Смесь малютка состав с рождения: Аптека Ригла – забронировать лекарства в аптеке и забрать самовывозом по низкой цене в Москва г.

Анализ повторных измерений не показал какой-либо значимости между групповыми различиями в вес младенца, длина, масса жира, масса без жира, FMI, FFMI и процентное содержание жира в организме. Скорректировано с учетом веса при рождении, длины тела и пола ребенка, жировой массы, обезжиренного масса, FMI и FFMI существенно не различались между исключительно грудное вскармливание и смешанное вскармливание младенцев на 2, 4, 8 и 12 неделях после родов. Между вычисленным FMI и измеренным процентом наблюдалась сильная корреляция. жировые отложения (до 0.974; ) в каждый момент времени.

4. Обсуждение

Результаты этого пилота проспективное исследование показывает, что исключительно грудное вскармливание может способствовать увеличению прибавка в весе и FMI в раннем послеродовом периоде (первые 12 недель после доставка) по сравнению со смешанным кормлением. Хотя результаты детского тела измерения состава из этого пилотного исследования аналогичны к ранее опубликованным данным Fomon et al. [21], Butte et al. [22] и Гилкрист [23], небольшие различия у младенцев методы кормления и рост ребенка и состав тела рассматриваются, как они сравнили исключительно грудное вскармливание и вскармливание смесями с текущим исследованием сравнение исключительно грудного вскармливания со смешанным кормлением.В соответствии с исследованием от Gilchrist [23], без значимого пола в этом исследовании наблюдались различия в прибавке в весе и увеличении ожирения, независимо от кормления в первые недели послеродового периода. Этот вывод противоречит выводы Buyken et al. [24], которые изучали детей старшего возраста. Buyken и другие. обнаружили, что дети мужского пола, находящиеся исключительно на грудном вскармливании в течение более длительного периода, были защищены от избыточного веса / ожирения, даже если их матери имели избыточный вес [24].В исследовании Butte et al. [22] авторы наблюдали более высокую скорость веса у детей, вскармливаемых смесью, по сравнению с младенцами в возрасте от 3 до 6 месяцев на грудном вскармливании, что противоречит результатам текущего исследования младенцев от 0 до 12 недель. Выводы из текущего исследования показывают, что прибавка в весе у детей, вскармливаемых исключительно грудью, была выше по сравнению с их коллегами, которые получали смешанное вскармливание через первые 12 недель после родов (рис. 1), что согласуется с предыдущие исследования, хотя они сравнивали исключительно грудное вскармливание с молочной смесью кормление [25–27].Это означает, что младенцы, находящиеся на исключительно грудном вскармливании, быстро набирают вес. в течение первых 12 недель послеродового периода, чем младенцы смешанного или смешанного происхождения. искусственно кормят. Это интересная находка который требует дальнейшего исследования по истечении 12 недель после родов, поскольку мы рекомендуем больше матерей кормят новорожденных исключительно грудью в течение первых 6 месяцев после доставки.

Кроме того, процент жира в организме число младенцев, вскармливаемых исключительно грудью, превысило число младенцев на смешанном вскармливании на 0.52% при 4 недель после родов, и разница продолжала увеличиваться на протяжении всего периода исследования, достигнув 1,12% жира в организме в 12 недель послеродового периода. Характер увеличения процента жира в организме, наблюдаемый в Настоящее исследование согласуется с выводами Гилкриста [23]. Тот же образец был наблюдалось, когда FMI использовался для оценки ожирения у младенцев (рис. 2). В разница в FMI и процентном содержании жира в организме между группами кормления, хотя и не статистически значимо, это важное наблюдение, поскольку оно позволяет измерить ожирение.С сильной связью повышенного ожирения с сердечно-сосудистыми заболеваниями. и других хронических заболеваний, важно понимать, почему младенцы, исключительно на грудном вскармливании набирают больше жира в организме, чем те, кто не получает исключительно грудное вскармливание в первые 12 недель после родов. Это также очень важно для будущих исследований, чтобы задокументировать, что происходит с различиями в ожирение в младенчестве удваивается и втрое превышает их массу при рождении в 4–6 месяцев и 9–12 месяцев, соответственно.В настоящем исследовании не было прямого измерения младенческого возраста. фактическое потребление, даже несмотря на то, что матери, которые кормили смешанным кормом, сообщили о доле ежедневное кормление из заменителей грудного молока. Будет интересно и важно для будущих исследований для количественной оценки потребления корма (грудное молоко только по сравнению с грудным молоком, и смесью с смесью только) и их соответствующие содержание энергии, чтобы проверить, имеют ли младенцы исключительно грудного вскармливания более высокие по сравнению с другими группами кормления в раннем послеродовом периоде, что приводит к быстрое увеличение веса и FMI / процент жира в организме.Также будет важно понять метаболизм младенцев, получающих разное питание в раннем послеродовой период. Лучшее знание фактического потребления пищи и метаболизма показатель в раннем послеродовом периоде поможет объяснить, почему младенцы исключительно грудного вскармливания набрать больше массы тела и FMI, а также процент жира в организме, чем младенцы получение смешанного или искусственного вскармливания в течение первых 3 месяцев жизни. Этот информация также поможет понять, почему кажется исключительно грудным вскармливанием. способствовать быстрому увеличению веса и высокому ожирению в раннем послеродовом периоде, в то время как другие исследования обнаруживают защитный эффект или отсутствие влияния на избыточный вес / ожирение позже в жизни ребенка.

Использование индекса массы тела (ИМТ) в качестве прокси для оценки ожирения и ожирения, в ряде исследований сообщается защитный эффект грудного вскармливания при детском ожирении [28, 29]. Эти исследования были поперечный характер и полагались на отзыв матери / опекуна методы кормления младенцев. Исследования, которые носили перспективный характер в этом области либо не сообщили об отсутствии влияния грудного вскармливания на избыточный вес / ожирение [30], либо грудное вскармливание как риск фактор избыточной массы тела / ожирения [31], в то время как исследования, в которых использовались метаанализ показал защиту грудного вскармливания от слабой до умеренной. против избыточного веса / ожирения в детстве [3, 5, 12, 17].Во всех этих исследованиях оценивалась взаимосвязь между грудным вскармливанием и избыточный вес / ожирение у детей старшего возраста, а не в раннем послеродовом периоде. Несмотря на то что, ИМТ, как правило, является хорошим инструментом для выявления избыточного веса / ожирения, этого недостаточно, особенно при оценке ожирения, отсюда и влияние текущего исследование с использованием FMI в этой области исследований в раннем послеродовом периоде. К с использованием FMI, жировая масса была скорректирована по длине ребенка, которая является показателем без жира и не связаны напрямую с массой тела.Помимо веса и тела измерения состава в этой области исследований, определение грудное вскармливание и продолжительность могут играть важную роль в несоответствиях сообщается в литературе. Несмотря на то, что в текущем исследовании есть небольшая выборка размер, перспективен в дизайне. Он применял строжайшее определение для исключительно грудное вскармливание, а также использовала систему композиции тела PEA POD который оказался точным при измерении состава тела в младенцы [20].Следовательно, существует необходимость для проспективного исследования с адекватной мощностью наблюдения за детьми с раннего от младенчества до подросткового возраста при строго определенном грудном вскармливании определения и измерения диетического питания, а также использование веса, ИМТ и тела методики композиции это доказано, чтобы быть точным.

Результаты текущего исследования наряду с другими предполагают быстрое увеличение веса и накопление жировой ткани в раннем послеродовом периоде, что требует дальнейшего изучения фактических потребление и метаболизм младенца, чтобы руководствоваться рекомендациями по кормлению и уходу за младенцем дается матерям и лицам, осуществляющим уход, как средство предотвращения избыточного веса и ожирение у детей.Важно подчеркнуть, что исследование было разработано для сравнения младенцев, находящихся на исключительно грудном вскармливании и искусственном вскармливании, а также веса и процент накопления жира в организме, но результаты сравнивают исключительно грудное вскармливание и смешанное вскармливание. Результаты этого исследования необходимо интерпретировать. и обобщать с осторожностью из-за небольшой выборки и участников в основном белые и хорошо образованные. Это исследование — одно из немногих, в котором изучили связь между грудным вскармливанием и избыточным весом / ожирением у детей. фактически измеряя состав тела младенца в раннем послеродовом периоде.С учетом сказанного, практикующие и родители / опекуны не должны упускать из виду многочисленные преимущества грудного вскармливания для здоровья младенца, матери и все общество даже в раннем послеродовом периоде. Кроме того, долгосрочные последствия грудного вскармливания для состава тела имеют большее значение для общественного здоровья значимость, чем эффект в течение первых 12 недель после родов, требующий дальнейшие проспективные исследования.

5. Заключение

Скорость набора веса и ожирение было немного выше среди младенцев, которые кормили исключительно грудью по сравнению с их коллегами, которые получали смешанное вскармливание в первые 12 недель после доставки.В целом процент жира в организме младенцев, находящихся на исключительно грудном вскармливании, был процентным. что на 1,3% выше, чем у детей со смешанным вскармливанием через 12 недель после родов. Исключительно младенцы на грудном вскармливании также весили немного больше и имели немного более высокий FMI, меньше FFMI через 12 недель после родов по сравнению с их коллегами на смешанном вскармливании. Там поэтому необходимы дальнейшие проспективные исследования в этой области для изучения что происходит с процентным содержанием жира в организме через 6 и 12 месяцев после родов, как ожидается, что младенцы удвоят и утроят свой вес при рождении соответственно, поскольку 6 месяцев и 12 месяцев послеродового периода также являются периодами высокой потребности в энергии в жизнь младенца.Если это будет сделано, это будет способствовать поиску эффективных способы профилактики избыточного веса / ожирения, особенно у детей. Это также даст лучшее понимание различий в ожирении между исключительно грудное вскармливание, смешанное вскармливание и грудное вскармливание в раннем возрасте. послеродовой период.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом на развитие факультета от Фонд исследований Университета Джорджии (UGARF). Автор выражает благодарность и признательность матерям, которые участвовали в этом исследовании со своими новорожденные.Он также хочет поблагодарить своего выпускника научные сотрудники Ирен Хацу, Доун МакДугалд и Приянка Чакраборти за их помощь в наборе, сборе данных и вводе данных.

Развитие кишечной микробиоты ребенка

Abstract

Почти сразу после рождения человека возникает новая микробная экосистема, которая находится в желудочно-кишечном тракте этого человека. Несмотря на то, что это универсальная и неотъемлемая часть биологии человека, временное развитие этого процесса, источники микробов, составляющих экосистему, как и почему она меняется от одного младенца к другому, и как состав этой экосистемы влияет на человека. физиология, развитие и болезнь все еще плохо изучены.В качестве шага к систематическому исследованию этих вопросов мы разработали микроматрицу для обнаружения и количественного определения последовательностей генов малых субъединиц рибосомной РНК (SSU рРНК) большинства известных в настоящее время видов и таксономических групп бактерий. Мы использовали этот микрочип вместе с секвенированием клонированных библиотек рДНК SSU, амплифицированных с помощью ПЦР, для профилирования микробных сообществ в среднем по 26 образцам стула от 14 здоровых доношенных новорожденных, включая пару дизиготных близнецов, начиная с первый стул после рождения и продолжающийся через определенные промежутки времени в течение первого года жизни.Чтобы исследовать возможное происхождение детской микробиоты, мы также составили профили вагинальных образцов и молока от большинства матерей, а также образцов кала от всех матерей, большинства отцов и двух братьев и сестер. Состав и временные паттерны микробных сообществ широко варьировались от ребенка к ребенку. Несмотря на значительные временные различия, отличительные черты микробного сообщества каждого ребенка были различимы с интервалами от недель до месяцев. Поразительно параллельные временные паттерны близнецов предполагают, что случайные воздействия окружающей среды играют важную роль в определении отличительных характеристик микробного сообщества у каждого ребенка.К концу первого года жизни идиосинкразические микробные экосистемы у каждого ребенка, хотя и различны, сходились к профилю, характерному для желудочно-кишечного тракта взрослого.

Информация об авторе

Уже почти столетие было признано, что люди населены удивительно плотной и разнообразной микробной экосистемой, но мы только начинаем понимать и ценить многие роли, которые эти микробы играют в здоровье и развитии человека.Знание состава этой экосистемы — решающий шаг к пониманию ее роли. В этом исследовании мы разработали и применили подход на основе микрочипов рибосомальной ДНК для отслеживания развития кишечной флоры у 14 здоровых доношенных детей в течение первого года жизни. Мы обнаружили, что состав и временные паттерны микробных сообществ широко варьировались от ребенка к ребенку, поддерживая более широкое определение здоровой колонизации, чем считалось ранее. К одному году младенцы сохранили свою уникальность, но приблизились к профилю, характерному для желудочно-кишечного тракта взрослого человека.Состав и временные паттерны развития кишечной микробиоты у пары разнояйцевых близнецов были поразительно похожи, что позволяет предположить, что генетические факторы и факторы окружающей среды формируют нашу кишечную микробиоту воспроизводимым образом.

Образец цитирования: Палмер С., Бик Е.М., ДиДжиулио Д.Б., Релман Д.А., Браун П.О. (2007) Развитие кишечной микробиоты у младенцев человека. PLoS Biol 5 (7): e177. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177

Академический редактор: Иджун Руан, Институт генома Сингапура, Сингапур

Поступила: 22 января 2007 г .; Принята к печати: 4 мая 2007 г .; Опубликован: 26 июня 2007 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями декларации Creative Commons Public Domain, которая предусматривает, что после размещения в общественном достоянии эта работа может быть свободно воспроизведена, распространена, передана, модифицированы, созданы на основе или иным образом использованы кем-либо в любых законных целях.

Финансирование: Эта работа финансировалась Фондом Хорна и Медицинским институтом Говарда Хьюза.

Конкурирующие интересы: ПОБ, исследователь Медицинского института Говарда Хьюза.

Сокращения: GI, желудочно-кишечный; nt, нуклеотид; ОТУ, оперативная таксономическая единица; prokMSA, выравнивание множественных прокариотических последовательностей; КПЦР, количественная ПЦР; рДНК, рибосомная ДНК; рРНК, рибосомальная РНК; СГУ, г. малая единица

Введение

Тело взрослого человека обычно содержит в десять раз больше микробных клеток, чем человеческих клеток, в основном из-за чрезвычайно высокой плотности микробов, обнаруженных в кишечном тракте человека (обычно 10 ¹¹ –10 ¹² микробов / мл просвета. содержание).Эта микробная экосистема выполняет множество важных функций для своего хозяина-человека, включая защиту от патогенов, обработку питательных веществ, стимуляцию ангиогенеза и регулирование накопления жира в организме хозяина [1–7]. Понятно, что этот список еще не полный; по мере расширения этой области исследований мы постоянно открываем для себя новые роли и отношения. Исследования на мышах-гнотобиотах были особенно полезными, демонстрируя важную роль микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в нормальном развитии кишечника [2,5].Кроме того, многие заболевания как у взрослых, так и у младенцев имеют известную или предполагаемую связь с микробиотой желудочно-кишечного тракта, включая рак желудка [8], лимфому лимфоидной ткани, ассоциированную со слизистой оболочкой [9], воспалительное заболевание кишечника [10,11] и некротический энтероколит [ 12,13].

Состав микробиоты ЖКТ взрослых был интенсивно изучен с использованием как культивирования, так и, в последнее время, методов на основе последовательности малых субъединиц (SSU) рибосомной ДНК (рДНК), не зависящих от культуры [14]. Одна только экосистема толстой кишки человека насчитывает более 400 видов бактерий, принадлежащих к ограниченному числу широких таксономических подразделений [15].Было обнаружено, что представители анаэробных родов Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, и Faecalibacterium составляют большую часть микробного сообщества кишечника взрослых людей. Тем не менее кишечник каждого взрослого человека, по-видимому, имеет уникальное микробное сообщество со структурой, которая остается стабильной в течение нескольких месяцев [3,15,16].

