированную при 37 ° C в течение 1 часа. В конце этого периода ферментативная реакция была остановлена ​​добавлением глицинового буфера (pH 10,7). Количество высвободившегося p -нитрофенола определяли с использованием спектрофотометра Beckman DU 640 при 400 нм.Содержание белка в экстракте фермента определяли методом Lowry et al. .16. Активность фермента выражали в нМ высвобожденного нитрофенола / мг белка.

ОЦЕНКА β-ГЛЮКУРОНИДАЗЫ В МОЧЕ

Случайный образец собирали в стерильный контейнер, и ферментативную активность определяли, как указано выше, для лимфоцитов с мочой вместо ферментного экстракта. Содержание креатинина в моче определяли методом Боннеса и Таусского [17]. Активность фермента выражали в нМ высвобожденного нитрофенола / мг креатинина, выведенного с мочой.

Результаты

Двести двадцать детей с врожденной или младенческой катарактой и 50 детей контрольной группы были обследованы на предмет врожденных нарушений метаболизма в течение 2 лет. Сто сорок восемь детей из группы катаракты и три контрольной группы показали положительную реакцию на тест Молиша. Трое детей из контрольной группы с положительной реакцией Молиша также показали положительные тесты Бенедикта. В моче была лактоза. Это было подтверждено бумажной хроматографией.Ни в одном из них не было фрагментов галактозы, ксилозы или ГАГ.

Среди 148 детей с катарактой, показавших положительный результат теста Молиша в моче, восемь также оказались положительными по Бенедикту. В этой группе из восьми человек трое имели галактоземию, а пять показали присутствие лактозы вместе с фрагментами ГАГ. По всем 145 случаям (таблица 1) было проведено дополнительное расследование.

Скрининговый тест на мукополисахариды; тест на цетилтриметиламмонийбромид в моче детей с врожденной или младенческой катарактой

Результаты спектрофотометрического определения общего ГАГ приведены в таблице 2.В значительном числе (84) случаев обнаружен повышенный уровень (101–500 мкг / мл) ГАГ в моче. Типичная бумажная хроматограмма мочи детей с катарактой, изученных на углеводы, показана на рисунке 1. Наряду с фрагментами ГАГ у них также была свободная ксилоза в моче. В восьми из 145 хроматографически обнаруженных ксилозоположительных случаев количество ксилозы было достаточно высоким, чтобы дать положительный результат теста Бенедикта. Образцы сыворотки показали ступенчатые коричневые пятна. Хотя гомогенат хрусталика этих детей показал фрагменты ГАГ в значительном количестве случаев, пятно ксилозы не было заметным.Однако, когда хроматография проводилась после окисления гомогената линзы разбавленным перманганатом калия, пятно ксилозы было четко идентифицировано (рис. 2).

Спектрофотометрическая оценка общих гликозаминогликанов (ГАГ) в моче детей с врожденной или младенческой катарактой

Бумажная хроматограмма, показывающая присутствие фрагментов ксилозы и гликозаминогликанов в образцах мочи детей с врожденной катарактой. (a, b, c) — три различных репрезентативных случая врожденной катаракты, а (d) — стандартная ксилоза.

Бумажная хроматограмма, показывающая присутствие ксилозы из ксилита в аспирате хрусталика детей с врожденной катарактой. (а) Стандартная ксилоза, (б) аспират хрусталика ребенка с врожденной катарактой после окисления перманганатом калия, (в) образец сыворотки крови ребенка с врожденной катарактой.

Типичная электрофореграмма ГАГ показана на рисунке 3. Очень значимое число, то есть 80% положительных по Молишу случаев, показало наличие двух дуг, одна в области CS, а другая — в области гепарансульфата.Все 50 образцов мочи из контрольной группы также были подвергнуты электрофорезу, и ни один не показал никаких дуг для гетерополисахаридов.

Электрофоретический профиль стандартного ГАГ, мочи детей с нормальной и врожденной катарактой. (a) Стандартный ГАГ (HS, гепарансульфат), (b) Стандартный ГАГ (CS, хондроитинсульфат), (c) и (d) два репрезентативных образца мочи детей с врожденной катарактой, показывающие присутствие фрагментов GAG, (e) моча нормальная, фрагментов ГАГ не обнаружено.

