Вакцина от стафилококка: Прививка от стафилококка | Стафилококковая вакцина

— обзор

Введение

Остеомиелит, связанный с имплантатом (ОМ), является одним из наиболее серьезных осложнений ортопедической хирургии.Остеомиелит — это инфекция костей, обычно возникающая в результате гематогенного или травматического воздействия бактерий. Несмотря на распространенность ОМ в ортопедической хирургии, врачи имеют ограниченные и недостаточные терапевтические возможности. Кроме того, ожидается, что общее количество процедур, выполняемых в ортопедии, продолжит расти в течение следующих нескольких десятилетий из-за старения населения. Особое значение имеют операции тотального эндопротезирования суставов, которые в США уже превышают один миллион в год.Согласно одному прогнозу на период с 2005 по 2030 год, общее протезирование тазобедренного сустава увеличится на 174%, а общее протезирование коленного сустава — на 673%. ¹ Текущий уровень инфицирования, связанный с эндопротезированием тазобедренного и коленного суставов, оценивается в 0,88% и 0,92% соответственно. ² Несмотря на то, что уровень инфицирования невелик, большой объем операций по замене суставов означает, что десятки тысяч пациентов столкнутся с этими опасными для жизни инфекциями. Помимо показателей, связанных с контролируемой средой при артропластике, частота инфицирования имплантированных устройств, связанных с открытыми переломами, колеблется от нескольких процентных пунктов до 50%, в зависимости от степени повреждения мягких тканей. ³ ОМ, связанная с имплантатом, остается значительной причиной заболеваемости и смертности инфицированного пациента, проблемой для лечащего хирурга и потенциально огромными расходами для больницы.

Стафилококки на сегодняшний день являются наиболее частыми инфекционными агентами при ОМ, ассоциированном с имплантатами. Лечение ОМ, связанного с ортопедическими имплантатами, осложняется патогенами, которые становятся все более устойчивыми к антибиотикам. ⁴ Staphylococcus aureus и коагулазонегативные стафилококки составляют 65–80% инфекций, связанных с имплантатами. ^5,6 Воздействие S. aureus , в частности, стало более серьезным из-за резкого роста числа инфекций, вызываемых устойчивым к метициллину S. aureus (MRSA), и продолжающимся появлением устойчивых к ванкомицину S. aureus . ^7,8

Несмотря на то, что это неподвижная грамположительная бактерия, S. aureus является серьезным патогеном из-за его повсеместного распространения среди людей и его многочисленных адаптаций, которые позволяют ему ниспровергать элементы иммунного ответа человека.В дополнение к секретируемым продуктам, которые подавляют действие комплемента и убивают фагоциты, и белку клеточной стенки, который снижает эффективность антител, связанных с клеточной стенкой, S. aureus накопил гены, которые делают его устойчивым ко многим антибиотикам. Он также может образовывать связанные с имплантатами биопленки, которые особенно трудно очистить. Поскольку стафилококки являются наиболее частыми возбудителями инфекций, связанных с имплантатами, большая часть текущих исследований, направленных на новые стратегии профилактики или лечения ОМ, связанных с имплантатами, сосредоточена на S.aureus и особенно MRSA.

Последствия остеомиелита, связанного с имплантатом, тяжелые и дорогостоящие. Недавние исследования показали, что пациенты с подтвержденными инфекциями MRSA испытали: (1) увеличение продолжительности пребывания в больнице на 50 дней, (2) 3 недели дополнительного лечения антибиотиками и дополнительным лечением и (3) увеличение смертности в 2,7 раза по сравнению с неинфицированным больным. Таким образом, разработка вакцины против MRSA или других методов лечения, направленных на предотвращение инфекций MRSA, окажет существенное влияние на экономику стационарного лечения. ^9,10 Больничные расходы, связанные с имплантационной ОМ, составляют от 35 000 до 100 000 долларов США на пациента, в зависимости от хирургического вмешательства и времени постановки диагноза, ¹¹ и пожизненные затраты на лечение тяжелых открытых переломов в размере 680 000 долларов США. ¹²

Клиническая картина пациента с остеомиелитом: Типичными клиническими проявлениями пациента с остеомиелитом являются боль и эритема в области хирургического вмешательства или инфицированной кости, лихорадка или озноб в анамнезе, а также возможный дренаж от образования свища или свища. расхождение хирургической раны.Затем диагноз подтверждается образцами крови (лейкоциты (WBC), скорость оседания эритроцитов (СОЭ), С-реактивный белок (СРБ)) и биопсией суставной жидкости (если возможно) или раны и прилегающей ткани, как показано. нужный. Культуры из этих источников обычно дают возбудителя.

Пути заражения ОМ: Как неподвижный микроорганизм, такой как S. aureus , попадает в место потенциальной инфекции, такое как ортопедический имплант, не совсем понятно.Обычно рассматривалось три пути передачи. Во-первых, прямая инфекция может возникнуть в результате хирургического воздействия на кость или имплантат во время процедуры фиксации перелома, артропластики сустава или коррекции основной деформации. Несмотря на то, что стерильная техника подвергается стрессу в этих хирургических условиях, внутреннюю скорость воздействия на 0,6–2,8% трудно снизить даже в наиболее контролируемых условиях. ¹³ Во-вторых, передача от соседних инфекций мягких тканей, возможно, в результате травмы, такой как открытые переломы, при которых рана сообщается с сломанной костью или имплантированными устройствами, представляет собой травматическую инокуляцию кости и имеет самый высокий уровень инфицирования (5 –30%) в ортопедической литературе. ¹⁴ Скорость инфицирования в значительной степени определяется временем введения внутривенных антибиотиков и серьезностью перелома (степень и размер перелома, повреждение мягких тканей и сопутствующее повреждение сосудов). Предполагается, что третий путь инфицирования имплантата является вторичным по отношению к гематогенному распространению, когда бактерии попадают в кровоток через разрыв кожи, ускользают и мигрируют из абсцесса или во время стоматологических процедур.

Из-за сложности передачи начало симптомов сильно варьирует и часто бывает через месяцы или годы после имплантации.Matar et al. продемонстрировал три окна инфекции после анализа серии инфицированных тотальных артропластик суставов (TJA): 19% произошли в течение 90 дней после операции, 40% произошли в период между 90 днями и 2 годами после операции, а 41% произошли более чем через 2 года после операции. . ¹⁵ Хотя вполне вероятно, что раннее проявление ОМ возникает в результате прямого инфицирования кости, имплантата или окружающих мягких тканей, а более поздние инфекции основаны в основном на гематогенном распространении, пути заражения во многих из этих случаев являются спорными .

Исследователи смогли идентифицировать некоторые клинические факторы риска для пациентов, перенесших артропластику сустава, и многие из этих факторов риска могут быть применены к другим ортопедическим пациентам. Вкратце, идентифицированные факторы риска включают: вторичную фармакологическую иммуносупрессию (хроническое употребление стероидов), патологические (диабет, СПИД) или злокачественные новообразования, курение, ожирение, предшествующую артропластику сустава (или инструментарий), мужской пол и повышенный индекс Чарлсона (который включает несколько сопутствующих заболеваний). , включая сердечную недостаточность, заболевание почек и гемиплегию).

В зависимости от времени постановки диагноза (например, менее 30 дней или менее 6 месяцев после операции и т. Д.) Сообщалось о различных терапевтических подходах. Они варьируются от курса внутривенных (IV) антибиотиков с сохранением исходного имплантата до двухэтапной обменной артропластики (TSEA), требующей удаления инфицированного имплантата, хирургической ирригации и санации (IandD) зараженной кости, введения антибиотика. цементный спейсер, обширный курс антибактериальной терапии и, наконец, реимплантация после исчезновения инфекции.С каждым стилем лечения связана значительная заболеваемость и смертность, и каждое решение должно приниматься индивидуально для каждого пациента.

Следует отметить, что TSEA — успешный подход примерно для 50% пациентов, у которых изначально диагностирована инфицированная TJA. Около 20% пациентов, которым была успешно проведена повторная имплантация, инфицируются повторно, иногда с другим организмом. Еще 30–35% инфицированных пациентов с TJA никогда не излечивают первичную инфекцию, и они прогрессируют до действительно неблагоприятных исходов в виде ампутации, слияния, стойкой инфекции или смерти.Мы убеждены, что эта популяция значительно обогащена пациентами с MRSA, и что эти ужасные исходы являются одной из многих клинических издержек этого опасного «супербактерия».

Столкнувшись с этими опасными для жизни инфекциями, многие исследователи ищут новые методы профилактики и лечения. К ним относятся металлические и пропитанные антибиотиками покрытия для имплантируемых устройств, цемент, смешанный с различными концентрациями и комбинациями антибиотиков, фотодинамическая терапия, новые классы антибиотиков и разработка пассивных вакцин с использованием моноклональных антител для защиты от первоначальной инфекции или предотвращения повторного заражения пациентов. с ранее известной инфекцией.

Животные модели играют важную роль в открытиях и разработках. Каждая из новых идей по профилактике или лечению ОМ, связанного с имплантатами, потребует обширных испытаний на животных, прежде чем можно будет проводить клинические испытания на людях. Вероятно, что ни одна животная модель не сможет охватить разнообразные клинические проявления инфекции, связанной с имплантатом человека; Тем не менее, модели на животных значительно облегчили наше понимание остеомиелита ¹⁶ и позволяют исследователям задавать конкретные вопросы о патофизиологии и терапии.В этой главе мы выделим исследования на животных, посвященные остеомиелиту, связанному с имплантатом S. aureus , чтобы дать клиницистам и фундаментальным ученым представление о современных моделях на животных, направленных на лечение наиболее распространенных форм остеомиелита, встречающихся в клинической практике.

Надежда на вакцинацию против инфекции Staphylococcus areus?

Золотистый стафилококк (S.aureus) входит в число наиболее важных причин инфекций у людей в мире и считается опасным больничным патогеном. Активная и пассивная иммунизация против мультирезистентных штаммов рассматривается как потенциально ценная альтернатива антибактериальной терапии. Однако до сих пор все вакцины-кандидаты оказались безуспешными. С помощью иммунизации на основе эпитопов ученые из больницы Кельнского университета и Немецкого центра исследований инфекций (DZIF) описали новую стратегию вакцинации против S.aureus в журнале Nature Partner npj Vaccines .

S. aureus вызывает опасные для жизни состояния, такие как инфекции глубоких ран, сепсис, эндокардит, пневмония или остеомиелит. Более того, повышение устойчивости к антибиотикам, например, в случае устойчивого к метициллину S. aureus (MRSA), ставит перед медициной новые задачи. В прошлом многочисленные вакцины против S.aureus были разработаны, но все без исключения оказались безуспешными на стадиях клинических испытаний. «Для будущего развития вакцин это означает, что традиционные подходы к разработке вакцин должны быть качественно изменены, чтобы добиться прорыва в создании эффективной вакцины против S. aureus», — поясняет профессор д-р Мартин Кренке, директор института. по медицинской микробиологии, иммунологии и гигиене в больнице Кельнского университета.