Напротив, микробиота желудочно-кишечного тракта младенцев более изменчива по своему составу и менее стабильна с течением времени. На первом году жизни кишечный тракт младенца прогрессирует от бесплодия до чрезвычайно плотной колонизации, заканчиваясь смесью микробов, которая в целом очень похожа на ту, что обнаруживается в кишечнике взрослого [17].Хотя начальная и конечная точки этого временного отрезка хорошо определены, путь между этими точками плохо понят. В литературе имеются противоречивые сообщения о составе микробиоты ЖКТ новорожденных и факторах, которые ее формируют. В нескольких исследованиях сообщалось, что бифидобактерии почти всегда доминируют в микробиоте ЖКТ грудных детей в возрасте нескольких недель [17–20], в то время как другие обнаружили, что они встречаются только у небольшой части младенцев или не являются преобладающими численно [21, 22].Влияние диеты на состав микробиоты желудочно-кишечного тракта младенцев также является спорным — многочисленные исследования показали более низкую численность бифидобактерий и более высокую численность аэробных бактерий в микробиоте желудочно-кишечного тракта младенцев на искусственном вскармливании по сравнению с младенцами на грудном вскармливании [ 20,21,23–25], однако в других отчетах такой разницы не обнаружено [26,27]. Способ родоразрешения часто упоминается как один из ключевых факторов, формирующих микробиоту младенца [18,28,29]. Сообщалось, что микробиота желудочно-кишечного тракта младенцев, рожденных с помощью кесарева сечения, отличается от микробиоты младенцев, рожденных естественным путем, как по времени колонизации, так и по составу [18,30–32], а в некоторых случаях имеются явные следы материнского микробиота влагалища в микробиоте желудочно-кишечного тракта новорожденных [33], однако относительная важность способа доставки для микробиоты желудочно-кишечного тракта неясна.Из-за увеличения частоты проблем с желудочно-кишечным трактом у недоношенных детей, влияние гестационного возраста также широко изучалось. Эти исследования неизменно показывают, что микробиота госпитализированных недоношенных детей отличается от микробиоты здоровых доношенных детей [32,34–36]. Попытки связать определенные микробы с возникновением некротического энтероколита, состояния с подозрением на бактериальную этиологию, которое является важной причиной заболеваемости и смертности недоношенных детей, дали неоднозначные результаты [32,36].Очевидно, что еще многое предстоит узнать о происхождении и развитии микробиоты желудочно-кишечного тракта младенцев и ее влиянии на здоровье и болезни.

Мы сосредоточили наше исследование на описании ряда профилей, которые составляют здоровую микробиоту желудочно-кишечного тракта младенцев, в надежде обнаружить темы, которые управляют ее развитием, а также предоставить подробный справочник и прочную основу для последующих исследований, посвященных изучению факторов, влияющих на ее развитие. Микробиота ЖКТ. В нашем исследовании участвовали 14 здоровых доношенных детей, рожденных от 13 здоровых матерей (включая одну группу разнояйцевых близнецов) (Таблица 1).Образцы стула собирали в соответствии с установленным графиком, начиная с первого стула после рождения: образцы собирали сначала ежедневно, а затем с уменьшающейся частотой в течение 1 года, с дополнительным отбором образцов вокруг ключевых событий (например, введение твердой пищи и введение антибиотиков), что дает в среднем 26 образцов стула на каждого ребенка (Таблица 2). Кроме того, у родителей, братьев и сестер были взяты образцы стула, а у матерей — вагинальные мазки и грудное молоко.Мы проанализировали микробиоту каждого из этих образцов с использованием недавно разработанной микроматрицы рДНК SSU, предназначенной для почти полного охвата известных видов рДНК SSU. Подмножество этих образцов было также проанализировано секвенированием библиотеки клонов рДНК SSU с целью калибровки и проверки наших результатов на микрочипах.

Результаты

Сравнение профилей бактериальных популяций на основе микрочипов и последовательностей

Чтобы изучить состав нашего набора образцов и обеспечить основу для количественной калибровки результатов микроматрицы, мы создали контрольный пул, объединив равные количества амплифицированной рДНК SSU из каждого ПЦР-амплифицируемого образца (за исключением образцов, собранных, когда младенцы были ≥1 года).Мы получили 3 458 высококачественных последовательностей клонов из библиотеки, созданной из этого пула, и таксономически присвоили каждой последовательности с помощью классификатора проекта базы данных рибосом [37]. Таксономическое распределение этих последовательностей суммировано в Таблице 3.

Чтобы оценить эффективность нашего нового дизайна микроматрицы относительно секвенирования рДНК SSU, мы секвенировали рДНК SSU, амплифицированные из каждого из 12 индивидуальных биологических образцов, полученных в этом исследовании, выбранных по их разнообразным профилям с помощью анализа микроматрицы 16S рДНК.Этот набор исследований включал ДНК, выделенную из восьми детских стула, двух материнских стула, одного вагинального мазка и одного образца грудного молока. Для каждого из этих образцов мы амплифицировали последовательности рДНК SSU с использованием тех же праймеров ПЦР, которые использовались в анализе микроматрицы, затем клонировали и секвенировали несколько сотен (среднее = 342) амплифицированных продуктов для всего 4100 последовательностей.

Мы сосредоточили наше сравнение на уровнях 2, 3 и 4 иерархии прокариотического выравнивания множественных последовательностей (prokMSA), которые очень приблизительно соответствуют уровням типа, класса и порядка в классической таксономической иерархии.На этих более широких уровнях ожидается, что большинство последовательностей будут иметь гомологию по крайней мере с одним зондом в нашем текущем дизайне микроматрицы, и последовательности рДНК, как правило, можно однозначно классифицировать. Оценки относительной численности на основе микрочипов были получены для 2149 видов и таксономических групп путем объединения данных от всех зондов, которые представляли любое подмножество рассматриваемого класса, как полностью описано в разделе «Материалы и методы». Оценки на основе последовательностей были получены путем таксономической классификации каждой последовательности путем присвоения кода операционной таксономической единицы (OTU) prokMSA наилучшего соответствия BLAST в базе данных prokMSA 2004 года из 86 453 последовательностей гена рибосомной РНК (рРНК) SSU [38] (наборы данных S1 и S2 ).Хотя относительную численность бактериального вида нельзя точно определить из его пропорционального представительства в пуле амплифицированных последовательностей рДНК, мы ожидаем, что такие оценки должны быть точными в пределах порядка величины и обычно в пределах нескольких раз [39–41], на основе предыдущих исследований, в которых сравнивали уровни численности, оцененные на основе секвенирования ампликонов рДНК SSU, с подсчетами, основанными на гибридизации in situ.

В целом результаты микроматрицы были очень похожи на результаты, полученные при секвенировании, как качественно, так и количественно.На рисунке 1А показано сравнение профилей сообществ каждого из 12 образцов, полученных в результате нашего анализа микрочипов и путем секвенирования, для каждой таксономической группы на уровне 2 таксономического дерева prokMSA. Обратите внимание, что уровни (например, уровень 2) в таксономии prokMSA не имеют последовательного соответствия уровням (например, типу) в классической таксономической иерархии, и, таким образом, некоторые из традиционных имен, связанных с группами уровня 2 prokMSA, могут выглядеть несколько несочетаемый. Как анализ последовательностей, так и анализ микроматрицы показали, что в образцах преобладает ограниченное число таксономических групп — 99% из 4100 последовательностей охватываются всего тремя из 22 подразделений prokMSA уровня 2: 2.15 (Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides), 2,28 (Proteobacteria) и 2,30 (грамположительные бактерии [включая Firmicutes и Actinobacteria]), а оставшийся 1% принадлежал к группам 2,10 (Prosthecobacter), 2,29 (Fusobacteria) , или 2,21 (цианобактерии и хлоропласты). Как показано на рис. 1B и 1C, профили популяции, полученные с помощью микроматрицы и анализа секвенирования, также были количественно схожи — корреляция Пирсона оценок относительной численности на основе микрочипов и секвенирования для 12 образцов была равна 0.97 на таксономическом уровне 2 prokMSA (рис. 1В), 0,89 на уровне 3 (рис. 1С) и 0,80 на уровне 4 (неопубликованные данные).

Рис. 1. Сравнение профилей сообществ на основе микрочипов и секвенирования

Полученные с помощью микрочипов и полученные путем секвенирования оценки данных численности таксономических групп сравниваются для 12 биологических образцов.

(A) Сравниваются оценки численности для всех таксонов prokMSA уровня 2, измеренные на массиве. Каждый столбец представляет собой один биологический образец, а каждая строка соответствует одной таксономической группе, идентифицируемой (справа от каждой строки) своим числовым кодом prokMSA OTU вместе с примерно соответствующим условным названием группы.

(B) Сравнение оценок относительной численности на основе последовательностей и микрочипов для таксономических групп уровня 2 в 12 образцах (то же, что и в [A]). Ось x представляет относительную численность, оцененную по частоте клонов из данной таксономической группы, а ось y представляет относительную численность, оцененную с помощью профилирования микроматрицы.

(C) То же, что (B) для таксономических групп уровня 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g001

Абсолютное количественное определение бактерий

Мы оценили общую плотность бактерий в каждом образце с помощью количественного анализа ПЦР (КПЦР) в реальном времени, используя широкий набор бактериальных праймеров и зондов (см. «Материалы и методы»). Мы использовали общее количество копий гена рРНК (обычно около пяти на геном [42]) на грамм стула, рассчитанное с помощью этого анализа, чтобы приблизительно определить общую плотность бактерий. Как показано на рисунке 2, общее количество копий гена рРНК было относительно нестабильным в течение первой недели жизни, а затем сохранялось у большинства младенцев в диапазоне от 10 ⁹ до 10 ¹⁰ / г стула (сырой вес).Хотя явного влияния способа родоразрешения на время колонизации не наблюдалось, следует отметить, что младенцы 13 и 14 лет (близнецы с дизиготом), которые были единственными младенцами, родившимися с помощью планового кесарева сечения и, следовательно, без разрыва околоплодных вод. мембрана и воздействие микробиоты родовых путей матери во время схваток или родоразрешения имели низкое количество бактерий (<10 ⁸ копий гена рРНК / г) до седьмого дня жизни.

Рис. 2. Изменение общей плотности фекальных бактерий в течение первого года жизни.

Для каждого образца ребенка численность бактерий оценивалась с помощью TaqMan ПЦР в реальном времени с универсальными бактериальными праймерами. Расчетные копии гена рРНК на грамм фекалий ( x -ось) нанесены на график как функция дней жизни ( x -ось). Обе оси имеют логарифмическую шкалу. Измерения обилия усечены по нижнему краю до значения, соответствующего 95-м процентилю экстракционных (отрицательных) контролей (количество копий, скорректированное на среднюю массу стула). Эпизоды антибактериального или противогрибкового (нистатин) лечения обозначены на временной оси серыми или розовыми полосами соответственно (дополнительную информацию см. В Таблице 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g002

Обзор профилей популяции бактерий на основе микрочипов

Мы проанализировали бактериальный состав 430 образцов — 363 образца детского стула, 43 образца стула взрослых, 2 образца стула братьев и сестер, 12 образцов грудного молока и 10 материнских вагинальных мазков — путем гибридизации с микрочипом ДНК, разработанным в этом исследовании. Объединив информацию по нескольким зондам (см. Материалы и методы), мы получили оценки относительной численности для 2149 вложенных таксономических групп и видов в каждой из этих выборок (все зонды перечислены в наборе данных S3; все таксоны перечислены в наборе данных S4).Как показано на рисунке 3, разнообразие на уровне филумов в образцах стула, проанализированных в этом исследовании, было чрезвычайно ограниченным. В подавляющем большинстве образцов преобладали всего три из 22 бактериальных групп уровня 2, представленных нашим микрочипом: 2,15 (Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides), 2,28 (Proteobacteria) и 2,30 (грамположительные бактерии [Firmicutes и Actinobacteria] ). Вторым важным открытием стала замечательная степень индивидуальных различий в процессе колонизации. Хотя таксоны, населяющие желудочно-кишечный тракт младенца, были ограничены на самых широких уровнях, каждый ребенок отличался сочетанием видов микробов, которые он приобрел и поддерживал, а также точным временным паттерном, в котором эти виды появлялись и исчезали. Bacteroides, , например, доминировали в ранней микробиоте некоторых младенцев, но практически отсутствовали на этой стадии у других младенцев. Третьей поразительной особенностью этого набора данных была относительная стабильность микробных популяций во времени — даже на ранних этапах заселения желудочно-кишечного тракта младенца большинство таксономических групп сохранялось в течение интервалов от недель до месяцев.

Рисунок 3. Обзор профилей микробных сообществ всех образцов

Каждый столбец ( n = 430) представляет один биологический образец, а каждая строка ( n = 2149) представляет одну таксономическую группу или вид.Выборки организованы во временном порядке, начиная с рождения слева и любых образцов, полученных от матери или других семей, справа от каждого временного курса. Клинья над столбцами пронумерованы в соответствии с идентификатором ребенка. Строки (таксоны) сортируются по их числовым кодам, так что подгруппы данной группы лежат непосредственно под более общей группой (например, 2.15, затем 2.15.1, затем 2.15.1.1). Символы «>» и «>>» добавляются к названиям помеченных таксономических групп, которые являются подгруппами на уровне 3 или уровне 4, соответственно, помеченной таксономической группы уровня 2.Увеличение темноты шкалы серого соответствует более высокому расчетному относительному содержанию.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g003

Основными измерениями различий между профилями колонизации различных таксономических групп были время колонизации и временная стабильность. В соответствии с предыдущими исследованиями [28,35,43,44], первыми колонизаторами часто были организмы, которые, как предполагалось, были аэробами (например, Staphylococcus, Streptococcus, и Enterobacteria), тогда как более поздние колонизаторы, как правило, были строгими анаэробами (Eubacteria и Clostridia) . Бактероиды сильно различались от ребенка к ребенку по времени своего первого появления, но в некоторой степени постоянно присутствовали почти у всех младенцев к 1 году. Несколько других таксонов, в том числе Prevotella, Acinetobacter, Desulfovibrio, Veillonella, и Clostridium perfringens, , имели тенденцию появляться временно, иногда появляясь и исчезая повторно в течение первого года жизни ребенка.

Сходства и различия между профилями населения

Мы исследовали сходства и различия в составе всех наших выборок путем иерархической кластеризации 430 образцов на основе их сходства в отношении их профилей численности для набора из 53 таксономических групп prokMSA уровня 4, которые имели как минимум две выборки с относительной оценка численности более 1%.Схема кластеризации, отраженная в дендрограмме в верхней части рисунка 4, выделяет несколько важных особенностей программы колонизации и показывает, что микробиота стула детей в возрасте 1 года и старше заметно отличается от таковой в более раннем возрасте и намного больше. похож на взрослых. До 6 мес. Образцы стула имели тенденцию группироваться по каждому ребенку, что указывает на то, что различия от ребенка к ребенку намного больше, чем изменения в течение недель или месяцев в составе микробиоты любого отдельного ребенка.Было два заметных исключения из этой кластеризации, ориентированной на ребенка. Во-первых, образцы из первых нескольких дней жизни часто сгруппированы вдали от остальных образцов данного ребенка, иногда сгруппировавшись с другими очень ранними образцами, а иногда с образцами из других мест (например, ребенок 8-го дня 1 с образцами из влагалища). Во-вторых, образцы от младенцев 13 и 14, которые являются разнояйцевыми близнецами, как правило, смешивались. На рисунке 4B показаны примеры нескольких описанных выше шаблонов кластеризации.