В ионообменной хроматографии за элюированием следовал анализ фракций на сахара. Одна из фракций показала только одно розовое пятно при бумажной хроматографии, и эта фракция была положительной при тесте на орцинол Биала, что подтвердило присутствие пентозы. Его также подвергали ВЭЖХ. Условия поддерживались, как указано в разделе методов. Аналогичным образом обрабатывали и стандартную ксилозу. Время удерживания как для стандарта, так и для теста было одинаковым — 9 минут (рис. 4).

Профиль элюирования ВЭЖХ. (а) Стандартная ксилоза, (б) фракция ионообменной хроматографии, которая показала единственное розовое пятно на бумажной хроматографии при окрашивании на сахар. И образец, и стандарт показали одинаковый пик со временем удерживания 9,0 минут.

Средние значения активности β-глюкуронидазы в лимфоцитах (таблица 3) были следующими: пораженные дети до 3 лет — 40; от 3 лет и до 12 лет — 50; в контрольной группе до 3 лет — 6; старше 3 лет и младше 12 лет — 7; в моче (таблица 4) детей до 3 лет с катарактой — 30; и старше 3 лет и младше 12 лет, 22.5; в контрольной группе до 3 лет — 9; и старше 3 лет и младше 12 лет — 13. Для статистического анализа применялся критерий суммы рангов Манна – Уитни – Уилкоксона. Результаты значимы, как указано в значениях p.

Активность β-глюкуронидазы в лимфоцитах, нМ выделенного нитрофенола / мг белка (катаракта v некатаракта)

Активность β-глюкуронидазы в моче, нМ выделенного нитрофенола / мг креатинина (катаракта v некатаракта)

Обсуждение

Кислотный мукополисахаридоз связан с деформациями костей, умственной отсталостью, лицевым дисморфизмом и гепатоспленомегалией.У некоторых пациентов было помутнение роговицы, но не катаракта. Один случай мукополисахаридоза I типа, переданный нам педиатрическим отделением детской больницы в Мадрасе, имел костные изменения, выделение фрагментов ГАГ с мочой и определенное помутнение хрусталика с передней субкапсулярной катарактой. Это был случай детской катаракты. Врожденная катаракта связана с синдромом Марфана с выделением ГАГ. В нашей тестовой группе детей не было синдрома Марфана, так как они не выделяли гидроксипролин, аминокислоту, уникальную для коллагеновых заболеваний, и не имели других глазных проявлений, таких как эктопия lentis, которая наблюдается у пациентов с синдромом Марфана.18

Гиалуронидаза действует на гиалуроновую кислоту, гепарансульфат и хондроитинсульфат с образованием тетрасахаридов. Эти тетрасахариды далее разлагаются β-глюкуронидазой, экзогликозидазой, которая гидролитически удаляет глюкуроновую кислоту из тетрасахаридов19 и локализуется в лизосомах и микросомах. Его субстраты включают тетрамеры дерматансульфата, гепарансульфата, хондроитинсульфата и гиалуроновой кислоты и соответствующих гетерополисахаридов. При наследственной недостаточности β-глюкуронидазы продукты деградации дерматансульфата, гепарансульфата и хондроитинсульфата выводятся с мочой.Электрофоретическая картина показала присутствие фрагментов CS и HS, но не гиалуроновой кислоты. Только эти полисахариды имеют ксилозу, присоединенную к серину основного белка протеогликана. Таким образом, экскреция этих фрагментов и ксилозы с мочой свидетельствует о дефиците β-глюкуронидазы у этих детей. Однако, вопреки нашим ожиданиям, наши результаты показали значительное повышение активности фермента. Следовательно, кажется, что гетерополисахариды могут подвергаться экстенсивному гидролизу β-глюкуронидазой с высвобождением их фрагментов в кровь и мочу.В отсутствие какой-либо возможной микробной инфекции повышенные уровни активности β-глюкуронидазы нельзя было объяснить иначе, как генетической ошибкой. Молекулярный скрининг генетической мутации ДНК, кодирующей этот фермент, может дать некоторое представление об этой проблеме.