После десятилетий исследований кельнские ученые опубликовали новую многообещающую стратегию вакцинации против S.aureus. Первоначально охарактеризовав несколько антигенов S. aureus как потенциальных кандидатов в вакцины, они пошли еще дальше. С помощью моноклональных антител, которые продемонстрировали защитный эффект на модели инфекции, доктор Александр Климка, первый автор исследования и глава рабочей группы DZIF, смог установить точное местоположение их сайтов связывания, известных как эпитопы. , в вакцинационных антигенах.

«Для белковой копропорфииноген-оксидазы S. aureus (CgoX) мы смогли сузить эпитоп до участка, состоящего из 12 аминокислот», — объясняет Клима.«Что делает эту работу особенной, так это то, что с помощью этой чрезвычайно маленькой части CgoX стало возможным вызвать защитный иммунный ответ против инфекции S. aureus. Сужение вакцины до небольшого эпитопа из 12 аминокислот составляет беспрецедентную точность вакцины кандидат против S. aureus «.

Особенно обнадеживает наблюдение, что более 97 процентов из более чем 35 000 исследованных клинических штаммов S. aureus имеют этот эпитоп в неизменном виде, и, таким образом, вакцина-кандидат будет иметь широкий эффект.«Иммунизация, ориентированная на эпитопы, представляет собой новое качество в разработке вакцин, поскольку можно ожидать гораздо меньше неблагоприятных иммунных реакций, чем тех, которые иногда наблюдаются при использовании общих белков или даже инактивированных патогенов», — заключает профессор Кренке.

Предоставлено Немецкий центр инфекционных исследований

Ссылка : Надеетесь на прививку от инфекции Staphylococcus areus? (2021, 21 января) получено 26 апреля 2021 г. из https: // medicalxpress.ru / news / 2021-01-вакцинация-стафилококк-areus-инфекции.html

Этот документ защищен авторским правом. За исключением честных сделок с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в информационных целях.

Использование противогрибкового иммунитета для реализации стратегии вакцины против Staphylococcus aureus

Abstract

Staphylococcus aureus ( S . aureus ) является одной из наиболее распространенных бактериальных инфекций во всем мире, а также устойчивыми к антибиотикам штаммами, такими как Methicillin-Resistant S . aureus (MRSA) представляют собой серьезную угрозу и бремя для общественного здравоохранения. MRSA заражает не только пациентов с ослабленным иммунитетом, но и здоровых людей, и быстро распространился из медицинских учреждений во внешнее сообщество. Однако все вакцины, испытанные в клинических испытаниях на сегодняшний день, не дали результатов. Лица с ослабленным иммунитетом, такие как пациенты с ВИЧ или пониженным уровнем CD4 ⁺ Т-клеток, очень чувствительны к S . aureus инфекций, и они также подвержены повышенному риску развития грибковых инфекций. Поэтому мы задались вопросом, может ли стимуляция противогрибкового иммунитета способствовать типу иммунных ответов, необходимых для эффективной защиты хозяина от S . золотистый . Здесь мы показываем вакцинацию мышей грибковой β-глюкановой частицей (GP), загруженной S . aureus обеспечивает защитный иммунитет к S . золотистый . Мы генерировали частицы глюкана, загруженные четырьмя S . aureus белков ClfA, IsdA, MntC и SdrE, создавая вакцину 4X-SA-GP. Вакцинация мышей тремя дозами 4X-SA-GP способствовала защите в системной модели S . aureus инфекция со значительным снижением бактериальной нагрузки в селезенке и почках. Вакцинация 4X-SA-GP индуцировала антиген-специфические Th2 и Th27 CD4 ⁺ Т-клетки и ответы антител и обеспечивала долгосрочную защиту. Эта работа предполагает, что система вакцины GP имеет потенциал в качестве нового подхода к разработке вакцин для S . золотистый .

Информация об авторе

Staphylococcus aureus ( S . aureus ) является серьезным бременем для общественного здравоохранения, поскольку является основной причиной устойчивых к антибиотикам инфекций во всем мире. Вакцины нацелены на S . aureus потерпели неудачу в клинических испытаниях, и причина этого отсутствия успеха остается неясной. Поскольку этот патоген продолжает быстро распространяться в глобальном масштабе, жизненно важно использовать новые подходы к S . aureus вакцинация. В этом исследовании мы показываем, что активация противогрибкового иммунитета с помощью вакцины с β-глюкановыми частицами может быть использована для прямой защиты от S . aureus системные инфекции у мышей. Эта работа расширяет возможности использования системы вакцины с частицами β-глюкана для потенциального использования в качестве столь необходимой вакцины, нацеленной на S . золотистый .

Образец цитирования: Патерсон MJ, Caldera J, Nguyen C, Sharma P, Castro AM, Kolar SL, et al.(2020) Использование противогрибкового иммунитета для реализации стратегии вакцины Staphylococcus aureus . PLoS Pathog 16 (8): e1008733. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733

Редактор: Майри К. Новерр, Медицинский факультет Тулейнского университета, США

Поступила: 8 ноября 2019 г .; Одобрена: 22 июня 2020 г .; Опубликовано: 20 августа 2020 г.

Авторские права: © 2020 Paterson et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения (https://www.nih.gov/), грант R01 DK093426 (Д.M.U.) и R01 AI127406 (для D.M.U, G.Y.L. и G.A.M.). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Staphylococcus aureus является одновременно комменсалом человека и грозным условно-патогенным микроорганизмом. В качестве комменсала S . aureus можно найти в таких местах, как передняя ноздри, горло, кожа и желудочно-кишечный тракт [1–3].Подсчитано, что от 20 до 40% людей в общей популяции колонизированы S . aureus в слизистой оболочке носа [2, 4]. Как условно-патогенный микроорганизм S . aureus может вызывать ряд заболеваний, включая инфекции кожи и мягких тканей (SSTI), эндокардит, сепсис, пневмонию, остеомиелит, бактериемию и абсцессы в тканях органов [5]. Причем S . aureus Смертность от бактериемии остается на высоком уровне 15–50%, несмотря на использование новых антибиотиков и упор на эпиднадзор и профилактику [6].Устойчивые к антибиотикам штаммы S . aureus становится все более распространенным, из них наиболее распространен метициллин-устойчивый S . aureus (MRSA), появляющееся в больницах и сообществах по всему миру. Эти штаммы заражают как здоровых людей, так и пациентов с ослабленным иммунитетом [1].

В отличие от многих бактериальных инфекций, S . aureus обычно не способствует устойчивым защитным иммунным ответам, и люди обычно не защищены от последующих S . aureus инфекций [7]. Следовательно, разработка вакцины нацелена на S . aureus — насущная и важная потребность общественного здравоохранения. К сожалению, вакцины, испытанные в клинических испытаниях, пока не доказали свою эффективность в обеспечении защиты [8–11]. Эти вакцины были направлены в первую очередь на выработку ответов антител и их неудач, а также на наблюдение, что пациенты с дефектами гуморального иммунитета, как правило, не проявляют повышенной чувствительности к S . aureus [12, 13], предполагают, что клеточный иммунитет (CMI) может быть более важным, чем предполагалось ранее, для защиты, индуцированной вакциной [7, 14].

Лица с дефектами CMI, такими как ВИЧ, недостаточная продукция IFNγ или лечение высокими уровнями глюкокортикоидов, испытывают больше S . aureus инфекций [7]. Пациенты с мутацией STAT3, которая вызывает синдром гипер-IgE (Джобса), имеют дисфункциональные или отсутствующие Т-хелперные (Th) 17 клетки, и они очень чувствительны к S . aureus инфекций [15, 16]. Из-за участия клеток Th27 в активации и рекрутировании нейтрофилов неудивительно, что пациенты с нейтрофильными расстройствами подвергаются большему риску инфицирования S . aureus [7]. Интересно, что многие иммунные дефекты, предрасполагающие людей к S . aureus также предрасполагают к грибковым инфекциям. Пациенты с ВИЧ более восприимчивы к грибковым инфекциям, особенно хроническому кандидозу кожно-слизистых оболочек (ККМ) [17].Кроме того, пациенты с дефицитом STAT3 и синдромом гипер-IgE часто испытывают CMC наряду с тяжелым S . aureus инфекций.

Th2 и Th27, как было показано, особенно важны для противогрибковых реакций на животных моделях и у людей [18–20]. Подмножества Т-клеток Th2 и Th27 участвуют в стимулировании активации фагоцитов и рекрутирования нейтрофилов посредством секреции цитокинов IFNγ и IL-17, и они также имеют решающее значение для очистки S . aureus инфекций [21]. Однако неспособность этих ответов вызвать долговременный иммунитет предполагает, что активация других врожденных ответов может быть необходима для стимулирования ответов Th2 и Th27 во время S . aureus инфекция. Противогрибковый иммунитет может быть использован для активации таких реакций.

Рецепторы распознавания врожденных образов (PRR), которые распознают молекулярные паттерны, ассоциированные с патогенами (PAMP), отвечают за начальное восприятие патогенов и адаптируют воспалительные иммунные ответы к прямым последующим адаптивным ответам [22].Одним из таких PAMP является β-глюкан, который состоит из углеводных полимеров (β (1 → 3) — и β (1 → 6) -связанных), которые в большом количестве обнаруживаются в стенках большинства грибковых клеток [23]. β-глюканы распознаются преимущественно PRR Dectin-1 [24], а также рецептором комплемента 3 (CR3) посредством активации альтернативного пути комплемента [24, 25]. Частицы β-глюкана (GP) были исследованы как потенциально новая платформа для доставки вакцины [25–30]. Частицы β-глюкана, полученные из дрожжей Saccharomyces cerevisiae , могут действовать как адъювант, стимулируя Dectin-1 и CR3.Полая структура GP позволяет загружать их полезными грузами, такими как белки или пептидные антигены, ДНК, миРНК, наночастицы или другие небольшие молекулы для различных целей, включая разработку вакцины [27]. Нагруженные антигеном частицы глюкана в конечном итоге способствуют созреванию антигенпрезентирующих клеток (APC) и инициированию адаптивных иммунных ответов с образованием антител и поляризацией Т-клеток CD4 ⁺ на субпопуляции Th2 и Th27 [26, 29, 31–37].

