БЦЖ расшифровка
Что такое БЦЖ и зачем ее делать своему новорожденному малышу в большей мере интересует молодых мамочек. Ведь они дают свое согласие на то, чтобы их крохе в первые же часы его жизни была сделана прививка от туберкулеза.
История вопроса
В русской литературе XIX литераторы при помощи тогда еще неизвестной палочки Коха умертвили множество вполне положительных персонажей. Все они погибли от грудной жабы или чахотки, болезни, которую в XX веке уже знали как туберкулез.
Возбудителя обнаружил немецкий микробиолог Роберт Кох в 1882 г. Бактерию назвали в его честь бациллой Коха. Но выявление возбудителя никак не отразилось на ходе войны с недугом: люди по-прежнему гибли, действенного лекарства не существовало.
В 1923 г. французские ученые А. Кальметт и Ш. Герен смогли создать противотуберкулезную вакцину. Новая культура была названа: бацилла Кальметта — Герена. Ее международное наименование — Bacillus Calmette—Guérin. Получилась аббревиатура — BCG, а русифицированный вариант – БЦЖ не расшифровывается. По факту это буквальное переложение сокращения медицинского термина, принятого международным сообществом врачей.
Французские ученые после 10 лет экспериментов смогли добиться того, что:
- появилась возможность хранить палочку Коха во внешней среде;
- полученный препарат вызывал болезнь в той слабой степени, чтобы человек заболел, но ему не было причинено никакого вреда.
Впервые прививка была введена в 1923 г. в институте Пастера (Франция). Тогда ее могли делать только через рот. Первые опыты вакцинирования были неудачными и вызывали осложнения.
В СССР массово прививка ставилась с 1962 г. До этого – и в довоенный период – она была доступна только жителям крупных городов.
Вакцинация новорожденных
Сегодня детям прививка БЦЖ ставится внутрикожно, что необходимо для локального развития туберкулезного процесса, который не опасен для общего состояния. В ответ на введение минимальной дозы микобактерий туберкулеза организм малыша вырабатывает антитела.
Зачем прививка ставится новорожденным еще в роддоме? Заражение туберкулезом происходит воздушно-капельным путем. Для ребенка достаточно, чтобы больной просто дыхнул на него.
Полноценный иммунитет против туберкулеза формируется в течение года. О том насколько прививка оказалась эффективна, свидетельствует наличие рубца и его величина: чем больший след на коже ребенка он оставил, тем более надежную систему защиты выработал организм.
Ревакцинация
Зачем делать ревакцинацию? Иммунитет, сформированный после первичного введения препарата, сохраняется в течение 5 лет. Для его поддержания требуется делать ревакцинацию. Повторно прививка ставится в возрасте 7 и 14 лет. В ходе исследований доказано, что делать ревакцинацию в дальнейшем нецелесообразно.
Контроль за способностью организма сопротивляться коварной бактерии осуществляется через пробу Манту. Это не прививка, и ее следует делать ежегодно.
Резюме
Нужна ли прививка БЦЖ ребенку, и стоит ли ее делать, решают родители. Противотуберкулезная вакцинация, как и все прочие медицинские манипуляции, имеет противопоказания, возможны осложнения. Важно разумно подойти к решению данного вопроса, оценив все сопутствующие риски.
возможные последствия, возможные осложнения, противопоказания
Туберкулёз – опаснейшее инфекционное заболевание, возбудителем которого является Mycobacterium tuberculosis, или микобактерия туберкулёза. Развивается болезнь стремительно, имеет массу последствий и осложнений, оставляя отпечаток на организме на всю жизнь. К сожалению, как и множество прочих, заболевание легче предотвратить, чем купировать возникшее заражение. На сегодняшний день единственным методом профилактики туберкулёза является БЦЖ-прививка. Последствия, осложнения и противопоказания — в статье.
Расшифровка вакцины БЦЖ
Что обозначает аббревиатура БЦЖ? Расшифровка латинского названия BCG истолковывается как bacillus Calmette–Guerin. В переводе на русский это означает «бацилла Кальметта-Герена». Таким образом, вовсе не сокращение аббревиатура БЦЖ. Расшифровка эта — прямое прочтение латинского сокращения, написанного кириллицей.
Вакцина БЦЖ: что это?
Вакцина БЦЖ – это взвесь ослабленной микобактерии бычьего вида с потерей вирулентности для человека. Существует две разновидности:
- БЦЖ – содержание Mycobacterium tuberculosis в составе вакцины слишком мало, чтобы вызвать заражение. Однако такого количества хватает, чтобы организм смог выработать иммунитет против опасного заболевания. Во всех странах, независимо от производителя, состав вакцины один и тот же. Именно поэтому нецелесообразно устраивать «гонку» за иностранной продукцией по личному убеждению, что она лучше отечественной.
- БЦЖ-М – благодаря пониженному содержанию микробных тел (в два раза меньше, чем в обычной вакцине БЦЖ), ею вакцинируют против туберкулёза недоношенных, ослабленных детей. Кроме того, если ребёнка по какой-либо причине «упустили из виду» в роддоме и не ввели вакцину в срок, в стационарах применяется именно БЦЖ-М.
Так ли нужна прививка?
Ни для кого не секрет, что вакцина не даёт 100% гарантии, что впоследствии заражение туберкулёзом не произойдёт. Так тогда для чего она нужна, спросите вы. Дело в том, что БЦЖ вырабатывает противотуберкулёзный иммунитет, способный оказывать мощную защиту при первичном инфицировании, а также при возможных последующих контактах с переносчиками туберкулёзной инфекции. Если же организм всё-таки окажется слабее болезни, то вакцина предотвратит развитие особо тяжёлых, генирализованных форм туберкулёза (диссеминированной и милиарной формы). Таким образом, не обеспечивая полной защиты от инфекции, прививка несколько облегчит течение болезни в случае заражения.
Кому рекомендована вакцинация БЦЖ?
Вакцинация рекомендована категориям людей:
- Новорожденные. Всем детям БЦЖ в год уже должна быть привита. Особенно в регионах с высокой распространённостью туберкулёза.
- Лица, постоянно контактирующие с заражёнными туберкулёзом (обычно медперсонал тубдиспанцеров и пр.).
В каком возрасте проводится вакцинация БЦЖ?
БЦЖ когда делают? Первичную вакцинацию принято проводить здоровому новорожденному ребёнку на 3-7 дне жизни. Предварительно врач обязательно должен осмотреть ребёнка, провести термометрию (при повышенной температуре тела процедура противопоказана), учесть данные анамнеза и все возможные противопоказания. Помимо этого, прививки БЦЖ детям осуществляются только после консультации у врача-специалиста с готовыми результатами исследований крови и мочи.
Вакцину следует вводить внутрикожно, в наружную поверхность левого плеча, доза не должна превышать 0,05 мг. Техника выполнения процедуры предполагает постепенное введение — для того, чтобы убедиться, что игла вошла под нужным углом. Если всё выполнено правильно, то на месте укола образуется папула диаметром в 7-9 миллиметров, белого цвета, обычно исчезающая через 15-20 минут после процедуры.
Дети, которые по той или иной причине не были привиты в роддоме, подвергаются вакцинации при первой же возможности. Если же с момента рождения прошло более двух месяцев, то перед прививкой обязательно проводится реакция Манту. При положительном результате БЦЖ проводить запрещается.
В медицинскую карту новорожденного врач обязан сделать пометку о проведенной вакцинации с указанием даты прививки, серии и контрольного номера вакцины. Помимо этого, в историю вносится и срок годности введённого препарата, а также предприятие-изготовитель.
Важно! Место вакцины запрещено обрабатывать какими-либо растворами. Наложение повязок также не допускается.
К чему такая спешка?
Также у врачей часто спрашивают, почему так рано делают БЦЖ. Когда делают прививку, родители недоумевают, зачем новорожденного, ещё неокрепшего ребёнка на третьи сутки подвергают такому испытанию. Дело в том, что ситуация с туберкулёзом такова, что не все больные знают о своей проблеме, продолжают вести привычный образ жизни. Являясь переносчиками опасной инфекции, они беспрепятственно посещают общественные места, что вызывает большую угрозу, в особенности для маленького ребёнка. Риск встречи малыша с бактерией очень велик. Именно поэтому прививку проводят максимально рано, чтобы на момент выписки у ребёнка уже начал формироваться иммунитет к Mycobacterium tuberculosis.
Ревакцинация БЦЖ
Повторной вакцинации подлежат дети в возрасте 7 и 14 лет, но только при условии отрицательной реакции на пробу Манту. Интервал между Манту и ревакцинацией не должен превышать двух недель.
К сожалению, в эпидемиологически неблагоприятных регионах страны дети заражаются микобактерией задолго до первой ревакцинации, поэтому повторно БЦЖ они не подвергаются.
Какие процессы в организме происходят после БЦЖ?
В место введения вакцины немедленно начинают прибывать макрофаги (или моноциты – разновидность лейкоцитов), поглощающие микобактерию туберкулёза. Возбудитель заболевания погибает вместе с макрофагами, в результате чего происходит образование некротических казеозных масс. Выходя наружу, они провоцируют образование рубца на месте введения вакцины.
Реакция на БЦЖ
Реакцией является развитие папулы на месте укола, появляющейся обычно у новорожденных спустя 4-6 недель после вакцинации. На месте прививки должен образоваться рубчик, по размеру которого возможно судить о приобретённом противотуберкулёзном иммунитете. Так, если после БЦЖ образовался рубец размером 2-4 мм, то говорят, что организм привитого будет сопротивляться заболеванию в течение 3-5 лет. Если же размер в 5-7 мм – то организм под защитой в течение 5-7 лет, а при 8-10 мм — в течение 10 лет.
Обычно прививка переносится хорошо, но иногда наблюдается появление реакций:
- БЦЖ покраснела. Если покраснение не распространяется на окружающие ткани и наблюдается исключительно в период прививочной реакции, то это является нормой. В редких случаях помимо покраснения могут сформироваться припухлость и келоидный рубец. Поводов для беспокойства при этом быть не может: таким образом кожные покровы реагируют на препарат.
- БЦЖ гноится. Нагноение и нарывы – нормальная реакция на компоненты прививки, которая пройдёт в скором времени. Обратиться к врачу стоит, если помимо нагноения вокруг места вакцинации появилась краснота и отёчность: возможно, произошло инфицирование ранки, которое обязательно нужно лечить.
- БЦЖ воспалилась. Беспокоиться и обращаться к врачу стоит лишь в случае распространения отёка и воспаления на кожу плеча, за пределы места вакцинации.
- БЦЖ чешется. Зуд на месте укола – нормальное явление, однако врачи советуют наложить марлевую салфетку на ранку, чтобы сдерживать ребёнка от расчёсывания.
- Температура после БЦЖ. Повышение температуры тела у новорожденного до 38 градусов является нормой, а вот если у семилетнего ребёнка после ревакцинации наблюдается повышение температуры, следует немедленно обратиться к врачу.
О чём говорит отсутствие реакции?
Если после вакцинации на месте инъекции не образовался рубец, то это является признаком того, что вакцина оказалась неэффективной, ведь иммунитет к опаснейшему заболеванию не сформировался. Поводов для беспокойства в данном случае быть не должно: через некоторое время после получения отрицательной реакции на пробу Манту можно провести ревакцинацию, не дожидаясь 7-летнего возраста.
Отсутствие реакции на первую прививку встречается нечасто, наблюдается у 5-10% детей. Помимо этого, около 2% населения на планете имеют врождённый иммунитет к туберкулёзу. Это значит, что заболеть в течение жизни они в принципе не могут.
Противопоказания к вакцинации
Противопоказания БЦЖ не так обширны, к ним относятся:
- Масса тела новорожденного менее 2500 г (при 2-4 степени недоношенности).
- Острые заболевания либо период обострения хронических заболеваний. Вакцинацию в таком случае следует проводить только после полного излечения, когда клинические проявления болезни пройдут окончательно.
- Врожденный иммунодефицит.
- Наличие в семье новорожденного генерализованной инфекции БЦЖ.
- ВИЧ-инфицирование матери.
- Лейкемия.
- Лимфома.
- Терапия подавляющими иммунитет препаратами.
Противопоказания к ревакцинации
Противопоказаниями к ревакцинации являются:
- Обострение хронических заболеваний либо любые острые заболевания на момент вакцинации БЦЖ. Температура тела (повышенная) является серьёзным аргументом для переноса прививки. Обычно ревакцинацию проводят спустя месяц после выздоровления.
- Злокачественные новообразования.
- Состояние иммунодефицита.
- Туберкулёз (в том числе на стадии выздоровления).
- Положительная реакция на пробу Манту.
- Осложнения после первичной вакцинации.
Лица, временно освобождённые от вакцинации по причине наличия противопоказаний, должны находиться под наблюдением и учётом медицинского персонала до полного выздоровления и прививания. Лица, подвергшиеся ревакцинации, также находятся под наблюдением и должны явиться на проверку прививочной реакции спустя 1, 3, 6, 12 месяцев после процедуры.
Что включает проверка прививочной реакции?
Такая проверка проводится спустя 1-3 месяца, полгода и через год после вакцинации и ревакцинации, она включает в себя:
- Регистрацию размера местной реакции.
- Регистрацию характера реакции (оценивается, произошло ли образование папулы, пустулы с корочкой или рубчика). Помимо этого, проверяется пигментация в месте прививки.
Прививка БЦЖ: осложнения возможны?
Действительно ли вакцина полностью безопасна? Имеет ли осложнения БЦЖ-прививка? Последствия могут проявиться в виде:
- Остеит – туберкулёз кости. Развитие заболевания обычно происходит спустя 0,5-2 года после вакцинации, оно вызывает серьёзнейшие нарушения иммунной системы.
- Генерализованная инфекция БЦЖ – формируется при наличии у ребёнка врождённых иммунных нарушениях.
- Воспаление лимфоузла – требуется немедленное оперативное вмешательство, если происходит резкое увеличение лимфоузла в размерах (более 1 см в диаметре).
- Холодный абсцесс – требует хирургического вмешательства. Такое явление является следствием подкожного (вместо внутрикожного) введения вакцины БЦЖ. Прививка, последствия которой таковы, была проведена неграмотно.
- Келоидный рубец – представляет из себя красную, набухшую кожу в месте прививки. При наличии рубца ревакцинацию в семилетнем возрасте не проводят.
- Обширная язва говорит о высокой чувствительности ребёнка на компоненты препарата. Обычно назначается местное лечение.
Совместимость с другими прививками
БЦЖ является специфической вакциной, одновременное применение с которой других препаратов недопустимо. Кроме того, не разрешается проводить дополнительную вакцинацию не только в день постановки БЦЖ, но и на протяжении 4-6 недель после, в период возникновения реакций на препарат. После инъекции БЦЖ до любой другой прививки должно пройти как минимум 35-45 суток.
До вакцинации БЦЖ допускается прививание ребёнка от гепатита В. Единственным условием является период иммунологического покоя, то есть до возраста в 3 месяца малышу противопоказаны любые прививки.
Уход за ребёнком после БЦЖ
Обычно каких-либо последствий после прививки не возникает, однако для «перестраховки» следует кое-что предпринять:
- Во-первых, рацион ребёнка должен остаться прежним. После вакцинации у малыша может наблюдаться жидкий стул, повышение температуры тела, а также рвота. Все эти последствия считаются нормальными, опасности для жизни и здоровья они не представляют.
- Жаропонижающие (при условии, что ребёнок не болен) следует давать на ночь при температуре выше 38,5 градусов. При фебрильных судорогах сбивать жар можно при 37,5 градусах.
- Применение антигистаминных препаратов крайне нежелательно. Покраснения и отёки должны проходить сами: здоровый организм справится самостоятельно.
- Купание не запрещено.
Обращаться к врачу следует в случае, если температуру невозможно сбить жаропонижающими (парацетамолом), если ребёнок беспокойный и долгое время отказывается от еды. При судорогах, потере сознания и гнойном нарыве на месте прививки незамедлительно вызывайте карету скорой помощи.
Отказ от БЦЖ
Сегодня всё чаще и чаще родители малышей высказывают недовольства по поводу тех или иных плановых прививок, считая их вредными. В моду входит практика отказа от вакцинирования. БЦЖ-прививка, последствия отказа от которой бывают весьма плачевными, не является исключением.
От вакцины против туберкулёза можно отказаться так же, как и от любой другой. Законодательство РФ подтверждает это право, тем самым перекладывая ответственность за детей на их родителей.
Что хотелось бы отметить по этому поводу? Сегодня в открытом доступе находится большое количество информации абсолютно обо всём. Каждый человек в состоянии самостоятельно изучать вопросы, касающиеся жизни и здоровья его и его семьи, принимать решения и нести ответственность за свои убеждения.
Если вы решите не прививать собственного ребёнка – никто ничего не скажет против. Нужно лишь собственноручно написать отказ в карте, обязательно указав, что не будете иметь никаких претензий к медицинскому персоналу впоследствии.
расшифровка, когда делают, меры предосторожности
Приверженцы прививок и протестующие были всегда, и каждый из них знает не понаслышке о вакцинации БЦЖ. У людей в России сложилось четкое представление, что делают ее сразу при рождении ребенка. Но это немного не так. Время, когда делают прививку, может существенно отличаться. У вакцины имеются и противопоказания, на которые врачи обращают внимание и могут вовсе отказать в прививании.
Что такое БЦЖ
БЦЖ – прививка от Бациллы Кальмета-Герена (это официальная расшифровка наименования прививки), что именуется в России просто – от туберкулеза. Это заболевание считается самым страшным и смертельно опасным, поскольку заразиться им можно и при контакте с больным, а умереть за несколько дней даже при интенсивном лечении.
Работы по определению эффективности стали проводиться учеными Гереном и Кальметом в 1908 году. Через 13 лет труда выяснилось, что с помощью представленного вещества можно обезопасить обезьян, кроликов и других животных особей в заболевании туберкулезом.
В 1921 году впервые провели вакцинацию перорально новорожденного Франции. Успех проводимых исследований привел к тому, что вакцину БЦЖ стали использовать в СССР, а на 2020 год прививка считается обязательной в 31 стране Мира. В 150 странах Мира ее рекомендуют населению, поэтому на данный момент более 2 млрд человек привиты.
После 2000 года в России стали активно использовать усовершенствованную прививку, именуемую БЦЖ-М. Она применяется для первичной вакцинации и повторной. По эффективности этот вариант не уступает основному, но последствий от нее в разы меньше.
Состав
Молодым родителям не дают информацию относительно состава БЦЖ. Но изучая представленный вопрос, можно привести следующие факты:
- В составе нет антибиотиков, консервантов и прочих подобных веществ.
- В растворе прививки содержится 0,05 мг микробных клеток и стабилизатора – глутамата натрия.
- Сама жидкость представляет собой пористую массу, которая в большей степени напоминает порошок, но не является им. Иногда в медучреждения поступают спрессованные таблетки.
- В комплекте всегда идет растворитель. Зачастую это натриевый хлорид в жидком виде. Его добавляют в определенном количестве в пористую массу или растворяют ею таблетку.
В результате прививка БЦЖ – это раствор, содержащий хлопья. При введении его в кровь человека поступают вакцинный штамм микобактерии. Он инициирует формирование продолжительного иммунитета.
Немного об эффективности
Антипрививочники не понимают пользы представленной вакцины. Но она есть. Это доказывается анализом смертности населения всего Мира. Так, прививка дает надежную защиту от развития туберкулеза мозга у детей, которые этому подвержены больше всего. На данный момент статистика воодушевляет – всего 5 случаев в России на все население за историю страны. В странах Европы средняя статистика удручающе – 1 случай на 10 млн. населения.
В большинстве стран Мира представленная прививка ввелась органами здравоохранения в список обязательных вакцин. В СССР БЦЖ был введен в обязательный список прививок в 1962 году. Прививали всех новорожденных во время пребывания в роддоме. С 2018 года ВОЗ внес представленное прививание в список рекомендованных, поэтому молодые мамы в роддоме после рождения малыша могут отказаться от нее.
Ученые в 2020 году отметили эффективность прививки БЦЖ в борьбе с COVID-19. Согласно статистике страны, где представленная вакцина не используется, больше всего пострадали от нового вируса.
В США, в Италии и в Нидерландах вакцину не используют. Ею прививаются жители только по собственному желанию.
Показания к применению
Несмотря на тот факт, что БЦЖ делают новорожденному сразу после рождения, есть уже взрослые люди без представленной прививки. В соответствии с определенными показаниями им все-таки рекомендуется вакцинация. Кому врачи настоятельно рекомендуют привиться:
- Детям до года, которые проживают в неблагоприятных условиях, в том числе в месте, где отмечено несколько больных туберкулезом.
- Детям и взрослым всех возрастов, которые имеют высокий риск заражения заболеванием.
- Взрослым, которые в силу своего рода деятельности вынуждены работать с больными людьми.
Родители новорожденного ребенка сейчас могут отказаться от прививок в силу различных причин. В большинстве случаев врачи сами оформляют медотвод недоношенным детям или родившимся с врожденными патологиями. Но до года рекомендуется привить ребенка, чтобы не спровоцировать заражение.
Противопоказания для прививки
Польза прививки неоспорима. Но и здесь существуют противопоказания, с которыми требуется считаться. Врачи запрещают проводить прививание при наличии следующих проблем:
- ребенок родился недоношенным – дается медотвод детям, рожденным менее 2,5 кг;
- у новорожденного выявили ряд врожденных патологий;
- у роженицы диагностировали внутриутробную инфекцию;
- у новорожденного или у подросшего ребенка имеются гнойно-септические заболевания;
- была диагностирована средняя или тяжелая форма гемолитической болезни;
- врачи выявили первичный иммунодефицит;
- у новорожденного выявлена неврологическая симптоматика поражения нервной системы;
- диагностированы генерализованные поражения кожного покрова;
- у пациента имеются злокачественные новообразования;
- человек принимает антидепрессанты – прививку можно делать после приема лекарственных препаратов;
- человек проходит лучевую терапию – необходимо выдержать время по факту окончания лечения в полгода;
- туберкулез уже был выявлен у больного;
- у молодой матери диагностировали ВИЧ, в течение которого она выносила и родила ребенка.
Запрещается делать прививку во время инфекционных заболеваний, в период обострения хронических патологий. Также нельзя прибегать к вакцинации, если у ребенка или взрослого развивается аллергия.
О последствиях и побочных действиях
Прививку делают в предплечье ребенку или взрослому человеку. В течение нескольких дней в месте укола имеется отметина. Через неделю или более образуется водяной пузырь. Постепенно он высыхает, образуется бляшка. Корочка просушивается до конца и отпадает. В результате на коже остается небольшая отметина – ямка, которая увеличивается в диаметре по мере роста человека. В первое время диаметр отметины составляет 0,5 см, со временем она становится 1-1,5 см.