Рисунок 4.Кластеризация выборок на основе профилей популяций наиболее распространенных и многочисленных таксонов

(A) Каждый столбец ( n = 430) представляет один биологический образец, а каждая строка ( n = 52) представляет одну таксономическую группу или вид 4 уровня. для двух или более образцов оценки относительной численности превышали 1%. Представлены все образцы, включая образцы стула от младенцев, родителей и братьев и сестер, а также образцы молока и влагалища. Образцы были сгруппированы с помощью центрированной корреляции Пирсона, так что столбцы, представляющие наиболее похожие образцы, сгруппированы вместе, тогда как таксономические группы (строки) сортируются численно, а не кластеризоваться.Увеличение темноты шкалы серого соответствует более высокому расчетному относительному содержанию. Значения log ₂ относительной численности.

(B) Отобранные кластеры, иллюстрирующие, что (1) профили из образцов стула раннего ребенка группируются по младенцу, (2) образцы стула очень раннего ребенка объединяются с образцами матери и (3) образцы из пары разнояйцевых близнецов группируются вместе и смешиваются.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g004

Большинство образцов грудного молока и материнского влагалища идеально сгруппированы по анатомическим участкам происхождения.Как и ожидалось, во всех вагинальных образцах, кроме одного, преобладали лактобациллы, включая Staphylococci , Bacteroides, Clostridia и Veillonella среди групп, которые в разной степени присутствовали как составляющие меньшинства. Влагалищный образец от одной из матерей (матери ребенка 11) имел отчетливо другой профиль популяции, в котором преобладали представители группы гамма-протеобактерий. Популяции микробов, обнаруженные в образцах молока, были разнообразными, часто включая смеси кишечных бактерий и видов Bacteroides, Pseudomonas, Haemophilus, Veillonella, и Streptococcus .

Для более систематического сравнения младенцев мы определили выборку ближайших соседей для каждой выборки, измеренную с помощью корреляции Пирсона оценок относительной численности уровня 4. Используя эту метрику, выборка ближайшего соседа любой данной выборки ребенка обычно была другой выборкой от того же ребенка — средний процент выборок от данного ребенка, для которого наиболее похожая выборка была от того же ребенка, составляла 82%. Рисунок 5 суммирует этот анализ и иллюстрирует интересный вывод о том, что по этому показателю наиболее похожей парой младенцев были младенцы 13 и 14 лет — разнояйцевые близнецы, воспитанные в одной и той же среде — 8 из 23 (35%) ближайших младенцев 13 лет. — образцы соседей были взяты от ребенка 14 (следующей наиболее похожей парой были дети 11 и 14 лет — 17%).

Рис. 5. Сходство микробиоты у младенцев

Для каждой пары образцов мы рассчитали образцы ближайшего соседа в соответствии с корреляцией Пирсона профилей относительной численности уровня 4. Затем для каждого ребенка мы вычислили, какой процент выборок ближайшего соседа был получен от каждого ребенка. Оттенок серого указывает процент образцов из детского Y (столбец), которые были ближайшими соседями образцов из детского X (строка), так что суммы строк составляют 100%.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.0050177.g005

Временные тенденции

Сходство профилей микробных сообществ в образцах стула младенцев от 1 года и старше друг с другом и с профилями стула взрослых предполагает, что со временем сообщества желудочно-кишечного тракта младенцев сошлись в сторону обобщенной «взрослой» микробиоты. Мы исследовали этот феномен, вычислив для каждого возрастного интервала среднюю попарную корреляцию Пирсона в профилях населения всех выборок младенцев, собранных в этом возрасте.Как показано на рис. 6А, этот анализ показал, что с течением времени микробиота младенцев постоянно приближалась к общему профилю. Мы также рассчитали для каждой временной точки среднюю корреляцию выборок младенцев в этот момент времени с обобщенным профилем взрослого (центроид 18 выборок взрослых — девять отцов и девять матерей из этого исследования). Этот анализ, показанный на рисунке 6B, подтвердил, что профиль, к которому сходится микробиота младенцев, аналогичен профилю взрослых, и выявил очевидную тенденцию к перегруппировке популяции, которая происходит примерно через 5 дней после рождения.Примечательно, что микробиота желудочно-кишечного тракта младенцев не была значительно больше похожа на микробиоту их родителей, чем на микробиоту других взрослых, если судить по корреляциям Пирсона их таксономических профилей уровня 4 (средняя корреляция ребенок-родитель 0,55 для внутри семьи по сравнению с 0,62. между семьями для девяти «триад» одновременно полученных образцов от ребенка, матери и отца, полученных в возрасте 1–1,5 года).

Рис. 6. Временные паттерны среднего попарного сходства профилей микробиоты детского стула

(A) Сходство между младенцами во времени.Для каждой временной точки, для которой было профилировано не менее шести младенцев, мы рассчитали среднюю попарную корреляцию Пирсона между таксономическими профилями уровня 4 всех младенцев в этот момент времени. Также показана средняя парная корреляция Пирсона между этими профилями у 18 взрослых участников этого исследования (девять мужчин и девять женщин) (пустой кружок обозначен стрелкой).

(B) Переход к взрослой флоре с течением времени. Для каждой временной точки, для которой был составлен профиль по крайней мере четырех младенцев, мы рассчитали среднюю корреляцию Пирсона между таксономическими профилями уровня 4 всех младенцев в этот момент времени и «общим взрослым» профилем.Общий профиль взрослого — это центроид 18 взрослых (девять мужчин и девять женщин) (родители в этом исследовании).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g006

Чтобы визуализировать временные закономерности в определенных филогенетических группах, населяющих кишечник младенца, мы составили график относительной численности девяти таксономических групп уровня 4, которые имели средняя относительная численность 1% или более с течением времени у каждого младенца (рис. 7). Этот анализ позволил нам выявить общие темы и интересные различия между профилями колонизации этих младенцев.Во-первых, мы заметили, что «неравномерные» популяции (популяции, в которых преобладает одна таксономическая группа) были обычными в первые несколько недель, но редко в более поздние сроки. Другой примечательной особенностью временной программы многих младенцев было возникновение одного или нескольких резких сдвигов в структуре популяции — такие сдвиги часто стабилизировались в пределах одного интервала выборки. Нам не удалось идентифицировать какой-либо конкретный возраст или сигнальное событие, постоянно связанное с такими переходами, хотя переход к «взрослому» профилю часто сопровождал введение твердой пищи.

Рис. 7. Временные профили наиболее обильных таксономических групп уровня 3

Таксономические группы уровня 3 были выбраны для отображения, если их средняя (нормализованная) относительная численность по всем образцам детенышей превышала 1%. Ось x показывает дни с момента рождения и отображается в логарифмической шкале, а ось y показывает оценочную (нормализованную) относительную численность. Для некоторых младенцев значения для первых нескольких дней не отображаются, поскольку общее количество бактерий в образцах стула, собранных в эти дни, было недостаточным для анализа на основе микрочипов.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g007

Несколько младенцев получали антибиотики либо в неонатальном периоде (дни 0–28), либо в более поздние месяцы (см. Таблицу 1 и Рисунок 2). Больше подробностей). В некоторых случаях лечение было связано с резким изменением плотности или состава микробиоты желудочно-кишечного тракта. Например, ребенок 8 получил два курса амоксициллина: один в 4 месяца и один в 6 месяцев. В обоих случаях как общая плотность бактерий (Рисунок 2), так и состав сообщества резко изменились (Рисунки 3 и 6).Действительно, у этого ребенка плотность бактерий в образцах кала снизилась настолько во время курсов антибиотиков, что мы не смогли амплифицировать достаточное количество рДНК SSU для анализа микрочипов, поэтому мы могли сравнивать популяции только до и после курса антибиотиков. Однако мы не выявили каких-либо устойчивых последствий лечения антибиотиками.

Эксперименты по валидации микрочипов

Результаты как анализа последовательности эталонного пула, так и анализа данных микроматрицы показали, что бифидобактерии были лишь второстепенными компонентами популяции — результат расходится с общепринятым мнением [20,21,26].Праймеры, которые мы использовали для широкодиапазонной ПЦР-амплификации контрольного пула (источник последовательностей), и образцы для анализа микрочипов были потенциально неоптимальными для амплификации Bifidobacteria [21,26] из-за трех несовпадений в последовательности рДНК Bifidobacterium longum и прямой праймер 8F, использованный в этом исследовании. Обзор 5′-последовательностей полноразмерных генов рДНК SSU показал, что бифидобактерии резко отличаются от обычно консервативной последовательности праймера 8F. Поэтому мы провели два независимых анализа, чтобы определить, нужно ли и каким образом корректировать количественные оценки бифидобактерий по результатам гибридизации микрочипов.Во-первых, мы количественно оценили относительную эффективность, с которой пара праймеров 8F / 1391R амплифицировала рДНК SSU из двух видов Bifidobacterium — Bifidobacterium longum и Bifidobacterium infantis — по сравнению с набором трех различных распространенных фекальных бактерий — Escherichia coli, Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis — все они имеют последовательности рДНК SSU с одним или несколькими несовпадениями с последовательностями праймеров 8F / 1391R ПЦР. Используя ряд стехиометрических смесей хромосомной ДНК, выделенных из этих видов, мы обнаружили, что после 20 циклов (количество циклов, использованных для наших анализов микроматриц и для амплификации контрольного пула перед секвенированием) эффективность амплификации двух видов бифидобактерий ДНК была в 8 раз ниже, чем у трех других видов, все из которых амплифицировались с почти одинаковой эффективностью (неопубликованные данные).Этот результат предполагает, что как результаты секвенирования контрольного пула, так и количественный анализ на основе микрочипов занижали численность группы бифидобактерий в восемь раз. Во-вторых, мы использовали анализ кПЦР в реальном времени с парой праймеров и зондом, оптимизированными для обнаружения бифидобактерий, чтобы получить независимую оценку численности бифидобактерий в каждом образце. Результаты подтвердили вывод микроматричного анализа о том, что бифидобактерии почти всегда были лишь второстепенными составляющими фекальной микробиоты как младенцев, так и взрослых в нашей исследуемой популяции (набор данных S5 и рисунок S1).

Большинство видов бактерий, идентифицированных в нашем наборе образцов, ранее входили в состав микробиоты желудочно-кишечного тракта человека. Однако был ряд случаев, когда результаты микроматрицы указывали на присутствие вида или группы бактерий, которые были неожиданными и не представлены в нашем пуле секвенированных эталонов. Мы исследовали несколько из этих случаев с помощью независимых анализов. Для 12 подозрительных видов / таксонов мы использовали родственные группоспецифичные праймеры в ПЦР-анализе, примененном к большинству или всем образцам, в которых подозреваемые виды / таксоны, по-видимому, присутствовали на основании результатов микроматрицы, а также небольшой набор образцов, в которых подозрительные виды не были обнаружены микрочипом.В одном случае, в случае Sutterella wadsworthia, секвенирование видоспецифичного продукта ПЦР подтвердило его присутствие. В семи из 12 случаев ни один из массивов положительных (или отрицательных) образцов не дал амплифицированного продукта при анализе ПЦР. Для четырех оставшихся случаев анализ якобы видоспецифической ПЦР дал амплифицированный продукт ожидаемого размера, но клоны, секвенированные из этого продукта, не соответствовали ожидаемым видам. Мы дополнительно исследовали эти четыре случая путем секвенирования библиотеки клонов, полученной путем амплификации с теми же праймерами широкого диапазона, которые использовались при подготовке к анализу микроматрицы.Хотя секвенирование не подтвердило присутствие какого-либо из четырех сомнительных видов / таксонов, оно предоставило убедительные доказательства основного источника ложноположительных сигналов гибридизации. В частности, в трех из четырех случаев мы идентифицировали относительно многочисленные виды, чья последовательность рДНК была достаточно похожа на последовательность зонда, что, вероятно, объясняло наблюдаемый сигнал. В одном случае (Legionella pneumophila), , присутствие которых прогнозировалось примерно в 1%, мы не смогли идентифицировать какие-либо виды-кандидаты, которые могли бы объяснить сигнал гибридизации (т.е.е., ни один с лучшими совпадениями BLAST ≥30 баллов) среди нашего набора из 192 последовательностей. Поскольку наша способность обнаруживать виды, присутствующие с частичной численностью 1%, составляла только 85%, остается возможным, что этот вид или другой вид со сходной последовательностью рДНК SSU мог присутствовать в небольшом количестве в подозрительных образцах.

Обнаружение и количественная оценка грибов и архей

Наши методы экстракции ДНК и амплификации рДНК были оптимизированы для бактерий и неоптимальны для эукариот и архей, поэтому мы отдельно проверили наличие и численность грибов или архей с помощью анализов кПЦР с широкой специфичностью для соответствующих таксономических групп.На основании нашего анализа количественной ПЦР, грибки периодически обнаруживались в образцах стула при относительно низкой численности (10 ⁴ –10 ⁶ генов рРНК / г сырой массы фекалий), сохраняющихся в течение различной продолжительности у отдельных детей в течение первого года жизни. . У одного из детей, участвовавших в этом исследовании (ребенок 10 лет), была отмечена сыпь от подгузников, а также молочница во рту, которые обычно вызываются грибком (Candida), и лечились противогрибковым средством (нистатином). ). Анализ qPCR обнаружил особенно высокие уровни грибковой рДНК в образцах стула этого ребенка, особенно в тот период, когда были описаны эти результаты.У матери этого ребенка также были заметно высокие уровни грибковых последовательностей рДНК SSU в пренатальном образце вагинального мазка, но не в образце стула «нулевого дня».

Распространенность архей была значительно ниже и более вариабельна, чем распространенность грибов или бактерий; Анализ qPCR обнаружил гены архейной рРНК (в диапазоне 10 ³ –10 ⁶ генов рРНК / г) только у семи младенцев в течение первого года жизни, а у четырех из этих младенцев они были обнаружены только у одного образец.У этих младенцев археи появлялись временно и почти исключительно в первые несколько недель жизни; они были обнаружены только у одного младенца после пятой недели жизни. Ограниченный анализ последовательностей архей, амплифицированных из трех образцов стула матери, которые дали положительный результат на археи (матери 4, 9 и 12), выявил преобладание Methanobrevibacter smithii (идентифицировано 7/8 архейных клонов, включая по крайней мере по одному клону от каждой матери), с одним дополнительным (некультурным) архейным филотипом.Результаты анализа количественной ПЦР грибов и архей включены в набор данных S5 и показаны графически вместе с результатами количественной ПЦР бактерий на рисунке S2.

Обсуждение

Микробная колонизация желудочно-кишечного тракта младенца — примечательный эпизод в жизненном цикле человека. Каждый раз, когда рождается человеческий ребенок, из стерильной среды развивается богатая и динамичная экосистема. В считанные дни микробные иммигранты создают процветающее сообщество, население которого вскоре превосходит численность собственных клеток ребенка.Эволюционно древний симбиоз между желудочно-кишечным трактом человека и его резидентной микробиотой, несомненно, включает в себя разнообразные взаимные взаимодействия между микробиотой и хозяином, что имеет важные последствия для здоровья и физиологии человека. Эти взаимодействия могут иметь полезные пищевые, иммунологические эффекты и эффекты развития или патогенные эффекты для хозяина [2,5,7,18,45].

Это исследование началось с разработки микрочипа ДНК с почти полным охватом бактериальных таксонов, представленных в доступной базе данных последовательностей генов SSU рРНК.Наш дизайн микроматрицы и экспериментальные методы были основаны на уроках, извлеченных при валидации менее полной микроматрицы SSU рДНК [46]. Эти предыдущие эксперименты позволили нам оптимизировать наши методы для компьютерного прогнозирования поведения гибридизации SSU рДНК и разработать экспериментальный протокол, который максимизировал специфичность гибридизации. Превосходное согласование измерений отдельных таксонов, определенных с использованием нового дизайна микрочипов, по сравнению с результатами секвенирования из соответствующих библиотек клонов рДНК SSU (рисунок 1) предполагает, что эти принципы дизайна справедливы для этой платформы для множества таксонов и дают нам уверенность в том, что как полнота, так и точность результатов, полученных с помощью нашего нового набора микрочипов.Однако важно отметить, что наши методы проектирования и анализа массивов несовершенны и все еще развиваются. Некоторые из неожиданных видов, которые, по прогнозам микроматрицы, должны присутствовать в одном или нескольких образцах, не могли быть подтверждены секвенированием. В большинстве этих случаев анализ последовательности исследуемых образцов показал, что перекрестная гибридизация на низком уровне высокоразвитых видов была ответственна за ложноположительный прогноз, результат, который будет приниматься во внимание в будущих раундах массива. дизайн и анализ.