Учитывая связь между пациентами со специфическими иммунными дефектами и повышенным риском грибковых заболеваний, и S . aureus , мы предположили, что вакцина из глюкановых частиц может обеспечить защитный иммунитет к S . aureus путем активации противогрибкового иммунитета через частицу β-глюкана при доставке S . aureus антигенов. Здесь мы демонстрируем, что иммунизация мышей GP + S . Вакцина с антигеном aureus защищает мышей от системной инфекции S . золотистый . Множественные типы иммунных клеток, включая дендритные клетки, фагоцитируют вакцину in vivo в брюшной полости, и эти профессиональные антигенпрезентирующие клетки жизненно важны для стимуляции сильных адаптивных Т-клеточных ответов [38].Более того, эта вакцинация способствует поляризации антиген-специфических CD4 ⁺ Т-клеток к субпопуляциям Th2 и Th27 и продукции антиген-специфических антител, что согласуется с предыдущими исследованиями с использованием нагруженных овальбумином терапевтов [26, 29]. Хотя антитела, продуцируемые в ответ на вакцину, могут обеспечивать некоторую умеренную защиту от инфекции, мы определили, что в нашей модели инфекции Т-клетки CD4 ⁺ имеют решающее значение для защиты, индуцированной вакциной. Наконец, GP + S . aureus антигенная вакцина вызвала долгосрочную защиту, так как у мышей снизилась бактериальная нагрузка в селезенке и почках, а также выявленные уровни антител через восемь недель после иммунизации.

Результаты

Идеальное количество антигенов, которые должны быть включены в S . Вакцина aureus до сих пор остается предметом дискуссий [7, 14, 39, 40]. Многие исследователи отдают предпочтение мультиантигенной вакцине, считая, что этот подход может обеспечить нацеливание на несколько S . aureus факторов вирулентности и механизмов выживания, которые могут быть эффективными для остановки бактерий на разных стадиях и участках инфекции [7]. Таким образом, мы решили оценить мультиантигенную вакцину GP. Лаборатория Schneewind ранее проверила антигенность поверхностных белков, консервативных в восьми различных S . aureus и идентифицировали антигены, обеспечивающие лучшую защиту [41]. Среди этих антигенов были фактор слипания поверхностных белков A (ClfA), регулируемый железом поверхностный детерминантный белок A (IsdA) и белок E, содержащий серин-аспартатный повтор (SdrE).Каждый из этих антигенов также использовался другими в различных мышах S . aureus исследования вакцинации, обеспечивающие защиту от летального в / в. заражение, образование абсцесса, артрит и некротическая раневая инфекция ([41–45]). Кроме того, многие другие группы продемонстрировали важность другого поверхностного белка, транспортного белка С марганца (MntC), в S . aureus вирулентность и эффективность включения ее в вакцины для индукции защиты [9, 46, 47].Как обсуждается ниже, несколько из этих антигенов прошли клинические испытания на людях. В совокупности данные предполагают, что это широко приемлемые антигенные мишени.

Мы рекомбинантно получили и очистили ClfA, IsdA, MntC и SdrE и загрузили их в наших терапевтов для создания «4X-SA-GP» для оценки как нового S . Вакцина aureus для мышей (S1 фиг.). Для некоторых экспериментов четыре рекомбинантных белка были помечены флуоресцентным зондом флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и затем включены в GP для создания «FITC-4X-SA-GP».

4X-SA-GP ведут себя аналогично ГП, нагруженным OVA, эффективно фагоцитируются дендритными клетками и способствуют созреванию дендритных клеток и выработке провоспалительных цитокинов

Для тестирования загруженных антигеном частиц глюкана (GP) в контексте S . aureus , мы сначала проверили стратегию вакцинации GP с использованием терапевтов, нагруженных овальбумином (GP-OVA), как ранее было создано и описано группами Левитца и Остроффа [25, 26, 29].GP обладают иммуностимулирующими свойствами в качестве адъюванта, а также могут действовать как система доставки антигена [27, 48–50]. Мы использовали анализ совместного культивирования, чтобы подтвердить, что антиген, который мы инкапсулировали в GP, может обрабатываться и представляться APC Т-клеткам CD4 ⁺ (S2, фиг.). Дендритные клетки, полученные из костного мозга мыши (BMDC), кормили терапевтами, нагруженными различными концентрациями OVA, и затем BMDC совместно культивировали с наивными OT-II CD4 ⁺ Т-клетками, которые распознают пептид OVA в контексте MHC-II. .Если антиген OVA съедается, процессируется и представляется Т-клеткам OTII как пептид OVA посредством BMDC, Т-клетки должны активироваться своим родственным антигеном, пролиферировать и поляризоваться на специфические подмножества Т-клеток в зависимости от среды цитокинов. Оценка продукции цитокинов Т-клетками OT-II с помощью проточной цитометрии показала, что клетки продуцировали IL-17 и IFNγ, причем увеличение продукции IL-17 соответствовало увеличению концентрации OVA в GP (S2A, S2C и S2D фиг.). Эти результаты также наблюдались в супернатантах совместного культивирования (S2F и S2G фиг.).Более того, GPs без антигена внутри (GP-No OVA) не вызывают пролиферации Т-клеток OT-II, в то время как GPs, инкапсулированные с OVA (0,5 мкг, 5 мкг, 50 мкг), способствуют устойчивой пролиферации OT-II, что определяется разведением CFSE ( S2B и S2E Рис.). Эти результаты подтверждают, что мы смогли успешно создать антиген-нагруженные GP, подобные тем, которые были описаны ранее [29, 51], и что эти частицы работали как система доставки антигена, управляя пролиферацией и производством цитокинов OT-II CD4 ⁺ Т-клеток.Более того, система GP-OVA специфически поляризует наивные Т-клетки OT-II на подмножества Th2 и Th27, которые являются подмножествами, наиболее необходимыми для создания защиты от S . aureus инфекция [21].

Чтобы установить, что GPs эффективно фагоцитируются, мы скармливали BMDC FITC-4X-SA-GP в течение 6 и 24 часов и анализировали их с помощью проточной цитометрии (рис. 1A). BMDC эффективно фагоцитировали частицы, причем более 66% BMDC составляли FITC ⁺ через 6 часов и более 70% через 24 часа после стимуляции.4X-SA-GP также индуцировал созревание BMDC, что видно по позитивной регуляции поверхностных MHC-II и CD86 (рис. 1B и 1C). Уровни экспрессии этих маркеров созревания были сопоставимы с уровнями, наблюдаемыми в BMDC, стимулированных GP-OVA и LPS. Кроме того, стимуляция BMDC дикого типа с помощью 4X-SA-GP приводила к продукции IL-6 (рис. 1D) и TNF-α (рис. 1E), в то время как стимуляция BMDC с нокаутом Dectin-1 приводила к значительному снижению продукции эти цитокины (рис. 1D и 1E). В отсутствие сыворотки и, следовательно, комплемента в этой системе in vitro , Dectin-1 является первичным рецептором для этих GPs [25].Возможно, что антигены (или совместно очищающие бактериальные продукты) в GP могут восприниматься другими PPR, что приводит к детектируемой продукции цитокинов клетками, нокаутированными по Dectin-1.

Рис. 1. 4X-SA-GP эффективно фагоцитируются дендритными клетками и способствуют созреванию дендритных клеток и продукции провоспалительных цитокинов in vitro .

(А). Типичные гистограммы проточной цитометрии, показывающие процентное содержание дендритных клеток (BMDC), полученных из костного мозга FITC ⁺ , после стимуляции меченным FITC 4X-SA-GP в течение 6 и 24 часов.Проценты и стандартное отклонение представляют 2 повтора / стимула. Анализ проточной цитометрии поверхностного MHC-II (B) и CD86 (C) на BMDC, стимулированных в течение 24 часов LPS, GP-OVA и 4X-SA-GP. Данные количественно оцениваются как средняя интенсивность флуоресценции (MFI) для каждого маркера. (D) BMDC дикого типа и (E) нокаут по дектину-1 (Dectin-1 KO) стимулировали 4X-SA-GP, и супернатанты собирали через 24 часа для определения цитокинов с помощью ELISA. Проценты и стандартное отклонение представляют 2 повтора / стимул (A-C) и 3 повтора / стимул (D-E).Анализ данных выполняли с использованием дисперсионного анализа для (B) и (C) и критерия Стьюдента для (D) и (E). *** р <0,0005; нс, не имеет значения. Данные представляют два эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.g001

Характеристика распределения 4X-SA-GP

Чтобы определить, какие субпопуляции иммунных клеток фагоцитируют 4X-SA-GP in vivo , мы вводили мышам однократную внутрибрюшинную инъекцию (т.е.п.) в дозе 5х10 ⁷ FITC-4X-SA-GP или немеченый 4X-SA-GP в качестве контроля. Мы собрали клетки перитонеальным лаважем через 24, 48 и 72 часа после инъекции и проанализировали иммунные клетки FITC ⁺ с помощью проточной цитометрии (рис. 2). Процент клеток FITC ⁺ в общей брюшной полости варьировался от в среднем более 7,5% через 24 часа до почти 9% через 48 часов, а затем упал до чуть более 4% через 72 часа после инъекции (рис. 2A. и 2Б). Анализ иммунных субпопуляций, которые были FITC ⁺ , показал, что миелоидные ДК, нейтрофилы, воспалительные моноциты, макрофаги F4 / 80 ⁺ , лимфоидные ДК и В-клетки все съедали частицы, которые были введены в брюшную полость (рис. 2C – 2H). ).

Рис. 2. Множественные субпопуляции иммунных клеток фагоцитируют 4X-SA-GP in vivo .

(A) Типичные графики проточной цитометрии и стратегия стробирования клеток FITC ⁺ из брюшной полости мышей, которым внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) инъецировали 4X-SA-GP (левый график) и меченный FITC 4X-SA-GP (справа участок) через 24 часа после инъекции. (B) Процент клеток FITC ⁺ в брюшной полости мышей, которым вводили i.p. инъекция 4X-SA-GP или меченного FITC 4X-SA-GP через 24, 48 и 72 часа после инъекции.Каждая точка данных представляет отдельную мышь (n = 1 для 4X-SA-GP на момент времени и n = 5 для FITC-4X-SA-GP на момент времени). (CE) Гистограммы проточной цитометрии показывают частоту указанных подмножеств иммунных клеток, которые являются клетками FITC ⁺ , что свидетельствует о фагоцитозе меченного FITC 4X-SA-GP через 24 часа (C), 48 часов (D) и 72 часа (E) после IP инжекция частиц. (FH) Гистограммы проточной цитометрии показывают количество подмножеств иммунных клеток из (CE), которые соответствуют FITC ⁺ в указанные моменты времени, 24 часа (F), 48 часов (G) и 72 часа (H) после инъекция изолирована из брюшной полости.Каждая точка данных представляет собой проценты или общие числа от отдельной мыши. Данные в процентах являются репрезентативными для двух экспериментов, а данные общего числа — для одного эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.g002

Первоначально, через 24 часа после инъекции, миелоидные ДК, воспалительные моноциты и макрофаги F4 / 80 ⁺ были основными типами клеток, фагоцитирующими 4X -SA-GPs на основе положительности FITC (рис. 2C и 2F). Через 48 часов макрофаги F4 / 80 ⁺ были основными клетками, которые были FITC ⁺ , за которыми следовали миелоидные DC; процент воспалительных моноцитов FITC ⁺ существенно снизился (рис. 2D и 2G).Интересно, что в этот момент общее количество и процент В-клеток FITC ⁺ увеличились (рис. 2D и 2G). Сообщалось, что В-клетки брюшной полости мыши (В-1-В-клетки) обладают антимикробными свойствами и способны фагоцитировать антиген в виде частиц и представлять антиген Т-клеткам CD4 ⁺ [52]. Этот тип мышиных В-клеток экспрессирует CR3 [53], что позволяет предположить, что эти В-клетки распознают и поглощают вакцину 4X-SA-GP. Через 72 часа макрофаги F4 / 80 ⁺ оставались доминирующим типом клеток FITC ⁺ , за которыми следовали миелоидные DC и B-клетки (рис. 2E и 2H).