Весь процесс образования ямки длится не более 2 месяцев. В течение всего срока необходимо наблюдаться у врача. Он будет проверять отсутствие инфицирования места укола.
После укола врачи диагностируют и более опасные последствия. Легкие осложнения заключаются в образовании язвы на месте укола, зуда и прочих неприятностей. Это связано с неправильным вводом раствора. Возможно повышение температуры тела, о чем следует сразу сказать врачу.
Тяжелые осложнения связаны с инфицированием раны и всего организма. Также врачи нередко диагностируют лимфаденит у пациента, который прошел вакцинацию или ревакцинацию.
Дополнительно следует выделить следующие проблемы, которые возникают сразу после вакцинации:
- Самым опасным считается проявление холодного абсцесса. Место укола начинает гноиться, образованный фурункул вскрывается самопроизвольно. Если этого не происходит, начинается повреждение мышечных тканей. Подобное приводит к операбельному вмешательству. Холодный абсцесс начинается в результате неправильно введенного раствора, нарушенных пропорций при изготовлении жидкости.
- Появление в месте укола инфильтрата. Причиной представленных неприятностей становится глубокое введение раствора. Пока инфекция не успела попасть в кровь, а находится только в нижних слоях эпидермиса, ситуацию можно решить быстро и без операции. В противном случае может потребоваться и переливание крови.
- Появление келоидного рубца. Появляется чаще у новорожденных вследствие хронического воспаления места укола.
- Редко, но у человека могут диагностировать остеит. Это туберкулез кости в месте укола. Патология диагностируется только через 1-2 года после вакцинации. Причиной развития раковых клеток становится не укол, а нарушения функций иммунной системы больного.
При возникновении любых жалоб после вакцинации следует обратиться к врачу. Он проведет обследование и назначит соответствующее лечение.
О способах применения и дозы
Еще на этапе создания вакцины людей прививали перорально. Сейчас это делают только через внутримышечные инъекции. А вот о дозировке говорить приходится подробнее.
Раствор вводят новорожденному в объеме 0,1 мл, где 0,05 мг составляет сам порошок или растворенная спрессованная таблетка. Для разбавления используется 0,9% растворитель натрия хлорид. Детям новорожденным делают укол на 3-7 день после рождения. Далее в возрасте 2 месяцев от рождения младенцу делают первую манту – пробу для выявления туберкулеза.
Ревакцинацию БЦЖ проводят в возрасте 7 лет при учете, что у ребенка будет отрицательная реакция на пробу манту. Это означает, что в организме нет инфильтрата, гиперемии. Их реакция манту составляет всего 1 мм. В противном случае дети не подлежат ревакцинации.
Приготовление раствора для ввода пациенту происходит в последовательности:
- Для вакцинации используют ампулу с объемом основного вещества в 1 мг. В ампуле содержится порошок, рассчитанный сразу на 10 доз.
- Чтобы получить 0,1 мл раствора, где будет содержаться 0,05 мг основного вещества, в ампулу добавляют 1 мл натрия хлорида. Используется 0,9% растворитель.
- После ввода растворителя в течение минуты порошок растворяется. Допустимо незначительное количество хлопьев, но они должны раствориться после 3-4 раз активного взбалтывания.
- В шприц нужно набирать 0,2 мл разведенного вещества. Далее удаляют около половины раствора, что происходит при устранении воздуха в шприце.
- Итог: поршень устанавливают на уровне 0,1 мл шприца и вводят в руку человека.
В результате получается густая суспензия белого или желтоватого цвета, которую можно вводить аккуратно в предплечье. Если в составе имеются хлопья, вакцину не используют.
Особенности применения
Поскольку прививка БЦЖ полезна и эффективна, но опасна для здоровья человека в случае допущенной ошибки, важно соблюдать условия разведения и применения вакцины. По данному вопросу выделяют следующие правила:
- Важную роль играет не только разведение порошка, но и его введение в организм новорожденного. Занимается этим только медперсонал, специально обученный к вводу прививок. Происходит это в роддоме. В большинстве случаев в день выписки, чтобы в дальнейшем малыш наблюдался у педиатра. Вводят вакцину утром, поскольку к вечеру у малыша может подняться температура, которую нужно сбивать.
- Укол новорожденному делается только при отсутствии противопоказаний. Разрешение выписывает врач. При необходимости проводится консилиум врачей для принятия верного решения.
- В школах ревакцинацию проводят только после предварительного манту и проверки ее результатов.
- Вакцинацию оформляют документально. В медицинской карте указывают дату проведения процедуры, название препарата и данные производителя, серия и срок годности введенного вещества.
- Головку ампулы вещества необходимо обтереть спиртом. Затем используют пинцет для вскрытия стеклянного сосуда.
- Нельзя разведенную вакцину оставлять на солнце, нужно уберегать от дневного света. Используют разведенный состав сразу после приготовления. Максимальный срок сохранения вещества 1 час. Если требуется хранить вакцину в течение указанного времени, разведенную ампулу помещают в холодильник, где поддерживается температура в диапазоне +2-+8°С. Время разведения ампулы указывают на бумаге и прикладывают к ней в холодильнике.
- Место ввода иглы в обязательном порядке обрабатывают спиртом. Игла располагается срезом вверх. Вводят вакцину в 2 этапа. На первом этапе необходимо ввести незначительную часть, чтобы проверить, что игла вошла в точности под кожу. Удостоверившись в этом, вводят оставшуюся часть. Это важно для новорожденных.
Сразу после прививания появится белая папула на месте укола. Она проходит в течение 20 минут. Если этого не произошло, следует показаться врачу.
О взаимодействии с другими веществами, передозировка
Случаев передозировки на данный момент не было установлено. БЦЖ можно делать отдельно от других вакцин. Должно пройти не менее месяца до или после процедуры, когда можно проводить новые вакцинации.
Во время вакцинации БЦЖ нельзя принимать другие лекарственные препараты – противоаллергенные, противовирусные и прочие. Последствий от нарушений в большинстве случаев нет, но взрослому человеку или новорожденному станет еще хуже. Все объясняется не негативным взаимодействием с лекарственными средствами, а общим плохим состоянием пациента.
О мерах предосторожности
Важно соблюдать все правила ввода вакцины, а также меры предосторожности. В противном случае пациента ждет оперативное вмешательство или переливание крови при заражении крови. Летальных исходов вследствие введенной прививки на данный момент не зарегистрировано. Но провоцировать осложнения врачам недопустимо.
К общим мерам предосторожности относят следующие факторы:
- Ввод препарата осуществляется только в мышечную ткань. Вливание состава под кожу приводит к развитию холодного абсцесса, описанного выше.
- Используются для вакцинации только одноразовые стерильные туберкулиновые шприцы – они меньше в сравнении со стандартными. Рассчитаны только на 1 мл вещества, иглы тонкие, поэтому новорожденному процедура не доставляет много боли. Чтобы растворить порошок, используется дополнительный одноразовый шприц объемов в 2 мл с длинной иглой. Им вносят растворитель в ампулу.
- После проведения вакцинации использованный шприц с иглой обрабатывают спиртом и утилизируют в соответствии с санитарными нормами.
- Специальные уколы для ввода вакцины БЦЖ используют только по назначению.
- Порошок еще до растворения хранят только в холодильнике.
- Прививание происходит в специальной стерильной комнате, куда не допускаются посторонние лица.
- Нельзя обрабатывать место укола йодом или другими веществами. Папула должна пропасть без внешнего воздействия, а последующие манипуляции могут только спровоцировать процесс нагноения.
Врачи не должны использовать ампулы, на которых нет этикетки или маркировки. Никогда не применяются составы с истекшим сроком годности, а также при изменении их цвета или структуры. Нельзя вскрывать ампулы, на которых есть трещина или надсечка.
БЦЖ важна для населения всех стран Мира. И даже если в государствах отсутствует обязательство вакцинации, сами граждане изъявляют желание прививания именно описанным составом.
ДНК- и РНК-вакцины: современное состояние, требования к качеству и особенности проведения доклинических исследований | Горяев
1. Tang DC, DeVit M, Johnston SA. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 1992;356(6365):152–4. https://doi.org/10.1038/356152a0
2. Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, Rhodes GH, Felgner PL, Dwarki VJ, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science. 1993;259(5102):1745–9. https://doi.org/10.1126/science.8456302
3. Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. DNA vaccines. Annu Rev Immunol. 1997;15:617–48. https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.15.1.617
4. Gurunathan S, Klinman DM, Seder RA. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. Annu Rev Immunol. 2000;18:927–74. https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.18.1.927
5. Hobernik D, Bros M. DNA vaccines — how far from clinical use? Int J Mol Sci. 2018;19(11):3605. https://doi.org/10.3390/ijms19113605
6. Liu MA, Ulmer JB. Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet. 2005;55:25–40. https://doi.org/10.1016/S0065-2660(05)55002-8
7. Weniger BG, Anglin IE, Tong T, Pensiero M, Pullen JK, Nucleic Acid Delivery Devices for HIV Vaccines Workshop Group. Workshop report: nucleic acid delivery devices for HIV vaccines: workshop proceedings, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland, USA, May 21, 2015. Vaccine. 2018;36(4):427–37. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2017.10.071
8. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vaccines — a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov. 2018;17(4):261–79. https://doi.org/10.1038/nrd.2017.243
9. Kumaragurubaran K, Kaliaperumal K. DNA vaccine: the miniature miracle. Vet. World. 2013;6(4):228–32. https://doi.org/10.5455/vetworld.2013.228-232
10. Cranenburgh R. Development of the ideal DNA vaccine requires the optimization of delivery strategies and plasmid vectors. BioPharm International. 2011;2011 Suppl.(7). http://www.biopharminternational.com/dna-vaccine-delivery
11. Garmory HS, Brown KA, Titball RW. DNA vaccines: improving expression of antigens. Genet Vaccines Ther. 2003;1:2. https://doi.org/10.1186/1479-0556-1-2
12. Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313–29. https://doi.org/10.1586/14760584.2016.1124762
13. Liu Z, Chen O, Wall JBJ, Zheng M, Zhou Y, Wang L, et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multigenes in a polycistronic vector. Sci Rep. 2017;7(1):2193. https://doi.org/10.1038/s41598-017-02460-2
14. Li L, Petrovsky N. Molecular adjuvants for DNA vaccines. Curr Issues Mol Biol. 2017;22:17–40. https://doi.org/10.21775/cimb.022.017
15. Darquet AM, Cameron B, Wils P, Scherman D, Crouzet J. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle. Gene Ther. 1997;4:1341–9. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300540
16. Hardee CL, Arévalo-Soliz LM, Hornstein BD, Zechiedrich L. Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy. Genes (Basel). 2017;8(2):65. https://doi.org/10.3390/genes8020065
17. Stenler S, Blomberg P, Smith CE. Safety and efficacy of DNA vaccines: plasmids vs. minicircles. Hum Vaccin Immunother. 2014;10(5):1306–8. https://doi.org/10.4161/hv.28077
18. Riede O, Seifert K, Oswald D, Endmann A, Hock C, Winkler A, et al. Preclinical safety and tolerability of a repeatedly administered human leishmaniasis DNA vaccine. Gene Therapy. 2015;22(8):628–35. https://doi.org/10.1038/gt.2015.35
19. Pushko P, Ишмухаметов АА, Вredenbeek PP, Lukashevich IS. Экспериментальные живые аттенуированные вакцины против желтой лихорадки на основе инфекционных ДНК. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2019;18(1):18–25. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2019-18-1-18-25
20. Pushko P, Lukashevich IS, Weaver SC, Tretyakova I. DNA-launched live-attenuated vaccines for biodefense applications. Expert Rev Vaccines. 2016;15(9):1223–34. https://doi.org/10.1080/14760584.2016.1175943
21. Dallmeier K, Neyts J. Bacterial artificial chromosomes. Patent WIPO N WO2014174078; 2014.
22. Ulmer JB, Mason PW, Geall A, Mandl CW. RNA-based vaccines. Vaccine. 2012;30(30):4414–8. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.04.060
23. Lundstrom K. RNA-based drugs and vaccines. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):253–63. https://doi.org/10.1586/14760584.2015.959932
24. Sahin U, Karikó K, Türeci Ö. mRNA-based therapeutics — developing a new class of drugs. Nat Rev Drug Discov. 2014;13(10):759–80. https://doi.org/10.1038/nrd4278
25. Geall AJ, Mandl CW, Ulmer JB. RNA: the new revolution in nucleic acid vaccines. Semin Immunol. 2013;25(2):152–9. https://doi.org/10.1016/j.smim.2013.05.001
26. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265–81. https://doi.org/10.1586/14760584.2015.973859
27. Youn H, Chung JK. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opin Biol Ther. 2015;15(9):1337–48. https://doi.org/10.1517/14712598.2015.1057563
28. Lundstrom K. Latest development on RNA-based drugs and vaccines. Future Sci OA. 2018;4(5):FSO300. https://doi.org/10.4155/fsoa-2017-0151
29. Eberhardt W, Doller A, Akool el-S, Pfeilschifter J. Modulation of mRNA stability as a novel therapeutic approach. Pharmacol Ther. 2007;114(1):56–73. https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2007.01.002
30. Atkins GJ, Fleeton MN, Sheahan BJ. Therapeutic and prophylactic applications of alphavirus vectors. Expert Rev Mol Med. 2008;10:e33. https://doi.org/10.1017/S1462399408000859
31. Brito LA, Kommareddy S, Maione D, Uematsu Y, Giovani C, Berlanda Scorza F, et al. Self-amplifying mRNA vaccines. Adv Genet. 2015;89:179–233. https://doi.org/10.1016/bs.adgen.2014.10.005
32. Klinman DM, Klaschik S, Tross D, Shirota H, Steinhagen F. FDA guidance on prophylactic DNA vaccines: analysis and recommendations. Vaccine. 2010;28(16):2801–5. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.11.025
33. Klug B, Reinhardt J, Robertson J. Current status of regulations for DNA vaccines. In: Thalhamer J, Weiss R, Scheiblhofer S, eds. Gene Vaccines. New York: Springer; 2012. P. 285–95. https://doi.org/10.1007/978-3-7091-0439-2_14
34. Bahl K, Senn JJ, Yuzhakov O, Bulychev A, Brito LA, Hassett KJ, et al. Preclinical and clinical demonstration of immunogenicity by mRNA vaccines against h20N8 and H7N9 influenza viruses. Mol Ther. 2017;25(6):1316–27. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.035
35. Ledwith BJ, Manam S, Troilo PJ, Barnum AB, Pauley CJ, Griffiths TG 2nd. Plasmid DNA vaccines: assay for integration into host genomic DNA. Dev Biol. 2000;104:33–43.
БЦЖ М и БЦЖ — в чем отличие?
БЦЖ М – щадящая профилактическая вакцинация против туберкулеза, которая делается недоношенным новорожденным деткам в родильном доме. Прививка не защищает ребенка от заболевания, но предотвращает серьезное осложнение, что опасно для жизни маленьких деток.
От обычной вакцины, БЦЖ М прививка отличается облегченным составом, в препарате содержится половина инактивированных микобактерий. Введение щадящего средства рекомендовано деткам с резус-конфликтом к матери, с неврологическими нарушениями после осложнений при родовой деятельности, если вес новорожденного менее двух килограмм.
Порядок иммунизации
Первую вакцину БЦЖ вводят в роддоме на 3–5 день жизни младенца, она не защищает от коварного недуга, но способствует выработке антител в организме, чтобы предотвратить смертельные осложнения:
- туберкулезный менингит;
- диссеминированный и милиарный туберкулез;
- поражение костей;
- клиническое состояние.
С такими формами болезни не способен справиться неокрепший организм ребенка, лечение является неэффективным, заболевание заканчивается летальным исходом.
Повторная вакцина вводится в семилетнем возрасте, следующая ревакцинация в 14 лет.
Бывают случаи, когда иммунизацию откладывают до выписки с роддома по следующим причинам:
- у ребенка иммунодефицит;
- если у членов семьи наблюдались тяжелые последствия вакцинации.
Вакцина вводится медицинским работником после осмотра ребенка педиатром, в домашних условиях процедура запрещена. Рекомендуется перед инъекцией сдать ребенку анализ мочи и крови.
Инъекцию делают тоненьким туберкулиновым шприцом со срезом.
СЕНСАЦИЯ ! Перейди по ссылке:
Препарат запрещается применять, если отсутствует:
- маркировка на ампуле;
- истекла годность смеси;
- наблюдаются любые изменения препарата, посторонние хлопья в порошке;
- имеются повреждения ампулы.
Сухое средство разводят непосредственно перед введением раствором натрия хлорида. Проводится вакцина БЦЖ М внутрикожно, несоблюдение этого правила вызывает целый ряд осложнений, приводит к холодному абсцессу.
На месте укола образуется папула размером до 10 мм, нормальная реакция развивается через 4–6 недель после инъекции. Место укола нельзя повреждать, особенно при водных процедурах, заклеивать пластырем, смазывать различными мазями, кремами.Соблюдение родителями рекомендаций специалистов, избавит ребенка от серьезных последствий.
Как избавиться от риска осложнений?
Чтобы уберечь малыша от серьезных последствий, важно проконсультироваться с опытным педиатром. Только специалист адекватно оценит состояние ребенка и даст разрешение на проведение процедуры.
До и после манипуляции необходимо соблюдать следующие советы:
- До инъекции сделать аллергический тест, что позволит оценить реакцию организма на введение туберкулина.
- После процедуры запрещается мочить место укола, мазать перекисью, зеленкой, клеить пластырь, самостоятельно убирать корку.
- При нагноении ранки, нельзя выдавливать гной, можно легонько промокнуть салфеткой.
- За несколько дней до процедуры лучше не менять питание, не добавлять новые смеси в рацион. Это позволит правильно оценить причину возможной аллергической реакции.
Пребывая в родильном доме необходимо соблюдать все рекомендации докторов. После выписки следить за состоянием малыша, при любых отклонениях срочно обратиться к педиатру.
Реакция на вакцину БЦЖ М наблюдается через два месяца после укола. Сначала образуется нагноение, затем ранка покрывается характерной корочкой. После заживления остается рубец, диаметром не более 10 мм. Все это время нужно оберегать рану от механического повреждения, особенно при купании.СЕНСАЦИЯ ! Перейди по ссылке:
Осложнения после введения препарата наблюдаются крайне редко, могут происходить следующие процессы:
- Холодный абсцесс развивается при неправильном введении средства, такое нарушение требует оперативного вмешательства.
- Образование язвы происходит при повышенной чувствительности организма к действующему веществу.
- Воспалительный процесс происходит из-за попадания бацилл в лимфоузлы, осложнение нуждается в экстренном лечении под наблюдением докторов.
- Келоидный рубец возникает при специфической реакции на препарат, в таких случаях ревакцинация в семилетнем возрасте не проводится.
- При серьезных нарушениях иммунной системы возникает генерализованная инфекция.
- Туберкулез костей диагностируют после двух лет прививания, наблюдается у одного из двухсот тысяч.
Предотвратить такие серьезные последствия очень трудно, их нельзя выявить у новорожденного ребенка. Важно правильно провести процедуру и наблюдать за реакцией организма. При нарушении состояния здоровья нужно немедленно обращаться к специалистам.
Противопоказания
Вакцинация не проводится, если у ребенка наблюдаются следующие противопоказания:
- обычная прививка БЦЖ не проводится новорожденным деткам, весом менее 2,5 кг;
- любая вакцинация противопоказана при иммунодефиците;
- запрещено вакцинирование при гемолитическом заболевании, внутриутробном инфицировании, гнойных болезнях, кожных высыпаниях;
- злокачественные новообразования, проблемы с нервной системой;
- если у матери обнаружено ВИЧ-инфицирование;
- повторное вакцинирование не проводится, если первичная прививка проходила с осложнениями.
Противопоказано в день введения препарата, проводить другие манипуляции. Между профилактическими прививками необходимо выждать месяц. Совместимой с БЦЖ является прививка от гепатита В, но разница между инъекциями составляет три дня.
Многие родители, выслушав от доктора все противопоказания и побочные явления, отказываются от вакцинации в роддоме. Чаще отказ обоснован вредностью добавок – ртуть и фенол, что входят в состав препарата. Но без данных консервантов вакцина не выпускается. Родители пишут письменный отказ от проведения вакцинации, вся ответственность при неблагоприятных последствиях ложится на них.
Важно понимать, что этот препарат является единственной профилактической мерой, чтобы защитить своего ребенка от тяжелых осложнений, вызванных туберкулезом.
При запрете на прививание необходимо полностью оградить дитя от контакта с инфицированными людьми.В большинстве случаев прививка не вызывает осложнений, но приносит большую пользу, в случае заболевания туберкулезной инфекцией. Поэтому нужно хорошо обдумать действия, проконсультироваться с хорошим специалистом, который подскажет правильное решение.
Как альтернативный вариант можно использовать ослабленный штамп микобактерий – вакцина БЦЖ М, чтобы предотвратить серьезные последствия туберкулезного заболевания.
от чего, расшифровка, новая противотуберкулезная вакцина, состав, вакцинация от туберкулеза новорожденным, сроки при отсутствии противопоказаний, когда делают, куда, что за прививка, как заживает, сколько действует, как называется, вводится детям в 7 лет, от чего помогает, защищает, взрослым после 30 лет, что такое и зачем его делать, можно ли заболеть туберкулезом, защищает ли, во сколько лет, график, фтизиатрия, не гноится
Многие мамы только в роддоме узнают, что такое БЦЖ и зачем его делают ребенку в первые дни жизни. В дальнейшем на протяжении жизни еще несколько раз вводится данная вакцина. Прививка БЦЖ предназначена для иммунизации детей и повышения их устойчивости к микобактериям туберкулеза. В детстве это заболевание протекает крайне тяжело и сопровождается рядом осложнений. Введение вакцины способствует снижению риска инфицирования.
Как расшифровывается аббревиатура
Русской аббревиатуры БЦЖ расшифровка невозможна. Она является адаптацией с латинского языка. В действительности называется прививка BCG и расшифровывается как Bacillus Calmette-Guerin. На русский язык данная расшифровка может быть переведена как бацилла Кальметта-Герена. Свое название данный тип микобактерий получил благодаря именам ученых, которые вывели его в лабораторных условиях.
Состав
Состав этой прививки от туберкулеза остается неизменным с 1921 года. Вакцина БЦЖ содержит ряд полученных в лабораторных условиях подтипов Mycobacteria bovic. Для изготовления препарата сначала микобактерии высеваются на питательную среду, а затем помещаются в необходимые температурные условия. Примерно через 7 дней выполняется фильтрация и концентрация микобактерий.
Получающаяся однородная масса разбавляется стерильной водой. После этого проводится высушивание препарата. Данная вакцина отличается содержанием и живых, и мертвых микобактерий, неспособных при введении в организм человека провоцировать развитие заболевания. Наиболее часто прививка включает следующие штаммы микроорганизмов:
- французский 1172 Р2;
- токийский 172;
- датский 1331.