Повышение активности фермента при врожденной ошибке метаболизма встречается редко, и, следовательно, наблюдаемое повышение уровня β-глюкуронидазы может быть вторичным по отношению к реальной аномалии у детей этой группы.

Из-за своей относительно небольшой молекулярной массы и анионной природы фрагменты GAG могут проникать в линзу и выделять ионы Na ⁺ , а также воду, вызывая помутнение линзы в результате чрезмерной гидратации.Ксилоза, присутствующая в хрусталике в виде ксилита, также может способствовать катарактогенезу. Сообщалось, что скармливание животным ксилозы вызывает катаракту так же, как и галактоземия из галактозы при галактоземии.

Таким образом, молекулярный механизм врожденной или детской катаракты с нарушенным метаболизмом протеогликанов, по-видимому, связан с накоплением ксилита из фрагментов ксилозы и фрагментов ГАГ в хрусталике.

В то время как 145 из 220 детей имели врожденную или младенческую катаракту с нарушением метаболизма протеогликанов, только у трех была галактозурия.Лактоза, выделяемая с мочой у нормальных детей, может иметь физиологический характер, поскольку у некоторых детей наблюдается лактозурия.

Исследование предлагает ценные генетические консультации. Если дети страдают галактоземической катарактой, им следует избегать молока и молочных продуктов, поскольку галактоза из лактозы, накапливающаяся в их крови, вызовет цирроз печени, панкреатит и т. Д., Но дети с врожденной катарактой из-за фрагментов ГАГ и ксилозы могут употреблять молоко без ограничений. Таким образом, это открытие имеет значение для местной офтальмологии и является ценным посланием для общественности.

Капиллярный электрофорез для скрининга и диагностики наследственных нарушений гемоглобина. Готовы к прайм-тайму?

Наследственные нарушения гемоглобина (Hb), также известные как гемоглобинопатии, условно классифицируются на две основные категории, которые влекут за собой структурные варианты гемоглобина (т.е. качественные или функциональные нарушения) и талассемии (т.е. количественные нарушения, характеризующиеся дефектным продуцированием глобина). Согласно последним статистическим данным, примерно 7% населения мира имеют наследственное нарушение гемоглобина, и ежегодно до 500 000 детей рождаются с тяжелыми формами этих состояний [1].Наследственные нарушения гемоглобина характерны для тропиков и субтропиков, но их распространенность в настоящее время постоянно увеличивается во всем мире из-за миграции [2]. Следовательно, предсказуемо, что диагностика и лечение наследственных нарушений гемоглобина будут экспоненциально расти во всем мире, особенно в некоторых странах южного Средиземноморья (например, Италия, Греция и Испания), из-за того, что гражданские войны и репрессивные режимы в Ближний Восток и Африка вынудили все большее число людей отправиться в опасное путешествие в Европу.

В соответствии с руководящими принципами Британского комитета по стандартам в гематологии выбор методологии и оборудования для диагностики наследственных нарушений гемоглобина должен основываться на сбалансированной комбинации рабочей нагрузки, биологического материала (например, крови или засохших пятен крови), аналитические характеристики, доступность оборудования и персонала на местах, опыт и затраты [3]. Хотя текущий арсенал для скрининга и диагностики гемоглобинопатий включает в себя множество методов, таких как электрофорез с ацетатом целлюлозы (CAE), изоэлектрическое фокусирование (IEF), жидкостная хроматография низкого давления (LPLC), высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC), тандемная масс-спектрометрия. спектрометрии (МС / МС), электрофореза капиллярной зоны (CZE) и даже генетического анализа Комитет пришел к выводу, что МС / МС и КЭ могут быть подходящей альтернативой ВЭЖХ при условии, что приемлемые аналитические и клинические характеристики могут быть полностью продемонстрированы.Спустя пять лет после публикации этих общепринятых рекомендаций накопились надежные доказательства того, что CZE может быть точным инструментом для скрининга и диагностики нарушений гемоглобина. В этом выпуске журнала мы публикуем два исследования, которые существенно подтверждают это предположение.