Мы использовали этот микрочип в подробном, систематическом и количественном исследовании бактериальной колонизации желудочно-кишечного тракта новорожденного человека. Мы использовали только что собранные образцы стула в качестве заменителей образцов, взятых из просвета и слизистой оболочки толстой кишки. Хотя, несомненно, существуют различия в популяционных профилях образцов стула и соответствующих слизистых оболочек, в предыдущем исследовании мы обнаружили, что профили, тем не менее, удивительно согласованы — достаточно, чтобы отдельные образцы стула можно было легко сопоставить с образцами биопсии толстой кишки от одного и того же человека на основе на сходство их бактериальных профилей [15,46].Таким образом, мы полагаем, что результаты нашего временного анализа бактериальных популяций в образцах детского стула предоставляют полезное окно для анализа резидентной микробиоты толстой кишки.

Принимая во внимание важность симбиоза между человеческим хозяином и кишечными комменсалами как для человека-хозяина, так и для микробного колониста, было бы легко представить, что программа микробной колонизации желудочно-кишечного тракта новорожденных развивалась под сильным избирательным давлением, воздействуя на как кишечная ниша, так и ее микробные колонисты должны быть сильно детерминированными и стереотипными.Мы могли ожидать, что весьма ограниченная группа совместно эволюционирующих комменсалов будет исключительно хорошо адаптирована к этой среде и будет последовательно доминировать в процессе колонизации стереотипным образом. Действительно, бактерии, которые мы обнаружили в кале младенцев и взрослых, предположительно отражающие микробиоту толстой кишки, были в значительной степени ограничены лишь небольшой подгруппой бактериального мира — Proteobacteria, Bacteroides, Firmicutes, Actinobacteria и Verrucomicrobia. Тем не менее, к удивлению, мы обнаружили, что в первые дни или месяцы жизни микробиота кишечника младенца и временная структура, в которой она развивается, заметно варьируются от человека к человеку.Кажущееся хаотичное развитие ранних событий колонизации и сходство бактериального состава некоторых образцов ранних младенцев с грудным молоком или вагинальными мазками позволяет предположить, что популяция бактерий, которая развивается на начальных стадиях, в значительной степени определяется конкретными бактериями. которому случайно подвергается ребенок. Примечательно, что эти материнские «сигнатуры» не сохранялись бесконечно, о чем свидетельствует наша неспособность найти значительно более высокую корреляцию общих таксономических профилей пар ребенок / родитель из одного и того же домохозяйства по сравнению с разными домохозяйствами.

Важным исключением из рассказа об индивидуальности и уникальности ранних профилей было поразительное сходство временных профилей разнояйцевых близнецов (младенцев 13 и 14) (Рисунки 4 и 5). Эти близнецы имели как общую среду обитания, так и примерно 50% генетической идентичности, что делает невозможным определение из этого исследования, в какой степени каждая из этих общих черт ответственна за их сходные модели колонизации. Однако данные этого и других исследований свидетельствуют о том, что общая среда является основным фактором.Одним из аргументов в пользу этой точки зрения является отсутствие сопоставимого сходства в микробных сообществах других пар, которые также имеют 50% генетическую идентичность, включая мать: ребенок, отец: ребенок и родной брат: ребенок (неопубликованные данные), хотя это несходство может отчасти из-за разных стадий их развития. Еще одним аргументом в пользу сильного влияния окружающей среды является случайное временное появление определенных организмов у обоих близнецов — трудно представить, что появление определенного микроба в конкретный день может быть генетически запрограммировано.Наш последний аргумент основан на доказательствах из предыдущего исследования, что микробиота генетически эквивалентных семей от скрещивания инбредных мышей была более похожей среди членов одного и того же «домохозяйства» (мать и потомство, живущие в одной клетке), чем между домохозяйствами [1].

Определение «здоровой» кишечной микробиоты охватывает удивительное разнообразие профилей сообщества в первые 6 месяцев жизни. Хотя в первые месяцы эти микробные сообщества были разнообразными и своеобразными, они постепенно становились все более похожими друг на друга (рис. 6А), приближаясь к общему профилю взрослого человека (рис. 6В), характеризующемуся преобладанием Bacteroides и Firmicutes, часто встречающихся Веррукомикробия и очень низкая численность протеобактерий и аэробных грамотрицательных бактерий в целом.Мы предполагаем, что самые ранние события колонизации в значительной степени определяются условно-патогенной колонизацией бактериями, которым ребенок подвергается в окружающей среде. Общие воздействия окружающей среды, вероятно, включают микробиоту влагалища, фекалий или кожи матери, о чем свидетельствует наблюдаемое сходство микробиоты раннего стула у некоторых младенцев с этими образцами, что согласуется с предыдущими доказательствами вертикальной передачи микробов [33,47 , 48]. Таким образом, разнообразие и вариативность отражают соответствующую индивидуальность этих случайных воздействий.Однако со временем преимущество пригодности таксонов, которые обычно доминируют в микробиоте толстой кишки взрослых особей, по-видимому, преодолевает первоначальное преимущество оппортунистов, колонизирующих на ранней стадии и менее приспособленных к кишечной среде. Кроме того, прогрессирующие изменения в кишечной среде из-за внутренних изменений слизистой оболочки кишечника, перехода на «взрослую» диету и влияния самой микробиоты [44,49–51] могут требовать все более строгого отбора для наиболее адаптированные бактерии.Таким образом, несмотря на неожиданно хаотичные первые месяцы жизни, становление экосистемы кишечника у младенцев, в конце концов, следует консервативной традиционной программе.

Трансформация кишечной микробиоты по образцу взрослого неявно включала замену видов, обнаруживаемых у младенцев, но редко у взрослых, видами, характерными для толстой кишки взрослых. Одной из потенциальных движущих сил таких демографических изменений может быть то, что взрослые члены сообщества в конечном итоге доминируют в силу их большей способности устойчиво и необратимо утвердиться после колонизации хозяина.Мы искали доказательства этой дифференциальной «липкости», сравнивая автокорреляцию во времени численности каждого «вида» (см. Материалы и методы). Мы не нашли четких доказательств того, что виды, характерные для взрослой микробиоты, смогли установить более стабильную по своей природе колонизацию, чем виды, характерные для детской микробиоты.

Мы и другие обнаружили, что индивидуально-специфические характеристики бактериальной микробиоты взрослых стабильны в том смысле, что они остаются более схожими у одного человека с течением времени, чем между отдельными людьми, в течение периода в год или более, и одного из поразительными результатами этого исследования было выявление относительно стабильных, индивидуальных паттернов бактериальной колонизации даже в первые недели и месяцы жизни.Эти наблюдения открыли интересную возможность того, что события оппортунистической колонизации в раннем младенчестве могут играть значительную роль в определении отличительных характеристик микробиоты одного и того же человека во взрослой жизни. Мы искали доказательства этого, сравнивая внутрииндивидуальные и межиндивидуальные корреляции бактериальных профилей через 1 или 2 мес. И 1 год, и не обнаружили существенной разницы (неопубликованные данные). Таким образом, хотя эти результаты, безусловно, не исключают возможности того, что события ранней колонизации играют важную роль в определении взрослой микробиоты, не похоже, что между ними существует сильная прямая корреляция.

Наши результаты и выводы значительно отличаются от многих предыдущих отчетов по нескольким аспектам. Одним из заметных расхождений между нашими исследованиями и многими другими была относительно низкая частота и численность бифидобактерий в фекальной микробиоте в любом возрасте от рождения до взрослого возраста. Бифидобактериям уделялось непропорционально большое внимание, отчасти из-за их предполагаемых положительных эффектов, и во многих исследованиях сообщалось (и повторялись обзоры), что в микробиоте грудных детей преобладают бифидобактерии [17–19].Таким образом, мы были удивлены и поначалу скептически относились к очевидной малочисленности бифидобактерий почти во всех наших образцах и предприняли шаги для проверки точности наших результатов. Специфичная для бифидобактерий КПЦР подтвердила вывод, сделанный на основе результатов нашего микроматрицы, что бифидобактерии редко были основными составляющими микробиоты ЖКТ, по крайней мере, в этой исследуемой популяции, и что у большинства младенцев они появлялись только через несколько месяцев после рождения, а затем сохранялись как микробиота. меньшинство населения.Хотя можно предположить, что существуют географические или демографические различия в распространенности бифидобактерий, мы подозреваем, что акцент на бифидобактерии в исследованиях и обзорах микробиоты желудочно-кишечного тракта младенцев может быть непропорционально распространенности, численности и значимости для здоровья.

Представленные здесь результаты указывают на многочисленные направления будущих исследований. Интересной особенностью динамики бактериальной популяции было появление резких сдвигов, перемежающих интервалы относительной стабильности.За исключением одного случая (лечение антибиотиками ребенка 8 лет), мы не смогли легко определить сильного кандидата в причину наблюдаемых нами сдвигов. Некоторые возможности включают вспышки бактериофагов, которые могут выборочно уничтожить доминирующую таксономическую группу [52]; случайное, условно-патогенное вторжение в метаболическую или анатомическую нишу более приспособленным видом; и тонкие изменения кишечной среды, вызванные развитием или диетой, нарушающие физический баланс популяции. Другими важными направлениями будущих исследований будут сравнение состава и эволюции микробных сообществ, встречающихся у этих здоровых детей, с сообществами недоношенных или других нездоровых детей, а также изучение влияния антибиотиков, диеты и способов родоразрешения на их развитие и эволюцию. сообщества.Несмотря на то, что здоровые дети в этом исследовании предполагали широкий диапазон профилей микробного сообщества, они были схожи в нескольких отношениях, в первую очередь в основных способствующих типах, в приобретении определенных ключевых типов с течением времени и в относительной стабильности их профилей. со временем. Возможно, что при других состояниях здоровья или болезни мы найдем либо виды или группы, которые являются новыми для этой среды, либо необычные комбинации этого недавно определенного набора «обычных» видов.

Важно отметить, что хотя мы показали, что микробиота кишечника становится все более стереотипной в течение первого года, четко установлено, что устойчивые межиндивидуальные различия сохраняются даже у взрослых [15,16].Когда и как развиваются эти стабильные «внутренние» характеристики микробиоты каждого человека? Как долго они сохраняются? Как различная стабильность колонизации разными бактериями связана с их микроанатомическими (например, крипта против ворсинок против слизистого слоя) или метаболическими нишами? Выявление экологических и генетических факторов, которые определяют отличительные характеристики микробиоты каждого человека, и определение того, влияют ли эти индивидуальные особенности на физиологию и здоровье хозяина, и каким образом, будет важной целью будущих исследований, в которых микроматрица, описанная в этом исследовании, будет быть полезным инструментом.

Материалы и методы

Разработка и производство микрочипов.

Микроматрица содержала 10 500 ДНК-зондов (10265 уникальных последовательностей). Зонды включали 1379 контрольных зондов (1144 уникальных последовательностей) и 9121 уникальных таксономически специфичных зонда (5938 зондов на групповом уровне и 3183 зондов на уровне видов), состоящих из 40-нуклеотидных (нуклеотидных) последовательностей, полученных из генов SSU рРНК, и выбранных для их специфичность к соответствующему виду или таксономической группе. Основные принципы проектирования подробно описаны в предыдущем отчете [46].Дизайн был основан на базе данных последовательностей рДНК prokMSA SSU 2004 года и филогенетическом дереве [38], содержащем 86 453 прокариотических последовательностей рДНК SSU (5 672 архей и 80 781 бактериальных), организованных в 672 архейных и 15 765 бактериальных ОТЕ. OTU были определены в prokMSA как группы последовательностей с оценками идентичности (как определено в [38]) выше 95% или 98% (в определенных родах, имеющих медицинское значение). Мы дистиллировали эту базу данных, выбрав одну высококачественную последовательность, репрезентативную для каждой OTU, и урезали последовательности до областей, амплифицированных универсальными бактериями (Bact-8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘[53] + 1391R: 5’- GACGGGCGGTGTGTRCA-3 ‘[54]) или архейный (Arch444 [55] / 1391R) праймеры.OTU в нашей сокращенной базе данных prokMSA были организованы в 945 (53 архейных + 892 бактериальных) таксономических групп (узлов), содержащих несколько OTU, и 92 отдельных «узла» OTU.

Номенклатура базы данных была такова, что каждая OTU была обозначена числовым кодом, который указывал на ее таксономию prokMSA, например, вид «1.2.3.4.5.6.007» принадлежит к суперварке 1, типу 1.2, классу 1.2.3, порядку 1.2. .3.4, семейство 1.2.3.4.5, род 1.2.3.4.5.6. В этой рукописи таксономические уровни упоминаются в соответствии с их глубиной в коде OTU, т.е.g., вид «1.2.3.4.5.6» принадлежит к группе с более широким охватом «1» на уровне 1 и к группе с меньшим охватом «1.2.3.4: на уровне 4».

Мы сгенерировали большой набор зондов-кандидатов, используя BLAST [56], чтобы предсказать возможность гибридизации перекрывающихся последовательностей из 40 нуклеотидов из каждой OTU в нашей базе данных дистиллированных последовательностей с каждой из других OTU в базе данных (путем разбиения каждой последовательности с окном на два). Последовательность считалась зондом-кандидатом для конкретной таксономической группы, если прогнозировалось, что она гибридизуется по крайней мере с 10% членов этой группы, а не с какими-либо членами, не входящими в группу, с использованием эмпирически определенного порога 28 из 40 совпадений BLAST — несовпадения (общее количество нуклеотидов за вычетом несовпадений соответствует лучшему совпадению BLAST для данной последовательности рДНК) в качестве предельного значения для потенциальной гибридизации [46].Из полученного набора зондов-кандидатов мы выбрали для каждого узла / таксономической группы два зонда, которые, по прогнозам, гибридизуются с наибольшей частью этой группы. Мы также выбрали зонды из нашего набора кандидатов таким образом, чтобы каждая OTU в нашей дистиллированной базе данных была представлена ​​зондами на максимально возможном количестве таксономических уровней. Из-за нехватки места в массиве мы не смогли напечатать видоспецифичные зонды для каждой OTU в нашей базе данных. Вместо этого мы дополнили набор зондов на уровне группы, разработанных, как описано выше, тремя дополнительными наборами зондов.Во-первых, мы составили список видов бактерий, которые были либо релевантными с медицинской точки зрения, либо известными человеческими комменсалами. Мы идентифицировали коды prokMSA для каждого из этих видов и протестировали выбранную последовательность из этой OTU для видоспецифичных 40-нуклеиновых последовательностей, как определено баллом совпадения-несоответствия BLAST не более 27 для любой другой последовательности. Мы также оценили видоспецифичные зонды из нашего предыдущего дизайна массива [46] в контексте базы данных prokMSA и включили 467 таких видоспецифичных зондов, представляющих 286 видов.Последней категорией таксономических зондов были зонды «новые OTU» — 316 зондов, разработанные для представления недавно открытых «видов» рДНК SSU, которые были идентифицированы в исследованиях толстой кишки [15] или желудка [57] взрослого человека (новые OTU были определены ограничение идентичности 99%, как описано в исходных исследованиях). Наконец, наш дизайн микрочипа включал 1153 контрольных зонда — положительных и отрицательных — предназначенных для нормализации и систематического изучения гибридизационного поведения. Отрицательные контроли включали как последовательности, не относящиеся к рДНК, так и последовательности рДНК обратного комплемента, тогда как положительные контроли включали последовательности праймеров и несколько наборов перекрывающихся зондов, охватывающих полные гены SSU рРНК бактерий, архей и эукариот.Прикрепленные к поверхности олигонуклеотидные зонды были синтезированы in situ, как описано ранее [58], с 10-нуклеотидным поли-Т линкером, используемым для связывания специфического 40-нуклеотидного ДНК-зонда (Agilent Technologies, http://www.chem.agilent.com ). Все наборы также включали 307 стандартных контрольных зондов Agilent. Все последовательности зондов и аннотации доступны в наборе данных S6.