Для сохранения свойств вакцина БЦЖ фасуется в стеклянные или пластиковые ампулы. Упаковка выполняется в стерильных условиях под вакуумом. Существует 2 варианта препарата, которым выполняется прививка, в т.ч. БЦЖ и БЦЖ М. Они отличаются количеством живых микроорганизмов, включенных в состав вакцины. БЦЖ с пометкой «М» является более щадящим вариантом, поэтому подходит данная прививка от туберкулеза новорожденным, появившимся раньше срока.
От чего защищает
Для защиты организма ребенка от микобактерий, вызывающих развитие туберкулеза, нужна прививка БЦЖ. Введение препарата, включающего ослабленные и лишенные вирулентности бактерии, не может стать причиной инфицирования, но позволяет запустить иммунную реакцию. Таким образом, вакцина помогает защитным механизмам в дальнейшем своевременно выявлять и уничтожать попавшие в организм микобактерии.
Повторная вакцинация от туберкулеза позволяет продлить эффект и защитить ребенка от микобактерий в периоды, когда риск заражения наиболее высок.
Детей прививают, не только чтобы не допустить развитие патологии. В действительности даже если ребенок прошел вакцинацию риск его заражения остается. Однако у заболевших в детском возрасте, вакцинированных пациентов патология протекает в более легкой форме и не сопровождается появлением осложнений. Прививка БЦЖ нужна для предохранения ребенка от развития крайне опасных форм туберкулеза, в т.ч. сопровождающихся поражением мозговых оболочек, суставов, костей и других органов.
Когда делают
Существует немало крайне важных прививок, в т.ч. и БЦЖ, график введения вакцины нужно соблюдать строго. Разработано расписание, согласно которому делают БЦЖ. При отсутствии противопоказаний первый раз вакцина от туберкулеза вводится ребенку на 3-5 день жизни. Следующий раз вакцину вводят в 7 лет. Рекомендована также прививка в 14 лет. Взрослым людям вакцинация против туберкулеза выполняется до 25 лет, но только при отрицательной пробе Манту. Прививка от туберкулеза взрослым после 30 лет делается только по назначению врача.
Противопоказания
Медотвод от БЦЖ новорожденным выполняется, если ребенок родился раньше срока или имеет вес менее 2,5 кг. Таким детям прививка делается после нормализации состояния и стабилизации массы тела. В этом случае рекомендована новая вакцина от туберкулеза БЦЖ М. Причина нежелательности прививки БЦЖ детям может крыться во врожденных аномалиях развития и внутриутробных инфекциях. Особенно опасна вакцинация, если мать ребенка страдает открытой формой туберкулеза. К противопоказаниям для вакцинации БЦЖ относятся:
- обострение хронических заболеваний;
- иммунодефицит;
- наличие ВИЧ у матери;
- злокачественные новообразования;
- родовые травмы;
- признаки ОРЗ или ОРВИ;
- гемолитическая болезнь новорожденных;
- осложнения после прививки у родственников ребенка.
Прививка от туберкулеза в 7 лет не проводится при положительной и сомнительной реакции Манту. Противопоказанием также выступают недавно перенесенные гнойно-септические заболевания. Нежелательна прививка БЦЖ для детей и подростков, у которых ранее наблюдались осложнения после введения препарата.
Куда делают
Вакцина БЦЖ вводится в наружную сторону левого плеча. В этой области даже у новорожденных кожа достаточно толстая для того, чтобы препарат можно было ввести в толщу эпидермиса.
Если ребенок родился недоношенным, врачи могут предложить подождать несколько месяцев или даже год, когда произойдет набор веса и место укола станет достаточно толстым.
Если ввести вакцину в плечо нельзя, инъекция может выполняться в любое другое место с толстой кожей на усмотрение делающих прививку врачей. В этом случае чаще всего прививка от туберкулеза новорожденным ставится в область бедра. Толщина кожи должна быть достаточной, чтобы ее можно было натянуть для введения иглы, а затем и препарата.
Как заживает БЦЖ
При правильном введении препарата в месте укола формируется плоская папула, достигающая 5-10 мм в диаметре. Она сохраняется около 15-20 минут. Противотуберкулезная вакцина дает реакцию через 30-45 дней. Процесс заживления может длиться до 2-3 месяцев. Сначала на коже в месте, куда был введен препарат, формируется папула. Поверхность кожи становится красной. Может появляться синяк темного цвета.
Если жидкость загноилась, это считается нормой. Дефект может сильно выступать над поверхностью кожи. Гнойник нельзя вскрывать, выдавливать, расчесывать и тереть. Он может вскрыться самостоятельно, но даже в этом случае нужно по возможности избегать его травмирования.
В ряде случаев возможно повторное образование гнойников. Область, куда вводилась прививка против туберкулеза, нельзя обрабатывать антисептиками. В дальнейшем на поверхности гнойника формируется корочка. Дефект постепенно зарастает. На его месте формируется рубец. Подобный процесс заживления свидетельствует о том, что сформирован иммунитет к туберкулезу, вакцинация прошла хорошо и дополнительные меры не требуются. Только у 10% кожа остается гладкой и следа от гнойника не остается.
Это не означает, что иммунитет не был сформирован.
Во фтизиатрии считается, что, если БЦЖ не гноится, значит, иммунитет не формируется. Отсутствие гнойной реакции может указывать на низкое качество вакцины. В этом случае может быть повторно введена вакцина туберкулезная БЦЖ. Однако даже в этом случае есть вероятность, что гнойник не появится. Это связано с тем, что примерно у 2% людей имеется генетическая устойчивость к микобактериям. В данном случае не только не будет реакции на прививку, но и место пробы Манту будет выглядеть, как укол.
Сколько действует
Длительные исследования позволили выявить лучшие сроки, когда должна быть выполнена вакцинация БЦЖ. Сделанная впервые в роддоме прививка от туберкулеза детям способна обеспечить иммунитет на протяжении 6-7 лет. Из-за этого ребенку в 7 лет требуется ревакцинация. Эффект после проведения иммунизации сохраняется еще около 6-7 лет. Проведенная в 14 лет ревакцинация позволяет создать иммунитет на последующее 10-15 лет. Людям, которые входят в группу риска, может быть рекомендовано проведение ревакцинации в 20-25 лет.
Можно ли заболеть, если есть прививка
Микробиология штаммов, вводящих в вакцину, такова, что их введение в организм человека позволяет создать иммунитет к микобактериям. Если есть прививка, риск заболеть туберкулезом намного меньше. Однако даже дети, которым была проведена вакцинация, не защищены на 100% от этого инфекционного заболевания. Привитые дети также могут заразиться туберкулезом при влиянии на организм таких неблагоприятных факторов, как:
- нерациональное питание;
- проживание в неблагоприятных санитарных условиях;
- длительный контакт с больным, страдающим открытой формой туберкулеза;
- тяжелые травмы;
- развитие злокачественных новообразований;
- лечение препаратами, снижающими иммунитет;
- хронические заболевания и т.д.
Сохраняющийся риск инфицирования обусловлен тем, что микобактерии туберкулеза отличаются высокой вирулентностью. Таким образом, даже после вакцинации в организме человека могут отсутствовать антитела к недавно появившимся штаммам микроорганизмов. В то же время даже в этом случае вакцинация небесполезна, т.к. она способна облегчить течение патологии.
от чего помогает вакцина и зачем нужна проба Манту
Хотя туберкулез у большинства ассоциируется с бедностью и низкой гигиеной, на самом деле от этой болезни страдают все слои населения и люди любого возраста. Для защиты от тяжелых форм болезни существует вакцинация, хотя она отличается по принципу воздействия от остальных, так как не спасает от заражения и развития болезни. Хотя с целью профилактики разработана прививка, но от чего она помогает? И есть ли у БЦЖ прививки расшифровка? Рассказываем, зачем нужна такая вакцина и что о ней надо знать.
Вакцина, которая не защищает от инфицирования
БЦЖ прививка: расшифровка названия вакцины не такое простое, как, например, у прививки АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина).
В названии вакцины БЦЖ скрыта не русскоязычная аббревиатура, в наименовании этой прививки расшифровка проводится по правилам французского произношения. Это Bacillus Calmette-Guerin, BCG, или Бацилла Кальметта-Герена, названная по именам французских бактериологов, создателей вакцины. Так что для БЦЖ прививки расшифровка скрывает не наименования болезней или компонентов. Ее назвали в честь ученых.
Назначение прививки БЦЖ, от чего она помогает, заключено в предупреждении развития скрытой инфекции в случае заражения в выраженный туберкулез с осложнениями. Если человек не только встретится с возбудителем туберкулеза (что может происходить очень часто), но болезнь начнет развиваться, она не перейдет в тяжелые формы. То есть вакцинация помогает организму защищаться от таких страшных осложнений, как туберкулезный менингит, туберкулезные поражения опорно-двигательного аппарата, тяжелых видов туберкулезного поражения легких.
Вакцинация от туберкулеза позволила добиться выраженного снижения количества болезни в детском возрасте, и вот уже много лет привитые люди не сталкиваются больше с туберкулезным менингитом.
Когда делают прививку БЦЖ?
БЦЖ прививка: от чего ее делают совсем маленьким детям? Вакцинацию от туберкулеза проводят еще в роддоме, на 4-ые сутки после появления ребенка на свет, согласно плану прививок. Эту вакцину вводят в плечо с левой стороны. Зачем надо проводить вакцинацию только что родившемуся ребенку?
Проблема в том, что во многих странах, не исключая Россию, ситуация с заболеваемостью далека от благополучной. Инфекция может подстерегать малыша даже в роддоме от посетителей соседней палаты, по дороге к дому и во время прогулок, а для формирования иммунного ответа в организме требуется время.
Многие больные туберкулезом могут не подозревать о заболевании и выделять возбудитель, не получая лечения. По этой причине встреча ребенка с туберкулезной микобактерией может произойти довольно рано. И чем раньше в организм проникнет инфекция, тем выше риск перехода инфицирования в серьезную форму заболевания, и тем ниже шанс на успешное лечение.
Живая вакцина: зачем в БЦЖ возбудитель?
В вакцине Кальметта-Герена обязательно присутствует штамм возбудителя болезни, хотя и в ослабленном состоянии, но живой. Причина, почему необходим именно живой штамм, в особенностях заболевания. При некоторых инфекциях для иммунного ответа достаточно ввести токсины, «следы пребывания возбудителя», но с туберкулезом все иначе.
Специфический иммунитет формируется исключительно при наличии в организме самого возбудителя или его вакцинной замены. Во всех странах используется только живой штамм, и по этой причине даже ведущие иммунологи не советуют пытаться прививать ребенка импортной вакциной. Живые штаммы очень чувствительны к условиям транспортировки и хранения, а в процессе доставки вакцины могут произойти случайные накладки, влияющие на качество штамма.
БЦЖ-М — еще одна форма БЦЖ прививки: от чего она используется? Это вакцина с меньшим количеством микробных тел, которая рекомендована к применению у ослабленных, недоношенных детей.
Осложнения и поствакцинальные реакции
Вакцинация от туберкулеза переносится детьми хорошо, однако надо знать о нормальной поствакцинальной реакции. Она — часть процесса формирования иммунитета, но вызывает немало тревог и вопросов у родителей.
Кожная реакция в норме начинает развиваться спустя 1,5-2 месяца после прививки.
- В месте укола сначала появляется уплотнение, бугорок, схожий со следами от комариного укуса.
- Затем этот узелок увенчивается пузырьком, наполненным жидкостью светло-желтого цвета.
- Спустя 4-8 недель он самопроизвольно лопается, на месте инъекции образуется корочка, которая затем отпадает и нарастает заново.
- Заканчивается все рубцеванием ткани, образуется характерный округлый шрамик.
Все этапы поствакцинальной реакции совершенно нормальны и не требуют ухода. Более того, применение дезинфицирующих препаратов нарушает формирование иммунного ответа, так как вакцинный штамм не устойчив к антисептикам и может быть таким образом уничтожен. Иммунитет в итоге будет не сформирован.
Осложнение возникает, если вакцина введена не в кожный слой, а попадает под кожу. В таком случае гнойничок отсутствует, но под кожей образуется уплотнение, поверх которого отмечается синеватый оттенок. В некоторых случаях это осложнение сопровождается увеличением подмышечных узлов с левой стороны. В таком случае надо обратиться к педиатру.
При нормальной реакции иммунитет продолжается до 6-7 лет.
Зачем делают пробу Манту?
Проба или реакция Манту позволяют определить степень защиты от туберкулеза по оценке напряженности поствакцинального иммунитета. Она не относится к прививкам, в ее составе — раствор оболочек микобактерии, туберкулин, который не провоцирует болезнь. Но по реакции на появление «осколков» возбудителя туберкулеза можно оценить наличие иммунитета или присутствие возбудителя болезни в организме.
После своевременной вакцинации от туберкулеза нормой для ребенка до 4-5 лет будет стойко положительная реакция Манту, при которой папула достигает размеров не менее 5 и не более 15 мм в диаметре.
Отклонения в размере, дополнительная симптоматика могут указывать как на ложноположительную реакцию, так и на отсутствие специфического иммунитета или присутствие бактерии туберкулеза в организме. Во всех случаях необходимы дополнительные обследования и, при необходимости, терапия.
Если ребенку показано лечение, отказываться нельзя: согласно исследованиям, при заражении в детском возрасте у 1 из 6 детей болезнь перетекает в явную форму уже в течение года после инфицирования.
Использованы фотоматериалы Shutterstock
Дизайн и синтез производных 1,2-дезоксипиранозы сплайсостатина А для лечения рака простаты
Реферат
We разработали и синтезировали новую 1,2-дезоксипиранозу и концевую эпоксидные метилзамещенные производные сплайсостатина A с использованием Julia-Kocienski олефинирование как ключевой шаг. Что касается биологической активности, 1,2-дезоксипиранозный аналог сплайсостатина A подавляет AR-V7 экспрессия на наноуровне (IC 50 = 3,3 нМ). Кроме того, тест на токсичность in vivo показал, что 1,2-дезоксипираноза аналог смог избежать тяжелой токсичности по сравнению со сплайсостатином А.
Ключевые слова: Рак простаты, сплайсинг, вариант сплайсинга, сплайсостатин А, токсичность
Один из наиболее распространенных видов рака у мужчин. рак простаты, который лечится с помощью терапии депривации андрогенов (ADT). Однако после ADT у большинства из них развивается резистентность к кастрации. рак простаты (CRPC). Затем этим пациентам с CRPC лечат гормональная терапия с использованием сигнального пути рецептора андрогенов (AR) ингибиторы, такие как энзалутамид или абиратерон, но многие пациенты с CRPC становятся устойчивыми к этим лекарствам через несколько лет. 1−3 Одной из причин сопротивления является проявление сращивания вариант AR, в частности AR-V7, который активируется постоянно без гормональных лигандов и способствует росту рака простаты. 4,5 Следовательно, разработка ингибиторов, направленных на экспрессию AR-V7 важен для лекарственно-устойчивой терапии CRPC, и с этой целью некоторые разработаны ингибиторы (ингибитор комплекса SF3b и ROR-γ антагонист). 6−10
Ранее было обнаружено, что целевой белок сращивание модуляторы сплайсостатина A ( 1 ) (), пладиенолида B и GEX1A (гербоксидиен) (Схема S1), которые показали сильная противоопухолевая активность в отношении солидных опухолей у мышей и некоторых раковых клеток, представлял собой комплекс SF3b в U2SnRNP (главный фактор пре-мРНК сращивание). 11−19 На сегодняшний день проведено несколько синтетических исследований (включая синтез аналогов) и исследования активности ингибирования сплайсинга мРНК 1 , пладиенолид B и GEX1A были проведены несколькими исследованиями группы, 20−37 , но имеется лишь несколько сообщений о модуляторах сращивания, которые могут подавляют экспрессию AR-V7.
Структура сплайсостатина А и его производных ( 1 — 5 ).
Недавно наша группа и группа Hsieh обнаружили, что 1 и его относительный пладиенолид B и тайланстатины (схема S1) могут ингибировать экспрессию AR-V7. 6-8 В частности, пладиенолид B значительно уменьшал объем опухоли мышей модели CRPC, сверхэкспрессирующих AR-V7. 7 Однако аналог пладиенолида B E7107 вошел в клиническую фазу I. испытания, и в результате некоторые пациенты страдали от потери зрения. 38,39 Следовательно, мы сосредоточили наше исследование на 1 и его производные. 40 Совсем недавно мы разработали и синтезировал 2 , который был синтезирован более легко и кислотоустойчивый, чем 1 , но имел слабое подавление AR-V7 активность (IC 50 = 132 нМ). 8 Кому открыть легко синтезируемые производные 1 с сильнодействующими Мы разработали и синтезировали подавляющую активность AR-V7. новые производные 3 — 5 на основе многих более подробные теоретические соображения. 41
Наши соображения при разработке производных инструментов 3 — 5 показаны в.
Стратегия разработки деривативов 3 — 5 .
Для 3 , Активность ингибирования экспрессии AR-V7 фенил- C -гликозидное производное 2 было слабее, чем у 1 .Мы предположили, что более слабый биологическая активность может быть связана с наличием объемного фенила группы, и поэтому мы разработали производное 1,2-дезоксипиранозы 3 , которое не имело функциональной группы в аномерном сайте и могло обладают более высокой кислотостойкостью, чем 1 . Кроме того, было считают, что C1 незамещенный пирановый фрагмент 3 может быть синтезирован легче, чем C1 метилкеталь пиран фрагмент 1 . (а).
Для 4 и 5 , мы предположил, что присутствие концевого эпоксида 1 и / или 2 требовалось для экспрессии биологической активности.Однако эпоксид обычно ассоциируется с нестабильностью или токсичностью, вызванной нецелевые эффекты (образование ковалентной связи с аминокислотными остатками других белков). 42 Таким образом, мы разработали производные 4 (3 ‘ R ) и 5 (3′ S ) до метильной группы на эпоксиде производного 3 (b), которое могло бы улучшить стабильность эпоксида.
Схема 1 иллюстрирует наш ретросинтетический анализ для 3 — 5 .Внутренняя двойная связь на C7 и C8 была построена Юлией-Коциенски. олефинирование между соответствующим альдегидом 9 , 10 или 12 (8)) и сульфон ( 11 21 или 6 — 8 ). Структуры 6 — 10 были получены из соответствующих олефинов 13 — 15 диастереоселективным прямым эпоксидированием, и олефины 13 — 15 могут быть получены реакцией Виттига соответствующего кетона, который был получен из д-глюкала.
Ретросинтетический анализ для 3 — 5
Синтез ключевых промежуточных олефинов 13 — 15 представлен на схеме 2.
(a) Синтез промежуточного соединения 13 и (б) Синтез Промежуточные продукты 14 и 15
Для 13 на схеме 2а гидроксильная группа защищенного 1,2-дезокси пираноза 16 , которая была получена из коммерчески доступного d-глюкаля, 43 была окислена до соответствующего кетон с периодинаном Десса – Мартина (ДМП) и последующими В результате реакции Виттига был получен олефин 17 с выходом 55% по сравнению с два шага. p- метоксибензилацеталь 17 был восстановлен до соответствующего первичного спирта i -Bu 2 AlH (DIBAL) при -10 ° C, и образовавшийся первичный спирт был защищен т -BuCOCl (PivCl) для получения 13 с выходом 87% (два этапа).
Для 14 и 15 на схеме 2b ацеталь 16 был уменьшен посредством DIBAL таким же образом, как описано выше, первичный гидроксил группа была защищена с помощью Si- t -BuMe 2 (TBS) группы, и образовавшийся вторичный спирт окисляли ДМП до производят кетон 18 .Последующая реакция Виттига продолжилась. для получения внутренних олефинов 19 и 20 . В реакция протекала гладко (EtPPh 3 + Br — , n- BuLi, THF, 0-40 ° C), чтобы создать геометрический изомер 19 ( Z ) и 20 ( E ) с выходом 47% соответственно. Построить тризамещенный олефины в положении C3, другие условия реакции фактически являются наносится (изменение температуры реакции, основы, субстрата).Детали условий реакции показаны на схеме S2. Наконец, группы TBS 19 ( Z ) и 20 ( E ) были удалены с помощью Bu 4 NF (TBAF) для синтеза соответствующего первичного спирта. Спирт дополнительно защищали PivCl с получением сложного эфира 14 ( Z ) и 15 ( E ) с выходом 59% и 74% за две стадии, соответственно.
Синтез бензотиазолов 6 — 8 . на схеме 3.Метоксибензильные группы p- из 13 — 15 удаляли 2,3-дихлор-5,6-дициано- p -бензохиноном (DDQ) с получением соответствующего спирта. Последующее диастереоселективное эпоксидирование двойной связи с каталитический ванадилацетилацетонат (VO (acac) 2 ) (10 мол.%) и т -BuOOH дает соответствующий эпоксид 21 — 23 в виде единственного диастереомера в 82%, 95% и 82% выход за две ступени соответственно.Относительная конфигурация из 22 определено методом рентгеноструктурного анализа. (См. Файл SI CIF). Далее вторичный гидроксильные группы 21 — 23 были защищены в виде TBS-эфира с O — ( т -бутилдиметилсилил) бензанилидом (TBS-BEZA) и TfO — PyH + . Пивалик сложный эфир удаляли с помощью DIBAL в THF при -30 ° C с получением спирты 24 — 26 в 59%, 66% и 64% соответственно за два шага.Наконец, спирты 2 4 — 26 обрабатывали 2-меркаптобензотиазолом. (BtSH), PPh 3 и диизопропилазодикарбоксилат (DIAD) в получают бензотиазолилсульфид, который окисляют м -хлорпероксибензойной кислотой ( м -CPBA) до генерируют сульфоны 6 — 8 в 73%, 78% и 69% доходность по двум ступеням соответственно.
Сульфон 6 и альдегид 12 были обработаны с LiN (SiMe 3 ) 2 (LHMDS) при −78 ° C в ТГФ (олефинирование Джулии-Коциенски) с получением диенового соединения, который обрабатывали HCl / MeOH (0.05%) с получением спирта 27 с выходом 63% за две стадии (схема 4а). 44 Далее, синтезировать связующие соединения 28 и 29 , мы изначально попробовали олефинирование Юлии-Коциенского с сульфонами 7 , 8 и альдегидом 12 , но реакция была неудачный. Подробности условий реакции показаны на схеме S3. Как показано на схеме 4b, мы попробовали другую комбинацию муфты. Окисление первичных спиртов 24 и 25 с помощью DMP давало соответствующие альдегиды 9 и 10 , а обработка сульфона 11 (21) и альдегидов 9 и 10 с получением LHMDS соответствующий продукт сочетания в приемлемых выход, который обрабатывали HCl / MeOH (0.05–0,1%), чтобы дать спирты 28 и 29 с выходами 39% и 59% более трех ступеней соответственно. 45 Ацетилирование спиртов 27 — 29 с Ac 2 O, триэтиламином (TEA) и N , N- диметил-4-аминопиридин (DMAP) дает соответствующий ацетат, и после удаления группы TBS с помощью TBAF она сгенерировала 3 — 5 с выходами 72%, 82% и 86% за два этапа, соответственно (схема 4в).