4X-SA-GP индуцирует защиту от

Мы протестировали наш S . aureus вакцина in vivo с использованием модели системной инфекции, индуцированной S . aureus перитонеальная проба. Мы вакцинировали самок мышей дикого типа однократной дозой 5 × 10 ⁷ 4X-SA-GP (внутрибрюшинно) с последующим четырехнедельным периодом покоя (рис. 3А). Контрольных животных «вакцинировали» PBS или пустыми GP.Затем мы проверили все три группы вакцинированных мышей с S . aureus (USA300) от i.p. инъекция 2х10 ⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ), и мы измерили бактериальную нагрузку в селезенке и почках через 24 часа. У мышей, вакцинированных 4X-SA-GP, значительно снизилась бактериальная нагрузка в селезенке по сравнению с мышами, вакцинированными контрольным носителем (фиг. 3B). Бактериальная нагрузка также была уменьшена в почках мышей, иммунизированных 4X-SA-GP, по сравнению с контрольными мышами PBS (фиг. 3C).Хотя это несущественно, у мышей, которым вводили вакцину пустым GP, по-видимому, были снижены КОЕ в селезенке и почках по сравнению с контрольными мышами PBS (фиг. 3B и 3C). Это может быть связано с адъювантным действием врачей общей практики, приводящим к воспалению, которое все еще присутствует в брюшной полости во время инфекции. С другой стороны, эта защита может быть результатом тренированного иммунитета [54–56].

Рис. 3. Мыши, иммунизированные 4X-SA-GP, имеют повышенную защиту от S . aureus инфекция.

(A) Экспериментальный график 1 вакцинации и S . Модель заражения aureus . (B и C) Самок мышей дикого типа (n = 5 на группу иммунизации: PBS, Empty-GP, 4X-SA-GP) инфицировали i.p. с 2×10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300) через 4 недели после одной вакцинации. Бактерии из селезенки (B) и почек (C) были выделены через 24 часа, и были подсчитаны КОЕ. (D) Экспериментальный график 3 прививок и S .Модель заражения aureus . (E и F) Самок мышей дикого типа (n = 10 на группу иммунизации: PBS, Empty-GP, 4X-SA-GP) инфицировали i.p. с 2×10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300) через 4 недели после третьей и последней вакцинации. Бактерии из селезенки (E) и почек (F) были выделены через 24 часа, и были подсчитаны КОЕ. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь. Анализ данных проводился с использованием теста Краскела-Уоллиса ((B) = 0,02, (C) = 0.14, (E) = 0,003, (F) = 0,001) и U-критерий Манна-Уитни. ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0005; нс, не имеет значения. Данные в (B) и (C) представляют два эксперимента, данные в (E) и (F) представляют три эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.g003

Затем мы исследовали эффекты увеличения графика вакцинации до трех полных прививок (рис. 3D). Этот подход был предложен для обеспечения наилучшего адаптивного ответа памяти в исследованиях на мышах, характеризующих систему частиц глюкана, нагруженную OVA [29].Мы вакцинировали (внутрибрюшинно) самок мышей дикого типа один раз в неделю в течение трех недель. Через четыре недели после последней вакцинации мы заражали мышей (внутрибрюшинно) S . aureus и проанализировали бактериальную нагрузку в селезенке и почках через 24 часа (рис. 3D). У мышей, вакцинированных 4X-SA-GP, значительно снизилась бактериальная нагрузка в селезенке и почках по сравнению с мышами, получившими контрольную вакцинацию PBS (рис. 3E и 3F). В то время как средние значения КОЕ у мышей, вакцинированных 4X-SA-GP, имели тенденцию к снижению, чем у мышей, вакцинированных пустым GP, в селезенке и почках, они существенно не различались (рис. 3E и 3F).Фактически, вакцинация пустым GP привела к снижению бактериальной нагрузки на почки, которая была значительно ниже, чем у контрольной группы PBS (рис. 3F). Эти результаты еще раз указывают на адъювантное качество самих частиц глюкана и, возможно, на непродолжительный, неантиген-специфический защитный воспалительный иммунитет.

4X-SA-GP способствует антиген-специфическим Th2 и Th27 CD4

Чтобы определить, способствовали ли три вакцинации адаптивным иммунным ответам, мы оценили антиген-специфические Т-клеточные ответы (рис. 4).Мы вакцинировали мышей в течение трех недель, а через пять дней после последней вакцинации мы выделили клетки из селезенки и стимулировали их смесью четырех очищенных рекомбинантных S . aureus белков или с убитыми нагреванием S . aureus (HK-SA). Мы собрали супернатанты после трех дней культивирования для анализа с помощью ELISA, и мы повторно стимулировали клетки с помощью PMA и иономицина для анализа путем окрашивания внутриклеточных цитокинов на IFNγ и IL-17. Проточная цитометрия выявила значительное увеличение частоты Т-клеток IL-17 ⁺ CD4 ⁺ из селезенки мышей, вакцинированных 4X-SA-GP, при стимуляции смесью белков и HK-SA по сравнению с CD4 ⁺ Т-клеток мышей, вакцинированных пустыми GP или контролем PBS (фиг. 4A и 4B).Мы подтвердили повышенную продукцию IL-17 из культуры спленоцитов мышей, вакцинированных 4X-SA-GP, после стимуляции белками с помощью ELISA, наблюдая, что уровни секретируемого IL-17 были значительно выше по сравнению с мышами, иммунизированными пустыми GP или мышами. PBS контроль (рис. 4C). Стимуляция HK-SA способствовала повышению уровня IL-17 у некоторых вакцинированных мышей, хотя и не достигла значимости (рис. 4C).

Рис. 4. 4X-SA-GP способствует антиген-специфическим Th2 и Th27 CD4 ⁺ Т-клеточным ответам у мышей после трех иммунизаций.

(A-E) Самок мышей дикого типа иммунизировали один раз в неделю в течение 3 недель PBS (n = 5), Empty-GP (n = 5) или 4X-SA-GP (n = 5). Через пять дней после последней вакцинации спленоциты каждой мыши стимулировали смесью всех 4 S . aureus очищенные рекомбинантные белки (белки) и убитые нагреванием S . aureus (HK-SA). Через 3 дня спленоциты стимулировали ацетатом форболмиристата (PMA) и иономицином, а затем анализировали проточной цитометрией после окрашивания внутриклеточных цитокинов.Типичные графики проточной цитометрии демонстрируют степень продукции IFNγ и IL-17 Т-клетками CD4 ⁺ (с синхронизацией по TCRβ ⁺ CD4 ⁺ ) в ответ на стимулы (белки, HK-SA) от селезенки (A ). Гистограммы показывают частоту цитокин-положительных клеток IL-17 (B) и IFNγ (D) в селезенке мышей. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь на всех гистограммах. (C и E) Супернатанты собирали на 3 день после стимуляции спленоцитов, и цитокины IL-17 (C) и IFNγ (E) определяли с помощью ELISA.Данные представляют два эксперимента. Анализ данных проводился с использованием ANOVA. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.g004

Анализ Т-клеток CD4 ⁺ из каждой группы с помощью проточной цитометрии выявил повышенную частоту IFNγ ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток в культурах спленоцитов мышей, вакцинированных 4X-SA-GP, при стимуляции четырьмя S . aureus рекомбинантных белков, которые были значимыми относительно частоты IFNγ ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток от мышей, вакцинированных пустым GP, и контрольных мышей с PBS (фиг. 4A и 4D). Уровни IFNγ в супернатантах спленоцитов также были повышены в культурах мышей, вакцинированных 4X-SA-GP, по сравнению с культурами двух других групп вакцинации при стимуляции белками (фиг. 4E). В конечном итоге этот анализ продемонстрировал, что иммунизация мышей трехкратной вакциной 4X-SA-GP способствовала антиген-специфическим Th2 и Th27 CD4 ⁺ Т-клеточным ответам, которые не наблюдались в группе вакцинации с пустым GP (или контрольной группе PBS. ).Для сравнения, вакцинация однократной дозой 4X-SA-GP также индуцировала антиген-специфические CD4 + Т-клеточные ответы, хотя ответы Th27 были не такими сильными (S3 фиг.).

Чтобы дополнительно охарактеризовать адаптивный ответ, вызванный тремя вакцинациями 4X-SA-GP, мы исследовали продукцию антиген-специфических антител, в частности подклассов IgG IgG1 и IgG2c. В-клеткам часто требуется помощь Т-лимфоцитов CD4 ⁺ , чтобы обеспечить переключение изотипа, созревание аффинности и память [57], и поэтому изучение продукции антиген-специфических антител также может дать некоторое понимание ответа Т-клеток CD4 ⁺ . вызвано вакцинацией.Мы обнаружили высокие уровни антител IgG1 (фиг. 5A) и IgG2c (фиг. 5B) против рекомбинантного (r) ClfA, rIsdA, rMntC и rSdrE в сыворотке всех мышей, вакцинированных 4X-SA-GP. Все три разведения сыворотки, проверенные на антитела против каждого белка, были значительно повышены по сравнению с сывороткой, протестированной от мышей, вакцинированных PBS или пустым GP (рис. 5A и 5B). Эти ответы резко контрастируют с относительно низкими уровнями антител, присутствующими у мышей, вакцинированных только одной дозой 4X-SA-GP (S4A и S4B фиг.).

Рис. 5. Три иммунизации мышей 4X-SA-GP вызывают устойчивые ответы антител.

(A и B) Сыворотку собирали у каждой группы вакцинированных мышей через 2 недели после третьей и последней иммунизации PBS, Empty-GP или 4X-SA-GP (n = 10 мышей на группу). Сыворотку разводили 10X 3 раза, начиная с 1: 1000, а затем тестировали на антитела, специфичные для каждого из 4 S . aureus белков, инкапсулированных в 4X-SA-GP с помощью ELISA. Подклассы IgG1 (A) и IgG2c (B) анализировали на специфичность в отношении rClfA, rIsdA, rMntC и rSdrE.Результатом анализа является оптическая плотность (OD) при 450 нм для каждого образца сыворотки. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь. Данные являются репрезентативными для трех экспериментов и были проанализированы с использованием ANOVA для каждого разведения. **** p <0,0001.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.g005

Мы также напрямую сравнили продукцию антител, индуцированную 4X-SA-GP, с антителами, продуцируемыми, когда широко применяемые квасцы, стимулирующие антитела, ) был использован.Мышей иммунизировали три раза, как указано выше, и дополнительную когорту мышей иммунизировали тем же путем и по той же схеме с соответствующими количествами четырех S . aureus антигенов в смеси с квасцами. Вакцина 4X-SA-GP индуцировала антитела сравнительно, если не лучше, чем подход с адъювантом квасцов (рис. 6). Взятые вместе, данные показывают, что трехкратная вакцинация мышей 4X-SA-GP способствует защите мышей от S . aureus и вызывает сильные антиген-специфические CD4 ⁺ Т-клетки и ответы антител.