Покрытие массива.

Наш набор микрочипов включает один или несколько группоспецифичных зондов для 649 из 950 таксономических групп в prokMSA и видоспецифических зондов для 1590 видов бактерий и 39 видов архей.Взятые вместе, эти зонды гарантировали, что 15 406 (94%) из 16 437 видов, представленных в базе данных prokMSA, имели по крайней мере один репрезентативный зонд на каком-то уровне дерева от типа к виду, а большинство видов prokMSA (74%) имели репрезентативные зонды на несколько таксономических уровней (в среднем 2,4 уровня на вид).

Объекты исследования и сбор образцов.

Тринадцать здоровых беременных женщин были набраны в Медицинском центре Стэнфордского университета. Все участники исследования, в том числе 14 младенцев (одна пара разнояйцевых близнецов), девять отцов, 13 матерей и двое братьев и сестер (в возрасте 1-2 лет) дали информированное согласие или получили согласие своих родителей.Дизайн исследования был одобрен административной комиссией Стэнфордского университета по медицинским исследованиям на людях. На 36–40 неделе беременности вагинальные мазки (Copan Diagnostics, http://www.copanusa.com) были получены от десяти из 13 матерей и немедленно заморожены при –20 ° C. После рождения родители брали образцы стула младенцев с помощью пробирок для сбора стула (Sarstedt, http://www.sarstedt.com/php/main.php), которые содержали ложку для стандартизированного сбора примерно 300 мг материала.Образцы детского стула были собраны в соответствии с предписанным графиком (Таблица 1) и немедленно помещены в домашние морозильные камеры. Образец стула матери «нулевого дня» был взят в течение 0–5 дней после родов. Образцы стула были доставлены на льду в лабораторию для обработки через 2 недели, 3 месяца и 6 месяцев после рождения ребенка. Двенадцать матерей предоставили образцы грудного молока (~ 20 мл) через 3–9 месяцев после родов, а одна из них также предоставила грудное молоко через 6 дней после родов; эти образцы были собраны в пробирки на 50 мл и немедленно заморожены.Девять из исследуемых семей также предоставили образцы стула одновременно от матери, отца и ребенка через 12–17 месяцев после рождения ребенка. По прибытии в лабораторию все образцы были немедленно перенесены в морозильную камеру с температурой –80 ° C и хранились там до обработки. Всего было собрано 548 образцов, в том числе 471 образец стула у младенцев, 39 образцов стула от матерей, 9 образцов стула от отцов, 2 образца стула от братьев и сестер, 16 образцов грудного молока и 11 вагинальных мазков. Родителям было поручено вести дневник, фиксируя ключевые события в категориях болезней, лекарств, изменения диеты и путешествий.Таблица 2 содержит выбранную информацию для каждого ребенка (например, пол и способ родов).

Экстракция ДНК и амплификация рДНК SSU.

экстрагировали из образцов стула с помощью мини-набора QIAamp Stool DNA (Qiagen, http://www1.qiagen.com). Вагинальные мазки обрабатывали с использованием мини-набора QIAamp DNA (Qiagen). Образцы молока сначала концентрировали вращением 2 мл в микроцентрифуге в течение 10 мин при 5000 g, удаляя 1800 мкл супернатанта. Осадок ресуспендировали в 200 мкл оставшегося супернатанта, и ДНК экстрагировали с помощью мини-набора QIAamp DNA.Образцы обрабатывали партиями примерно по 16, и в каждый цикл включали несколько контрольных экстрактов для мониторинга загрязнения. Отношение образцов к контролю экстракции составляло 6,8 для стула, 2,8 для вагинальных мазков и 5,3 для молока.

SSU была амплифицирована из экстрагированной ДНК с использованием бактериально-специфических праймеров широкого спектра действия Bact-8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘) [53] и T7-1391R (5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGGGCGGTGTGTRCA-3) [46,5]. Эти праймеры амплифицируют приблизительно 90% или более полноразмерной бактериальной последовательности, кодирующей рРНК SSU, и обеспечивают промотор для РНК-полимеразы Т7.Смеси для ПЦР состояли из 1 × буфера II для ПЦР (Applied Biosystems, http://www.appliedbiosystems.com), 1,5 мМ MgCl ₂ , 0,05% Triton X-100, 20 мМ хлорида тетраметиламмония, 2% диметилсульфоксида, 0,1 Концентрации мМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, концентрации каждого праймера 0,4 мкМ, 2,5 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq (Applied Biosystems) и 5 ​​мкл экстрагированной ДНК в конечном объеме 50 мкл. Используемые условия ПЦР: 5 минут при 95 ° C, 20 циклов по 30 с при 94 ° C, 30 с при 55 ° C и 90 с при 72 ° C, затем 8 минут при 72 ° C.Амплификацию проводили с использованием системы ПЦР GeneAmp 9700 (Applied Biosystems). В случаях чрезвычайно низкого выхода объединяли несколько 20-цикловых реакций. Реакции ПЦР очищали в 96-луночном формате с использованием системы на основе шариков для очистки ПЦР с переключателем заряда Invitrogen (Invitrogen, http://www.invitrogen.com) и хранили при -20 ° C.

Строительство эталонного бассейна.

Нашим общим эталоном была эквимолярная смесь ампликонов рДНК SSU из каждого образца (детский или материнский стул, вагинальное или грудное молоко), собранных до того, как субъекту исполнился 1 год.Для создания эквимолярной смеси очищенные продукты ПЦР с 20 циклами количественно определяли в 96-луночном формате с использованием набора дцДНК Quant-It PicoGreen (Molecular Probes, http://probes.invitrogen.com) и объединяли в равных количествах. Приблизительные доли рДНК SSU, полученной из стула, влагалища и молока, в полученном пуле составляли 90%, 5% и 5% соответственно. Этот пул ДНК использовали как в качестве матрицы для транскрипции in vitro (для гибридизации микроматриц), так и для конструирования библиотеки клонов SSU рДНК.

Анализ последовательности и таксономическая классификация клонированных продуктов ПЦР рДНК.

Контрольный пул (эквимолярная смесь ампликонов рДНК SSU из большинства образцов, описанных выше) клонировали и секвенировали, как описано ранее [15]. Мы получили 3458 высококачественных бактериальных последовательностей рДНК длиной более 800 нуклеотидов, включая 3163 двойных и 295 одиночных считываний. Эти последовательности были таксономически классифицированы с использованием классификатора Ribosomal Database Project (RDP) (обобщены в таблице 3).

Мы также клонировали и секвенировали несколько сотен ампликонов рДНК SSU (среднее значение = 342; диапазон = 125–557 адекватных последовательностей) из каждого из 12 различных индивидуальных образцов одним и тем же способом, получив в общей сложности 4100 высококачественных последовательностей длиной более 800 nt.12 секвенированных образцов состояли из десяти образцов стула (день 11 от ребенка 2; день 1 от матери ребенка 3; неделя 12 от ребенка 3; месяц 6+ от ребенка 8; день 1 и день 2B от ребенка 10; день 12 от ребенка. 12; 7 месяц от ребенка 13; 7 месяц от матери близнецов: младенцев 13 и 14; и 7 месяц от ребенка 14), один образец молока от матери близнецов 13 и 14 и один образец из влагалища от матери близнецов 13 и 14.

Каждая последовательность из этих 12 отдельных образцов была таксономически классифицирована в соответствии с таксономией prokMSA 2004 года [38] с использованием BLAST.В частности, мы использовали BLAST, чтобы найти последовательность с наибольшим количеством совпадений во всей базе данных prokMSA (также обрезанной до 8F и 1391R). Сообщали о двух самых успешных совпадениях и сравнивали их (совпадения с менее чем 600 совпадающими нуклеотидами не учитывались), и если эти два совпадения были сопоставлены с одним и тем же OTU, то последовательность была отнесена к этой OTU. Если два самых популярных совпадения различались по таксономическому коду, то последовательность классифицируется только на самом конкретном уровне, разделяемом двумя лучшими совпадениями. В случаях, когда второй лучший результат был значительно хуже (соответствует 2-му / соответствует 1-му <0.9) учитывалось только лучшее попадание. Коды prokMSA OTU явно определяют таксономическую классификацию последовательности на всех филогенетических уровнях для всех 4100 высококачественных последовательностей «индивидуального образца».

Мечение и гибридизация.

Очищенные ампликоны рДНК SSU использовали в качестве матрицы для основанного на транскрипции синтеза аминоаллил-меченой одноцепочечной РНК с использованием набора для транскрипции MEGAScript T7 In Vitro (Ambion, http://www.ambion.com). Реакции транскрипции очищали в 96-луночном формате с использованием системы очистки РНК MagMax от Ambion и хранили при -20 ° C.Большие партии (5–10 мкг) эталонной РНК (эквимолярный пул всех образцов; см. Ниже) метили, используя сложный эфир Cy3 NHS, и хранили в течение нескольких недель для повторного использования. В день гибридизации 1 мкг каждого образца РНК метили, используя сложный эфир Cy5 NHS, как описано ранее [46]. Затем мы объединили 100 нг Cy5-меченного образца и 100 нг Cy3-меченного контрольного пула в объеме 48 мкл (в воде, свободной от нуклеаз). Затем мы добавили 2 мкл 25-кратного буфера для фрагментации Agilent и фрагментировали РНК путем нагревания при 70 ° C в течение 30 минут перед остановкой реакции, поместив ее на лед и добавив 50 мкл 2-кратного буфера для гибридизации Agilent.Непосредственно перед гибридизацией мы нагревали реакционную смесь до 95 ° C в течение 5 минут, затем охлаждали на льду перед добавлением 120 мкл 1 × гибридизационного буфера к 100 мкл фрагментированной меченой РНК и загружали 200 мкл этой смеси в камеру для гибридизации. (Agilent). Массивы гибридизовали при 60 ° C во вращающейся печи в течение 14–18 ч. Слайды промывали в 6 × SSC, 0,005% TritonX-102 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем в 0,1 × SSC, 0,005% TritonX-102 в течение 5 минут и немедленно сканировали с использованием сканера Agilent DNA Microarray Scanner.Промывка и сканирование проводились в среде с низким содержанием озона [59].

Нормализация данных микрочипа.

Данные были извлечены из отсканированного изображения микрочипа с использованием самой последней версии программного обеспечения Agilent Feature Extraction (версии 7.1.1–8.1.1). Необработанные значения интенсивности флуоресценции Cy5 (или Cy3) за вычетом фона для каждого зонда были нормализованы путем деления значений Cy5 (или Cy3) на медианное значение Cy5 (или Cy3) универсального зонда «UNIV2» (расширенная версия 3 ‘ПЦР праймер 1391R: 5’-GTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC-3 ‘) из соответствующего массива и умножение на 100.На этом этапе значения варьировались от 0,01 до примерно 100; значения выше 100 были редкими и возникали только тогда, когда флуоресцентный сигнал для определенного зонда был ярче, чем у универсального зонда. Нормализованные значения Cy5 были «декомпрессированы» следующей коррекцией: декомпрессированный Cy5 равен 10 в степени log ₅ нормализованной интенсивности Cy5. Эта декомпрессия корректирует нелинейную связь сигналов гибридизации с относительной численностью целевых видов, которую мы наблюдали в серии экспериментов по серийному разведению, описанных в предыдущем отчете [46].В этих экспериментах мы обнаружили, что 10-кратное изменение численности переводится примерно в 5-кратное изменение соответствующей интенсивности флуоресценции. После этого преобразования расширенный диапазон значений составлял от 0,001 до приблизительно 700. Мы использовали BLAST для прогнозирования гибридизации каждой из 3458 общих эталонных последовательностей рДНК, превышающих 800 пар оснований, используя схему взвешивания, описанную ранее [46], так что зонд с идеальным соответствием каждой последовательности будет иметь ожидание 100%, а зонды с меньшим количеством совпадений или несовершенные совпадения с последовательностями в контрольном пуле будут иметь соответственно более низкие ожидаемые значения гибридизации.Затем мы рассчитали логарифмическое (наблюдаемое / ожидаемое) отношение для каждого зонда в контексте нашей объединенной эталонной смеси образцов и применили эти поправочные коэффициенты для конкретных зондов к разуплотненным значениям Cy5.

Фильтрация микрочипов.

Микроматричный анализ синтетических пулов определенного состава позволил нам идентифицировать плохо работающие зонды, которые затем были исключены из дальнейших анализов. Мы оценили эффективность зонда с использованием пяти синтетических пулов (четыре пула из шести уникальных продуктов ПЦР рДНК, один пул из 230 уникальных продуктов ПЦР рДНК [из [46]]) и одного биологического пула (общий эталон, описанный выше), состав которых характеризовался следующим: глубокое секвенирование.Зонды со значениями интенсивности флуоресценции более 0,5% от интенсивности универсальных зондов, несмотря на отсутствие предсказанной гомологии последовательности (определяемой как значение совпадения-несовпадения BLAST менее 25 из возможных 40) с любым из видов в образце, были исключены. из последующих анализов. Мы также отбросили данные от зондов, у которых наблюдаемая (декомпрессированная) интенсивность сигнала в 100 раз выше или ниже, чем ожидалось, в анализах биологического контрольного пула (как описано выше в разделе нормализации данных микроматрицы).Оставшийся набор из 6381 зонда с хорошими характеристиками использовался во всех последующих анализах.

Оценка численности таксономических групп.

Для каждого образца мы получили оценку относительной численности каждой таксономической группы в нашем филогенетическом дереве с использованием алгоритма, который гарантирует, что ни один вид не вносит более одного вклада в оценку численности таксономической группы, и что нижележащие зонды (зонды, которые представляют отдельные подмножества видов, принадлежащих к этой филогенетической группе) включены в оценку совокупной численности группы.В частности, для каждой филогенетической группы в каждом образце мы отсортировали все находящиеся ниже по течению зонды в соответствии с их оценками относительной численности на основе микрочипов и рассчитали общую сумму оценок относительной численности всех неперекрывающихся зондов. В результате специфические зонды, добавленные вместе для представления данной таксономической группы, варьировались в разных образцах, в зависимости от того, какие конкретные зонды имели наибольший сигнал гибридизации в этом образце.

Сравнение данных микрочипа и последовательностей.

Оценки относительной численности каждой группы prokMSA на каждом уровне таксономической иерархии в контрольном пуле и в 12 отдельных образцах, проанализированных с помощью секвенирования, были получены путем расчета доли последовательностей в соответствующей библиотеке рДНК, которые были назначены пользователя BLAST в эту группу. Эти основанные на последовательностях оценки численности были напрямую сравнены с оценками, полученными на основе данных микрочипа, как описано в предыдущем разделе.

Автокорреляционный анализ.

Мы использовали автокорреляции как способ измерения тенденции таксономической группы к сохранению после установления («липкость»). Для данного временного ряда от времени a до времени b, мы вычислили корреляцию Пирсона для каждого дочернего вектора ( a + 1,…, b ) и вектора ( a, …, b — 1), представляющий логарифмические оценки (относительной численности). Автокорреляция каждой таксономической группы затем была принята как медианная автокорреляция для всех младенцев, для которых рассматриваемая таксономическая группа присутствовала хотя бы один раз (определяемая как численность> 0.1%) в рассматриваемом временном интервале. В нашем «липком» анализе мы выполнили этот анализ отдельно для двух разных наборов образцов, собранных с разными интервалами выборки, чтобы избежать смешивающего эффекта вариации в интервалах выборки: (1) образцы раз в неделю с 1 по 12 недель; и (2) ежемесячные пробы с 1 по 6 месяцев.