(a) Синтез 27 , (b) Синтез 28 и 29 , и (c) производное 1,2-дезоксипиранозы 3 и его производное эпоксидного заместителя 4 и 5.
Исследование биологической активности представлена в таблице 1. Производные 3 — 5 подавленные AR-V7 сплайсинг (IC 50 = 3,3, 202 и 187 нМ соответственно). В биологическая активность 4 и 5 была практически идентичен таковому у 2 (IC 50 = 132 нМ), но активность 3 была значительно улучшена по сравнению с из 2 .Результат из 3 предположили, что фенильная группа в положении C1 может создавать стерические препятствия в комплексе SF3b и устранять фенильная группа значительно улучшила биологическую активность. В результаты 4 и 5 показали, что введенные метильная группа на эпоксиде может блокировать сеть водородных связей вокруг эпоксида и ослабляют взаимодействие с комплексом SF3b. Поскольку были различные аминокислотные остатки, которые могли взаимодействовать с эпоксид 4 или 5 , разница стереохимия ( R и S ) эпоксиметил не влиял на биологическую активность.С уважением в тесте на токсичность in vivo мыши дикого типа, которым вводили 1 (280 нМ / тело, n = 6), показали тяжелую токсичность (мыши погибли в течение 24 ч).
Таблица 1
Выражение AR-V7 Тормозная активность Оценка для 1 и 3 — 5
IC 50 (нМ) | ||||
---|---|---|---|---|
3 | 4 | сплайсостатин A ( 1 )|||
AR-V7-GFP отрицательная популяция | 3.3 | 202 | 187 | 0,6 |
Однако ни одна из мышей, подвергшихся лечению с 3 (280 нМ / тело, n = 7) умерло, и они не показали значительного веса потеря по сравнению с мышами, которых лечили только ДМСО ( n = 8) (). 46-49
In vivo оценка токсичности ДМСО, 3 и сплайсостатин А ( 1 ) для мышей дикого типа (инъецированный на 0, 2, 4 сутки 280 нмоль / тело, n = 6-8).Сплайсостатин A убил всех обработанных мышей ( n = 6).
В заключение, мы разработали, синтезировали и биологически оценен производные сплайсостатина А, производное 1,2-дезоксипиранозы 3 и концевые эпоксидные метилзамещенные производные ( 4 , 5 ). Фрагмент 1,2-дезоксипиранозы и его концевой эпоксидный метилзамещенный фрагмент были синтезированы из коммерчески доступный d-глюкаль, и синтетические стадии для 24 были довольно короткими. 21 Мы также исследовали олефинирование Юлии-Коциенски на предмет соответствующих комбинации. Кроме того, значения IC 50 при подавлении AR-V7 для соединений 3 — 5 были слабее чем у 1 ; однако соединение 3 показало активность (IC 50 ) в низком наномолярном диапазоне. Тест in vivo на токсичность показал, что мыши дикого типа, обработанные с 1 умерли в течение 24 часов, но мыши, обработанные 3 , не умерли в течение 14 дней и не показали потери веса.Следовательно, мы успешно создали 3 с высоким выражением AR-V7 ингибирующая активность и низкая токсичность in vivo .
тазповер
17 октября 2019 г. Пресс-релиз
Stealth BioTherapeutics объявила о презентации новых данных из открытой расширенной части исследования TAZPOWER фазы 2/3 по оценке эламипретида у пациентов с синдромом Барта. Результаты, представленные на ежегодном собрании Американского общества генетики человека (ASHG) в 2019 году в Хьюстоне, штат Техас, показали, что лечение эламипретидом привело к увеличению среднего ударного сердечного объема на 27% или количества крови, перекачиваемой левым желудочком сердца. за сокращение от исходного уровня испытания (40.8 мл) до 36-й недели (51,8 мл) открытого расширения. Ударный объем левого желудочка является одним из основных факторов, определяющих сердечный выброс или объем крови, перекачиваемый сердцем, который является важным показателем того, насколько эффективно сердце может удовлетворить потребности организма в перфузии различных органов. У здоровых мальчиков-подростков ожидаемый средний ударный объем составляет 85 мл.
«Основываясь на представленных данных, показывающих увеличение ударного объема, лечение эламипретидом, по-видимому, улучшило функцию сердца, что может указывать на ремоделирование сердца», — отметил д-р.В. Рид Томпсон, адъюнкт-профессор педиатрии медицинского факультета Университета Джона Хопкинса. «Большинство пациентов с синдромом Барта страдают сердечным заболеванием, поэтому сердечный эффект был бы важным исходом в этих условиях, который требует дальнейшего исследования».
Щелкните здесь, чтобы увидеть полный пресс-релиз.
Ниже приводится краткое изложение прямой презентации, предложенной в сотрудничестве с Фондом синдромов Барта (BSF) для пациентов с синдромом Барта и членов их семей 21 марта 2018 г.Генеральный директор Stealth BioTherapeutics Рини Маккарти и главный специалист по клиническим разработкам Джим Карр, Pharm.D., Представили обновленную информацию о клинических испытаниях Stealth при синдроме Барта и первичной митохондриальной миопатии и ответили на вопросы сообщества.
Это резюме и его содержимое предназначены только для справочных целей и для предполагаемой аудитории. Такие репродукции и копии разрешены только в том случае, если они предоставляются Stealth непосредственно целевой аудитории.
BSF напоминает нашему сообществу, что этот веб-семинар был предназначен для того, чтобы помочь информировать и просвещать наши семьи. Это никоим образом не является одобрением Stealth или его исследуемого соединения эламипретида. Это краткое изложение и его содержание не предназначены для предоставления или замены медицинских рекомендаций. Посоветуйтесь со своим врачом по поводу лечения, которое может быть подходящим для вас или члена вашей семьи.
О нашем партнерстве с сообществом Барт
Клинические испытания необходимы для продвижения разработки экспериментальных методов лечения к потенциальному одобрению.Перед проведением клинических испытаний целесообразно провести обширные лабораторные эксперименты и на животных, и за это мы признательны Биллу Пу, Натану Алдеру, Хейзел Сзето и другим членам Научно-медицинского консультативного совета BSF за их рекомендации и выводы. Однако, помимо этого, мы безмерно, безмерно благодарны сообществу Barth. Участвовать в клинических испытаниях непросто, весело или удобно. Это влечет за собой поездки, инъекции, оценки и оценки, которые могут быть очень разрушительными и утомительными из-за неопределенной клинической пользы.Это требует целеустремленности, настойчивости и храбрости.
Мы приветствуем участников наших испытаний и их семьи, которые терпят все эти потрясения в своей повседневной жизни. Мы с сожалением отмечаем самоотверженность исследователей в наших испытаниях, которые выполняют эту работу сверх своей обычной загруженности. Мы благодарны BSF и его научному консультативному совету за поддержку этого исследования и за сотрудничество с нами в его проведении. Мы искренне надеемся, что это поможет улучшить понимание этого заболевания и приблизит нас к терапевтическому вмешательству.
О компании Stealth BioTherapeutics
Основанная в 2006 году, Stealth BioTherapeutics — это биофармацевтическая компания на клинической стадии, разрабатывающая исследуемые препараты для лечения заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией. Наша научная деятельность сосредоточена на митохондриях и на том, как митохондриальная терапия может положительно повлиять на жизнь пациентов. Мы стремимся позитивно влиять на жизнь пациентов с помощью новых вариантов лечения и предлагать медицинским работникам возможность изменить клиническую практику и результаты лечения пациентов.Наши соединения разрабатываются для лечения митохондриальных заболеваний, для которых не существует лечения, одобренного FDA, и где современные подходы часто носят лишь паллиативный характер. Нашим ведущим кандидатом в разработке является эламипретид, исследуемый препарат, который разработан как для системного, так и для офтальмологического применения, с потенциалом модифицировать заболевание посредством митопротекции — способности улучшать функцию митохондрий при одновременном снижении окислительного стресса.
Наука, лежащая в основе нашего ведущего кандидата-исследователя, поддерживается независимыми рецензируемыми публикациями и рефератами, представленными в международно признанных научных журналах, на конгрессах и симпозиумах.
В настоящее время Stealth проводит клинические испытания для пациентов с первичной митохондриальной миопатией, синдромом Барта, наследственной оптической нейропатией Лебера и связанной с возрастом дегенерацией желтого пятна. Исследование синдрома Барта называется TAZPOWER.
Эламипретид и митохондриальная энергия
Щелкните изображение для просмотра в полноэкранном режиме
Митохондрии находятся почти в каждой клетке тела и производят около 90% энергии (АТФ), необходимой для жизни человека.Митохондрии имеют две мембраны, внешнюю и внутреннюю митохондриальную мембрану. АТФ продуцируется цепью переноса электронов (ETC), расположенной в пределах изгибов, или крист, внутренней митохондриальной мембраны. Кардиолипин, фосфолипид, обнаруженный только в этой внутренней мембране, отвечает за формирование структуры крист. Эламипретид нацелен на кардиолипин и связывается с ним,
, стабилизирующий его при окислительном стрессе. Более поздние эксперименты показали, что эламипретид также связывается с монолизокардиолипином, который может иметь аналогичный стабилизирующий эффект.
Щелкните изображение, чтобы просмотреть в полный размер.
Кривизна крист внутренней митохондриальной мембраны (IMM) важна структурно, потому что она поддерживает комплексы ETC в оптимальной близости друг к другу. В дисфункциональных митохондриях высокий уровень окислительного стресса может вызвать перекисное окисление кардиолипина, которое изменяет его нормальную структуру. Это, в свою очередь, приводит к деградации архитектуры крист, что, в свою очередь, приводит к смещению комплексов ETC и дальнейшему нарушению функции ETC.
Кардиолипин и митохондриальная мембрана
Как указывалось ранее, эламипретид нацелен на кардиолипин и обратимо связывается с ним во внутренней митохондриальной мембране, стабилизируя его при окислительном стрессе. Этот эффект был проиллюстрирован во время эксперимента с использованием кардиомиоцитов морской свинки или клеток сердца. Клетки сердца обладали более здоровым мембранным потенциалом и жизнеспособностью клеток во время окислительного стресса при обработке эламипретидом по сравнению с плацебо. Окислительный стресс повреждает кардиолипин, вызывая митохондриальную дисфункцию и вызывая апоптоз или гибель клеток.
Хотя этот эксперимент был проведен ex vivo (не на живом животном) с использованием здоровых кардиомиоцитов морских свинок, и поэтому он не может быть предсказуемым для людей с генетическим митохондриальным заболеванием, он действительно помогает проиллюстрировать защитную роль эламипретида для митохондрий, подвергающихся окислительному процессу. стресс.
Кардиолипинв здоровых митохондриях сердца и скелетных мышц, или кардиолипин 18: 2: 4, имеет 4 жирные ацильные цепи, которые придают ему коническую структуру, которая создает изогнутую основу крист внутренней митохондриальной мембраны.Как обсуждалось выше, изгибы крист помогают удерживать комплексы ETC близко друг к другу, оптимизируя создание АТФ и минимизируя утечку электронов и связанную с ними генерацию активных форм кислорода.
Нездоровые митохондрии имеют аномальный кардиолипин, часто из-за того, что кардиолипин подвергся перекисному окислению или деградации в результате окислительного стресса. Это изменяет его коническую структуру и приводит к аномальной структуре крист, которая затем позволяет комплексам цепи переноса электронов дрейфовать, увеличивая утечку электронов и вызывая еще больший окислительный стресс.
Данные показывают, что одна молекула эламипретида может связываться с двумя молекулами кардиолипина (Szeto, 2014). Благодаря своей уникальной структуре эламипретид взаимодействует с кардиолипином или связывается с ним в двух местах: в верхней части (или в головных группах) и в хвостах (или цепях жирных кислот) молекулы. Мы считаем, что взаимодействие эламипретида с кардиолипином помогает стабилизировать кардиолипин от повреждающего воздействия окислительного стресса, тем самым предотвращая или уменьшая дальнейшую дисфункцию митохондриальных мембран и, в конечном итоге, гибель клеток.
При синдроме Барта дефицит кардиолипина в первую очередь связан с генетической мутацией, приводящей к аномальному составу кардиолипина. Генетическая мутация затрагивает тафаззин , фермент ремоделирования кардиолипина, в результате чего образуется форма кардиолиопина, называемая монолискардиолипином или MLCL. MLCL отличается от типичного кардиолипина тем, что имеет только три «хвоста», тогда как типичный кардиолипин имеет четыре «хвоста», как обсуждалось выше. Важно отметить, что это изменение изменяет функцию митохондрий и снижает выработку энергии в них.
Щелкните изображение, чтобы просмотреть в полном размере
Исследования на животных по оценке эламипретида
Высокоэнергетические системы органов больше зависят от производства энергии митохондриями. Фактически, только сердце производит около 6 кг АТФ в день! Следовательно, дисфункция митохондрий непропорционально влияет на высокоэнергетические системы органов. У пациентов с синдромом Барта функция скелетных мышц и сердечная функция часто нарушены, что вызывает слабость, утомляемость и кардиомиопатию.Точно так же у пациентов с другими первичными митохондриальными заболеваниями может быть нарушена функция скелетных мышц, сердца и глаз, что приведет к мышечной слабости, непереносимости физических упражнений, кардиомиопатии, потере зрения и т. Д. Нормальная структура и функция митохондрий важны для правильного функционирования этих систем органов. .
Доклинические (животные) модели заболеваний показали, что лечение эламипретидом восстанавливает структуру и функцию митохондрий с соответствующим повышением выработки АТФ и снижением образования АФК до нормальных или близких к нормальным уровням, а также снижает воспаление, фиброз и гибель клеток (Szeto et al, 2015; Szeto and Birk, 2014).Также было обнаружено, что лечение эламипретидом улучшает функцию органов на животных моделях стареющих скелетных мышц, сердечной недостаточности, острого повреждения почек, нейродегенеративных заболеваний и заболеваний глаз. Однако по-прежнему необходимы дополнительные исследования на людях, чтобы оценить потенциальную эффективность эламипретида у людей с этими заболеваниями.
Щелкните изображение для просмотра в полном размере
Путешествие по разработке лекарств от редких заболеваний
Процесс разработки терапевтических средств для редких заболеваний включает в себя несколько этапов, от открытия потенциально терапевтических соединений до тестирования их безопасности и эффективности в клетках, тканях и животных, до тестирования их безопасности на здоровых добровольцах, а затем до тестирования их на безопасность и эффективность. эффективность у людей с заболеваниями.Этот процесс обычно занимает десятилетие или больше.
Щелкните изображение, чтобы просмотреть его в полном размере
Процесс начинается с проверки множества молекул на предмет основных физических и химических характеристик. Затем на животных проводят испытания, чтобы исключить очевидную токсичность, а также понять, проявляют ли выбранные молекулы активность в различных моделях заболеваний. Следует отметить, что с момента выбора молекулы для проведения доклинических испытаний вероятность того, что лекарство будет успешно коммерциализировано, составляет лишь около 5-10%.
Предполагая, что очевидная токсичность не выявлена, и молекула, по-видимому, проявляет активность на моделях заболевания, молекула переходит к клиническим испытаниям в фазе 1 клинических испытаний, которые обычно проводятся на добровольцах без болезней для оценки безопасности для людей. Начиная с фазы 1, молекула переходит к фазе 2 клинических испытаний, обычно проводимых на пациентах с заболеванием и предназначенных для дальнейшей оценки безопасности и эффективности (благоприятное влияние на признаки и симптомы заболевания).Если лекарство кажется безопасным и эффективным, подтверждающее тестирование проводится в клинических испытаниях фазы 3. Вообще говоря, если не считать редких заболеваний, в этом процессе будет участвовать более 1000 человек. Если на этапе 3 подтверждается безопасность и эффективность препарата, спонсор (то есть фармацевтическая компания) подает заявку на одобрение в FDA, что обычно занимает около года. В совокупности этот процесс нередко занимает 10 и более лет.
Для ультра-редких заболеваний, таких как Барт, для которых нет одобренных методов лечения и число больных невелико, может быть сложно провести несколько клинических испытаний с точки зрения набора персонала.По этой причине, если данные продолжающегося исследования TAZPOWER свидетельствуют о клинической пользе, Stealth может обсудить с FDA возможность получения одобрения на основе этих данных.
Результаты клинических испытаний первичной митохондриальной миопатии (ПММ)
MMPOWER , первое клиническое испытание Stealth с участием пациентов с ПММ, было рандомизированным двойным слепым плацебо-контролируемым испытанием, в котором проверялась безопасность, переносимость и эффективность трех различных доз эламипретида, вводимых один раз в день внутривенно в течение пяти дней, у 36 пациентов (возраст 16-65) с ПММ.Оказалось, что лечение эламипретидом хорошо переносится, серьезных побочных эффектов не наблюдалось. Пациенты, получавшие наивысшую дозу эламипретида, продемонстрировали улучшение на 44 метра с поправкой на плацебо в тесте с шестиминутной ходьбой (6MWT) — оценке, измеряющей, как далеко они могут пройти за шесть минут. Это достигло номинального значения и поддержало дальнейшие исследования эламипретида в этой популяции пациентов.
MMPOWER-2 , клиническое испытание Stealth фазы 2 для лиц с PMM, было рандомизированным двойным слепым плацебо-контролируемым испытанием для оценки безопасности, переносимости и эффективности эламипретида, вводимого один раз в день подкожно 30 пациентам (возраст от 16 до 16 лет). 65) с PMM.Это было 12-недельное перекрестное испытание, означающее, что участники были рандомизированы для получения инъекций либо эламипретида, либо плацебо в течение начального 4-недельного периода, после чего они не получали лечения в течение 4-недельного периода «вымывания» перед скрещиванием. для получения противоположной инъекции в течение последних 4 недель. Исследование TAZPOWER для людей с синдромом Барта имеет аналогичный перекрестный дизайн, но продолжительность каждого периода лечения составляет 12 недель.
Целью MMPOWER-2 была дальнейшая оценка безопасности, а также доказательства эффективности по нескольким конечным точкам для поддержки исследования фазы 3 для людей с PMM.Первые результаты MMPOWER-2 показали улучшения во многих конечных точках, включая следующие конечные точки:
- 6MWT: субъекты, получавшие эламипретид, прошли в среднем на 20 метров дальше на 6MWT, чем пациенты, получавшие плацебо, хотя эта разница не достигла статистической значимости.
- Полная усталость PMMSA: PMMSA (Оценка симптомов первичной митохондриальной миопатии) — это инструмент оценки результатов, разработанный Stealth, в соответствии с которым пациенты с PMM сообщают о своей усталости, мышечной слабости и других неприятных симптомах по шкале 1 (наименее тяжелые). ) до 4 (наиболее тяжелая форма) на каждый симптом.Во время приема эламипретида они сообщили о значительном уменьшении утомляемости, которое было статистически значимым по сравнению с тем, как они оценивали свое чувство усталости во время приема плацебо.
Шкала утомляемости NeuroQoL. Шкала утомляемости NeuroQoL была разработана Национальными институтами здравоохранения и использовалась для измерения утомляемости во многих исследованиях нервно-мышечных заболеваний. В MMPOWER-2 субъекты, получавшие эламипретид, показали статистически значимое и клинически значимое улучшение утомляемости по этой шкале.
PMMSA Самый беспокоящий симптом: Когда испытуемых регистрировали в MMPOWER-2, их просили определить, какой из симптомов, идентифицированных PMMSA, больше всего беспокоит их лично. Помимо утомляемости и мышечной слабости, эти симптомы включали головную боль, желудочно-кишечные симптомы, равновесие, зрение и т. Д. Во время приема эламипретида у них наблюдалось статистически значимое улучшение их индивидуального «наиболее беспокоящего симптома», оцененного PMMSA.
MMPOWER-3 — это текущее испытание фазы 3, которое проводится для лиц, завершивших REPOWER, обсервационное исследование в PMM. Во время MMPOWER-3 мы будем использовать многие из тех же конечных точек, которые использовались в MMPOWER-2.
Безопасность, переносимость и введение эламипретида
Эламипретид вводили путем внутривенной инфузии или подкожной инъекции более чем 500 здоровым добровольцам и пациентам. Лечение эламипретидом в целом оказалось безопасным и хорошо переносимым, без серьезных побочных эффектов по сравнению с контрольной группой плацебо в исследованиях, проведенных на сегодняшний день.Однако полная характеристика профиля безопасности эламипретида продолжается, и ее необходимо продолжать тщательно оценивать, прежде чем можно будет сделать какие-либо окончательные заключения о профиле безопасности исследуемого продукта.
Эламипретид и его плацебо-контроль вводятся подкожно (вводятся самостоятельно ежедневно) в испытаниях TAZPOWER и MMPOWER-3. Наиболее частыми побочными эффектами, наблюдаемыми при подкожном введении, являются преходящие реакции в месте инъекции, которые обычно характеризовались как легкие по своей природе.Большинство участников исследования TAZPOWER сообщили о реакциях в месте инъекции в течение первого периода лечения, что позволяет предположить, что эти реакции возникают как с эламипретидом, так и с плацебо у лиц с Барт, которые участвуют в исследовании TAZPOWER.
Доклинические исследования синдрома Барта
Stealth Biotherapeutics благодарит BSF и его научно-медицинский консультативный совет за поддержку исследования, посвященного изучению влияния эламипретида на людей с синдромом Барта, и за его партнерство в отношении соответствующей доклинической работы, проводимой нами, а также независимыми академиками. исследователи.
Щелкните изображение для просмотра в полном размере
Как уже упоминалось, эламипретид связывается с типичным кардиолипином, также называемым кардиолипином 18: 2: 4, в соотношении две молекулы кардиолипина к одной молекуле эламипретида, стабилизируя его при окислительном стрессе. Как обсуждалось выше, похоже, что эламипретид связывается как с верхней (или головными группами), так и с хвостами (или цепями жирных кислот) молекулы кардиолипина. Мы думаем, что это может иметь значение в контексте Барта, в котором «хвостовой» состав MLCL отличается от типичного кардиолипина тем, что MLCL имеет три по сравнению с типичными четырьмя «хвостами».Структура верхней или головной группы такая же, как у MLCL и кардиолипина, поэтому можно ожидать, что эламипретид все еще может там связываться.