Рис. 6. Реакции антител, индуцированные 4X-SA-GP, аналогичны тем, которые индуцируются обычным адъювантом квасцами.

Самок мышей дикого типа иммунизировали один раз в неделю в течение 3 недель с помощью PBS (n = 10), Empty-GP (n = 10), 4X-SA-GP (n = 9) или такого же количества S . . aureus антигенов в смеси с квасцами (n = 9). Сыворотку собирали у каждой группы через 2 недели после третьей и последней иммунизации. Сыворотку разводили 10X 3 раза, начиная с 1: 1000, а затем тестировали на общие антитела IgG, специфичные для каждого из 4 S . aureus белков включены в вакцину с помощью ELISA. Результатом анализа является оптическая плотность (OD) при 450 нм для каждого образца сыворотки. Данные являются репрезентативными для трех экспериментов и были проанализированы с использованием ANOVA и t-критерия для каждого разведения. ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001; нс, не имеет значения.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.g006

Перенесенные антитела не вызывают защиты, и Т-клетки CD4

Успешный S .Вакцина aureus , скорее всего, должна вызывать как антитела, так и Т-клеточные ответы CD4 ⁺ [7, 14]. Чтобы проверить, достаточно ли антител, продуцируемых в ответ на 4X-SA-GP, для обеспечения защиты самостоятельно, мы выполнили перенос сыворотки. Мы собрали сыворотку у мышей, вакцинированных 4X-SA-GP, пустыми-GP или PBS, и перенесли сыворотку на наивных мышей-реципиентов через i.p. инъекция. На следующий день мы заразили мышей-реципиентов S . aureus и оценивали КОЕ селезенки и почек через 24 часа.Не было различий в количестве бактерий в селезенке (фиг. 7A) или почках (фиг. 7B) мышей, получавших сыворотку 4X-SA-GP, по сравнению с мышами, получавшими сыворотку PBS или пустую сыворотку GP. Мыши, которым вводили сыворотку 4X-SA-GP, имели более низкие средние значения количества КОЕ в селезенке и почках (рис. 7A и 7B) по сравнению с группами сыворотки PBS и пустой GP, что позволяет предположить, что антиген-специфические антитела из 4X-SA -GP-сыворотка может иметь умеренный защитный эффект, но недостаточный, чтобы формально обеспечить значительную защиту.

Рис. 7. Одних антител недостаточно для обеспечения индуцированной 4X-SA-GP защиты от системного S . aureus , тогда как Т-клетки CD4 ⁺ незаменимы.

(A и B) Самок мышей дикого типа иммунизировали один раз в неделю в течение 3 недель PBS, Empty-GP или 4X-SA-GP, и сыворотку собирали у каждой группы мышей через 2 недели после последней вакцинации. Сыворотку от каждой группы мышей собирали и вводили внутрибрюшинно. самкам мышей-реципиентов дикого типа (n = 5 мышей / группа, сыворотка PBS, сыворотка Empty-GP, сыворотка 4X-SA-GP).Мыши-реципиенты были инфицированы i.p. с 2×10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300) на следующий день. Бактерии из селезенки (A) и почек (B) были выделены через 24 часа, и были подсчитаны КОЕ. (C и D) Самок мышей дикого типа иммунизировали один раз в неделю в течение 3 недель PBS (n = 9), Empty-GP (n = 10) или 4X-SA-GP (n = 10). Через четыре недели после последней вакцинации 4–5 мышей в каждой вакцинированной группе лечили внутрибрюшинно. с антителом против CD4 ⁺ или соответствующим антителом изотипического контроля в день -1 и день 0.В день 0 все группы мышей были инфицированы i.p. с 2×10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300). Бактерии из селезенки (C) и почек (D) были извлечены через 24 часа после S . Было подсчитано aureus и КОЕ. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь. Данные переноса сыворотки представляют два эксперимента. Данные об истощении Т-лимфоцитов CD4 ⁺ взяты из единственного эксперимента. Анализ данных проводился с использованием теста Краскела-Уоллиса ((A) = 0.18, (B) = 0,46, (C) = 0,0,02, (D) = 0,05) и U-критерий Манна-Уитни. * р <0,05, ** р <0,01; нс, не имеет значения.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.g007

Чтобы оценить роль антиген-специфичных Т-лимфоцитов CD4 ⁺ в индуцированной вакциной защите, мы истощили Т-клетки CD4 ⁺ до заражения. . Вакцинированные мыши из каждой группы (PBS, empty-GP, 4X-SA-GP) получали i.p. инъекция либо антитела против CD4 ⁺ , либо соответствующего контрольного антитела изотипа через четыре недели после вакцинации.Чтобы гарантировать истощение CD4 ⁺ Т-клеток, мы измерили процентное содержание CD4 ⁺ Т-клеток до инфицирования в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC), выделенных из каждой группы мышей, и после инфицирования в MLN с помощью проточной цитометрии (S5 Рисунок). При заражении S . aureus , мы наблюдали, что истощение Т-клеток блокирует защиту, обеспечиваемую вакциной 4X-SA-GP (рис. 7C и 7D).

Мыши защищены от системных

Затем мы попытались установить, может ли защитный иммунитет, индуцированный вакцинацией 4X-SA-GP, обеспечивать защиту после периода времени, превышающего четыре недели.Мы вакцинировали животных трижды, как и раньше, но перед заражением давали им отдых в течение восьми недель. Мыши, вакцинированные 4X-SA-GP, все еще были значительно защищены через 8 недель (фиг. 8). Интересно, что в этот более поздний момент времени защита, обеспечиваемая мышами, вакцинированными пустым GP, по-видимому, полностью исчезла (рис. 8A и 8B). Более того, через восемь недель после последней вакцинации относительные уровни антител подклассов IgG1 и IgG2c, специфичных для каждого белка, были сильными, определяемыми и часто сравнимыми с уровнями, наблюдаемыми в сыворотке крови мышей через две недели после вакцинации (S6A и S6B, фиг.).Эти результаты предполагают, что вакцинация мышей тремя дозами 4X-SA-GP индуцирует длительный защитный иммунитет против S . aureus с антиген-специфическими адаптивными клеточными и гуморальными иммунными ответами.

Рис. 8. Защитный иммунитет от 4X-SA-GP против S . aureus инфекция длится долго.

(A и B) Самок мышей дикого типа иммунизировали один раз в неделю в течение 3 недель PBS (n = 7), Empty-GP (n = 7) или 4X-SA-GP (n = 7).Через восемь недель после последней вакцинации мышей инфицировали i.p. с 2×10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300). Бактерии из селезенки (A) и почек (B) были выделены через 24 часа, и были подсчитаны КОЕ. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь. Анализ данных проводился с использованием теста Краскела-Уоллиса ((A) = 0,0001 (B) = 0,008 и U-критерия Манна-Уитни. ** p <0,01, *** p <0,005; нс, не достоверно. одиночный опыт.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.1008733.g008

Обсуждение

Золотистый стафилококк — наиболее частая причина инфекций в США. Устойчив к антибиотикам S . aureus штаммов, например, устойчивый к метициллину S . aureus (MRSA) быстро распространились по всему миру, заражая как людей с ослабленным иммунитетом, так и здоровых людей, что делает его серьезной угрозой общественному здоровью [8]. Вакцины нацелены на S . aureus потерпели неудачу в клинических испытаниях [9], и причина этого отсутствия успеха остается неизвестной.Поскольку этот патоген продолжает быстро распространяться в глобальном масштабе, жизненно важно использовать новые подходы к S . Появляется вакцина aureus . Наблюдение за условиями, предрасполагающими человека к S . Инфекции aureus часто также предрасполагают к грибковым инфекциям, что говорит о том, что элементы иммунитета эффективны против S . aureus имеют много общего с элементами иммунитета, которые способствуют защите от грибковых инфекций.Поэтому мы предположили, что вакцина основана на активации противогрибковых врожденных иммунных ответов в контексте доставки S . aureus антигенов могут быть продуктивными. В этом исследовании мы разработали и протестировали на мышах вакцину-кандидат, состоящую из грибковых частиц β-глюкана, загруженных четырьмя S . aureus белковых антигенов (4X-SA-GP).

Из четырех S . aureus белковых антигенов, которые мы использовали, ClfA и MntC есть и используются (вместе с капсулярными полисахаридами) в вакцинах, которые прошли клинические испытания.В этом случае вакцина использует нетоксичный мутант перекрестно реагирующего материала 197 дифтерийного токсина (CRM197) в качестве адъюванта, но до сих пор не доказала свою эффективность в предотвращении инфекции. Вакцина вырабатывает антитела к ClfA и MntC, которые могут оказаться эффективными in vitro [58]. Ряд других антигенов также был передан в клинические испытания, но ни один из них пока не доказал свою эффективность [59]. Рабочая гипотеза состоит в том, что успешная вакцина должна вызывать защитный Т-клеточный ответ вместо или в дополнение к ответу антител [60].

Вакцинация мышей 3 дозами 4X-SA-GP вызвала длительные (не менее 8 недель) клеточные и гуморальные антигенспецифические иммунные ответы. Антиген-специфические Т-клеточные ответы были поляризованы в сторону Th2 и Th27, как и следовало ожидать для адъювантной активности β-глюкана, и эти Т-клеточные ответы были важны для индуцированной вакциной защиты от системной инфекции с S . золотистый . Вакцина также вызывала сильные ответы антител IgG1 и IgG2c на S . aureus , хотя неясно, были ли эти ответы антител достаточными для обеспечения защиты от инфекции.

Через четыре недели после завершения вакцинации животные сохраняли некоторую изменчивую неспецифическую повышенную устойчивость к S . aureus , вызванная частицами β-глюкана, не имеющими S . aureus антигенов. Этот иммунитет исчез через 8 недель, но антигенспецифический иммунитет, индуцированный частицами, нагруженными антигеном, сохранился.Следовательно, возможно, что частицы β-глюкана сами по себе вызывают некоторый непродолжительный неантиген-специфический воспалительный иммунитет, благодаря которому клетки врожденного иммунитета проявляют повышенную чувствительность. Будущие исследования могут быть разработаны для характеристики клеточных и молекулярных сигнатур, связанных с этой временной защитой, но антиген-специфические ответы более продолжительны.