Обнаружение последовательностей архей и грибов.

Для скрининга последовательностей рДНК архей и грибов. мы сначала проверили пулы, включающие все извлеченные образцы ДНК от каждого ребенка (т.е., один пул на ребенка), все образцы стула родителей, все образцы из влагалища и все образцы молока, соответственно. Для каждого пула, дающего положительный результат, все образцы компонентов затем анализировались индивидуально. Для скрининга последовательностей рДНК архей мы использовали два набора специфичных для архей праймеров с широким спектром действия: A751F и U1406R [60]; и Arch433F (5′-TCCAGGCCCTACGGG-3 ‘[61]) и Arch958R (5′-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3′ [62,63]). Для скрининга грибов мы использовали специфические для грибов праймеры широкого спектра действия 817F [64] и 1536R-rev (5’-AATRCAATGCTCTATCCCCA-3 ‘, адаптировано из [64]).Смеси для ПЦР были аналогичны тем, которые использовались для ПЦР с широким спектром бактерий, описанной выше, но со следующими изменениями: для ПЦР, специфичной для грибов, концентрация MgCl ₂ была увеличена до 2 мМ, а BSA был добавлен в конечной концентрации. 1 мг / мл. В реакции ПЦР, специфичных для грибов и архей, хлорид тетраметиламмония не добавляли, а добавляли 2 мкл объединенной ДНК с конечным объемом 50 мкл. Программа цикла состояла из 5 минут при 95 ° C, 35 циклов (30 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 55 ° C и 30 секунд при 72 ° C), а затем 8 минут при 72 ° C.Реакции амплификации анализировали на агарозных гелях.

Анализ систематической ошибки амплификации.

Чтобы выяснить, могут ли несовпадения бактериальных праймеров влиять на амплификацию, была выделена ДНК из пяти контрольных штаммов бактерий: Escherichia coli (клетки TOP10, Invitrogen), Clostridium perfringens (ATCC 13124), Bacteroides fragilis (ATCC 25285), Bifidobacterium longum. (ATCC 15707) и Bifidobacterium infantis (ATCC 15697) с использованием мини-набора QIAamp DNA.Концентрации ДНК измеряли с помощью УФ-спектрофотометра и корректировали для корректировки выхода ДНК, размера генома и количества копий гена рРНК SSU на геном для получения «нормализованных» ДНК, каждая из которых содержит одинаковое количество копий гена рРНК SSU на мкл. Бактериальную ДНК из лизатов амплифицировали индивидуально или парами с использованием праймеров 8F и T7-1391R, как описано выше, с использованием 20 или 35 циклов. Для парных реакций нормализованную ДНК Bifidobacterium longum смешивали с неразбавленными или серийными разведениями нормализованной ДНК из Escherichia coli, Clostridium perfringens, или Bacteroides fragilis.После амплификации смеси ПЦР очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick (Qiagen) и расщепляли с использованием набора рестрикционных ферментов, выбранных для различения двух продуктов ПЦР, полученных с парными видами. Расщепления анализировали на агарозных гелях для количественной оценки относительного количества продуктов ПЦР, представляющих Bifidobacterium longum и виды в группе сравнения, соответственно.

Количественная ПЦР.

Отдельный анализ кПЦР в реальном времени использовался для амплификации и количественного определения рДНК каждой из четырех микробных групп: все бактерии, бифидобактерии, все грибы и все археи.Тотальный бактериальный КПЦР выполняли с использованием смеси 10: 1 универсального прямого праймера 8FM (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ‘, адаптировано из [53]) и соответствующего прямого праймера 8FB для Bifidobacterium longum (5′-AGGGTTCGATTCTGGCTCAG-3′, это исследование ), с обратным праймером Bact515R (5’-TTACCGCGGCKGCTGGCAC-3 ‘, адаптированным из [54]) и зондом TaqMan Bact338K (5′-FAM / CCAKACTCCTACGGGAGGCAGCAG / TAMRA-3’, адаптированным из [65]). Мы дополнили универсальный бактериальный прямой праймер прямым праймером Bifidobacterium longum, потому что анализ последовательностей рДНК SSU показал, что эта группа была особой, поскольку она имела три несовпадения с нашим прямым праймером 8FM.Пилотные исследования показали, что эта смесь праймеров позволяет сравнимую амплификацию генов рРНК SSU из репрезентативных Bifidobacteria, Bacteroides, Enterobacteria и Clostridia. КПЦР рода Bifidobacterium выполняли с использованием праймеров Bif42F [26] и Bif164R (5′-CATCCGGCATTACCACCCGTT-3 ‘, адаптировано из [66]) и зонда Bif126_Taqman [26]. Тотальную количественную ПЦР грибов проводили с использованием праймеров ITS1F-F (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ‘[67]) и ITS4-R (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ [68] и зонда TaqMan 5.8S (5’-FAM / CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATG / TAMRA-3 ‘, адаптировано из [68]. КПЦР архей выполняли с использованием праймеров Arch433F (5′-TCCAGGCCCTACGGG-3′) [61] и Arch958R (5′-YCCGGCGTTCC) [63], и зонд 515F TaqMan (5’-FAM / GTGCCAGCMGCCGCGGTAA / TAMRA-3 ‘, адаптированный из [54]). Для всех анализов qPCR каждая 20-мкл реакционная смесь содержала 1 × мастер-микс TaqMan Universal PCR (Applied Biosystems) , 0,9 мкМ каждого праймера (0,09 мкМ праймера 8FB в общем бактериальном анализе), 0,2 мкМ зонда, 1 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) и 2 мкл экстрагированной ДНК.Программа термоциклирования состояла из 95 ° C в течение 10 минут, за которыми следовали либо 40 циклов (анализы на бактерии и бифидобактерии), либо 45 циклов (анализы грибов и архей) 95 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд, 60 ° C в течение 45 с, 65 ° C в течение 15 с и 72 ° C в течение 15 с [69]. Реакции проводили в системе обнаружения последовательностей Prism 7900HT (Applied Biosystems). Для построения стандартных кривых использовали десятикратные серийные разведения известных количеств рДНК из соответствующей микробной группы (т. Е. Бактерий, бифидобактерий, грибов или архей).Абсолютную численность рДНК рассчитывали на основе стандартных кривых с использованием программного обеспечения SDS версии 2.1 (Applied Biosystems) с базовым уровнем, установленным на циклах 3–15 (бактериальные и бифидобактериальные анализы) или циклах 3–13 (анализы грибов и архей), а также пороге цикла. устанавливается в пределах геометрической фазы кривой усиления. Чувствительность каждого анализа составляла приблизительно 100 молекул рДНК на лунку для реакции ПЦР. Каждый реакционный планшет для количественной ПЦР включал два типа отрицательных контролей (контроль реагентов и контроль аликвот), каждый в трех экземплярах.Специфичность ПЦР-анализа на бифидобактерии в реальном времени была проверена с использованием геномной ДНК, выделенной из 17 контрольных бактериальных штаммов: Bacillus subtilis (ATCC 6633), Bacteroides fragilis (ATCC 25285), Bacteroides thetaiotaomicron (ATCC 29148), Bifidobacterium longum) (ATCC 15ifidobacterium longum) (ATCC 15ifidobacterium longum). Infantis (ATCC 15697), Clostridium perfringens (ATCC 13124), Clostridium putrefaciens (ATCC 25786), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (клетки TOP10; Invitrogen), Haemophilus haemolyticus (ATCC 33390), Lactophilus haemolyticus (ATCC 33390), Lactophilus haemolyticus (ATCC 33390), Lactophilus haemolyticus (ATCC 33390), Lactobacillus Lactobacillus delbrueckii (ATCC 4797), Megasphaera elsdenii (ATCC 17752), Proteus vulgaris (ATCC 13315), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) и Streptococcus salivarius (ATCC 13419).

Проверка подозрительных видов / таксонов.

Мы исследовали происхождение сигналов гибридизации массива, представляющих 12 видов / таксонов, присутствие которых в образцах было неожиданным и не подтвержденным последовательностями в контрольном пуле. Для каждого анализа мы использовали один или оба из двух независимых анализов. Во-первых, мы попытались амплифицировать последовательности, очевидно обнаруженные с помощью анализа массива, с использованием праймеров, специфичных для видов / таксонов; когда продукт был получен, его дополнительно анализировали путем секвенирования.Для амплификации последовательностей мы использовали праймер, идентичный 40-мерному зонду, который давал сигнал гибридизации на нашем микроматрице в качестве 5′-праймера и 40-мерную универсальную последовательность (обратный комплемент последовательности UNIV2, приведенный выше) в качестве 3′-фрагмента. грунтовка. В некоторых случаях мы также пытались амплифицировать подозрительную последовательность, используя усеченную (23-мерную) версию соответствующего олигонуклеотидного зонда из микроматрицы в паре с известным группоспецифическим праймером ПЦР от ProbeBase [55]. Все ПЦР проводили в условиях, идентичных тем, которые использовались при первоначальных амплификациях образцов для анализа микрочипов.Положительные полосы ожидаемого размера были клонированы и секвенированы. В качестве второго подхода четыре образца, которые, как было предсказано на основе результатов микроматрицы, содержали последовательности от неожиданных видов, были дополнительно проанализированы путем секвенирования библиотек клонов рДНК SSU (96–288 клонов), созданных путем амплификации с использованием бактериальных праймеров широкого диапазона 8F и 1391R (как указано выше. ), а также клонирование и секвенирование, как описано ранее [15]. Относительная численность, предсказанная анализом микрочипов, и количество секвенированных клонов были следующими: Vibrio (13%): 96, Deinococcus (0.1%): 192, спирохет (1%): 288 и Legionella pneumophila (1%): 192.

Вспомогательная информация

Набор данных S3. Нормализованные данные микрочипов для всех образцов и всех отфильтрованных зондов

Необработанные интенсивности Cy5 преобразовывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Обратите внимание, что для образцов с повторной гибридизацией ( n = 36) показаны усредненные значения, а названия образцов обозначены (Avg).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.sd003

(19,0 МБ TXT)

Рисунок S1. Численность бактерий и бифидобактерий в течение первого года жизни

Для каждого образца ребенка общее количество бактерий и бифидобактерий оценивалось с помощью ПЦР в реальном времени TaqMan, как подробно описано в разделе «Материалы и методы». Для каждой из этих таксономических групп оценочные копии гена рРНК на грамм фекалий ( y -ось) нанесены на график как функция дней жизни (ось x- ). Обе оси имеют логарифмическую шкалу.Для каждой таксономической группы измерения численности усекаются на нижнем конце диапазона до значения, соответствующего 95-му процентилю экстракционных (отрицательных) контролей для соответствующего набора праймеров ПЦР (10702 и 1183 копий рДНК на грамм эквивалента стула. для общих бактерий и бифидобактерий соответственно). Таким образом, значения, нанесенные на соответствующие нижние пределы обнаружения, обычно представляют собой численность ниже указанного значения (диапазон, включающий ноль).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.0050177.sg001

(457 КБ PDF)

Рисунок S2. Обилие фекальных бактерий, грибов и архей в течение первого года жизни

Для каждого образца младенца обилие бактерий, грибов и архей оценивалось с помощью ПЦР в реальном времени TaqMan, как подробно описано в разделе «Материалы и методы». Для каждой из этих таксономических групп расчетные копии гена рРНК на грамм фекалий ( x -ось) нанесены на график как функция дней жизни ( x -ось). Обе оси имеют логарифмическую шкалу.Для каждой таксономической группы измерения численности усекаются на нижнем конце диапазона до значения, соответствующего 95-му процентилю экстракционных (отрицательных) контролей для соответствующего набора праймеров ПЦР (10702, 9831 и ноль копий рДНК на грамм). эквивалента стула для бактерий, грибов и архей соответственно). Таким образом, значения, нанесенные на соответствующие нижние пределы обнаружения, обычно представляют собой численность ниже указанного значения (диапазон, включающий ноль). Все значения, для которых оценка численности методом qPCR была равна нулю (только для архей), были опущены.Эпизоды антибактериального или противогрибкового (нистатин) лечения обозначены на временной оси серыми или розовыми полосами соответственно (дополнительную информацию см. В Таблице 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.sg002

(773 КБ PDF)

Благодарности

Мы благодарим все семьи, принявшие участие в этом исследовании. Мы благодарны за помощь членов групп Брауна и Релмана, включая Стивена Поппера, Гарольда Амогана, Ле Детлефсена и Лину Веннстрём, а также за ценные советы Майкла Эйзена (Национальные лаборатории Лоуренса Беркли и Калифорнийский университет в Беркли), Роба Тибширани ( Стэнфорд) и Джерел Дэвис.Мы благодарим Карен Нельсон и Джоан Эмерсон (Институт геномных исследований) за техническую поддержку в создании и секвенировании библиотеки клонов рДНК SSU. Мы благодарим Horn Foundation за поддержку этой работы. ПОБ — исследователь Медицинского института Говарда Хьюза. DAR является лауреатом премии Pioneer от Национального института здравоохранения.

Вклад авторов

CP, EMB, DBD, DAR и POB разработали и разработали эксперименты и проанализировали данные. CP, EMB и DBD проводили эксперименты.Документ написали CP, EMB, DBD и POB.