Клеточные эксперименты в системах моделирования липидного бислоя также предполагают, что эламипретид связывается с MLCL в том же соотношении, что и типичный кардиолипин (Alder & Szeto, et.al.). Это обеспечивает доклиническое обоснование гипотезы о том, что эламипретид может аналогичным образом связываться с монолизокардиолипином у пациентов с Барт.
В другом эксперименте ex-vivo, проведенном докторомBill Pu с использованием кардиомиоцитов или сердечных клеток, полученных от индивидов Барта, а также нормальных сердечных клеток, эламипретид улучшал митохондриальную функцию в клетках, полученных из Барта (Кардиомиопатия с помощью медицинской терапии в мышиной модели синдрома Барта, представленная на конференции BSF 2016, Клируотер-Бич. , Флорида, 22 июля 2016 г.). В этом эксперименте кардиомиоциты, полученные из Барта, прилагали больше усилий в состоянии покоя, чем нормальные сердечные клетки, предполагая, что им нужно больше работать, чтобы производить минимальную энергию, необходимую в состоянии покоя.Напротив, кардиомиоциты, полученные из Барта, были неспособны затрачивать значительно больше усилий при максимальной нагрузке, что позволяет предположить, что у них нет свободных мощностей для увеличения выработки энергии по требованию. По-видимому, дисфункциональным митохондриям требуется гораздо больше «усилий» для производства АТФ, даже в состоянии покоя. При лечении эламипретидом кардиомиоциты, полученные из Барта, вели себя ближе к норме.
Хотя это эксперимент на клеточных линиях, полученных из Барта, а не на живом животном, эти и другие доклинические исследования предоставили научную поддержку эламипретиду как терапевтическому кандидату для Барта.
Нажмите на изображение для просмотра в полном размере
TAZPOWER
Дизайн испытания TAZPOWER аналогичен описанному выше для MMPOWER-2. TAZPOWER — это двойное слепое плацебо-контролируемое рандомизированное перекрестное исследование. Лица, участвующие в испытании, получали либо эламипретид, либо плацебо в течение периода лечения 3 месяца, а затем переходили на противоположное лечение после периода вымывания. Учитывая, что синдром Барта встречается очень редко, в исследование включены только 12 человек; дизайн перекрестного исследования обеспечивает большую статистическую мощность, что особенно важно при таком небольшом числе участников.В ходе этого исследования оценивается несколько конечных точек, большинство из которых было выбрано на основе отзывов клиницистов и людей, страдающих Барт, о функциональных нарушениях (то есть непереносимости физических упражнений, слабости) и симптомах, испытываемых людьми с Барт. К ним относятся оценка симптомов синдрома Барта (BTHS-SA), новый инструмент оценки результатов, сообщаемый пациентами, который был разработан Stealth на основе информации, собранной во время интервью с людьми, живущими с синдромом Барта. После того, как субъекты завершат испытание, у них будет возможность продолжить прием препарата в течение открытого периода продления.
Голоса пациентов в редких заболеваниях
FDA неоднократно указывало на важность включения «голоса пациента» в разработку лекарств. Это особенно важно при редких заболеваниях. Например, Закон о лечении 21 века требует, чтобы спонсоры учитывали точку зрения пациента. PDUFA, закон о плате за лекарства, отпускаемые по рецепту, специально поощряет использование результатов, сообщаемых пациентами. Эти нормативные инициативы подчеркивают важность показателей результатов, сообщаемых пациентами, таких как BTHS-SA, разработанная нами для исследования TAZPOWER.
Голос людей с редкими заболеваниями и их пропаганда имеют решающее значение в обучении FDA. В очень небольшом клиническом исследовании, таком как TAZPOWER, может быть сложно увидеть убедительные клинические данные, которые достигают статистической значимости. Голос пациента может быть особенно критичным в этой обстановке. Stealth намеревается продолжать активно взаимодействовать как с сообществом BSF, так и с FDA с целью как можно быстрее предоставить терапевтические возможности пациентам, страдающим синдромом Барта.
Вопросы и ответы сообщества
Многие мальчики и молодые люди с BTHS перенесли трансплантацию сердца и в настоящее время исключены из испытаний эламипретида.Пожалуйста, объясните, почему и будет ли у этих людей возможность участвовать в будущем.
Лица, перенесшие трансплантацию сердца, были исключены, чтобы свести к минимуму любые искажающие переменные, которые могли бы повлиять на результаты испытания. Предпринимаются агрессивные попытки минимизировать переменные, чтобы конечные точки (измеримые результаты) исследования могли быть надежно связаны с исследуемым препаратом и не зависели от каких-либо других переменных.В этом случае, хотя люди, перенесшие BTHS и трансплантацию сердца, не имели права на TAZPOWER, если препарат был одобрен, то эти люди имели бы доступ к препарату, если их лечащий врач посчитал это целесообразным.
Что означает статус Fast Track (предоставленный Stealth для эламипретида в исследовании BTHS FDA в 2017 году) и период продления открытого лейбла?
СтатусFast Track, присвоенный FDA, обеспечивает упрощенный путь между компанией и FDA и просто подразумевает более высокий уровень взаимодействия и партнерства из-за важности клинического исследования.Он не предоставляет пациентам более широкого или быстрого доступа к исследуемому препарату.
Открытое расширение (OLE) для пациентов с редкими заболеваниями важно, поскольку оно позволяет пациентам продолжать терапию до тех пор, пока лекарство не будет одобрено, если есть выгода. OLE доступен для пациентов, участвующих в исследовании TAZPOWER, до тех пор, пока препарат не будет одобрен для лечения синдрома Барта или пока Stealth не прекратит усилия по развитию этого заболевания. OLE также предоставляет возможность постоянного сбора данных о безопасности.
Если кардиолипин недостаточен у людей с BTHS, как действует эламипретид (поскольку эламипретид связывается с кардиолипином)?
Доклиническая работа Ex-vivo продемонстрировала, что соотношение связывания эламипретида и монолискардиолипина такое же, как у нормального кардиолипина, а также продемонстрировало улучшение функции кардиомиоцитов, полученных из Барта.Эта работа поддерживает гипотезу о том, что эламипретид может стабилизировать внутреннюю митохондриальную мембрану у людей с BTHS, несмотря на дефицит кардиолипина. Однако нам нужно будет оценить данные продолжающегося исследования TAZPOWER, чтобы убедиться, что клинические данные являются подтверждающими.
Почему детям младше 12 лет не разрешили участвовать в исследовании TAZPOWER, и будут ли эти дети когда-либо иметь доступ к препарату?
Исторически сложилось так, что FDA поощряло спонсоров демонстрировать безопасность и эффективность новых исследуемых продуктов, таких как эламипретид, у взрослых, прежде чем предоставлять доступ педиатрическим пациентам.По этой причине TAZPOWER был ограничен для лиц старше 12 лет. Тем не менее, Stealth хорошо осведомлен о бремени болезни, которую синдром Барта представляет для маленьких детей, и стремится разработать терапию для детей с Барт, если будет доказана эффективность эламипретида у взрослых с Барт. Соответственно, Stealth оценивает возможность клинического исследования синдрома Барта у детей, включая оценку возраста и ограничений дозирования, которые, вероятно, будут на основе мг / кг, а не стандартной подкожной дозы, которая в настоящее время используется в TAZPOWER и MMPOWER-3.
Из клинических испытаний Stealth, какие из клинических испытаний наиболее многообещающие и с наибольшей вероятностью приведут к одобрению препарата?
Несмотря на то, что Stealth провела большую часть клинических исследований митохондриальной миопатии, возможно, что TAZPOWER станет первым испытанием, которое приведет к одобрению эламипретида.
Влияет ли эламипретид на спортсменов и работоспособность? Почему 6MWT (тест с шестиминутной ходьбой) был выбран в качестве основной конечной точки в исследованиях TAZPOWER и MMPOWER?
Эламипретид не влияет на нормальные митохондрии.В моделях на мышах молодая здоровая мышь не имеет никакого преимущества при введении эламипретида, поэтому мы не можем ожидать, например, что спортсмены или другие здоровые люди получат пользу от эламипретида. Однако у старых мышей с митохондриальной дисфункцией эламипретид восстанавливает митохондриальную функцию почти до нормального уровня.
Клинические испытания должны иметь функциональные и субъективные конечные точки, которые позволяют исследователям единообразно оценивать пользу для всех пациентов. Это должно дать регулирующим органам уверенность в том, улучшаются ли клинические результаты, такие как утомляемость и функция скелетных мышц, статистически значимым образом.
ИспытанияTAZPOWER и MMPOWER включают как субъективные тесты, такие как NeuroQoL и PMMSA / BTHS-SA, так и функциональные тесты, такие как 6MWT. 6MWT, который измеряет функцию скелетных мышц, оценивая, как далеко человек может пройти за 6 минут, является конечной точкой, хорошо признанной регулирующими органами в США и Европе.
Будет ли доза корректироваться в зависимости от веса во время испытания или периода OLE? Является ли вес фактором, влияющим на эффективность препарата, или стандартная доза, попавшая в организм, должна одинаково работать для людей с таким разным весом? Некоторые 12-летние дети могут с трудом выполнять требования к весу, а другие могут весить намного больше.
Хотя исследователи Stealth наблюдали доказательства доза-ответ в одном из наших испытаний, после достижения определенной степени воздействия лекарственного средства мы не думаем, что есть дополнительные преимущества от увеличения воздействия еще выше. Поэтому, несмотря на признание того, что у одного субъекта может быть значительно более высокое воздействие препарата, чем у другого, мы не думаем, что это приведет к разной эффективности. Вообще говоря, как только мы достигли терапевтической дозы (которая, по нашему мнению, является дозой 40 мг, которую мы тестируем в TAZPOWER), не наблюдается сильной корреляции между даже более высокими концентрациями и эффектами эламипретида.
Возможно ли, что лекарство могло занять больше времени у некоторых субъектов Барта, чем у других, чтобы доказать свою эффективность?
По идее, чтобы увидеть ответ одного предмета по сравнению с другим, может потребоваться больше времени. Например, могут быть различия в степени окислительного стресса, который существует в митохондриях между одним человеком и другим. Кроме того, это может зависеть от желаемого эффекта. Например, может потребоваться больше времени, чтобы увидеть улучшение выполнения упражнений по сравнению с улучшением симптомов.
Влияет ли возраст на эффективность эламипретида? Например, чем старше пациент Барта, тем менее эффективным может быть лекарство для снятия усталости. Однако в презентации говорилось о влиянии на «стареющих животных». Были ли это «нормальные» стареющие животные, поэтому эламипретид помогает при «нормальном старении», но не влияет на влияние старения на людей, у которых также есть синдром Барта?
Возраст сам по себе не должен влиять на эффективность препарата.Вместо этого в исследованиях на животных, а также в некоторых исследованиях на людях было обнаружено, что более дисфункциональные митохондрии, по-видимому, лучше реагируют на препарат. Другими словами, чем больше присутствовала дисфункция, тем лучше действовало лекарство. С вашей точки зрения, причина, по которой мы считаем, что видим признаки улучшения в «нормальном старении», заключается в том, что дисфункция митохондрий связана с «нормальным старением»; тогда как у Барта дисфункция митохондрий обычно существует с рождения.
Старение может привести к снижению митохондриальной активности, поэтому возможно, что препарат может иметь дополнительные преимущества, поскольку человек Барта продолжает стареть, но нам потребуются дополнительные данные, чтобы мы могли оценить это.
Для многих лекарств конкретная мутация имеет значение. Так ли обстоит дело с синдромом Барта и эламипретидом?
Очень хороший отзыв. Например, некоторые люди с синдромом Барта могут иметь большую способность производить тафаззин . Возможно, эти люди будут лучше или хуже реагировать на препарат. Это тонкости, которые мы не смогли выяснить в проведенных нами доклинических экспериментах.
Можно ли улучшить в 6MWT на 44 метра или более, но при этом человек на самом деле не чувствует себя лучше? Может ли более длительное употребление препарата помочь больше?
Да, это возможно.6MWT описывает влияние на физическое функционирование, но не отражает изменений в симптомах. Есть надежда, что препарат может улучшить как физическое функционирование, так и симптомы. Кроме того, можно было бы надеяться, что улучшение физического функционирования приведет к способности лучше выполнять действия, связанные с повседневной жизнью, тем самым улучшая качество жизни. Также возможно, что более длительное лечение эламипретидом может помочь, поскольку улучшение митохондриальной функции может, в свою очередь, привести к улучшению функции конечных органов, но это то, что нам нужны дополнительные данные, чтобы установить в отношении Барта.
Когда команда Stealth говорит о слабости и усталости, используют ли они эти слова как синонимы?
Нет, под слабостью понимается слабость скелетных мышц. Усталость больше связана с чувством истощения или сильной усталости.
Поскольку одно из испытаний эламипретида было специально для сердечной недостаточности, существует ли вероятность улучшения функции сердца у пациентов с синдромом Барта, даже если нет улучшения в 6MWT?
Да, может быть воздействие на сердце, не зависящее от воздействия на работоспособность.Чтобы лучше понять это, нам нужно будет оценить данные после завершения испытания.
Дополнительные ссылки
Szeto HH. Первое в своем классе кардиолипин-защитное соединение в качестве лечебного средства для восстановления биоэнергетики митохондрий. Br J Pharmacol. 2014 Апрель; 171 (8): 2029-50.
Szeto HH, Liu S, Soong Y, Birk AV. Улучшение митохондриальной биоэнергетики в условиях ишемии увеличивает толерантность к теплой ишемии в почках. Am J Physiol Renal Physiol.2015, 1 января; 308 (1): F11-21. Epub 2014 22 октября
Szeto HH, Birk AV. Интуиция и открытие новых соединений, восстанавливающих пластичность митохондрий. Clin Pharmacol Ther. 2014 декабрь; 96 (6): 672-83.
Sathappa M, Ольха NN. Ионизирующие свойства кардиолипина и его вариантов в модельных бислоях. Biochim Biophys Acta. 2016 июнь; 1858 (6): 1362-72. Epub 2016 7 марта
Кимура Т., Дженнингс В., Эпанд РМ. Роли конкретных видов липидов в клетке и их молекулярный механизм.Prog Lipid Res. 2016 Апрель; 62: 75-92. Epub 2016 11 февраля
Для получения дополнительной информации о Stealth BioTherapeutics посетите сайты www.StealthBT.com и www.clinicaltrials.gov.
Stealth BT благодарит BSF (www.barthsyndrome.org) и пациентов и их семьи, страдающие от Барта, за их поддержку и сотрудничество.
базолатеральных сортирующих сигналов рецепторов тиротропина и лютеинизирующего гормона: необычное семейство сигналов, имеющих необычную дистальную внутриклеточную локализацию, но не связанных по своей структуре | Молекулярная эндокринология
Аннотация
Механизмы базолатерального нацеливания на рецепторы, связанные с G-белком, остаются в значительной степени неизвестными.Эксперименты по мутагенезу позволили нам идентифицировать базолатеральные сигналы сортировки рецепторов ТТГ и ЛГ, экспрессируемых в клетках почек собак Madin-Darby и фолликулярных клетках FRT щитовидной железы. Неожиданно эти сигналы (аминокислоты 731–746 и 672–689 соответственно) имеют необычную локализацию в дистальной части внутриклеточного домена рецепторов на значительном расстоянии от мембраны. При трансплантации на рецептор p75-нейротропина эти сигналы перенаправляют этот обычно апикально экспрессируемый белок на базолатеральную клеточную поверхность.Они не зависят от сигнала эндоцитоза. Сигналы базолатеральной сортировки рецепторов ТТГ, ЛГ и ФСГ не проявляют гомологии первичной последовательности друг с другом или с каким-либо другим известным сигналом. Кроме того, исследования кругового дихроизма показывают, что три сигнала демонстрируют различные вторичные структуры. Рецептор ТТГ имеет стабильную спиральную структуру, рецептор ЛГ имеет как спиральную, так и β-пластинчатую структуру, а сигнал сортировки рецептора ФСГ имеет основную структуру случайной спирали. Это означает, что даже в близкородственных рецепторах могут быть обнаружены разные вторичные структуры для базолатеральных сигналов, не связанных с сигналами интернализации.Это наблюдение контрастирует с тем, что известно о базолатеральных сигналах, связанных с сигналами интернализации, для которых была описана общая структура β-витков. Делеция базолатеральных сигналов сортировки приводит к апикальному нацеливанию рецепторов, подтверждая существование информации апикальной сортировки. Однако растворимая форма рецептора ТТГ, которая содержит все N — и предполагаемые O -связанные олигосахариды, секретируется неполяризованным образом. Это означает, что информация апикальной сортировки должна располагаться где-нибудь в другом месте, либо в трансмембранных, либо во внутриклеточных доменах рецептора.
ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ОБРАЗУЮТ высокоорганизованные клеточные листы, которые обладают разнообразными векторными функциями транспорта, абсорбции, секреции и барьера. Эти функции зависят от поляризованного распределения белков и липидов между апикальной и базолатеральной поверхностями клеток, причем каждый домен имеет очень разный состав (1). Сортировка мембранных белков в сети транс -Гольджи требует определенных сигналов сортировки, закодированных в структуре транспортируемых белков. Базолатеральные сигналы сортировки соответствуют дискретным последовательностям, локализованным во внутриклеточном домене трансмембранных белков рядом с мембраной, которые, вероятно, декодируются разными цитозольными адаптерами (2).
Хотя было показано, что многие G-белковые рецепторы обнаруживают поляризованную экспрессию в эпителиальных клетках (3–5), сигналы, участвующие в их поляризованной сортировке, остаются в значительной степени неизвестными. Было высказано предположение, что наличие множества цитоплазматических, трансмембранных и внеклеточных доменов в этих рецепторах приводит к различным типам иерархических и конкурирующих сигналов (6).
Рецепторы гонадотропина [LH (LHR) и FSH (FSHR)] и TSH (TSHR) относятся к большому семейству рецепторов, связанных с G-белком (7, 8).Они обладают характерными семью трансмембранными охватывающими доменами, но образуют специфическую подгруппу, характеризующуюся наличием большого внеклеточного домена, состоящего из повторяющихся мотивов, богатых лейцином, и сильно гликозилированы. Этот домен отвечает за связывание гормона с высоким сродством. Эти три рецептора в основном связаны с G s , что приводит к индуцированной гормонами активации аденилатциклазы.
FSHR и LHR играют центральную роль в воспроизводстве посредством контроля синтеза и секреции половых стероидов и их роли в созревании гамет (7).TSHR играет ключевую роль в контроле роста и функции щитовидной железы (8). Естественные герминальные мутации этих рецепторов описаны при гипотиреозе и бесплодии человека (8, 9).
Особенностью TSHR и FSHR является их поляризованная экспрессия в фолликулярных клетках щитовидной железы и клетках Сертоли соответственно (8). Напротив, LHR присутствует на всей поверхности клеток тека, гранулезы и лютеиновых клеток яичника и клеток Лейдига в семенниках (8). Это неполяризованное распределение связано с тем, что LHR физиологически не экспрессируется в поляризованных клетках.
Ранее мы экспрессировали все три рецептора в эпителиальных клетках почек собак Madin-Darby (MDCK) (10). Это позволило нам воспроизвести физиологическое базолатеральное нацеливание TSHR и FSHR в этих клетках. Однако мы также показали, что LHR имеет поляризованное базолатеральное распределение в поляризованных клетках MDCK, подтверждая, что все три рецептора содержат базолатеральный сигнал сортировки в своей структуре.
Мы первоначально охарактеризовали базолатеральный сигнал сортировки FSHR (11).Он имеет необычную локализацию, находящуюся в дистальной части внутриклеточного домена рецептора на расстоянии от мембраны. Это был первый базолатеральный сигнал сортировки, идентифицированный для рецептора, связанного с G-белком, и, в более общем смысле, для рецептора гормона (11).
Несколько исследований было выполнено на других рецепторах, связанных с G-белком (6, 12, 13), и базолатеральные сигналы сортировки расширенного семейства рецепторов, связанных с G-белком, остаются в значительной степени неизвестными. Доступность трех связанных рецепторов, связанных с G-белком, принадлежащих к одной и той же подгруппе, обеспечивает выгодную модель для сравнительного анализа различных структурных детерминант их поляризованного нацеливания.Это может позволить идентифицировать специфические особенности базолатеральных сигналов для связанных рецепторов, связанных с G-белком.
Другой особенностью этой подгруппы рецепторов является существование растворимых форм, удаленных из своего трансмембранного домена путем альтернативного сплайсинга. Что касается LHR, вариантные белки физиологически экспрессируются в семенниках и яичниках (7). Растворимая форма TSHR была обнаружена в крови человека (8), и было высказано предположение, что она кодируется вариантными усеченными мРНК.Это потребовало бы их секреции с базолатеральной стороны поляризованных клеток. Однако поляризованная секреция этих растворимых вариантов ранее не изучалась. Внеклеточный домен этих рецепторов сильно гликозилирован, и сообщалось, что N -связанных сахаров соответствуют сигналу апикальной сортировки в клетках MDCK (14). Таким образом, мы также изучили поляризованную экспрессию усеченного TSHR, соответствующего его эктодомену.
РЕЗУЛЬТАТЫ
С-концевой участок внутриклеточного домена TSHR участвует в базолатеральной локализации рецептора в клетках MDCK и Thyroid FRT
Чтобы определить, какая область TSHR необходима для базолатеральной сортировки, мы сконструировали разные мутанты, удаленные для различных частей С-концевого хвоста рецептора (рис.1А). Усеченные рецепторы стабильно экспрессировались в клетках MDCK, и их распределение анализировали с помощью конфокальной микроскопии (фиг. 1B) с использованием моноклональных антител, направленных против внеклеточного домена TSHR. В клетках, экспрессирующих рецептор дикого типа, сильное мечение мембраны наблюдалось на базолатеральных участках с ретикулярным рисунком, характерным для базолатеральной локализации. Вертикальные срезы xz клеток подтвердили эту базолатеральную локализацию, особенно с сильным латеральным окрашиванием.В клетках, экспрессирующих удаленную версию THSR (TSHRΔ708–764, удаленная большая часть внутриклеточного домена рецептора), сильное мечение клеточной поверхности было обнаружено только на апикальных срезах. Вертикальный разрез показывает, что мечение ограничено в верхней части клеток, подтверждая апикальное распределение усеченного рецептора. Это указывает на то, что базолатеральная информация для сортировки находится в дистальной части внутриклеточного домена TSHR.
Рис.1.