Несколько лет назад группа исследователей, работавших над разработкой вакцины Candida albicans , обнаружила, что их вакцина обеспечивает перекрестную защиту от S . aureus [61]. В вакцине используется рекомбинантная Candida агглютинин-подобная последовательность 3 (Als3) адгезин / инвазин в качестве антигена и смешана с квасцами в качестве адъюванта. В то время как вакцина индуцирует хорошую продукцию антител против Als3, которые перекрестно реагируют с S . aureus клеточные стенки, защита на мышиных моделях инфекции требовала опосредованного Т-клетками иммунитета (особенно поляризованных ответов Th2 и Th27), а не В-клеточного иммунитета [62, 63]. Поляризация Т-клеток CD4 ⁺ как к подмножествам Th2, так и к Th27 в ответ на 4X-SA-GP может сделать этот подход более желательным по сравнению с вакцинами, которые поляризуют Т-клетки только на одну основную подгруппу.Клетки Th27, по-видимому, играют основную роль в обеспечении защиты от кожных, респираторных и кожно-слизистых инфекций [64, 65], тогда как клетки Th2 играют защитную роль при инфекции кровотока [62]. Следовательно, дифференцировка CD4 ⁺ Т-клеток в обе эти подгруппы с помощью иммунизации 4X-SA-GP может помочь гарантировать, что при инфекции произойдет эффективный опосредованный Т-клетками ответ ниже по течению. Предыдущие исследования показали, что S . aureus -специфические Т-клетки, которые стимулируют рекрутирование и активацию фагоцитов за счет продукции провоспалительных цитокинов IFNγ и / или IL-17, важны для иммунитета к S . aureus [61, 66].

Платформа вакцины GP ранее исследовалась в основном в контексте разработки противогрибковых вакцин [28, 67] из-за отсутствия эффективных вакцин против грибковых инфекций. Грибы сопротивляются лизису системой комплемента, но отложение iC3b на грибах вызывает опсонизацию и фагоцитоз [68]. Во многих случаях антитела не защищают от грибковых инфекций [69], а некоторые вакцины в настоящее время также сосредоточены на выработке клеточных иммунных ответов [28], учитывая, что Т-клетки играют важную роль в борьбе с грибковыми инфекциями.Исследования, посвященные кандидозу и аспергиллезу, показывают, что ответы Th2 и Th27 более важны, чем образование нейтрализующих антител [70]. Вакцинация мышей глюкановыми частицами, нагруженными щелочными экстрактами, производными Cryptococcus , защищала животных от летального заражения Cryptococcus neoformans и Cryptococcus gattii [28]. Частицы глюкана сами по себе в качестве вакцины также обеспечивали защиту мышей от инфекции Aspergillus fumigatus [67].Таким образом, исследования, оценивающие ВОП как платформу вакцины для индукции противогрибкового иммунитета, идут дальше, чем оценка ВОП как вакцины для S . aureus , и они демонстрируют потенциальные возможности врачей общей практики в качестве вакцины для индукции защитного клеточного иммунитета. Сходство между иммунными ответами, необходимыми для противогрибкового и противостафилококкового иммунитета, предполагает, что аналогичные стратегии вакцинации могут быть эффективными, и потребуются дальнейшие исследования для более полной оптимизации S на основе GP. aureus вакцина.

Материалы и методы

Заявление об этике

Это исследование было выполнено в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных. Этот протокол был одобрен комитетом по использованию и уходу за животными Медицинского центра Сидарс-Синай (IACUC 7174 и 8836).

Микробы

Для всех S . aureus , использовали доминантный штамм CA-MRSA в США, USA300, в частности клон округа Лос-Анджелес (LAC) [71]. S . aureus LAC обычно культивировали в триптическом соевом бульоне. Для экспериментов использовали бактерии в середине логарифмической фазы, субкультивированные из ночных культур. Бактерии дважды промывали PBS перед использованием, и инокуляцию подтверждали определением КОЕ на чашках с кровяным агаром. Теплоизоляция S . aureus получали инкубированием промытой в течение ночи культуры S . aureus в течение 45 минут при 90 ° C. Затем бактерии промывали для удаления секретируемых белков.Стерильность убитых бактерий подтверждали подсчетом КОЕ на чашке с агаром.

Мыши

мышей C57BL / 6 были приобретены у Jackson Laboratories, а трансгенные мыши Rag2 / OT-II были приобретены у Taconic. Трансгенных мышей OT-II TCR и мышей с нокаутом Dectin-1 разводили и содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, в помещении для животных Cedars-Sinai Medical Center. Подходящих по возрасту самок мышей в возрасте 8–12 недель использовали в экспериментах in vitro и in vivo .Из-за гендерных различий в восприимчивости к S . aureus [72], в этом исследовании использовались только самки мышей.

Первичные ячейки

Дендритные клетки костного мозга (BMDC) мышей с нокаутом C57BL / 6 и Dectin-1 выращивали, как описано ранее [73], в RPMI (Corning) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10 нг / мл рекомбинантной мышиной гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (Peprotech). Между 7-10 днями дифференцированные клетки использовали для анализов стимуляции in vitro .CD4 ⁺ Т-клетки были выделены из объединенных селезенок и лимфатических узлов самок мышей OT-II или Rag2 / OT-II в возрасте 8-12 недель с использованием набора для выделения Т-клеток EasySep, наивного CD4 ⁺ (STEMCELL Technologies). .

BMDC стимуляция

BMDC высевали из расчета 5 × 10 ⁵ клеток / лунку в 24-луночные планшеты TC (для анализа проточной цитометрии) или 2 × 10 ⁵ клеток / лунку в 96-луночных круглодонных планшетах TC (для совместного культивирования Т-клеток). На следующий день после повторного посева BMDC стимулировали в течение 24 часов с помощью GP-OVA (10 частиц на клетку), 4X-SA-GP (10 частиц на клетку) или 100 нг / мл LPS (Invivogen).Для цитокинового анализа BMDC супернатанты собирали через 24 часа после стимуляции, а для анализа маркеров созревания BMDC поднимали после стимуляции в течение ночи PBS, содержащим 2 мМ EDTA, с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием и проточной цитометрией.

ELISA и проточная цитометрия

Иммуноферментный анализ (ELISA) проводили в соответствии с инструкциями производителя для IL-6, TNFα, IL-17A и IFNγ (BioLegend). Для анализа антител в сыворотке мышей планшеты для ELISA (Corning Costar) покрывали 5 мкг на лунку rClfA, rIsdA, rMntC, rSdrE при 4 ° C в течение ночи.Планшеты блокировали разбавителем для анализа ELISA (BioLegend) с последующей инкубацией с сывороткой от вакцинированных мышей при разведении 1: 1000, 1: 10 000 и 1: 100 000 в разбавителе для анализа. Затем планшеты инкубировали с конъюгированным с биотином антимышиным IgG1 (BioLegend), а затем с конъюгированным со стрептавидином антимышиным IgG-HRP (BioLegend). Для IgG2c сыворотки инкубировали с антимышиным IgG2c-HRP (SouthernBiotec). Затем планшеты инкубировали с раствором субстрата TMB (BD OptEIA), реакции останавливали с помощью 2N H ₂ SO ₄ , и планшеты считывали при 450 нм.

Конъюгированные с флуорофором антимышиные антитела, направленные против следующих молекул, использовали для окрашивания клеток: CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), Ly6C (HK1.4), Ly6G (1A8), F4 / 80 (BM8), CD19 (1D3 / CD19), IA / IE (M5 / 114.15.2, CD80 (16-10A1), CD86 (GL-1), IL-17A (TC11-8h20.1), IFNγ (XMG1.2), CD3 (145-2C11), TCRβ (H57-597), CD4 (GK1.5), TCR Vβ5.1 / 5.2 (MR9-4), TCR Vα2 (B20.1) (все от BioLegend). Все образцы были предварительно окрашены анти-CD16 / CD32 (eBioscience) для блокирования рецепторов FC и фиксируемый краситель жизнеспособности Zombie (BioLegend) для выявления мертвых клеток.Для окрашивания внутриклеточных цитокинов клетки стимулировали в течение 4 часов коктейлем для активации клеток (BioLegend) в присутствии GolgiStop (BD Biosciences) в течение последних 3 часов стимуляции. После добавления Fc-блока, красителя жизнеспособности и окрашивания поверхности проводили внутриклеточное окрашивание цитокинов с использованием набора для окрашивания цитофикса / цитоперма (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы собирали с помощью LSRII (BD Biosciences), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree star).

Вестерн-блоттинг

Для оценки овальбумина или рекомбинантных белков в частицах глюкана 2×10 ⁶ частиц загружали в градиентный гель и подвергали гель-электрофорезу с использованием системы электрофореза геля Novex NuPAGE (Invitrogen), и белки переносили на поливинилидендифторид (PVDF). ) мембрана (Millipore). Блоты GP-OVA зондировали антителом против овальбумина (антиальбумин, Calbiochem), а затем вторичным антителом, конъюгированным с HRP (Jackson ImmunoResearch).Блоты инкубировали с субстратом ECL (Pierce), а затем экспонировали на рентгеновской пленке. Блоты 4X-SA-GP зондировали антителом против 6xHN (Clontech Laboratories) для обнаружения полигистидиновой метки на N-конце каждого из рекомбинантных белков, а затем вторичных антител, конъюгированных с инфракрасным красителем (LI-COR). Полосы визуализировали на системе визуализации Odyssey (LI-COR).

DC: совместное культивирование Т-клеток OT-II

BMDC помещали в 96-луночные круглодонные планшеты TC при 2 × 10 ⁵ клеток / лунку и стимулировали в течение ночи GP-No OVA или GP-OVA (10 частиц / клетку).На следующий день BMDC были тщательно промыты и добавлены [74] наивные OT-II CD4 ⁺ T-клетки, меченные CFSE, в соотношении 1: 5 (2×10 ⁵ DC: 1×10 ⁶ T-клеток) и клетки культивировали с RPMI с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия и 55 мкМ 2-меркаптоэтанола. После 4–5 дней совместного культивирования супернатанты собирали для анализа цитокинов с помощью ELISA, и Т-клетки повторно стимулировали с помощью Cell Activation Cocktail (BioLegend) и Golgistop (BD Biosciences) и окрашивали внутриклеточно конъюгированными с флуорофором антителами против IL-17A и IFNγ. .

Антиген-нагруженные частицы глюкана

частиц β-глюкана получали обработкой зимозана A Saccharomyces cerevisiae (Sigma) горячей щелочью для удаления агонистов TLR, как описано ранее [75]. Вкратце, сначала готовили суспензию частиц зимозана, и затем частицы кипятили в 10 М NaOH в течение 1 часа с последующими 5 промываниями в стерильном PBS. Затем частицы глюкана сушили в вакуумном концентраторе Savant SpeedVac. Высушенные частицы глюкана загружали различными концентрациями овальбумина (OVA) или рекомбинантного S . aureus белков (с или без TRITC или FITC-мечения), как описано ранее [29, 51]. Частицы глюкана (GP) хранили в виде замороженных аликвот и обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой водяной бане в течение 15 минут перед их использованием in vitro или in vivo . Пустые GP получали так же, как загруженные GP, за исключением добавления какого-либо белкового антигена.