Список литературы

1. 1. Ley RE, Backhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD и др. (2005) Ожирение изменяет микробную экологию кишечника. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 11070–11075.
2. 2. Backhed F, Ding H, Wang T, Hooper LV, Koh GY и др. (2004) Микробиота кишечника как фактор окружающей среды, регулирующий накопление жира. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 15718–15723.
3. 3. Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI (2006) Микробная экология: кишечные микробы человека, связанные с ожирением.Природа 444: 1022–1023.
4. 4. Stappenbeck TS, Hooper LV, Gordon JI (2002) Регуляция развития кишечного ангиогенеза с помощью местных микробов через клетки Панета. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15451–15455.
5. 5. Сюй Дж., Гордон Дж. И. (2003) Вступительная статья: Почитай своих симбионтов. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 10452–10459.
6. 6. Hooper LV, Midtvedt T, Gordon JI (2002) Как взаимодействия хозяина и микробов формируют питательную среду кишечника млекопитающих.Анну Рев Нутр 22: 283–307.
7. 7. MacDonald TT, Gordon JN (2005) Бактериальная регуляция кишечных иммунных ответов. Гастроэнтерол Clin North Am 34: 401–412.
8. 8. Парсоннет Дж., Фридман Г.Д., Вандерштин Д.П., Чанг Й., Фогельман Дж. Х. и др. (1991) Инфекция Helicobacter pylori и риск рака желудка. N Engl J Med 325: 1127–1131.
9. 9. Лекит М., Абачин Э., Мартин А., Пойярт С., Почарт П. и др. (2004) Иммунопролиферативное заболевание тонкого кишечника, связанное с Campylobacter jejuni.N Engl J Med 350: 239–248.
10. 10. Отт С.Дж., Мусфельдт М., Вендерот Д.Ф., Хампе Дж., Брант О. и др. (2004) Уменьшение разнообразия бактериальной микрофлоры слизистой оболочки толстой кишки у пациентов с активным воспалительным заболеванием кишечника. Кишечник 53: 685–693.
11. 11. Сексик П., Риготтье-Гойс Л., Грамет Г., Сутрен М., Покхарт П. и др. (2003) Изменения доминирующих фекальных бактериальных групп у пациентов с болезнью Крона толстой кишки. Кишечник 52: 237–242.
12. 12.Fell JM (2005) Воспалительные кишечные заболевания новорожденных: некротический энтероколит и аллергический колит. Early Hum Dev 81: 117–122.
13. 13. de la Cochetiere MF, Piloquet H, des Robert C., Darmaun D, ​​Galmiche JP, et al. (2004) Ранняя кишечная бактериальная колонизация и некротический энтероколит у недоношенных детей: предполагаемая роль Clostridium . Pediatr Res 56: 366–370.
14. 14. Vaughan EE, Schut F, Heilig HG, Zoetendal EG, de Vos WM, et al.(2000) Молекулярный взгляд на экосистему кишечника. Curr Issues Intest Microbiol 1: 1–12.
15. 15. Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, et al. (2005) Разнообразие кишечной микробной флоры человека. Наука 308: 1635–1638.
16. 16. Zoetendal EG, Akkermans AD, De Vos WM (1998) Анализ гель-электрофореза в градиенте температуры 16S рРНК из образцов фекалий человека выявляет стабильные и специфичные для хозяина сообщества активных бактерий.Appl Environ Microbiol 64: 3854–3859.
17. 17. Старк П.Л., Ли А. (1982) Микробная экология толстой кишки грудных детей и детей, вскармливаемых смесями, в течение первого года жизни. J Med Microbiol 15: 189–203.
18. 18. Penders J, Thijs C, Vink C, Stelma FF, Snijders B, et al. (2006) Факторы, влияющие на состав кишечной микробиоты в раннем младенчестве. Педиатрия 118: 511–521.
19. 19. Бенно Ю., Савада К., Мицуока Т. (1984) Микрофлора кишечника младенцев: состав фекальной флоры у младенцев, находящихся на грудном и искусственном вскармливании.Microbiol Immunol 28: 975–986.
20. 20. Favier CF, Vaughan EE, De Vos WM, Akkermans AD (2002) Молекулярный мониторинг последовательности бактериальных сообществ у новорожденных людей. Appl Environ Microbiol 68: 219–226.
21. 21. Hopkins MJ, Macfarlane GT, Furrie E, Fite A, Macfarlane S (2005) Характеристика кишечных бактерий в детском стуле с использованием ПЦР в реальном времени и анализов северной гибридизации. FEMS Microbiol Ecol 54: 77–85.
22. 22. Hall MA, Cole CB, Smith SL, Fuller R, Rolles CJ (1990) Факторы, влияющие на присутствие фекальных лактобацилл в раннем младенчестве.Arch Dis Child 65: 185–188.
23. 23. Йошиока Х, Исэки К., Фудзита К. (1983) Развитие и различия кишечной флоры в неонатальном периоде у младенцев, находящихся на грудном и искусственном вскармливании. Педиатрия 72: 317–321.
24. 24. Harmsen HJ, Wildeboer-Veloo AC, Raangs GC, Wagendorp AA, Klijn N, et al. (2000) Анализ развития кишечной флоры у детей, находящихся на грудном вскармливании и на искусственном вскармливании, с использованием методов молекулярной идентификации и обнаружения. J Pediatr Gastroenterol Nutr 30: 61–67.
25. 25. Balmer SE, Wharton BA (1989) Диета и фекальная флора новорожденного: грудное молоко и детские смеси. Arch Dis Child 64: 1672–1677.
26. 26. Пендерс Дж., Винк С., Дриссен С., Лондон Н., Тиджс С. и др. (2005) Количественная оценка Bifidobacterium spp., Escherichia coli и Clostridium difficile в образцах фекалий младенцев, вскармливаемых грудью и вскармливаемых смесями, с помощью ПЦР в реальном времени. FEMS Microbiol Lett 243: 141–147.
27. 27. Lundequist B, Nord CE, Winberg J (1985) Состав фекальной микрофлоры у детей, вскармливаемых грудью и из бутылочки, от рождения до восьми недель.Acta Paediatr Scand 74: 45–51.
28. 28. Orrhage K, Nord CE (1999) Факторы, контролирующие бактериальную колонизацию кишечника у младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Acta Paediatr Suppl 88: 47–57.
29. 29. Fanaro S, Chierici R, Guerrini P, Vigi V (2003) Микрофлора кишечника в раннем младенчестве: состав и развитие. Acta Paediatr Suppl 91: 48–55.
30. 30. Bennet R, Nord CE (1987) Развитие фекальной анаэробной микрофлоры после кесарева сечения и лечения антибиотиками у новорожденных.Инфекция 15: 332–336.
31. 31. Neut C, Bezirtzoglou E, Romond C, Beerens H, Delcroix M и др. (1987) Бактериальная колонизация толстой кишки у новорожденных, рожденных путем кесарева сечения. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A] 266: 330–337.
32. 32. Hallstrom M, Eerola E, Vuento R, Janas M, Tammela O (2004) Влияние способа доставки и некротизирующего энтероколита на микрофлору кишечника у недоношенных детей. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 23: 463–470.
33. 33. Мандар Р., Микелсаар М. (1996) Передача микрофлоры матери новорожденному при рождении. Биол для новорожденных 69: 30–35.
34. 34. Швирц А., Грюль Б., Лобниц М., Мишель П., Радке М. и др. (2003) Развитие бактериального состава кишечника у госпитализированных недоношенных детей по сравнению с доношенными детьми, находящимися на грудном вскармливании. Pediatr Res 54: 393–399.
35. 35. Саката Х., Йошиока Х., Фудзита К. (1985) Развитие кишечной флоры у младенцев с очень низкой массой тела при рождении по сравнению с нормальными доношенными новорожденными.Eur J Pediatr 144: 186–190.
36. 36. Миллар М.Р., Линтон С.Дж., Кейд А., Глэнси Д., Холл М. и др. (1996) Применение ПЦР гена 16S рРНК для изучения флоры кишечника недоношенных детей с некротическим энтероколитом и без него. J Clin Microbiol 34: 2506–2510.
37. 37. Коул Дж. Р., Чай Б., Марш Т. Л., Фаррис Р. Дж., Ван К. и др. (2003) Проект базы данных рибосом (RDP-II): предварительный просмотр нового средства автоматического выравнивания, которое позволяет регулярно обновлять новую таксономию прокариот. Nucl Acids Res 31: 442–443.
38. 38. ДеСантис Т.З., Дубосарский И., Мюррей С.Р., Андерсен Г.Л. (2003) Комплексное построение выровненных последовательностей для автоматизированного проектирования эффективных зондов (CASCADE-P) с использованием 16S рДНК. Биоинформатика 19: 1461–1468.
39. 39. Дедыш С.Н., Панкратов Т.А., Белова С.Е., Куличевская И.С., Лизак В. (2006) Филогенетический анализ и определение состава бактериального сообщества на кислых сфагновых торфяниках in situ. Appl Environ Microbiol 72: 2110–2117.
40. 40.Шмитт-Вагнер Д., Фридрих М.В., Вагнер Б., Брюн А. (2003) Филогенетическое разнообразие, численность и осевое распределение бактерий в кишечном тракте двух термитов, питающихся почвой (Cubitermes spp.). Appl Environ Microbiol 69: 6007–6017.
41. 41. Salzman NH, de Jong H, Paterson Y, Harmsen HJ, Welling GW и др. (2002) Анализ библиотек 16S микрофлоры желудочно-кишечного тракта мышей выявил новую большую группу кишечных бактерий мышей. Микробиология 148: 3651–3660.
42. 42. Acinas SG, Marcelino LA, Klepac-Ceraj V, Polz MF (2004) Дивергенция и избыточность последовательностей 16S рРНК в геномах с множественными оперонами рРНК. J Bacteriol 186: 2629–2635.
43. 43. Park HK, Shim SS, Kim SY, Park JH, Park SE и др. (2005) Молекулярный анализ колонизированных бактерий в кишечнике новорожденного человека. J Microbiol 43: 345–353.
44. 44. Mackie RI, Sghir A, Gaskins HR (1999) Микробная экология развития желудочно-кишечного тракта новорожденных.Am J Clin Nutr 69: 1035S – 1045S.
45. 45. Macdonald TT, Monteleone G (2005) Иммунитет, воспаление и аллергия в кишечнике. Наука 307: 1920–1925.
46. 46. Палмер С., Бик Е.М., Эйзен М.Б., Экбург П.Б., Сана Т.Р. и др. (2006) Быстрое количественное определение сложных микробных популяций. Nucleic Acids Res. 34.
47. 47. Линц Б., Баллу Ф., Мудли Й., Маника А., Лю Х. и др. (2007) Африканское происхождение тесной связи между человеком и Helicobacter pylori.Природа 445: 915–918.
48. 48. Caufield PW, Saxena D, Fitch D, Li Y (2007) Популяционная структура плазмид-содержащих штаммов Streptococcus mutans, члена местной биоты человека. J Bacteriol 189: 1238–1243.
49. 49. Беленгер А., Дункан С.Х., Колдер А.Г., Холтроп Дж., Луи П. и др. (2006) Два пути метаболического перекрестного питания между Bifidobacterium adolescentis и анаэробами, продуцирующими бутират, из кишечника человека. Appl Environ Microbiol 72: 3593–3599.
50. 50. Самуэль Б.С., Гордон Дж. И. (2006) Гуманизированная модель мыши-гнотобиотической мыши мутуализма «хозяин-архей-бактерия». Proc Natl Acad Sci U S A 103: 10011–10016.
51. 51. Зонненбург JL, Chen CT, Gordon JI (2006) Геномные и метаболические исследования воздействия пробиотиков на модельного симбионта кишечника и хозяина. PLoS Biol 4: e413 ..
52. 52. Фарук С.М., Насер И.Б., Ислам М.Дж., Фарук А.С., Гош А.Н. и др. (2005) Сезонные эпидемии холеры обратно коррелируют с распространенностью фагов холеры в окружающей среде.Proc Natl Acad Sci U S A 102: 1702–1707.
53. 53. Edwards U, Rogall T, Blocker H, Emde M, Bottger EC (1989) Выделение и прямое полное определение нуклеотидов целых генов. Характеристика гена, кодирующего рибосомную РНК 16S. Nucleic Acids Res 17: 7843–7853.
54. 54. Lane DJ, Pace B, Olsen GJ, Stahl DA, Sogin ML, et al. (1985) Быстрое определение последовательностей 16S рибосомной РНК для филогенетических анализов. Proc Natl Acad Sci U S A 82: 6955–6959.
55. 55. Loy A, Horn M, Wagner M (2003) probeBase: Интернет-ресурс для олигонуклеотидных зондов, нацеленных на рРНК. Nucleic Acids Res 31: 514–516.
56. 56. Альтшул С.Ф., Гиш В., Миллер В., Майерс Е. В., Липман Д. Д. (1990) Базовый инструмент поиска локального выравнивания. J Mol Biol 215: 403–410.
57. 57. Бик Э.М., Экбург П.Б., Гилл С.Р., Нельсон К.Э., Пурдом Э.А. и др. (2006) Молекулярный анализ бактериальной микробиоты в желудке человека. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 732–737.
58. 58. Blanchard AP, Kaiser RJ, Hood LE (1996) Матрицы олигонуклеотидов высокой плотности. Biosens Bioelectron 11: 687–690.
59. 59. Фаре Т.Л., Коффи Э.М., Дай Х., Хе Ю.Д., Кесслер Д.А. и др. (2003) Влияние атмосферного озона на качество данных микрочипов. Anal Chem 75: 4672–4675.
60. 60. Baker GC, Smith JJ, Cowan DA (2003) Обзор и повторный анализ доменно-специфичных праймеров 16S. J Microbiol Methods 55: 541–555.
61. 61. Лепп П.У., Бриниг М.М., Оуверни С.К., Палм К., Армитаж Г.К. и др.(2004) Метаногенные археи и пародонтоз человека. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 6176–6181.
62. 62. DeLong EF, Wickham GS, Pace NR (1989) Филогенетические красители: зонды на основе рибосомной РНК для идентификации одиночных клеток. Наука 243: 1360–1363.
63. 63. Делонг Е.Ф. (1992) Археи в прибрежных морских средах. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 5685–5689.
64. 64. Borneman J, Hartin RJ (2000) Праймеры для ПЦР, которые амплифицируют гены рРНК грибов из образцов окружающей среды.Appl Environ Microbiol 66: 4356–4360.
65. 65. Аманн Р.И., Биндер Б.Дж., Олсон Р.Дж., Чисхолм С.В., Деверо Р. и др. (1990) Комбинация олигонуклеотидных зондов, нацеленных на 16S рРНК, с проточной цитометрией для анализа смешанных микробных популяций. Appl Environ Microbiol 56: 1919–1925.
66. 66. Langendijk PS, Schut F, Jansen GJ, Raangs GC, Kamphuis GR, et al. (1995) Количественная флуоресцентная гибридизация in situ Bifidobacterium spp. с геноспецифическими зондами, нацеленными на 16S рРНК, и их применением в образцах фекалий.Appl Environ Microbiol 61: 3069–3075.
67. 67. Гардес М., Брунс Т.Д. (1993) Праймеры ITS с повышенной специфичностью в отношении базидиомицетов — применение для идентификации микоризы и ржавчины. Мол Экол 2: 113–118.
68. 68. White TJ, Burns T, Lee S, Taylor J (1990) Амплификация и секвенирование генов грибковой рибосомной РНК для филогенетики. В: Иннис М.А., Гельфанд Д.Х., Снинский Дж. Дж., Уайт Т. Дж., Редакторы. Протоколы ПЦР. Руководство по методам и приложениям. Сан-Диего (Калифорния): Academic Press.С. 315–322.
69. 69. Brinig MM, Lepp PW, Ouverney CC, Armitage GC, Relman DA (2003) Распространенность бактерий подразделения TM7 в поддесневой бляшке человека и их связь с заболеванием. Appl Environ Microbiol 69: 1687–1694.

Молозиво — суперпродукт для вашего новорожденного

Молозиво — это первое грудное молоко, которое вырабатывается в середине беременности (12-18 недель) и вырабатывается непрерывно в течение первых нескольких дней после рождения ребенка.Это густое, липкое, концентрированное молоко, обычно желтого, прозрачного или белого цвета, хотя может быть и других цветов. Он состоит из иммунных факторов, белков, сахара и жиров.

Польза молозива для новорожденного

В течение нескольких минут после рождения ребенка можно начинать грудное вскармливание. Хотя все младенцы получают пользу от молозива, у недоношенных детей, которые потребляют молозиво из материнской груди, «состояние здоровья значительно лучше» (5), чем у тех, кто этого не делает.

• Помогает вашему ребенку развить сильную иммунную систему (содержит антитела и лейкоциты).
• Создает прочное покрытие на желудке и кишечнике вашего ребенка, чтобы не дать микробам вызвать болезнь и предотвратить воспаление.
• Действует как слабительное, помогая вашему ребенку вывести меконий (темные первые корма).
• Помогает предотвратить желтуху и избавиться от вредных продуктов жизнедеятельности. Узнайте больше о грудном вскармливании и желтухе.
• Обеспечивает мозг, глаза и сердце вашего ребенка необходимой смесью питательных веществ для роста.
• Содержит большое количество белков, солей, жиров и витаминов для полноценного питания.
• Полноценное питание, которое легко усваивает желудок вашего ребенка. Это идеальная еда для вашего новорожденного.
• Помогает предотвратить низкий уровень сахара в крови у новорожденных.

Сколько достаточно?

Нормально производить всего 1-4 чайные ложки молозива в день . Помните, что желудок вашего ребенка может быть размером с мрамор, поэтому большое кормление может показаться маленьким.Научиться сосать и глотать молоко легче в небольших количествах. Если ваш ребенок сначала не может сосать грудь, сцеживайте молозиво вручную, чтобы его можно было накормить. Ручное сцеживание молозива обычно дает больше объема, чем молокоотсос в первые часы.