Цитоплазматический хвост TSHR содержит базолатеральную сортирующую информацию A. Представлена последовательность внутриклеточного домена TSHR. Стрелки указывают на локализацию стоп-кодонов, введенных в мутанты с делецией (TSHRΔ708–764, TSHRΔ731–764 и TSHRΔ747–764). B, клетки MDCK, экспрессирующие TSHR дикого типа и усеченный TSHR, выращивали на фильтрах и обрабатывали для непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии, как описано в Materials and Methods . TSHR детектировали с помощью моноклональных антител T5–317, направленных против внеклеточного домена.В каждом случае верхняя панель показывает горизонтальное сечение (xy) ячеек, а нижняя панель показывает вертикальное сечение (xz). C. Анализ с помощью иммунопреципитации клеточной поверхности распределения TSHR дикого типа и усеченного TSHR, экспрессированного в клетках MDCK. Трансфицированные клетки MDCK, выращенные на фильтрах, метили, и иммунопреципитацию клеточной поверхности проводили с использованием поликлональных антител, направленных против внеклеточного домена TSHR. Комплексы рецептор-антитело, присутствующие на апикальной (Ap) или базолатеральной (B1) поверхности, очищали и анализировали с помощью SDS-PAGE и флюорографии.Маркеры молекулярной массы (килодальтон) указаны на слева . D, клетки FRT щитовидной железы, трансфицированные диким типом (WT) или усеченным TSHR, выращивали на фильтрах и обрабатывали для поверхностной иммунопреципитации, как описано для клеток MDCK.
Рис. 1.
Цитоплазматический хвост TSHR содержит базолатеральную сортирующую информацию A. Представлена последовательность внутриклеточного домена TSHR. Стрелки указывают на локализацию стоп-кодонов, введенных в мутанты с делецией (TSHRΔ708–764, TSHRΔ731–764 и TSHRΔ747–764).B, клетки MDCK, экспрессирующие TSHR дикого типа и усеченный TSHR, выращивали на фильтрах и обрабатывали для непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии, как описано в Materials and Methods . TSHR детектировали с помощью моноклональных антител T5–317, направленных против внеклеточного домена. В каждом случае верхняя панель показывает горизонтальное сечение (xy) ячеек, а нижняя панель показывает вертикальное сечение (xz). C. Анализ с помощью иммунопреципитации клеточной поверхности распределения TSHR дикого типа и усеченного TSHR, экспрессированного в клетках MDCK.Трансфицированные клетки MDCK, выращенные на фильтрах, метили, и иммунопреципитацию клеточной поверхности проводили с использованием поликлональных антител, направленных против внеклеточного домена TSHR. Комплексы рецептор-антитело, присутствующие на апикальной (Ap) или базолатеральной (B1) поверхности, очищали и анализировали с помощью SDS-PAGE и флюорографии. Маркеры молекулярной массы (килодальтон) указаны на слева . D, клетки FRT щитовидной железы, трансфицированные диким типом (WT) или усеченным TSHR, выращивали на фильтрах и обрабатывали для поверхностной иммунопреципитации, как описано для клеток MDCK.
Чтобы охарактеризовать последовательность, необходимую для базолатерального нацеливания TSHR, распределение двух других мутантов с делециями анализировали с помощью конфокальной микроскопии. С усеченным рецептором TSHRΔ731–764 мы наблюдали апикальное распределение, подобное таковому у первого мутанта TSHRΔ708–764. Напротив, мутантный TSHRΔ747-764 имел в основном базолатеральную поляризованную экспрессию, сходную с экспрессией рецептора дикого типа (Fig. 1B). Таким образом, последовательность, расположенная между остатками 731 и 746, скорее всего, будет содержать базолатеральную информацию для сортировки.
Для количественной оценки рецепторных молекул, присутствующих в каждом мембранном домене, мы выполнили эксперименты по иммунопреципитации клеточной поверхности на поляризованных монослоях клеток MDCK. После метаболического мечения клеток поликлональное антитело, направленное против внеклеточного домена TSHR, было добавлено либо в апикальный, либо в базолатеральный компартмент клеток (10). Затем комплексы рецептор-антитело очищали и анализировали гель-электрофорезом (фиг. 1С). Для рецептора дикого типа приблизительно 95% молекул рецептора иммунопреципитировались с базолатеральной клеточной поверхности.Аналогичная пропорция была обнаружена на базолатеральной мембране мутанта TSHRΔ747–764. Однако в случае клеток MDCK, экспрессирующих TSHRΔ708–764 и TSHRΔ731–764, только 10–20% рецепторных молекул иммунопреципитировались из домена базолатеральной мембраны; большинство рецепторных молекул экспрессировалось на апикальной поверхности клетки.
Мы подтвердили, что базолатеральная информация сортировки, отображаемая в C-концевой части TSHR, также функциональна в клетках щитовидной железы. Таким образом, мы исследовали поляризованную экспрессию TSHR дикого типа и двух усеченных мутантов рецепторов Δ708–764 и Δ731–764 в поляризованной линии клеток крысы FRT (рис.1D). Рецептор дикого типа имеет базолатеральную локализацию в этих клетках, тогда как локализация обратная с двумя усеченными рецепторами. Таким образом, мы можем заключить, что последовательность, расположенная ниже остатка 731, также участвует в базолатеральной локализации TSHR в клетках щитовидной железы.
Последовательность, расположенная между остатками 731–746, содержит автономный базолатеральный сигнал сортировки, передаваемый на гетерологичный белок
Мы показали, что делеция последовательности, соответствующей остаткам 731-746, изменяет базолатеральную локализацию TSHR.Таким образом, эта последовательность, скорее всего, содержит базолатеральный сигнал сортировки. Однако эта последовательность могла быть только частью сигнала и может быть недостаточной для нацеливания рецептора на домен базолатеральной мембраны. Эта последовательность может также стабилизировать рецептор на базолатеральной клеточной поверхности.
Чтобы показать, что картированная последовательность соответствует автономному и независимому базолатеральному сигналу сортировки, передаваемому на другой белок, химерный белок был сконструирован с рецептором нейротропина (NTR; рис.2А). Этот рецептор имеет апикальное распределение в клетках MDCK. Мы использовали усеченный p75 NTR с делецией после пятой аминокислоты его цитоплазматического хвоста (NTRt). Эта конструкция также имеет апикальное распределение в клетках MDCK (15). Последовательность, кодирующая аминокислоты 729-746 TSHR, была слита с цитоплазматическим хвостом NTRt (см. Материалы и методы ).
Рис. 2.
Базолатеральный сигнал сортировки TSHR является автономным и не зависит от сигнала эндоцитоза и G s Coupling A, схематическое изображение NTR дикого типа (NTR) и усеченного (NTRt) NTR и химерный рецептор NTRt / TSHR729–746.Базолатеральный сигнал сортировки TSHR был перенесен на C-концевой конец NTRt. Были сконструированы химерные рецепторы с базолатеральным сортирующим сигналом TSHR, содержащим аланиновые мутации. B. Были помечены поляризованные монослои клеток MDCK, постоянно экспрессирующие химерный NTR, содержащий сигнал базолатерального сортировки TSHR дикого типа или мутантный TSHR. Затем проводили поверхностную иммунопреципитацию с добавлением моноклонального антитела против NTR (ME20.4) либо в апикальный (Ap), либо в базолатеральный (B1) отсек.Комплексы рецептор-антитело очищали и анализировали гель-электрофорезом и флюорографией. Маркеры молекулярной массы указаны на слева (килодальтон). Клетки C, COS-7, трансфицированные TSHR дикого типа (•) или усеченным TSHRΔ731–764 (▪), инкубировали с [ 125 I] bTSH, промывали и помещали при 37 ° C на различные периоды времени (см. Материалы и методы ). После кислотной промывки для удаления радиоактивно меченного гормона, остающегося на поверхности клетки, клетки выделяли инкубацией с трипсином.Считалось, что резистентная к трипсину радиоактивность представляет собой интернализованный гормон и выражается в процентах от йодированного гормона, первоначально связанного с клетками. D, клетки COS-7, трансфицированные диким типом (WT) или усеченным TSHR, инкубировали в течение 45 минут с bTSH и количественно оценивали накопление цАМФ. NT, Контрольные клетки.
Рис. 2.
Базолатеральный сигнал сортировки TSHR является автономным и не зависит от сигнала эндоцитоза и G s Coupling A, схематическое изображение NTR дикого типа (NTR) и усеченного (NTRt) NTR и химерного рецептора NTRt / TSHR729–746.Базолатеральный сигнал сортировки TSHR был перенесен на C-концевой конец NTRt. Были сконструированы химерные рецепторы с базолатеральным сортирующим сигналом TSHR, содержащим аланиновые мутации. B. Были помечены поляризованные монослои клеток MDCK, постоянно экспрессирующие химерный NTR, содержащий сигнал базолатерального сортировки TSHR дикого типа или мутантный TSHR. Затем проводили поверхностную иммунопреципитацию с добавлением моноклонального антитела против NTR (ME20.4) либо в апикальный (Ap), либо в базолатеральный (B1) отсек.Комплексы рецептор-антитело очищали и анализировали гель-электрофорезом и флюорографией. Маркеры молекулярной массы указаны на слева (килодальтон). Клетки C, COS-7, трансфицированные TSHR дикого типа (•) или усеченным TSHRΔ731–764 (▪), инкубировали с [ 125 I] bTSH, промывали и помещали при 37 ° C на различные периоды времени (см. Материалы и методы ). После кислотной промывки для удаления радиоактивно меченного гормона, остающегося на поверхности клетки, клетки выделяли инкубацией с трипсином.Считалось, что резистентная к трипсину радиоактивность представляет собой интернализованный гормон и выражается в процентах от йодированного гормона, первоначально связанного с клетками. D, клетки COS-7, трансфицированные диким типом (WT) или усеченным TSHR, инкубировали в течение 45 минут с bTSH и количественно оценивали накопление цАМФ. NT, Контрольные клетки.
Поверхностное распределение гибридного рецептора NTRt / TSHR729-746, экспрессированного в клетках MDCK, было исследовано с помощью иммунопреципитации клеточной поверхности с использованием моноклональных антител против эктодомена NTR (подарок от Dr.А. Ле Бивик, UMR 6156, CNRS, Марсель, Франция; Рис. 2Б). Хотя приблизительно 90% p75 NTRt экспрессировалось в домене апикальной мембраны, только около 10% молекул химерного рецептора были обнаружены на поверхности апикальной клетки. Таким образом, мы можем заключить, что аминокислоты 731-746 TSHR кодируют эффективный базолатеральный сигнал сортировки. Этот сигнал независим и может быть передан гетерологичному белку.
Базолатеральный сигнал сортировки рецептора ТТГ не зависит от тирозина или гидрофобного дублета
Базолатеральные сигналы сортировки как TSHR, так и FSHR расположены в дистальной части внутриклеточного домена рецепторов, которые имеют слабую гомологию первичных последовательностей.Было показано, что тирозин и лейцин в сигнале важны для функции базолатерального сигнала сортировки FSHR. Тирозин и гидрофобный дублет также обнаруживаются в базолатеральном нацеливающем сигнале TSHR. Чтобы установить, изменяет ли мутация этих остатков функцию автономного базолатерального сигнала сортировки, мы также создали химерные рецепторы, в которых тирозин и дублет лейцин-изолейцин были мутированы в аланины. Как показано на фиг. 2B, мутация этих остатков не изменяет базолатеральное нацеливание гибридного рецептора.Те же мутации были введены в последовательность полного TSHR без изменения экспрессии TSHR на базолатеральной мембране (данные не показаны).
Базолатеральный сигнал сортировки TSHR не зависит от сигнала эндоцитоза и не участвует в G
s Связывание белковБыло показано, что многие базолатеральные сигналы сортировки совпадают или перекрываются с сигналами эндоцитоза (2, 16). Поэтому мы изучили интернализацию [ 125 I] бычьего ТТГ ([ 125 I] bTSH) в клетках MDCK, экспрессирующих либо дикого типа, либо мутантный рецептор, удаленный для базолатерального сигнала сортировки.Как показано на фиг. 2C, в мутантном рецепторе не может быть обнаружено никаких изменений интернализации рецептора по сравнению с рецептором дикого типа.
Затем мы исследовали возможное участие этой области TSHR в связывании белка G s . Усеченный TSHRΔ708–764, -Δ731–764 и -Δ747–764 трансфицировали в клетки COS-7. Базальная и максимальная стимуляция аденилатциклазы, индуцированная гормонами, была аналогична таковой, наблюдаемой с рецептором дикого типа (фиг. 2D). Таким образом, базолатеральный сигнал сортировки TSHR не зависит от его сигнала эндоцитоза, и соответствующая последовательность не участвует в связывании G s .
C-терминальная область LHR также содержит базолатеральный сигнал сортировки
Несмотря на отсутствие гомологии последовательностей, базолатеральные сигналы сортировки FSHR и TSHR расположены в дистальной части внутриклеточного домена каждого рецептора. Таким образом, возник вопрос, содержит ли третий рецептор, принадлежащий к этой подгруппе, LHR, базолатеральный сигнал сортировки в этой дивергентной дистальной области. Таким образом, мы сконструировали три мутанта рецептора, удаленные из различных частей внутриклеточного домена LHR (рис.3А). Распределение этих рецепторов, экспрессируемых в клетках MDCK, анализировали с помощью конфокальной микроскопии (фиг. 3B). Первый мутант LHRΔ651–696, который удален для всей области, расходящейся между рецепторами гонадотропина и TSHR, обнаруживает апикальную локализацию. Второй мутант LHRΔ666–696 также обнаруживает апикальную локализацию, тогда как последний мутант, LHRΔ690–696, обнаруживает базолатеральное распределение, подобное таковому рецептора дикого типа.
Рис. 3.
С-концевой хвост LHR содержит базолатеральный сигнал сортировки A. Представлена последовательность внутриклеточного домена LHR. Стрелки указывают на локализацию стоп-кодонов, введенных в делеционные мутанты (LHRΔ651–696, -Δ666–696 и -Δ690–696). B, клетки MDCK, стабильно трансфицированные диким типом (WT) или усеченным LHR, выращивали до слияния на фильтрах. Клетки обрабатывали для непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии, как описано в Materials and Methods . LHR окрашивают с использованием моноклонального антитела LHR38. Верхняя панель (xy) показывает горизонтальный разрез, а нижняя панель (xz) показывает вертикальный разрез ячеек MDCK.C. После метаболического мечения клеток MDCK, экспрессирующих LHR дикого типа или усеченный LHR, проводили иммунопреципитацию рецептора на апикальной (Ap) или базолатеральной (B1) поверхности, как описано в Материалы и методы , с использованием моноклонального антитела LHR38. . Комплексы рецептор-антитело очищали и анализировали с помощью SDS-PAGE и флюорографии. Маркеры молекулярной массы указаны на слева (килдодальтон).
Рис. 3.
С-концевой хвост LHR содержит базолатеральный сигнал сортировки A, представлена последовательность внутриклеточного домена LHR. Стрелки указывают на локализацию стоп-кодонов, введенных в делеционные мутанты (LHRΔ651–696, -Δ666–696 и -Δ690–696). B, клетки MDCK, стабильно трансфицированные диким типом (WT) или усеченным LHR, выращивали до слияния на фильтрах. Клетки обрабатывали для непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии, как описано в Materials and Methods . LHR окрашивают с использованием моноклонального антитела LHR38. Верхняя панель (xy) показывает горизонтальный разрез, а нижняя панель (xz) показывает вертикальный разрез ячеек MDCK.C. После метаболического мечения клеток MDCK, экспрессирующих LHR дикого типа или усеченный LHR, проводили иммунопреципитацию рецептора на апикальной (Ap) или базолатеральной (B1) поверхности, как описано в Материалы и методы , с использованием моноклонального антитела LHR38. . Комплексы рецептор-антитело очищали и анализировали с помощью SDS-PAGE и флюорографии. Маркеры молекулярной массы указаны на слева (килдодальтон).
В экспериментах по иммунопреципитации на клеточной поверхности примерно 90% рецепторных молекул были обнаружены на апикальной клеточной поверхности (рис.3C), подтверждая обратную поляризацию усеченных рецепторов LHRΔ651–696 и -Δ666–696. Напротив, 85–90% молекул рецептора были обнаружены в домене базолатеральной мембраны для рецептора дикого типа и для мутанта LHRΔ690–696. Таким образом, мы можем сделать вывод, что дистальная часть внутриклеточного домена LHR, скорее всего, будет содержать базолатеральный нацеливающий сигнал, расположенный между остатками 666 и 690.
В случае FSHR и TSHR мы показали, что последовательность 14 или 15 остатков, соответственно, достаточно для базолатерального нацеливания.Чтобы более точно очертить область LHR, участвующую в базолатеральном нацеливании, мы привили 18 остатков рецептора (остатки 672-689) к цитоплазматическому хвосту усеченного p75 NTRt (Fig. 4A). Иммунопреципитация клеточной поверхности (рис. 4B) показала, что этих 18 остатков достаточно для перенаправления химерного рецептора p75 NTRt / LHR672–689 на базолатеральную поверхность клеток MDCK. Мы можем заключить, что в дистальной части внутриклеточного домена LHR остатки 672-689 кодируют эффективный базолатеральный сигнал сортировки.
Рис. 4.
Базолатеральный сигнал сортировки LHR является автономным и независимым от G s Coupling A, схематическое изображение химерного рецептора NTRt / LHR672–689. B. Анализ распределения NRTt и химерного рецептора NTRt / LHR672–689 с использованием иммунопреципитации клеточной поверхности моноклональным антителом против NTR. После очистки комплексов рецептор-антитело радиоактивно меченный рецептор анализировали гель-электрофорезом и флюорографией.Маркеры молекулярной массы указаны на слева (килодальтон). C, клетки COS-7, трансфицированные диким типом (WT) или усеченным LHR, инкубировали в течение 45 мин с hCG и измеряли накопление цАМФ (см. Материалы и методы ). NT, Контрольные клетки.
Рис. 4.
Базолатеральный сигнал сортировки LHR автономен и не зависит от G s Coupling A, схематическое изображение химерного рецептора NTRt / LHR672–689. B. Анализ распределения NRTt и химерного рецептора NTRt / LHR672–689 с использованием иммунопреципитации клеточной поверхности моноклональным антителом против NTR.После очистки комплексов рецептор-антитело радиоактивно меченный рецептор анализировали гель-электрофорезом и флюорографией. Маркеры молекулярной массы указаны на слева (килодальтон). C, клетки COS-7, трансфицированные диким типом (WT) или усеченным LHR, инкубировали в течение 45 мин с hCG и измеряли накопление цАМФ (см. Материалы и методы ). NT, Контрольные клетки.
Было обнаружено, что интернализация LHR дикого типа и интернализация мутанта рецептора Δ651–696 сходна (данные не показаны), как ранее описано для аналогичного мутанта LHR крысы (17).Точно так же не может быть обнаружено различий в сцеплении G s между диким типом и усеченными Δ651–696 и Δ666–696 рецепторами, удаленными из базолатерального сигнала сортировки (Fig. 4C). Таким образом, базолатеральный сигнал сортировки LHR также не зависит от эндоцитоза и связывания G s .
Сравнение этого сигнала с сигналами FSHR и TSHR показывает, что они не имеют гомологии первичной последовательности. Тирозин находится в сигнале рецептора свиньи. Однако этот тирозин не консервативен в LHR, клонированном у других видов млекопитающих, особенно в LHR человека, и поэтому не ожидается, что он будет играть важную функциональную роль.
Исследование кругового дихроизма сигналов базолатеральной сортировки TSHR, LHR и FSHR
Сигналы базолатеральной сортировкиTSHR, LHR и FSHR имеют необычную локализацию в дистальной части их внутриклеточного домена на значительном расстоянии от мембраны. Однако их первичные последовательности различаются. Несмотря на это несоответствие в первичных структурах, эти три базолатеральных сигнала могут иметь общую вторичную структуру.
Мы определили вторичные структуры сигналов сортировки TSHR, LHR и FSHR, используя анализ спектров кругового дихроизма (CD) синтетических пептидов, охватывающих сигналы сортировки (Таблица 1).Феномен CD очень чувствителен к вторичной структуре полипептидов. Основное поглощение в дальней УФ-области происходит от пептидных связей (хромофоров). Например, α-спиральный узор характеризуется типичными сигналами на 192, 208 и 222 нм, соответствующими трем электронным переходам в пептидной связи (сильное π → π * ⊥, малое π → π * // и n → π * соответственно), тогда как структура случайной катушки характеризуется всего двумя сигналами на 195 и 212 нм (π → π * и n → π * соответственно).Как описано ранее, самый простой метод извлечения содержания вторичной структуры из данных CD — это предположить, что спектр представляет собой линейную комбинацию спектров CD каждого типа вторичной структуры (, например, чистая α-спираль, чистая β-цепь, и т. Д. ), скорректированный с учетом его обилия в конформации полипептида (18, 19). Из этой информации можно качественно оценить преобладающую вторичную структуру полипептида или количественно процентное содержание каждой вторичной структуры, используя расчет деконволюции (см. Материалы и методы ).Спектры регистрировали в различных растворах, включая додецилсульфат натрия (SDS), который имитирует двухслойную среду мембраны (20), а также трифторэтанол (TFE) и метанол (MeOH), которые позволяют оценить склонность пептидов к принятию спиральной конформации. (21) (рис.5). Данные показали, что пептид, производный от TSHR, дает сильный сигнал при 192, 208 и 222 нм (так называемый эффект Коттона) во всех растворителях, указывая на то, что пептид имеет стабильную спиральную структуру. Пептид, производный от LHR, давал более слабый эффект Коттона, даже в TFE, который является спиральным промотором, и спектры КД показали, что пептид проявляет тенденцию к образованию как спиральных, так и β-складчатых структур.Было замечено, что спектры КД TSHR и LHR в SDS демонстрируют слабость растворителя. Этот эффект, который, вероятно, связан с частичной агрегацией пептидов в мицеллах SDS, можно объяснить светорассеянием. Действительно, более сильное ослабление сигнала с длиной волны 192 нм по сравнению с сигналами с длиной волны 208 и 222 нм обычно считается признаком рассеяния света. Наконец, пептид, производный от FSHR, преимущественно имел структуру случайной спирали с очень небольшой тенденцией к спиральной структуре.Действительно, кривые КД, полученные для этого последнего пептида, не демонстрируют какой-либо конкретной структуры. Вместе эти данные показывают, что базолатеральные сигналы сортировки TSHR, LHR и FSHR имеют различные вторичные структуры.
Рис. 5.
Спектры кругового дихроизма TSHR, LHR и FSHR базолатеральных сигналов сортировки в SDS-мицеллах, метаноле и трифторэтаноле Спектры дихроизма в дальней УФ-области TSHR (T725-G753) (A), LHR (N671-T691) ( B) и FSHR (H671-N695) (C) в мицеллах SDS (SDS), абсолютном MeOH и TFE-воде (90:10).
Рис. 5.
Спектры кругового дихроизма TSHR, LHR и FSHR базолатеральных сигналов сортировки в SDS-мицеллах, метаноле и трифторэтаноле Спектры дихроизма в дальнем УФ-диапазоне TSHR (T725-G753) (A), LHR (N671-T691) (B) и FSHR (H671-N695) (C) в мицеллах SDS (SDS), абсолютном MeOH и TFE-воде (90:10).