Клонирование и очистка рекомбинантных белков

Кодирующие последовательности для ClfA, IsdA, MntC и SdrE амплифицировали с помощью ПЦР без сигнального пептида или сигнала сортировки (список последовательностей праймеров см. В таблице 1), как описано ранее [41].Продукты ПЦР клонировали в вектор экспрессии pET6xHN с использованием набора для клонирования In-Fusion Cloning Kit (Clontech Laboratories) для экспрессии рекомбинантных белков, которые имеют N-концевую метку слияния 6xHN. Рекомбинантные белки очищали из лизатов, осветленных бактериями, с использованием смолы His60 Ni Superflow (смола Ni-IDA), буферов His60 Ni и гравитационных колонок (ClonTech Laboratories) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные белки подвергали удалению эндотоксина с помощью центробежных колонок для удаления эндотоксинов (Pierce), концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon Ultra (Millipore) и конечную концентрацию белка определяли с помощью анализа белка BCA (Pierce).

Внутрибрюшинные инъекции 4X-SA-GP, меченного FITC

Мышам внутрибрюшинно вводили 5×10 ⁷ FITC-меченый или немеченый 4X-SA-GP и давали им отдохнуть в течение 24, 48 или 72 часов перед умерщвлением. Полость брюшины промывали 10 мл холодного PBS с 2 мМ EDTA. Затем клетки подсчитывали и окрашивали на поверхностные маркеры CD11b, CD11c, Ly6C, Ly6G, F4 / 80 и CD19 и анализировали проточной цитометрией. Количество клеток на мл (сначала введенных на клетках FITC ⁺ ) определяли с помощью счетных шариков CountBright Absolute Counting Beads (Invitrogen).

Селезенки выделяли через 5 дней после последней вакцинации мышей PBS, empty-GP или 4X-SA-GP. Эритроциты лизировали, клетки ресуспендировали в RPMI с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия и 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и высевали в количестве 3 × 10 ⁶ клеток / лунку. Для специфической стимуляции клетки культивировали со смесью 4 рекомбинантных белков (10 мкг / белок на мл) или убитыми нагреванием S . aureus при MOI 5. Супернатанты собирали через 72 часа для анализа цитокинов с помощью ELISA. Для анализа внутриклеточных цитокинов клетки стимулировали коктейлем для активации клеток (BioLegend) в течение 4 часов и Golgistop (BD Biosciences) в течение последних 3 часов стимуляции. Затем внутриклеточные цитокины (IL-17A и IFNγ) анализировали с помощью проточной цитометрии.

Модель вакцинации и заражения

Модель однократной вакцинации: мышей однократно вакцинировали PBS в качестве контроля, пустыми GP или 4X-SA-GP (5×10 ⁷ GP).Мышей давали отдыхать в течение 5 дней перед сбором селезенки и MLN для анализа рестимуляции Т-клеток. Для модели инфекции мышей давали отдых в течение 4 недель после одной вакцинации, а затем инокулировали 2 × 10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300) через i.p. инъекция. Мышей умерщвляли через 24 часа после заражения, селезенку и почки собирали, гомогенизировали и высевали на чашки с кровяным агаром. КОЕ подсчитывали после инкубации в течение ночи при 37 ° C.

Модель тройной вакцинации: мышей вакцинировали один раз в неделю в течение 3 недель с помощью PBS в качестве контроля, пустых GP или 4X-SA-GP (5×10 ⁷ GP / доза). Для сравнения с квасцами мышей иммунизировали согласованными с полезной нагрузкой количествами S . aureus антигенов (50 мкг / инъекция) в смеси с квасцами (1 мг / инъекция). Количества рекомбинантных белков, нагруженных частицами глюкана, оценивали, зная количество белка, добавленного к препарату частиц, и вычитая количество, оставшееся в супернатантах.Мышей давали отдыхать в течение 5 дней перед сбором селезенки и MLN для анализа рестимуляции Т-клеток. Для модели инфекции мышей отдыхали в течение 4 или 8 недель (если указано) после последней вакцинации, а затем им инокулировали 2 × 10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300). Мышей умерщвляли через 24 часа после заражения, селезенку и почки собирали, гомогенизировали и высевали на чашки с кровяным агаром. КОЕ подсчитывали после инкубации в течение ночи при 37 ° C.

Перенос сыворотки

Мышей вакцинировали один раз в неделю в течение 3 недель PBS в качестве контроля, пустых GP или 4X-SA-GP (5×10 ⁷ GP / дозу). Через две недели после последней вакцинации у всех мышей собирали сыворотку и объединяли в соответствии с группой вакцинации. Мыши-реципиенты получали i.p. инъекции 150 мкл объединенной сыворотки в день -1 и затем инокулировали 2х10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300) через i.p. инъекция на следующее утро в день 0.Мышей умерщвляли через 24 часа после заражения, селезенку и почки собирали, гомогенизировали и высевали на чашки с кровяным агаром. КОЕ подсчитывали после инкубации в течение ночи при 37 ° C.

CD4

Мышей вакцинировали один раз в неделю в течение 3 недель PBS в качестве контроля, пустых GP или 4X-SA-GP (5×10 ⁷ GP / дозу). Мыши отдыхали в течение 4 недель, а затем получали i.p. инъекция антитела против CD4 ⁺ (клон Gk1.5, BioXCell) 300 мкг в 500 мкл PBS в день -1 и 100 мкг в 500 мкл PBS в день 0, как описано ранее [76].Контрольным мышам вводили i.p. инъекция соответствующего контрольного антитела изотипа (BioXCell) в той же дозировке и объеме. В день 0 всем мышам инокулировали 2 × 10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300) через i.p. инъекция. Мышей умерщвляли через 24 часа после заражения, селезенку и почки собирали, гомогенизировали и высевали на чашки с кровяным агаром. КОЕ подсчитывали после инкубации в течение ночи при 37 ° C. PBMC выделяли из крови мышей и объединяли из всех групп мышей в день 0 до заражения, окрашивали поверхностными маркерами CD3, CD4 и TCRβ и анализировали проточной цитометрией для оценки эффективности CD4 ⁺ T истощение клеток.MLN собирали на 1 день после инфицирования, и изолированные клетки окрашивали на поверхностные маркеры CD3, CD4 и TCRβ и анализировали с помощью проточной цитометрии, чтобы оценить, что Т-клетки CD4 ⁺ все еще истощены после заражения.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с помощью t-критерия Стьюдента, двустороннего дисперсионного анализа с использованием апостериорного критерия множественных сравнений Тьюки (обозначен ANOVA в подписях к рисункам) или U-критерия Манна-Уитни с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.Все статистические детали экспериментов, такие как количество повторов, можно найти в подписях к рисункам. Столбцы ошибок, если они присутствуют, указывают на среднее значение + SD. Значения p менее 0,05 считаются значимыми.

Схемы

S1A Схема Fig была создана с помощью BioRender.com.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Генерация 4X-SA-GP,

(A) Схема поколения 4X-SA-GP.В частицы глюкана загружали очищенные рекомбинантные белки с гист-меткой: rClfA, rIsdA, rMntC и rSdrE. (B) Гель SDS-PAGE, окрашенный кумасси из 4 очищенных рекомбинантных белков: дорожка 1, rClfA (98,3 кДа), дорожка 2, rMntC (36,2 кДа), дорожка 3, rIsdA (34,1 кДа), дорожка 4, rSdrE (118,6 кДа). ). Приблизительный молекулярный вес каждого белка указан в скобках. Все дорожки содержат примерно 10 мкг белка. (С). Вестерн-блоттинг 4X-SA-GP с использованием антитела против 6xHN для исследования белков, меченных гистами, внутри GP.2×10 ⁷ 4X-SA-GP загружены в переулок.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.s001

(TIF)

S2 Рис. GP-OVA способствует пролиферации и поляризации наивных CD4

(A-G) BMDC, стимулированные GP-No OVA или GP-OVA (загруженные различными концентрациями OVA), использовали для активации наивных CFSE-меченных OT-II CD4 ⁺ Т-клеток в неполяризующих условиях.(A) Типичные графики проточной цитометрии показывают степень дифференцировки Th2 (IFNγ ⁺ ) и Th27 (IL-17 ⁺ ) Т-клеток при каждом условии активации BMDC. (B) Типичные гистограммы проточной цитометрии демонстрируют степень поляризации Т-клеток, соответствующую приведенным выше данным, с розовой гистограммой из совместной культуры без стимуляции, используемой в качестве контрольной точки для процента пролиферации. (C-D) Гистограммы, количественно определяющие процент клеток OT-II IL-17 ⁺ (C) и IFNγ ⁺ (D) и процент пролиферации CFSE (E).(F-G) Супернатанты совместной культуры собирали на 5 день и анализировали на продукцию IL-17 (F) и IFNγ (G) с помощью ELISA. Процентные показатели проточной цитометрии и данные ELISA и их стандартное отклонение являются репрезентативными для двух повторов / условий. Данные представляют два эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.s002

(TIF)

S3 Рис. 1. Иммунизация 4X-SA-GP способствует менее оптимальным антиген-специфическим CD4

(A-E) Самок мышей дикого типа иммунизировали один раз PBS (n = 5), Empty-GP (n = 5) или 4X-SA-GP (n = 5). Через пять дней после вакцинации спленоциты каждой мыши стимулировали смесью всех 4 S . aureus очищенные рекомбинантные белки (белки) и убитые нагреванием S . aureus (HK-SA) на 3 дня. (Без стимуляции, без стимуляции). Через 3 дня спленоциты стимулировали ацетатом форболмиристата (PMA) и иономицином, а затем анализировали проточной цитометрией после окрашивания внутриклеточных цитокинов.Типичные графики проточной цитометрии демонстрируют степень продукции IL-17 и IFNγ из CD4 ⁺ Т-клеток (управляемых по TCRβ ⁺ CD4 ⁺ ) в ответ на стимулы (белки, HK-SA) от селезенки (A ). (B и D) Гистограммы показывают частоту IL-17 (B) и IFNγ-положительных клеток в селезенке мышей. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь на всех гистограммах. (C и E) Супернатанты собирали на 3 день после стимуляции спленоцитов (A), и цитокины IL-17 (C) и IFNγ (E) определяли с помощью ELISA.Анализ данных проводился с использованием ANOVA. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,005, **** p <0,0001. Данные являются репрезентативными для одного эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.s003

(TIF)

S4 Рис. Мыши, получившие одну вакцинацию 4X-SA-GP, не развивают устойчивых антител.