Количество вырабатываемого вами молозива идеально подходит для вашего ребенка. Количество питья, которое ваш ребенок будет пить, будет увеличиваться с каждым днем. По мере роста желудка ребенка количество молока будет увеличиваться, поэтому не забывайте кормить ребенка грудью так часто, как он хочет, чтобы молоко начало и оставалось крепким.

Когда мне перестать производить молозиво?

Ваше тело будет вырабатывать молозиво исключительно в течение 2-5 дней после рождения. После этого на смену приходит «переходное молоко» — смесь молозива и более зрелого молока.
К моменту сцеживания промежуточного молока живот новорожденного начинает растягиваться и теперь может потреблять больше молока за раз.

Составлено с использованием информации из следующих источников:

1.Хэнсон, Л., Коротконва, М., Важность молозива, Грудное вскармливание может повысить собственную иммунную систему ребенка. (2002). Детская инфекционная болезнь Жур; 21: 816-821.

2. Дионна. (2010). Состав на грудном молоке. Часть 1. Воспитание привязанности.

The Composition of Breastmilk, Part 1

3. О’Коннер, М., (1998). Анатомия и физиология: состав молока.

4. Спенглер, А., Ранденберг, А., Бреннер, М., Ховетт, М., (2008). Модели живота как инструменты обучения: в чем их польза? Журнал человеческой лактации. Май 2008 г., т. 24; № 2.

5. Международная лига Ла Лече. Молозиво: общее.

https://www.llli.org/breastfeeding-info/colostrum-general/

Питание для новорожденных: чем кормить детей в первый год жизни

Детское питание

Некоторые женщины предпочитают не кормить грудью или не могут полагаться только на грудное молоко. Хотя грудное молоко является золотым стандартом, смесь может помочь заполнить пробелы.С 1925 года компания Abbott является новатором в области детского питания, чтобы дать детям хороший старт в жизни.

Вот некоторые ингредиенты, которые родители должны знать при выборе смеси.

• ДГК, лютеин и витамин Е для развития мозга и глаз
• 2’-FL HMO (Олигосахариды человеческого молока) для поддержки иммунитета
• Не содержит пальмового олеина для отличного усвоения кальция и укрепления костей

Дети, находящиеся на грудном вскармливании, как правило, имеют более сильную иммунную систему, чем дети, вскармливаемые смесями, и революционное исследование Abbott показало, что это может быть частично связано с пребиотиками в грудном молоке, называемыми олигосахаридами человеческого молока (ОПЗ).*

Abbott была первой компанией в мире, которая включила этот важный ингредиент в детскую смесь, представив Similac ^® Pro-Advance и Pro-Sensitive с формулой 2′-FL HMO. И теперь дети, находящиеся на искусственном вскармливании, могут пользоваться преимуществами, которые раньше были доступны только детям, находящимся на грудном вскармливании.

После того, как вы выберете смесь, следующим шагом будет поиск подходящей детской бутылочки. Это скорее процесс исключения, чем вопрос личных предпочтений — по крайней мере, для вас. Ваш ребенок в конечном итоге решит, что лучше, поэтому будьте готовы попробовать несколько видов детской бутылочки и соски.

Наконец, прочтите эти советы о том, как смешивать и готовить смесь. Не рекомендуется использовать разбавленную смесь для здоровья ребенка.

Исходные твердые частицы

AAP предлагает начинать прием твердой пищи в возрасте шести месяцев, но вы также можете следить за сигналами того, что ваш ребенок готов попробовать новую пищу.

«Признаки развития помогают нам понять, когда дети готовы начать прием твердой пищи, — объясняет Томпсон, — например, когда они могут сидеть без поддержки и держать голову вверх, когда они открывают рот, когда видят ложку еды, и когда они могут двигать пищу из ложки в рот.«

Начните с малого, включив в рацион детскую кашу. И, как правило, оставайтесь простыми и добавляйте по одному новому блюду за раз.

Первый год — критический период роста и развития для младенцев, и, сосредоточив внимание на правильном питании, вы можете помочь им встать на правильный путь.

* не из грудного молока

Кормление смесями связано с изменениями в составе микробиома кишечника младенцев

Энн Хардинг

НЬЮ-ЙОРК (Reuters Health) — Состав микробиома кишечника у младенцев, которых кормили смесью грудного молока и смеси, аналогичен составу микробиома младенцев, вскармливаемых только смесями, согласно новому Выводы.

И микробиота детей, которых кормили любой смесью, значительно отличается по составу от микробиоты детей, вскармливаемых исключительно грудью, обнаружили доктор Джульетта Мадан и доктор Энн Хоэн из Медицинской школы Гейзеля в Дартмутском колледже в Ганновере, штат Нью-Гэмпшир, и их коллеги. . Они сообщили о своих результатах в Интернете 11 января в JAMA Pediatrics.

«Мы ожидали найти обратное, поэтому это несколько удивительно», — сказал доктор Мадан в телефонном интервью агентству Reuters Health.

Авторы отмечают, что появляется все больше доказательств связи между составом микробиома кишечника и многими ключевыми последствиями для здоровья взрослых, но относительно микробиом кишечника у младенцев и детей было проведено относительно мало.Они добавляют, что предыдущие исследования связали способ доставки и воздействие грудного вскармливания с профилями кишечного микробиома у младенцев. Воздействие микрофлоры влагалища во время родов может иметь важное значение для создания собственного микробиома младенца, в то время как грудное молоко может способствовать его развитию.

В новом исследовании исследователи использовали секвенирование гена 16S рРНК нового поколения для сравнения состава кишечного микробиома 102 здоровых шестинедельных младенцев. Семьдесят детей родились естественным путем, а 32 — кесаревым сечением.Семьдесят младенцев находились на исключительно грудном вскармливании, 26 получали грудное молоко и смесь, а шесть получали только смесь.

Как способ доставки, так и метод кормления были независимо связаны с составом микробиома кишечника, как это было определено с помощью анализа UniFrac. Были статистически значимые различия в составе микробиома между младенцами, вскармливаемыми исключительно грудью, и младенцами, вскармливаемыми только смесью, а также между детьми, находившимися исключительно на грудном вскармливании, и теми, кто получал и грудное молоко, и смесь.Однако не было статистически значимой разницы в составе микробиома между группами, получавшими только смесь, и группами смешанного питания.

Различия между естественными родами и младенцами, рожденными с помощью кесарева сечения, были аналогичны различиям между разными группами кормления.

У новорожденных, рожденных естественным путем, повышенное содержание бактерий Bacteroides, которые являются известным компонентом здоровой микробиоты кишечника младенцев и важны для созревания иммунной системы, сказал доктор Хоэн в телефонном интервью Reuters Health.

«По мере того как мы будем следить за возрастом этой когорты и собирать данные о пользе для здоровья и рисках для здоровья, мы сможем лучше прояснить, есть ли последствия для здоровья, связанные с наблюдаемыми нами закономерностями», — сказал д-р Мадан. . Она и ее коллеги планируют следить за детьми до пяти лет.

Конечная цель этого исследования, по словам доктора Мадана, будет состоять в том, чтобы найти способы восстановления здорового микробиома у младенцев, микробиомы которых были изменены определенным воздействием.

«Это хорошее исследование, это не удивительно для меня», — сказала в телефонном интервью Reuters Health доктор Меган Азад из Исследовательского института детской больницы Манитобы в Виннипеге. Доктор Азад изучает микробиом младенца, но не принимал участия в новом исследовании. Она отметила, что кормление младенца даже небольшим количеством смеси дает кишечным бактериям новую пищу, которая потенциально может изменить популяции бактерий в кишечнике.

Для врачей и родителей важно понимать потенциальное влияние как способа родоразрешения, так и вскармливания младенцев сейчас и в будущем, добавила она.

«Это важные решения, которые, вероятно, будут иметь долгосрочные последствия для здоровья, которые мы не ценили до того, как проводилось это исследование микробиома», — сказал д-р Азад. «Это сложный вопрос, потому что мы не хотим обвинять или стыдить мам за их решения, но в то же время мы хотим, чтобы информация была доступна, чтобы помочь информировать их о выборе».

Национальные институты здравоохранения и Агентство по охране окружающей среды поддержали это исследование. Авторы не сообщили о раскрытии информации.

ИСТОЧНИК: http://bit.ly/22WSJ4t

JAMA Pediatr 2016.

(c) Авторские права Thomson Reuters 2016. Нажмите, чтобы узнать об ограничениях — http://about.reuters.com/fulllegal.asp

Что такое лучший вид молочной смеси?

Посмотрите наше видео, чтобы получить информацию о молочных смесях.

Что такое детская смесь?

Детская смесь предназначена для замены родителей, которые не могут или решили не кормить грудью своих детей. Его формула имитирует питательный состав грудного молока (Martin et al, 2016).

Что лучше: порошковая или готовая формула?

Детское питание обычно бывает двух разных форм: сухого порошка, который вы смешиваете с водой, или готового к употреблению жидкого смеси. Между ними нет разницы в составе, но готовое к употреблению молоко, как правило, дороже и требует большей упаковки (Martin, 2016; NHS Choices, 2016; Crawley, 2018; Crawley and Westland, 2019). Используемые ингредиенты различаются у разных производителей, и также могут быть различия от партии к партии.

Какие ингредиенты входят в состав детской смеси?

В основе большинства видов детского молока лежит коровье или козье молоко в виде обезжиренного или полножирного, жидкого или сухого молока или с использованием концентратов деминерализованного сывороточного протеина. В молочную основу добавляются лактоза или другие углеводы, растительные, рыбные и другие масла, витамины и минералы (Crawley and Westland, 2019).

Основными компонентами любого детского молока, независимо от формата (порошковое или готовое к употреблению), являются белки, жиры, углеводы, витамины и минералы (Crawley and Westland, 2019).Основные производители детских смесей разрабатывают собственные торговые марки, в которых каждый из этих компонентов сочетается. Вы можете увидеть полный список компонентов на упаковке детской смеси для младенцев (Crawley, 2018).

Какие питательные вещества в молочной смеси лучше всего?

Если какое-либо вещество доказало свою пользу для вашего ребенка и может быть добавлено в детские смеси, закон требует, чтобы оно добавлялось ко всем смесям (Crawley, 2018). Поэтому покупка более дорогой смеси не означает, что ваш ребенок будет расти или развиваться лучше, чем если бы вы покупали более дешевую смесь.Базовый профиль питания большинства видов детского молока на самом деле очень похож (NHS Choices, 2016; Crawley and Westland, 2019).

В Великобритании ингредиенты детских смесей строго регулируются, и каждый производитель должен следовать строгим национальным и европейским рекомендациям по составу (Martin, 2016). Производители молочных смесей должны добавлять компоненты молочных смесей в соответствии с нормативной базой Положений о детских смесях и последующих смесях 2007 года. Они также должны соблюдать любые соответствующие изменения в этих правилах и в правилах, касающихся пищевых продуктов для специальных медицинских целей.

Какая молочная смесь лучше?

Для здорового доношенного ребенка не имеет значения, какой бренд вы выберете. Все они имеют разные заявления и имеют разные ингредиенты. Тем не менее, независимо от стоимости, как мы уже говорили, все бренды должны соответствовать одним и тем же стандартам питания и безопасности и иметь относительно схожий состав (Martin, 2016; Crawley, 2018).

First Steps Nutrition Trust предлагает здесь дополнительную информацию о различных брендах молочных смесей, доступных в Великобритании, и их ингредиентах.У нас также есть статья о различных типах молочных смесей.

Могу ли я изменить смесь, которую использует мой ребенок?

Традиционно родителям рекомендовали придерживаться одного бренда, но нет убедительных доказательств того, что изменение приносит какой-либо вред (NHS Choices, 2016; Crawley, 2018). Вы можете попробовать разные смеси, чтобы увидеть, что ваш ребенок предпочтет, если небольшие различия в составе ингредиентов окажут влияние.

Поскольку производители иногда немного меняют ингредиенты от партии к партии, может оказаться, что один бренд больше не согласен с вашим ребенком.Если вы хотите сменить торговую марку, поговорите со своим лечащим врачом (NHS, 2016). Некоторым младенцам может быть лучше с помощью специальной смеси вместо обычной, но для этого требуется медицинская помощь.

Формула вегетарианская или веганская?

Только некоторые формулы являются вегетарианскими, так как многие из них содержат рыбий жир и / или животный сычужный фермент. Информацию о подходящих формулах можно получить здесь от Trust First Steps Nutrition.

Смеси на основе сои подходят для вегетарианцев, но не рекомендуются для детей младше шести месяцев, за исключением случаев, когда они находятся под наблюдением врача (Crawley and Westfield, 2019).В настоящее время в Великобритании нет детского молока, подходящего для веганов, поскольку даже молоко без животных белков содержит витамин D из овечьей шерсти.

Рекомендуется, чтобы те, кто придерживается веганской диеты, кормили грудью в течение первого года жизни и могли переводить своих детей на молоко неживотного происхождения в возрасте одного года (Crawley and Westfield, 2019). Родители, которые хотят воспитать своих детей веганами, должны обратиться за медицинской помощью, чтобы убедиться, что их потребности в питании удовлетворяются (Crawley and Westfield, 2019).

Какое соотношение между молочными смесями и грудным молоком для здоровья моего ребенка?

При безопасном приготовлении смеси дети получают питательные вещества, необходимые им для роста и развития (Martin, 2016; Crawley and Westfield, 2019). Тем не менее, молочные смеси не могут предложить многие из тех же преимуществ для здоровья, что и грудное вскармливание, например, защиту от инфекций и других заболеваний (Martin, 2016). Это связано с тем, что живые клетки, гормоны и дружественные бактерии не могут быть воспроизведены искусственным процессом (Crawley, 2018).

Могу ли я использовать смесь и продолжать кормить грудью?

Если вы продолжите кормить грудью, а также кормить смесью, ваше грудное молоко будет по-прежнему приносить пользу вашему ребенку (Crawley, 2018). Обеспечение молоком обычно обеспечивается частым и эффективным грудным вскармливанием. На это может повлиять кормление вашего ребенка молочной смесью, потому что это может означать, что ваш ребенок будет реже кормить грудью, и, следовательно, вы будете вырабатывать меньше молока.

Прочтите нашу статью о смешанном вскармливании, чтобы узнать больше. Возможно, вам будет полезно обсудить возможные варианты с вашей акушеркой, патронажной сестрой или консультантом по грудному вскармливанию.Вы также можете связаться с одним из наших дружелюбных и знающих консультантов по грудному вскармливанию, позвонив в нашу Линию поддержки грудного вскармливания по телефону 0300 330 0700. Они открыты с 8 утра до полуночи каждый день.

Как приготовить порошковую смесь?

Поскольку порошкообразная смесь не является стерильной, важно каждый раз готовить ее правильно, используя кипяченую воду, остывшую не более 30 минут. Чтобы убить любые бактерии в порошке, важно, чтобы температура воды была не менее 70 ° C (NHS, 2016).

Безопасное приготовление является ключевым моментом — все смеси должны быть приготовлены с использованием правильного количества порошка, поскольку разбавление или использование слишком большого количества порошка может вызвать недомогание вашего ребенка (NHS, 2015). См. Наше пошаговое руководство по приготовлению детской смеси и приготовлению бутылочки, если вас нет дома.

Последнее обновление этой страницы: май 2019 г.

Дополнительная информация

Мы поддерживаем всех родителей, как бы они ни кормили своего ребенка. Если у вас есть вопросы, проблемы или вам нужна поддержка, вы можете поговорить с консультантом по грудному вскармливанию, позвонив на нашу горячую линию по телефону 0300 330 0700, независимо от того, кормите ли вы исключительно грудью или используете молочную смесь.Консультанты по грудному вскармливанию прошли обширную подготовку, выслушают, не осуждая и не критикуя, и предложат соответствующую информацию и предложения. Вы также можете найти больше полезных статей здесь.

Для получения более подробной информации о различных доступных молочных смесях посетите сайт First Steps Nutrition Trust.