Таблица 1. Расчетные вторичные структурысигналов сортировки FSHR, TSHR и LHR в мицеллах SDS, MeOH и TFE на основе измерений CD
Вторичная структура . | ФШР . | LHR . | TSHR . | |||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | |||||||||
Мицеллы SDS | ||||||||||||||
H | 23 | 21 | 38 | |||||||||||
B | 2 | 19 | ||||||||||||
T | 14 | 2 | 0 | |||||||||||
R | 38 | 32 | 39 | 39 | 49 904 | 49 | 65 | |||||||
B | 26 | 27 | 33 | 11 | 0 | 15 | ||||||||
9044 | ||||||||||||||
R | 38 | 9046 9 | 18 | 35 | ||||||||||
TFE / вода (90/10) | ||||||||||||||
H | 32 | 47 | 61 | 20 | 13 | 10 | 0 | 20 | ||||||
T | 12 | 4 | 0 | |||||||||||
R | 38 | 10738 | 107
Вторичная структура . | ФШР . | LHR . | TSHR . | |||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | |||||||||
Мицеллы SDS | ||||||||||||||
H | 23 | 21 | 38 | |||||||||||
B | 2 | 19 | ||||||||||||
T | 14 | 2 | 0 | |||||||||||
R | 38 | 32 | 39 | 39 | 49 904 | 49 | 65 | |||||||
B | 26 | 27 | 33 | 11 | 0 | 15 | ||||||||
9044 | ||||||||||||||
R | 38 | 9046 9 | 18 | 35 | ||||||||||
TFE / вода (90/10) | ||||||||||||||
H | 32 | 47 | 61 | 20 | 13 | 10 | 0 | 20 | ||||||
T | 12 | 4 | 0 | |||||||||||
R | 38 | 107
Расчетные вторичные структуры сигналов сортировки FSHR, TSHR и LHR в мицеллах SDS, MeOH и TFE на основе измерений CD
Вторичная структура . | ФШР . | LHR . | TSHR . | |||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | |||||||||
Мицеллы SDS | ||||||||||||||
H | 23 | 21 | 38 | |||||||||||
B | 2 | 19 | ||||||||||||
T | 14 | 2 | 0 | |||||||||||
R | 38 | 32 | 39 | 39 | 49 904 | 49 | 65 | |||||||
B | 26 | 27 | 33 | 11 | 0 | 15 | ||||||||
9044 | ||||||||||||||
R | 38 | 9046 9 | 18 | 35 | ||||||||||
TFE / вода (90/10) | ||||||||||||||
H | 32 | 47 | 61 | 20 | 13 | 10 | 0 | 20 | ||||||
T | 12 | 4 | 0 | |||||||||||
R | 38 | 10738 | 107
Вторичная структура . | ФШР . | LHR . | TSHR . | |||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | Соотношение (%) . | NRMSD (%) . | |||||||||
Мицеллы SDS | ||||||||||||||
H | 23 | 21 | 38 | |||||||||||
B | 2 | 19 | ||||||||||||
T | 14 | 2 | 0 | |||||||||||
R | 38 | 32 | 39 | 39 | 49 904 | 49 | 65 | |||||||
B | 26 | 27 | 33 | 11 | 0 | 15 | ||||||||
9044 | ||||||||||||||
R | 38 | 9046 9 | 18 | 35 | ||||||||||
TFE / вода (90/10) | ||||||||||||||
H | 32 | 47 | 61 | 20 | 13 | 10 | 0 | 20 | ||||||
T | 12 | 4 | 0 | |||||||||||
R | 38 | 107
Исследование поляризованной секреции усеченного TSHR, соответствующего эктодомену
В этой подгруппе рецепторов обнаруженовариантов усеченных рецепторов, генерируемых альтернативным сплайсингом, удаленных для трансмембранного домена (7).Усеченные мРНК TSHR были обнаружены с помощью ПЦР, и было высказано предположение, что соответствующие белки могут достигать кровотока (8). Однако их поляризованный трафик не изучался. Эти растворимые рецепторы гликозилированы, и было описано, что гликозилирование соответствует апикальному сигналу сортировки трансмембранных или секретируемых белков (14). Кроме того, мы показали, что делеция базолатерального сигнала сортировки TSHR дает рецептор, который экспрессируется на апикальной клеточной поверхности клеток MDCK.Это означает, что оставшаяся часть рецептора содержит сигнал апикальной сортировки, обнаруживаемый делецией доминирующего базолатерального сигнала нацеливания.
Мы также изучали поляризованную секрецию усеченного рецептора TSHRΔ314–764, соответствующего вариантной форме, удаленной из трансмембранного и внутриклеточного доменов. Этот усеченный рецептор содержит все шесть сайтов N -гликозилирования TSHR (22) и четыре потенциальных сайта O -гликозилирования, определенных с помощью NetOGlyc 2.0 Prediction Server (рис. 6A). В нем отсутствует небольшая часть внеклеточного домена, поскольку ранее было показано, что более длинные рецепторы не секретируются и захватываются внутриклеточно (23).
Рис. 6.
Исследование поляризованной секреции усеченного TSHR, соответствующего эктодомену A, растворимой форме TSHR (TSHRΔ314–764), содержащей шесть N -связанных олигосахаридов (○) и потенциал 4 Были сконструированы O -связанные сахара (▵) и изучена его поляризованная секреция.B. После метаболического мечения клеток MDCK, постоянно экспрессирующих TSHRΔ314–764, растворимый TSHRΔ314–764, присутствующий в апикальных (Ap) и базолатеральных (B1) супернатантах культур, подвергали иммуноочистке с использованием моноклональных антител T5–317. Рецептор с радиоактивной меткой анализировали с помощью SDS-PAGE и флюорографии. C1 и C2 соответствуют двум разным клонам. Маркеры молекулярной массы указаны на слева (килодальтон). C. Количественное определение рецептора TSHRΔ314–764, секретируемого в апикальном и базолатеральном отделах трансфицированных клеток MDCK, выращенных на фильтрах, с использованием денситометрического сканирования авторадиограммы.WT, Дикий тип. Указаны средства четырех различных экспериментов. Тот же результат был получен для двух разных клонов.
Рис. 6.
Изучение поляризованной секреции усеченного TSHR, соответствующего эктодомену A, растворимой форме TSHR (TSHRΔ314–764), содержащей шесть N -связанных олигосахаридов (○) и потенциал 4 O -связанных сахаров (▵) был сконструирован, и его поляризованная секреция была изучена. B. После метаболического мечения клеток MDCK, постоянно экспрессирующих TSHRΔ314–764, растворимый TSHRΔ314–764, присутствующий в апикальных (Ap) и базолатеральных (B1) супернатантах культур, подвергали иммуноочистке с использованием моноклональных антител T5–317.Рецептор с радиоактивной меткой анализировали с помощью SDS-PAGE и флюорографии. C1 и C2 соответствуют двум разным клонам. Маркеры молекулярной массы указаны на слева (килодальтон). C. Количественное определение рецептора TSHRΔ314–764, секретируемого в апикальном и базолатеральном отделах трансфицированных клеток MDCK, выращенных на фильтрах, с использованием денситометрического сканирования авторадиограммы. WT, Дикий тип. Указаны средства четырех различных экспериментов. Тот же результат был получен для двух разных клонов.
Поляризованную секрецию усеченного рецептора анализировали сравнительно на трех различных клонах MDCK, экспрессирующих разные уровни этого мутантного рецептора. После метаболического мечения трансфицированных клеток MDCK растворимый TSHRΔ314–764, присутствующий в среде, очищали и анализировали с помощью гель-электрофореза. Как показано на фиг. 6, B и C, 55 ± 7,5% рецептора секретировалось в апикальной среде, тогда как 45 ± 7,5% секретировалось в базолатеральном компартменте (средние значения четырех независимых экспериментов).Таким образом, растворимый TSHRΔ314–764 демонстрирует неполяризованную секрецию. Таким образом, мы можем сделать вывод, что сайты N -глизозилирования рецептора и потенциальные O -глизозилированные сайты, обнаруженные во внеклеточном домене рецептора, не содержат информации апикальной сортировки, и что информация апикальной сортировки TSHR, выявленная с помощью делеция доминирующего базолатерального сигнала сортировки может быть локализована в другом месте рецептора, в трансмембранном или внутриклеточном домене.
ОБСУЖДЕНИЕ
Мало что известно о сигналах, которые опосредуют нацеливание белков с множественными трансмембранными доменами. Для белков, содержащих один трансмембранный домен, было описано несколько базолатеральных сигналов сортировки, соответствующих коротким аминокислотным последовательностям, расположенным в цитоплазматическом хвосте белков, в непосредственной близости от мембраны (2). Большинство сигналов зависит от остатка тирозина для их функции, включенной в последовательность NPXY или YXX0 (где Ø — объемный гидрофобный остаток).Эти сигналы часто коллинеарны с сигналами быстрого эндоцитоза (2, 24). Менее распространенные сигналы характеризуются гидрофобным дублетом (25), тогда как другие сигналы не имеют явного консенсуса (26).
В расширенном семействе рецепторов, связанных с G белками, многие члены, как было показано, обнаруживают поляризованную экспрессию (3–5, 27), но вовлеченные молекулярные механизмы плохо изучены. Для α 2A -адренергического рецептора было высказано предположение, что различные части трансмембранного домена участвуют в базолатеральном нацеливании рецептора (6, 28).Информация о базолатеральной сортировке была идентифицирована во второй внутриклеточной петле рецептора вазопрессина (13) и в третьей внутриклеточной петле рецептора m3-мускаринового ацетилхолина (12), но удаление этой последней последовательности не изменило базолатеральную экспрессию рецептора. . Локализация этих двух базолатеральных сигналов сортировки варьируется и также отличается от таковой для сигнала FSHR.
В этом исследовании мы показали, что базолатеральные сигналы сортировки TSHR и LHR расположены между остатками Leu 732 и His 746 и Arg 672 и Asp 689 , соответственно.Как и сигнал FSHR, они имеют одну и ту же необычную локализацию в дистальной части их внутриклеточного домена, на значительном расстоянии от мембраны. Однако это расстояние может быть уменьшено, потому что молекулярное моделирование и мутагенез LHR предполагают, что спираль 7 параллельна внутренней поверхности мембраны, что, следовательно, также может иметь место для цитоплазматического хвоста (29). Это также может иметь место для связанных TSHR и FSHR. Кроме того, пальмитоилирование цистеинов во внутриклеточном домене TSHR и LHR создает четвертую внутриклеточную петлю, которая также способствует сокращению этого расстояния (30, 31).Подобно базолатеральному сигналу сортировки FSHR, мы показали, что сигналы TSHR и LHR не связаны с сигналами эндоцитоза. Они не зависят от мотивов тирозина и дилейцина. Эти сигналы не имеют гомологии с другими известными базолатеральными сигналами и демонстрируют отличия друг от друга по первичным последовательностям.
В отсутствие сохранения последовательностей сигналов сортировки мы задавались вопросом, могла ли, тем не менее, сохраниться вторичная структура сигналов.В самом деле, хотя сигналы интернализации на основе тирозина обнаруживают небольшое сходство с точки зрения аминокислотной последовательности, структурные модели предсказывают, что они имеют общую структуру, включающую плотный β-поворот (32). Исследования с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) сигналов поляризации, связанных с сигналами эндоцитоза, показали, что базолатеральные сортирующие мотивы на основе Tyr, а также другие не-Tyr-основанные, содержат очевидную структуру β-витков (33–35), предполагая, что это может также быть универсальным признаком базолатеральных сигналов (36).Однако в случае рецепторов гонадотропина и TSHR исследования CD показали, что каждый сигнал имеет отчетливую конформацию, отличную от β-поворота. На сегодняшний день структуры только двух других базолатеральных сигналов сортировки, независимых от сигналов эндоцитоза, были изучены с помощью двумерной ЯМР-спектроскопии. Это показывает, что вторичная структура базолатерального сигнала сортировки полимерного Ig-рецептора содержит два структурных домена, β-поворот и зарождающуюся α-спираль (33). Эта ситуация напоминает то, что мы наблюдали для сигнала LHR, который формирует как спиральные, так и β-листовые структуры.Совсем недавно другое исследование крысиного транспортера Na + / таурохолат показало, что два базолатеральных сигнала сортировки, присутствующие в его цитоплазматическом домене, принимают в основном случайную структуру спирали (37), как и сигнал FSHR. Напротив, спиральная структура базолатерального сигнала TSHR не связана с какими-либо известными сигналами.
В близкородственном семействе FSHR, LHR и TSHR, которые, как считается, происходят от одного и того же предкового гена (7, 8), мы показываем, что, хотя необычная дистальная локализация сигналов сохранялась во время эволюции, первичная и вторичные структуры сигналов расходятся.Это исследование, в котором не удалось обнаружить общих черт даже в базолатеральных сигналах сортировки близкородственных белков, в сочетании с ЯМР-исследованиями сигналов полимерного Ig-рецептора и Na + / транспортера таурохолата, показывает разнообразие вторичных структур базолатеральных сигналов. не связаны с сигналами интернализации. Это наблюдение контрастирует с тем, что было показано в случае базолатеральных сигналов, связанных с сигналами эндоцитоза. Двумерное ЯМР-исследование и ограниченное молекулярное моделирование позволят подтвердить это разнообразие структур.
Сходство между базолатеральными и эндоцитозными сигналами указывает на то, что базолатеральные сигналы сортировки д. Взаимодействовать со специфическими областями адаптерных белков, которые обеспечивают включение грузовых белков в транспортные пузырьки. На сегодняшний день только две адаптерные субъединицы клатрина, μ 1B и μ 4 , участвуют в базолатеральной сортировке некоторых белков в эпителиальных клетках (38, 39). Однако могут быть задействованы и другие адаптеры, поскольку некоторые базолатеральные белки правильно нацелены на эпителиальные клетки, дефицитные по μ 1B или μ 4 (38, 39).
Из-за своей разной вторичной структуры три базолатеральных сигнала сортировки могут взаимодействовать с разными адаптерами. В случае полимерного рецептора Ig было высказано предположение, что два структурных домена его базолатерального сортирующего сигнала могут обеспечивать базолатеральное нацеливание двумя разными путями и / или путем, включающим разные адаптеры (40). Другая возможность может заключаться в том, что три базолатеральных сигнала сортировки взаимодействуют с одним и тем же адаптером, но с разной посадкой.Фактически, было показано, что сигнал интернализации P-селектина, не основанный на Tyr (41), связывается с адаптином μ 2 таким же образом, как описано ранее для других мотивов на основе Tyr, но на большей площади поверхности, чем типичные мотивы. Таким же образом недавно было высказано предположение, что разные классы базолатеральных сигналов сортировки могут связываться с μ 1B в разных регистрах или посредством взаимодействия с разными остатками (42). Необходимы дальнейшие исследования для определения клеточного (-ых) белка (-ов) и механизма (-ов), участвующих в базолатеральном нацеливании на рецепторы гонадотропина и TSHR.
Делеция базолатеральных сигналов TSHR, LHR и FSHR дала рецепторы, которые нацелены на апикальную клеточную поверхность, показывая наличие информации апикальной сортировки. Часто апикальные сигналы соответствуют N — или O -связанным олигосахаридам во внеклеточном домене белков (14).
Были обнаружены усеченные варианты TSHR, соответствующие его эктодомену (8), и была выдвинута гипотеза, что соответствующие белки могут быть ответственны за растворимую форму TSHR, секретируемую в крови человека.Однако для этого потребуется, чтобы усеченный рецептор достиг базолатеральной поверхности клеток либо поляризованным базолатеральным, либо неполяризованным секретом. Мы показали, что мутантный TSHRΔ314-764, соответствующий эктодомену рецептора со всеми N -гликозилированными сайтами и четырьмя предполагаемыми O -гликозилированными сайтами, секретируется неполяризованным образом в клетках MDCK. Следовательно, если усеченные варианты TSHR физиологически экспрессируются, они могут достигать кровообращения.Это также означает, что для TSHR внеклеточные гликаны, связанные с N или предполагаемые O , не несут информацию апикальной сортировки. Таким образом, эта информация, по-видимому, находится либо в трансмембранном, либо во внутриклеточном домене рецептора, как описано для других белков (43, 44). Более того, информация апикальной сортировки была идентифицирована в цитоплазматическом хвосте двух рецепторов, связанных с G-белком, родопсина и рецептора вазопрессина (13, 45). Т.о., в ходе эволюции рецепторы гонадотропина и TSHR могли сохранять в своей структуре информацию апикальной сортировки, которая маскируется доминирующими базолатеральными сигналами сортировки.
Таким образом, определение базолатеральных сигналов сортировки трех связанных рецепторов, связанных с G-белком, предоставляет информацию об эволюции сигналов базолатеральной сортировки связанных с G-белком рецепторов, которые остаются в значительной степени неизвестными. Сравнительный ЯМР и два гибридных исследования позволят лучше понять задействованные механизмы.
Изменение локализации TSHR было показано при раке щитовидной железы. Это может быть связано с потерей клеточной поляризации, но также с молекулярной аномалией в базолатеральном сигнале сортировки (46) или с потерей кофактора, необходимого для правильного нацеливания на рецептор.Кроме того, при некоторых заболеваниях были обнаружены естественные мутации рецепторов гонадотропина и TSHR (8). В некоторых случаях такие естественные мутации могут изменять перенос рецепторных клеток только в поляризованных клетках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Конструирование векторов экспрессии, кодирующих делеционные мутанты TSHR и LHR
Векторы экспрессии, кодирующие TSHR (pSG5-hTSHR) и LHR (pSG5-pLHR), были описаны ранее (47, 48).ПЦР-опосредованный мутагенез олигонуклеотидов использовали для введения стоп-кодонов в векторы pSG5-hTSHR и pSG5-pLHR.
В случае TSHRΔ708–764 был сконструирован фрагмент длиной 501 п.н. (положение 1877–2378 последовательности кДНК TSHR, +1 является первым основанием исходного кодона), содержащий стоп-кодон в положении 708. После переваривания с использованием Xcm I и Bst EII очищенный фрагмент клонировали в pSG5-hTSHR, расщепленный теми же ферментами.
В случае мутантов TSHRΔ731–764 и TSHRΔ747–764 были сконструированы два фрагмента длиной 441 п.н. (положение 2044–2460 последовательности кДНК), содержащие стоп-кодон в положении 731 или 747.После переваривания Bst EII и Hpa I очищенные фрагменты клонировали в вектор pSG5-TSHR, расщепленный теми же ферментами.
В случае TSHRΔ314-764 был сгенерирован фрагмент длиной 214 п.н., содержащий стоп-кодон в положении 314 и сайт Bsu 36I на его 3′-конце. Этот продукт ПЦР расщепляли Afl II и Bsu 36I и клонировали в pSG5-TSHR, расщепленный теми же ферментами.
В случае мутантов с делецией pLHR, LHRΔ651–696, LHRΔ666–696 и LHRΔ690–696, были обнаружены три фрагмента длиной 635 пар оснований (положение 1738–2373 последовательности кДНК), содержащие стоп-кодон в положениях 651, 666 и 690. построен.После переваривания с Esp I и Bam HI их клонировали в pSG5-pLHR, который ранее был переварен теми же ферментами.
Сайт-направленный мутагенез сигнала базолатерального сортировки TSHR
Две точечные мутации были произведены в базолатеральном сортирующем сигнале TSHR с использованием ПЦР-опосредованного мутагенеза олигонуклеотидов. Тирозин 739 и лейцин 741 были заменены в аланине с использованием той же стратегии, что и для мутантов TSHRΔ731–764 и TSHRΔ747–764.
Конструирование векторов экспрессии, кодирующих химерные рецепторы между усеченным рецептором нейротропина NTRt и базолатеральным сигналом сортировки TSHR или LHR
Мы использовали вектор pCB6, содержащий NTR, лишенный его внутриклеточного домена (шесть остатков ниже трансмембранного домена), который был описан ранее (49). Базолатеральные сигналы сортировки TSHR (и дополнительных аминокислот, необходимых для сохранения открытой рамки считывания) или LHR были клонированы в сайт Xba I, давая NTRt / TSHR729–746 или NTRt / LHR672–689.Химерные рецепторы, содержащие мутантный базолатеральный сигнал сортировки, также были сконструированы, давая замены NTRt / TSHR729-Y739A-746 и NTRt / TSHR729-L741A-I742A-746 с Tyr 739 Ala и Leu 741 Ala-Ile 742 Ala соответственно. .
Культура клеток и экспрессия TSHR, мутантов LHR и химеры NTRt
КлеткиMDCK (тип II) и FRT (подарок от доктора Б. Руссе, INSERM, Unité 369, Лион, Франция) поддерживали, как описано ранее (10, 50).Различные клеточные линии были получены, как описано ранее (10). Антитела T5–317, LHR38 или ME20.4 (подарок доктора А. Ле Бивика) были использованы для скрининга клонов, экспрессирующих рецепторы ТТГ и ЛГ или химеру нейротропина (10, 11). Мы также подтвердили, что поляризованный фенотип трансфицированных клеток MDCK и FRT не изменился (10).
Непрямая иммунофлуоресценция и конфокальная микроскопия
КлеткиMDCK выращивали на 12-миллиметровых фильтрах (0,4 мкм полиэфирный Transwell, Costar Corp., Кембридж, Массачусетс) и обработали, как описано ранее (11). Вкратце их фиксировали 3% параформальдегидом. После насыщения PBS, содержащим 1% БСА (фракция V, Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури), апикальные и базолатеральные поверхности инкубировали с той же средой, содержащей моноклональные антирецепторные антитела: T5-317 (5 мкг / мл). , LHR38 (5 мкг / мл) или ME20.4 (разведение 1: 200), направленных против внеклеточного домена TSHR, LHR или NTR, соответственно, с последующей инкубацией с козьим антимышиным IgG Alexa Fluor-488 (Molecular Проба, Евгений, Орегон).После промывки образцы помещали в флуоресцентную среду для закрепления (DAKO, Carpenteria, CA) и наблюдали под микроскопом (Axiovert 135M, Zeiss, Deerfield, IL) в сочетании с конфокальным лазерным сканирующим устройством (Zeiss LSM 410).
Анализы цАМФ
цАМФ измеряли, как описано ранее (10), после 45-минутной инкубации трансфицированных клеток COS-7 со 100 мМЕ / мл bTSH (Sigma-Aldrich Corp.) или 30 МЕ / мл хорионического гонадотропина человека (ХГЧ; Organon, West Orange, Нью-Джерси).