В предыдущей статье You-Qiong et al. проанализировали 15 образцов (13 образцов крови взрослых и 2 образца пуповинной крови) пациентов, гетерозиготных по Hb New York, с помощью методов CZE и HPLC [4]. Интересно, что все случаи могут быть диагностированы с помощью CZE, тогда как ни один из них не может быть обнаружен с помощью ВЭЖХ, поскольку вариант не может быть отделен от HbA с помощью местного оборудования.Хотя оптимальная эффективность CZE для скрининга и диагностики нарушений гемоглобина недавно была подтверждена в других исследованиях [5], потенциальные преимущества этого метода выходят за рамки аналитической области. Одним из основных недостатков большинства коммерческих анализаторов ВЭЖХ является проблема точного измерения HbA _1c у пациентов с гемоглобинопатией, особенно при наличии распространенных вариантов Hb, таких как HbC, HbS или значения HbF> 10-15% [ 6].Тем не менее, два недавних исследования, опубликованные в предыдущем номере этого журнала, убедительно показали, что этот недостаток может быть хотя бы частично преодолен CZE. Ji et al. измерили HbA _1c в образцах крови пациентов с различными нарушениями гемоглобина и пришли к выводу, что талассемия, HbE, HbG Coushatta, HbG Taipei и Hb Kaohsiung усложняют обнаружение HbA _1c , тогда как гликированный Hb можно точно измерить с помощью CZE [7 ]. Что касается других распространенных вариантов гемоглобина, то в другом исследовании Weykamp et al.оценили аналитическое влияние HbS, HbC, HbD, HbE, HbJ и HbG на точность HbA _1c [8], а также пришли к выводу, что гликированный гемоглобин можно надежно измерить с помощью CZE.

Во второй статье, опубликованной в этом выпуске журнала, Pornprasert и др. Разработали специальные материалы по контролю качества для анализа некоторых форм талассемии и вариантов гемоглобина, которые обычно наблюдаются в Юго-Восточной Азии [9]. Интересно, что контрольные материалы по типированию гемоглобина могут быть сохранены и затем точно проанализированы с помощью многих коммерчески доступных методов, включая ВЭЖХ и CZE, что представляет собой ценный ресурс для внутреннего и внешнего контроля качества диагностики гемоглобинопатий.

В настоящее время использование CZE стало обычным явлением в клинических лабораториях из-за универсальности этого метода для проведения электрофореза белков [10, 11] и иммунотипирования [12], а также для измерения HbA _1c [13] или углеводно-дефицитный трансферрин (CDT) [14]. Несмотря на то, что использование CZE имеет несколько практических преимуществ, таких как положительная идентификация образца, прокалывание крышки и возможность смешивания образцов на борту, отсутствие некоторых ручных операций и сокращение времени оборачиваемости, а также высокая производительность и воспроизводимость [15], некоторые технические проблемы по-прежнему мешают его точности, которые обычно включают в себя ложно завышенные значения HbA ₂ у пациентов с HbC или завышенные значения HbF у пациентов с HbS [16], а также различный характер миграции большинства вариантов Hb, который заставит лабораторных специалистов пересмотреть и обновить свою обычную практику интерпретации хроматограмм и электрофореграмм.Несмотря на эти ограничения, сейчас кажется разумным предположить, что CZE может быть готов в самое лучшее время для скрининга и диагностики нарушений гемоглобина.

Автор, ответственный за переписку: проф. Джузеппе Липпи, Лаборатория клинической химии и гематологии, Академическая больница Пармы, Via Gramsci 14, 43126 Parma, Италия, E-mail: [email protected]; [email protected].

Справочные материалы

1. Везералл Д., Акиньянджу О., Фухароен С., Оливьери Н., Масгроув П. Унаследованные нарушения гемоглобина.В: Jamison DT, Breman JG, Measham AR, Alleyne G, Claeson M, Evans DB и др., Редакторы. Приоритеты борьбы с болезнями в развивающихся странах, 2-е изд. Вашингтон (округ Колумбия): Всемирный банк, 2006. Глава 34. Поиск в Google Scholar

2. Липпи Дж., Монтаньяна М., Данезе Э., Сальваньо Г.Л., Беллорио Ф., Франкини М. и др. Частота и тип впервые выявленных вариантов гемоглобина в Северной Италии. Переливание крови 2010; 8: 307–8. Поиск в Google Scholar

3. Райан К., Бэйн Б.Дж., Уортингтон Д., Джеймс Дж., Плевс Д., Мейсон А. и др .; Британский комитет стандартов в гематологии.Значительные гемоглобинопатии: рекомендации по скринингу и диагностике. Br J Haematol 2010; 149: 35–49. Искать в Google Scholar

4. You-Qiong L, Hui-Ping H, Zhi-Zhong C, Lin Z, Liang L, Gui-Fang Q, et al. Сравнение капиллярного электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для обнаружения и количественного определения гемоглобина Нью-Йорк. Clin Chem Lab Med 2016; 54: 91–5. Поиск в Google Scholar

5. Ойарт М., Ван Лаер С., Клаерхаут Х, Вермеерш П., Десмет К., Пауэлс С. и др.Оценка капиллярного электрофореза Sebia Minicap flex для тестирования гемоглобинопатии. Int J Lab Hematol 2015; 37: 420–5. Поиск в Google Scholar

6. Национальная программа стандартизации гликогемоглобина (NGSP). Факторы, влияющие на результаты теста HbA1c. Доступно по адресу: http://www.ngsp.org/factors.asp. По состоянию на 7 июня 2015 г. Поиск в Google Scholar

7. Ji L, Yu J, Zhou Y, Xia Y, Xu A, Li W, et al. Ошибочные измерения HbA1c при наличии β-талассемии и распространенных вариантов китайского гемоглобина.Clin Chem Lab Med 2015; 53: 1451–8. Искать в Google Scholar

8. Weykamp C, Kemna E, Leppink S, Siebelder C. Скорость гликирования гемоглобинов S, C, D, E, J и G, а также аналитическое влияние на измерение HbA1c с помощью аффинной хроматографии и капиллярного электрофореза . Clin Chem Lab Med 2015; 53: e207–10. Искать в Google Scholar

9. Pornprasert S, Tookjai M, Punyamung M, Pongpunyayuen P, Jaiping K. Разработка контрольных материалов для типирования гемоглобина для лабораторных исследований талассемии и гемоглобинопатий.Clin Chem Lab Med 2016; 54: 81–9. Искать в Google Scholar

10. Боссайт X, Лиссоир Б., Мариен Дж., Майзин Д., Вунккс Дж., Бланкарт Н. и др. Автоматический электрофорез белков сыворотки крови по капиллярам. Clin Chem Lab Med 2003; 41: 704–10. Искать в Google Scholar

11. Липпи Г., Баттистелли Л., Вернокки А., Муссап М. Аналитическая оценка новой системы капиллярного электрофореза Helena V8. J Med Biochem 2013; 32: 245–9. Искать в Google Scholar

12. Барлоу И.М., Кемп М.Л. Оценка системы электрофореза зоны Sebia Capillarys для анализа моноклональных парапротеинов.Br J Biomed Sci 2010; 67: 150–3. Искать в Google Scholar

13. Маринова М., Алтиниер С., Калдини А., Пассерини Дж., Пиццагалли Дж., Броги М. и др. Многоцентровая оценка анализа гемоглобина A1c на капиллярном электрофорезе. Clin Chim Acta 2013; 424: 207–11. Искать в Google Scholar

14. Дейвс М., Семин Р., Флореани М., Пусседду И., Косио Дж., Липпи Г. Сравнительная оценка электрофореза капиллярной зоны и ВЭЖХ при определении трансферрина с дефицитом углеводов. Clin Chem Lab Med 2011; 49: 1677–80.Искать в Google Scholar

15. Алтиниер С., Варагноло М., Занинотто М., Плебани М. Идентификация и количественное определение гемоглобинов в цельной крови: аналитические и организационные аспекты пирсинга Capillarys 2 Flex по сравнению с электрофорезом в агарозе и методами ВЭЖХ. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 791–7. Искать в Google Scholar

16. Грин Д. Н., Вон С. П., Экипаж Б. О., Агарвал А. М.. Успехи в выявлении гемоглобинопатий. Clin Chim Acta 2015; 439: 50–7. Поиск в Google Scholar

Опубликован в Интернете: 2015-8-1

Опубликован в печатном виде: 2016-1-1

Исследовательские статьи, журналы, авторы, подписчики, издатели