Поверхностная иммунопреципитация дикого типа и мутантных TSHR и LHR и химерных рецепторов NTRt / TSHR729–746 и NTRt / LHR672–689, экспрессируемых в клетках MDCK
Использовалиполяризованных монослоев клеток MDCK. Рецепторы, экспрессируемые на поверхности клеток, подвергали иммунопреципитации, как описано ранее (10, 11). После метаболического мечения клеток проводили поверхностную иммунопреципитацию с использованием поликлональных антител TSHR19–389 (10) к TSHR и моноклональных антител LHR38 и ME20.4, для LHR и NTR соответственно, распознающих внеклеточный домен соответствующего рецептора. Экстракцию и очистку комплексов рецептор-антитело проводили, как описано ранее (10, 11). Все эксперименты проводились как минимум дважды с трехкратным образцом.
Исследование поляризованной секреции мутанта рецептора TSHRΔ314–764
КлеткиMDCK, постоянно экспрессирующие мутант рецептора TSHRΔ314–764, выращивали на 24-мм поликарбонатных фильтрах, подвергали импульсной обработке в течение 1 часа с [ 35 S] метионином и прогоняли в течение 5 часов со средой, содержащей немеченые аминокислоты.Растворимый рецептор TSHRΔ314–764, секретируемый либо в апикальной, либо в базолатеральной культуральной среде, затем подвергали иммуноочистке с использованием моноклональных антител T5–317.
Электрофорез и авторадиография
SDS-PAGE выполняли, как описано ранее (10). Гели фиксировали и обрабатывали для флюорографии. Для количественной оценки использовалось денситометрическое сканирование.
Интернализация ТТГ и ЛГ, опосредованная рецепторами
клеток MDCK, экспрессирующих TSHR или LHR дикого типа или мутировавшие, обрабатывали, как описано ранее (51).Вкратце, их инкубировали в течение 2 часов при 4 ° C (для TSHR) или 10 минут при 37 ° C (для LHR) с [ 125 I] bTSH (0,1 мкКи / мл; ERIA Diagnostic Pasteur, Sanofi, France) или [ 125 I] ХГЧ (325 мкКи / мл; PerkinElmer, Wellesley, MA) (10, 51). Несвязанный лиганд удаляли, и клетки инкубировали при 37 ° C в течение различных периодов времени (0–30 мин). Лиганд, оставшийся на поверхности клетки, удаляли кислотными промывками. Наконец, клетки выделяли добавлением трипсина и подсчитывали общую радиоактивность суспензии.Это значение соответствует интернализованной фракции. Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка немеченого bTSH (Sigma-Aldrich Corp.) или hCG (Organon) и с нетрансфицированными клетками MDCK. Интернализованный лиганд выражали как процент от общей радиоактивности (с поправкой на неспецифическое связывание), первоначально связанной с клетками.
Синтез пептидов: последовательности человеческих TSHR, FSHR и LHR
TSHR725–753 (THDMRQGLHNMEDVYELIENS-HLTPKKQG), FSHR671–695 (HCSSAPRVTSGSTYILVPLSHLAQN) и LHR671–694 (NKPSRSTLKLTTLQCQYSTVMDKTVMDK).1 ммоль) твердофазным методом с использованием пептидного синтезатора 433A PE Applied Biosystems (Foster City, CA) и стандартной процедуры F-moc, как описано ранее (52). Синтетические пептиды очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac C 18 2,2 × 25 см (Alltech, Templemars, Франция) с использованием линейного градиента (10–50% за 45 мин) ацетонитрил / TFA (99,9: 0,1, объем / объем) при скорости потока 10 мл / мин. Аналитическая ВЭЖХ с обращенной фазой выполнялась на колонке Vydac C 18 (0.45 × 25 см) с использованием линейного градиента (10–60% за 25 мин) ацетонитрил / TFA при скорости потока 1 мл / мин. Очищенные пептиды характеризовали с помощью масс-спектрометрии с времяпролетной ионизацией с использованием матрицы и лазерной десорбции на спектрометре Tof-Spec E (Micromass, Манчестер, Великобритания).
КД-спектроскопия
Спектры КД пептидов записывали при комнатной температуре на спектрополяриметре CD6 (Jobin Yvon, Лонжюмо, Франция). Прибор обычно калибровали водным раствором (+) — 10-камфорсульфоновой кислоты.Спектры КД были получены в дальнем УФ-диапазоне с использованием диапазона длин волн 186–260 нм при разрешении 1 нм в ячейках размером 0,02 см. Было записано десять сканирований со скоростью 1 точка каждые 2 с. Используемые концентрации пептида составляли 112,5 мкм (FSHR), 93,53 мкм (TSHR) и 100,0 мкм (LHR), как определено по поглощению тирозина при 276 нм с использованием коэффициента экстинкции 1450 см -1 × m -1. (53). Средние значения остаточной эллиптичности ([θ]) были выражены в градусах × квадратных сантиметрах × декамолях -1 и были рассчитаны по уравнению [θ] = θ × M / 10 × l × C, где θ — наблюдаемая эллиптичность в градусах. , M представляет собой средний молекулярный вес остатка пептида, l, если длина оптического пути в сантиметрах, и C, если концентрация пептида в граммах × миллилитр -1 .Спектры КД записывали с пептидами в растворе SDS [25 мМ TSHR (pH 6,6), LHR (pH 7,5) и FSHR (pH 7,7)], метаноле и TFE / H 2 O (90:10). Оценка конформаций была выполнена с использованием эталонных кривых CD, представленных Yang et al. (18) и Chang et al. (19). Расчеты были выполнены с использованием специальной программы, применяющей обычное правило аддитивности между 190 и 240 нм на каждом нанометре. Все комбинации конформации (, т.е. спираль, β-лист, β-виток и случайная спираль) были рассчитаны от 0 до 100% с шагом 1%.Полученные теоретические кривые вычитались из экспериментальных и использовался метод наименьших квадратов для определения наилучшего соответствия.
Благодарности
Мы благодарны А. Ле Бивику за подарок антител и вектора экспрессии NTR, а также Б. Руссе за подарок клеток FRT. Мы благодарим П. Леклерка [Service Commun de Microscopie Confocale, Institut Fédératif de Recherche (IFR) 93] за помощь с анализом конфокальной микроскопии и L. Outin (Service Commun de Photographie, IFR 93) за графическую помощь.Мы благодарим C. Pichon за производство антирецепторных антител и C. Gilbert за техническую помощь.
Работа была поддержана Национальным институтом медицинских исследований, Парижским медицинским университетом XI и Фондом медицинских исследований.
Сокращения:
CD,
FSHR,
hCG,
хорионический гонадотропин человека;
LHR,
MDCK,
Собачья почка Мадина-Дарби;
MeOH,
ЯМР,
ядерный магнитный резонанс;
NTR,
NTRt,
усеченный рецептор нейротропина;
SDS,
TFE,
TSHR,
Simons
K
,Fuller
SD
1985Полярность поверхности ячейки
Annu Rev Cell Biol
1
:243
—288
2Материя
K
,Mellman
I
1994
Механизмы сортировки клеток и полярность клеточного транспорта.
Curr Opin Cell Biol
6
:545
—554
3Возняк
M
,Limbird
LE
1996
адатеральных адатеральных рецепторов Madin -Клетки почек собак Дарби II с помощью различных механизмов нацеливания.
J Biol Chem
271
:5017
—5024
4Song
Y
,Chan
CW
,Коричневый
GM
9000 9000 PangM
1997
Исследования почечного действия мелатонина: доказательства того, что эффекты опосредуются рецепторами 37 кДа подтипа Mel1a, локализованными в основном на базолатеральной мембране проксимального канальца.
FASEB J
11
:93
—100
5Luo
H
,Tesfaye
A
,Schieren
I
r J JЭкспрессия рецепторов 5-HT1C в трансфицированных клетках MDCK функционально и анатомически асимметрична.
Am J Physiol
265
:C193
—C200
6Saunders
C
,Keefer
JR
,Bonner
CA,9000 9000
LE, CA,Нацеливание рецепторов, связанных с G-белком, на базолатеральную поверхность поляризованных эпителиальных клеток почек включает множественные несмежные структурные сигналы.
J Biol Chem
273
:24196
—24206
7Misrahi
M
,Beau
I
,Meduri
G
at4M
,Loosfelt
H
,Ghinea
N
,Hai
MV
,Bougneres
PF
,Milgrom
adad стероидогенез: физиология и патология.Baillieres Clin Endocrinol Metab
12
:35
—66
8Misrahi
M
,Milgrom
E
1997
рецептор TSH.
In:Weetman
AP
,Grossman
A
, ред.Справочник по экспериментальной фармакологии: фармакотерапия щитовидной железы.
Берлин, Гейдельберг
:Springer-Verlag;
33
—73
9Themmen
APN
,Huhtaniemi
IT
2000
Мутации гонадотропинов и рецепторов гонадотропинов — физиология и патофизиология функции гипофиза.
Endocr Ред.
21
:551
—583
10Beau
I
,Misrahi
M
,Gross
B
000
,Vann H
,Hai
MT
,Pichon
C
,Milgrom
E
1997
Базолатеральная локализация и трансцитоз гонадотропиновых и тиреотропиновых рецепторов Darby canney.
J Biol Chem
272
:5241
—5248
11Beau
I
,Groyer-Picard
MT
, LeBivic
ALoosfelt
H
,Milgrom
E
,Misrahi
M
1998
Сигнал базолатеральной локализации рецептора фолликулостимулирующего гормона.
J Biol Chem
273
:18610
—18616
12Nadler
LS
,Kumar
G
,Nathanson
NM
базовый сигнал сортировки для мускаринового рецептора ацетилхолина M3 в клетках почек собак Madin-Darby.J Biol Chem
276
:10539
—10547
13Hermosilla
R
,Schulein
R
9000mic4 2001отдельных доменов Cytoplas, объединяющих функции сортировки белков рецептор вазопрессина V2 в эпителиальных клетках почек собак Madin Darby.
Mol Pharmacol
60
:1031
—1039
14Scheiffele
P
,Fullekrug
J
2000
Гликозилирование и транспорт белков.
Essays Biochem
36
:27
—35
15Le
Bivic
A
,Sambuy
Y
,Patzak
A
000 PatioM
,Rodriguez-Boulan
E
1991
Внутренняя делеция в цитоплазматическом хвосте меняет апикальную локализацию человеческого рецептора NGF в трансфицированных клетках MDCK.
J Cell Biol
115
:607
—618
16Rodriguez-Boulan
E
,Zurzolo
C
1993
Полярность клеток.
J Cell Sci 17 (Suppl)
:9
—12
17Киши
M
,Ascoli
M
2000
Хвост крысы с концевым С-концом / ллогутропин CG) рецептор независимо модулирует человеческую (h) CG-индуцированную интернализацию рецептора клеточной поверхности и лизосомное нацеливание интернализованного комплекса hCG-рецептор.
Mol Endocrinol
14
:926
—936
18Yang
JT
,Wu
CS
,Мартинес
HM
круговая конформация
dich .Методы Enzymol
130
:208
—269
19Chang
CT
,Wu
CS
,Yang
9000 Cir4 JT анализ конформации включение β-витков.Anal Biochem
91
:13
—31
20Condamine
E
,Rebuffat
S
,Prigent
Y
Seal B
,Davoust
D
1998
Трехмерная структура ионного канала, образующего пептид трихорцианин TA VII, связанный с мицеллами додецилсульфата натрия.
Биополимеры
46
:75
—88
21Sonnichsen
FD
, VanEyk
JE
,Hodges
RS
D000000000000000 Влияние трифторэтанола на вторичную структуру белка: исследование ЯМР и КД с использованием синтетического пептида актина.Биохимия
31
:8790
—8798
22Нагаяма
Y
,Нишихара
E
,Намба
000 M
,Namba
H
,Namba
H
,2000
Идентификация сайтов аспарагин-связанного гликозилирования на рецепторе тиреотропина человека и исследования их роли в функции и экспрессии рецептора.
J Pharmacol Exp Ther
295
:404
—409
23Harfst
E
,Johnstone
AP
,Nussey
SSвне зоны действия
рецептора тиреотрофина человека, выраженного в виде рекомбинантного белка.
Дж Мол Эндокринол
9
:227
—236
24Heilker
R
,Manning-Krieg
U
,Zuber
9000
000 JF4 1996Связывание адаптеров клатрина in vitro с сигналами сортировки коррелирует с эндоцитозом и базолатеральной сортировкой.
EMBO J
15
:2893
—2899
25Hunziker
W
,Fumey
C
1994
G энцефалопатическая сортировка макоцинита ди-лейцина рецепторы в клетках MDCK.
EMBO J
13
:2963
—2967
26Casanova
JE
,Apodaca
G
,Mostov
KE
автономная сортировка Сигнал автономной сортировки цитоплазматический домен рецептора полимерного иммуноглобулина.Cell
66
:65
—75
27Talor
Z
,Emmanouel
DS
,Katz
связывание AI
инсулин
трубчатые перепонки из почек кролика.J Clin Invest
69
:1136
—1146
28Keefer
JR
,Kennedy
ME
,Limbird
LE
важные конструктивные особенности Важные конструктивные особенности по сравнению с поляризацией α2A-адренорецептора на базолатеральной мембране клеток почек собак Madin-Darby.J Biol Chem
269
:16425
—16432
29Fanelli
F
,Puett
D
2002
Информация о структурном моделировании рецепторов молекулярного генеза: информация о структурах молекулярного генеза .
Эндокринная
18
:285
—293
30Танака
K
,Нагаяма
Y
,Nishihara
E
000
000000000 Y Nishihara,Niwa
M
1998
Пальмитоилирование рецептора тиреотропина человека: более медленное внутриклеточное перемещение мутанта с дефектом пальмитоилирования.
Эндокринология
139
:803
—806
31Kawate
N
,Menon
KM
1994
гуманизированные гормональные рецепторы трансмутации хлороинфосфатных рецепторов. Отмена пальмитоилирования путем мутации остатков Cys-621 и Cys-622 в цитоплазматическом хвосте увеличивает индуцированную лигандом интернализацию рецептора.
J Biol Chem
269
:30651
–30658
32Оно
H
,Stewart
J
,Fournier
9000ss4
I
,Miyatake
S
,Saito
T
,Gallusser
A
,Kirchhausen
T
,Bonifacino
9000 Сортировка сигналов
9000 JS
9000 Взаимодействие на основе JS 9000 с клатрин-ассоциированными белками.
Наука
269
:1872
—1875
33Aroeti
B
,Kosen
PA
,Kuntz
FE
0009000Cohen
1993
Мутационный и вторичный структурный анализ базолатерального сигнала сортировки полимерного рецептора иммуноглобулина.
J Cell Biol
123
:1149
—1160
34Bansal
A
,Gierasch
LM
1991
Рецептор обратного интернализации NPXL принимает сигнал поворота. конформация.
Ячейка
67
:1195
—1201
35Eberle
W
,Sander
C
,Klaus
W
,000000000 Schmidt4000 Schmidt4000 K
,Peters
C
1991
Эссенциальный тирозин сигнала интернализации в лизосомальной кислой фосфатазе является частью β-поворота.
Ячейка
67
:1203
—1209
36Aroeti
B
,Охрименко
H
,Reich
V
PolzeOrze
Orze транспорт белков плазматической мембраны: новые роли оболочек, SNARE, GTPases и их связь с цитоскелетом.
Biochim Biophys Acta
1376
:57
—90
37Sun
AQ
,Arrese
MA
,Zeng
hou
hou
,000MM
,Сухи
FJ
2001
Котранспортер Na + / желчной кислоты в печени крысы. Важность цитоплазматического хвоста для функционирования и нацеливания на плазматическую мембрану.
J Biol Chem
276
:6825
—6833
38Folsch
H
,Оно
H
,Bonifacino
ISellmanНовый адаптерный комплекс клатрина обеспечивает базолатеральное нацеливание в поляризованных эпителиальных клетках.
Ячейка
99
:189
—198
39Simmen
T
,Хонингование
S
,Icking
A
,000 R000 R9000 R9000 9000 R9000 R9000 9000 R9000 R90002002
AP-4 связывает базолатеральные сигналы и участвует в базолатеральном сортировке в эпителиальных клетках MDCK.
Nat Cell Biol
4
:154
—159
40Reich
V
,Мостов
K
,Aroeti B1996 Базолатеральный сортирующий сигнал полимерного иммуноглобулина содержит два функциональных сигнала полимеризации. .
J Cell Sci
109
:2133
—2139
41Оуэн
DJ
,Setiadi
H
,Evans
PR
000 RP, Mc4SA
2001
Третий сайт, определяющий специфичность, в μ2 адаптине для последовательностей выше сортировочных мотивов Yxxφ.
Трафик
2
:105
—110
42Сугимото
H
,Сугахара
M
,Folsch
H
000000
000 Koide
,Tanaka
N
,Nishimura
T
,Furukawa
M
,Mullins
C
,Nakamura
N
000
000
000
000 Mellman
000
Mellman
2002
Дифференциальное распознавание базолатеральных сигналов на основе тирозина субъединицей AP-1B micro1B в поляризованных эпителиальных клетках.
Ячейка Mol Biol
13
:2374
—2382
43Кунду
A
,Авалос
RT
,Сандерсон
DP
0009000Сандерсон
CM
0009,Трансмембранный домен нейраминидазы вируса гриппа, белка типа II, обладает сигналом апикальной сортировки в поляризованных клетках MDCK.
J Virol
70
:6508
—6515
44Dunbar
LA
,Aronson
P
,Caplan
MJ
9000 устойчивый сегмент государственная локализация аденозинтрифосфатазы, переносящей ион.J Cell Biol
148
:769
—778
45Chuang
JZ
,Sung
CH
1998
Цитоплазмический поляризованные клетки MDCK.
J Cell Biol
142
:1245
—1256
46Koivisto
UM
,Hubbard
AL
,Mellman
I
I
гиперхолестеринемия из-за нарушения поляризованного нацеливания на рецептор ЛПНП.Ячейка
105
:575
—585
47Мисрахи
M
,Гинея
N
,Sar
S
,Saunier
,Loosfelt
H
,Cerutti
M
,Devauchelle
G
,Milgrom
E
1994
Обработка предшественников гормонов щитовидной железы человека, стимулирующих различные гормональные рецепторы гормонов человека. (тироциты человека, трансфицированные L-клетки и инфицированные бакуловирусом клетки насекомых).
Eur J Biochem
222
:711
—719
48VuHai-LuuThi
MT
,Misrahi
M
,Houllier
000
Houllier
МилгромE
1992
Вариантные формы рецептора лутропина / хориогонадотропина свиньи.
Биохимия
31
:8377
—8383
49Хемпстед
BL
,Патил
N
,Тиль
B
00090009 цитоплазматических последовательностей рецептора фактора роста нервов приводит к потере связывания лиганда с высоким сродством.J Biol Chem
265
:9595
—9598
50Zurzolo
C
,Gentile
R
,Mascia
A
bi9,
Mascia
A
bi9,
9000
C
,Aloj
L
,Avvedimento
VE
,Nitsch L1991 Поляризованный эпителиальный фенотип является доминирующим у гибридов между поляризованными и неполяризованными линиями клеток щитовидной железы крыс.
J Cell Sci
98
:65
—73
51Баратти-Эльбаз
C
,Ghinea
N
,Lahuna
000 4 Lahuna 9000
s PichonC
,Milgrom
E
1999
Пути интернализации и рециркуляции рецептора тиреотропина.
Mol Endocrinol
13
:1751
—1765
52Leprince
J
,Gandolfo
P
,Thoumas
JL,Vaudry
H
,Tonon
MC
1998
Взаимосвязь между структурой и активностью ряда аналогов октадекануропептида ODN на мобилизацию кальция в астроцитах крыс.
J Med Chem
41
:4433
—4438
53Gill
SC
, vonHippel
PH
1989
Расчетные коэффициенты аминокислотной последовательности на основе аминокислотных коэффициентов.
Анал Биохим
182
:319
—326
Авторские права © 2004 Эндокринное общество
Молекулярное клонирование генов гормонов
Об этой книге
Введение
Пептидные гормоны — это небольшие белки, которые регулируют клеточный метаболизм посредством своего специфического взаимодействия с тканями эндокринной, нервной и иммунной систем, а также в эмбриональном развитии.За последние десять лет усовершенствования методов технологии рекомбинантных ДНК привели к клонированию генов, кодирующих примерно 50 различных гормональных и регуляторных пептидов, в том числе тех, в которых сами пептиды и мРНК, кодирующие пептиды, присутствуют только в следовых количествах в ткани происхождения. В дополнение к предоставлению кодирующих последовательностей распознаваемых гормональных и регуляторных пептидов, секвенирование генов выявило новые биоактивные пептиды, кодируемые предшественниками прогормонов, которые затем высвобождаются вместе с гормональными пептидами во время клеточного расщепления предшественников.Кодирование нескольких пептидов в одной моноцистронной мРНК, по-видимому, является генетическим механизмом для создания биологической диверсификации без необходимости амплификации последовательностей генов. Две из целей в сборке этой книги — представить в одном томе известные первичные структуры генов, кодирующих несколько полипептидных гормонов и родственных регуляторных пептидов, и предоставить отчет о различных подходах, которые были применены. используется для идентификации и отбора клонированных генов, кодирующих эти полипептиды.Содержание двух вводных глав призвано предоставить читателю краткую справочную информацию о подходах к клонированию генов, а также структуре и экспрессии генов, кодирующих гормоны.
Ключевые слова
ДНК Пептиды биология биосинтез клонирование экспрессия генов иммунная система метаболизм физиология белок структура белка белки ткань транскрипция
Редакторы и сотрудники
- 1.Лаборатория молекулярной эндокринологии и Медицинский институт Говарда Хьюза, Массачусетская больница общего профиля, Бостон, США,
Библиографическая информация
- Название книги Молекулярное клонирование генов гормонов
- Авторы
Джоэл Ф.Хабенер
- Название серии Молекулярная биология и биофизика
- DOI https://doi.org/10.1007/978-1-4612-4824-8
- Информация об авторских правах Humana Press 1987
- Имя издателя Humana Press
- электронные книги Архив книг Springer
- ISBN в твердом переплете 978-0-89603-091-6
- ISBN в мягкой обложке 978-1-4612-9178-7
- электронная книга ISBN 978-1-4612-4824-8
- Номер издания 1
- Число страниц XVIII, 442
- Количество иллюстраций 0 ч / б иллюстраций, 0 иллюстраций в цвете
- Темы
Клеточная биология
- Купить эту книгу на сайте издателя
01 Dungeoneer | Развлечения (общие)
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 10 по 30 не показаны при предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 39 по 41 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 47 по 76 не показаны при предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 84 по 96 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 100 по 109 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы 113–114 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 118 по 125 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 129 по 130 не показаны при предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 138 по 139 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 143 по 148 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 152 по 159 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 163 по 166 не показаны в этом предварительном просмотре.
Вы читаете бесплатный превью
Страницы с 174 по 176 не показаны при предварительном просмотре.