(A-B) Сыворотку собирали у каждой группы вакцинированных мышей через 2 недели после одной иммунизации PBS, Empty-GP или 4X-SA-GP (n = 5 мышей на группу). Сыворотку разводили в 3 раза в соотношении 1: 1000, 1: 10 000 и 1: 100 000 и затем тестировали на антитела, специфичные для каждого из 4 S . aureus белков, инкапсулированных в 4X-SA-GP с помощью ELISA. Подклассы IgG1 (A) и IgG2c (B) анализировали на специфичность в отношении rClfA, rIsdA, rMntC и SdrE. Результатом анализа является оптическая плотность (OD) при 450 нм для каждого образца сыворотки. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь. Анализ данных проводился с использованием ANOVA. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. Данные являются репрезентативными для одного эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.s004

(TIF)

S5 Рис. Проточно-цитометрический анализ процентного содержания CD4 + Т-клеток после обработки истощающими антителами.

(A-B) Самок мышей дикого типа иммунизировали один раз в неделю в течение 3 недель PBS (n = 9), Empty-GP (n = 10) или 4X-SA-GP (n = 10). Через четыре недели после последней вакцинации 4–5 мышей в каждой вакцинированной группе лечили внутрибрюшинно. с антителом против CD4 ⁺ или соответствующим антителом изотипического контроля в день -1 и день 0. В день 0 все группы мышей были инфицированы i.п. с 2×10 ⁷ КОЕ S . aureus (LAC USA300). (A) графики проточной цитометрии, демонстрирующие степень истощения CD4 ⁺ Т-клеток из объединенных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) из каждой вакцинированной группы мышей в день 0 до того, как мышей инфицировали S . золотистый . (B) графики проточной цитометрии, демонстрирующие степень истощения CD4 ⁺ Т-клеток из объединенных MLN из каждой вакцинированной группы мышей через 24 часа после инфицирования мышей S . aureus (день 1). Клетки из (A) и (B) гейтировали по клеткам CD3 ⁺ .

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.s005

(TIF)

S6 Рис. 4X-SA-GP Вакцинация индуцирует у мышей длительные ответы антител.

(A-B) Две группы самок мышей дикого типа иммунизировали один раз в неделю в течение 3 недель PBS (n = 5), Empty-GP (n = 5) или 4X-SA-GP (n = 5). Сыворотку собирали у одной группы мышей (PBS, Empty-GP, 4X-SA-GP; n = 5 мышей / группу) через 2 недели после последней вакцинации и через 8 недель после последней иммунизации для другой группы мышей (PBS, Empty-GP, 4X-SA-GP; n = 5 мышей / группа).Сыворотку разводили в 3 раза в соотношении 1: 1000, 1: 10 000 и 1: 100 000 и затем тестировали на антитела, специфичные для каждого из 4 S . aureus белков, инкапсулированных в 4X-SA-GP с помощью ELISA. Подклассы IgG1 (A) и IgG2c (B) анализировали на специфичность в отношении rClfA, rIsdA, rMntC и rSdrE. Результатом анализа является оптическая плотность (OD) при 450 нм для каждого образца сыворотки. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь. Анализ данных проводился с использованием ANOVA. * р <0,05, ** р <0.005. Данные представляют по меньшей мере два эксперимента с сывороткой через две недели и один эксперимент с сывороткой через 8 недель.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008733.s006

(TIF)

Ссылки

1. 1. Лю GY. Молекулярный патогенез инфекции Staphylococcus aureus. Pediatr Res. 2009; 65 (5 Pt 2): 71R – 7R. pmid: 191
2. 2. Wertheim HF, Melles DC, Vos MC, van Leeuwen W., van Belkum A, Verbrugh HA и др.Роль носительства в инфекциях, вызванных Staphylococcus aureus. Lancet Infect Dis. 2005. 5 (12): 751–62. pmid: 16310147.
3. 3. Crossley K, Solliday J. Сравнение ректальных мазков и культур кала для выявления желудочно-кишечного носительства Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 1980. 11 (4): 433–4. pmid: 6989861
4. 4. Беккер К., Шаумбург Ф., Фегелер С., Фридрих А.В., Кёк Р., Исследование PoMMP. Золотистый стафилококк из общей популяции Германии очень разнообразен.Int J Med Microbiol. 2017; 307 (1): 21–7. Epub 2016/11/30. pmid: 28017539.
5. 5. Тернер Н.А., Шарма-Куинкель Б.К., Маскаринек С.А., Эйхенбергер Е.М., Шах П.П., Каругати М. и др. Метициллин-устойчивый золотистый стафилококк: обзор фундаментальных и клинических исследований. Nat Rev Microbiol. 2019; 17 (4): 203–18. pmid: 30737488.
6. 6. ван Хал С.Дж., Йенсен С.О., Васька В.Л., Эспедидо Б.А., Патерсон Д.Л., Госбелл И.Б. Предикторы смертности при бактериемии Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev.2012. 25 (2): 362–86. pmid: 224
7. 7. Спеллберг Б., Даум Р. Разработка вакцины против золотистого стафилококка. Semin Immunopathol. 2012. 34 (2): 335–48. Epub 2011/11/14. pmid: 22080194
8. 8. Тернер Н.А., Шарма-Куинкель Б.К., Маскаринек С.А., Эйхенбергер Е.М., Шах П.П., Каругати М. и др. Метициллин-устойчивый золотистый стафилококк: обзор фундаментальных и клинических исследований. Nat Rev Microbiol. 2019. Epub 2019/02/08. pmid: 30737488.
9. 9. Реди Д., Рафаэлли К.С., Россетти Б., Де Лука А., Монтаньяни Ф.Доклиническая и клиническая разработка вакцины против Staphylococcus aureus: современное состояние дел. New Microbiol. 2018; 41 (3): 208–13. Epub 2018/06/06. pmid: 29874390.
10. 10. Missiakas D, Schneewind O. Вакцины против Staphylococcus aureus: отклонение от гимнов. J Exp Med. 2016; 213 (9): 1645–53. Epub 2016/08/15. pmid: 27526714
11. 11. Янсен К.Ю., Гирдженти Д.К., Скалли И.Л., Андерсон А.С. Обзор вакцины: «Вакцины против Staphyloccocus aureus: проблемы и перспективы». Вакцина. 2013. 31 (25): 2723–30.Epub 2013/04/23. pmid: 23624095.
12. 12. Голландия SM. Хроническая гранулематозная болезнь. Clin Rev Allergy Immunol. 2010. 38 (1): 3–10. pmid: 19504359.
13. 13. Роос Д., Кунс Д. Б., Маддалена А., Роеслер Дж., Лопес Дж. А., Арига Т. и др. Гематологически важные мутации: Х-сцепленная хроническая гранулематозная болезнь (третье обновление). Blood Cells Mol Dis. 2010. 45 (3): 246–65. Epub 2010/08/21. pmid: 20729109
14. 14. Проктор Р.А. Проблемы универсальной вакцины против Staphylococcus aureus.Clin Infect Dis. 2012. 54 (8): 1179–86. Epub 2012/02/21. pmid: 22354924.
15. 15. Милнер Дж. Д., Бренчли Дж. М., Лоуренс А., Фриман А. Ф., Хилл Б. Дж., Элиас К. М. и др. Нарушение дифференцировки клеток T (H) 17 у субъектов с аутосомно-доминантным синдромом гипер-IgE. Природа. 2008. 452 (7188): 773–6. Epub 2008/03/12. pmid: 18337720
16. 16. Heimall J, Freeman A, Holland SM. Патогенез синдрома гипер-IgE. Clin Rev Allergy Immunol. 2010. 38 (1): 32–8. pmid: 19452285.
17. 17.Lanternier F, Cypowyj S, Picard C, Bustamante J, Lortholary O, Casanova JL и др. Первичные иммунодефициты, лежащие в основе грибковых инфекций. Curr Opin Pediatr. 2013. 25 (6): 736–47. pmid: 24240293
18. 18. Верма А., Вютрих М., Дипе Г., Кляйн Б. Адаптивный иммунитет к грибам. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014; 5 (3): a019612. Epub 2014/11/06. pmid: 25377140
19. 19. Вотье С., Соуза МаГ, Браун Г.Д. Лектины С-типа, грибы и ответы Th27. Cytokine Growth Factor Rev.2010. 21 (6): 405–12. Epub 2010/11/12. pmid: 21075040
20. 20. Романи Л. Иммунитет к грибковым инфекциям. Nat Rev Immunol. 2011. 11 (4): 275–88. Epub 2011/03/11. pmid: 21394104.
21. 21. Кришна С., Миллер Л.С. Врожденные и адаптивные иммунные ответы против кожных инфекций Staphylococcus aureus. Semin Immunopathol. 2012; 34 (2): 261–80. Epub 2011/11/06. pmid: 22057887
22. 22. Платон А., Уилмент Дж. А., Браун Г. Д.. Лектиноподобные рецепторы С-типа кластера дектина-1: лиганды и сигнальные пути.Int Rev Immunol. 2013. 32 (2): 134–56. pmid: 23570314
23. 23. Браун Г.Д. Дектин-1: сигнальный рецептор, не распознающий паттерн TLR. Nat Rev Immunol. 2006; 6 (1): 33–43. pmid: 16341139.
24. 24. Netea MG, Joosten LA, van der Meer JW, Kullberg BJ, van de Veerdonk FL. Иммунная защита от грибковых инфекций Candida. Nat Rev Immunol. 2015; 15 (10): 630–42. Epub 2015/09/21. pmid: 26388329.
25. 25. Хуанг Х., Острофф Г.Р., Ли С.К., Агарвал С., Рам С., Райс П.А. и др.Относительный вклад дектина-1 и комплемента в иммунные ответы на бета-глюканы в виде частиц. J Immunol. 2012. 189 (1): 312–7. Epub 2012/05/30. pmid: 22649195
26. 26. Хуанг Х., Острофф Г.Р., Ли С.К., Шпехт, Калифорния, Левиц С.М. Надежная стимуляция гуморальных и клеточных иммунных ответов после вакцинации частицами бета-глюкана, нагруженными антигеном. MBio. 2010; 1 (3). Epub 2010/07/20. pmid: 20802824
27. 27. Левитц С.М., Хуанг Х., Острофф Г.Р., Шпехт, Калифорния. Использование компонентов клеточной стенки грибов в вакцинах.Semin Immunopathol. 2015; 37 (2): 199–207. Epub 2014/11/18. pmid: 25404118
28. 28. Specht CA, Lee CK, Huang H, Tipper DJ, Shen ZT, Lodge JK и др. Защита от экспериментального криптококкоза после вакцинации частицами глюкана, содержащими щелочные экстракты криптококка. MBio. 2015; 6 (6): e01905–15. Epub 2015/12/22. pmid: 26695631
29. 29. Хуанг Х., Острофф Г.Р., Ли С.К., Шпехт, Калифорния, Левиц С.М. Характеристика и оптимизация платформы вакцины на основе глюкановых частиц.Clin Vaccine Immunol. 2013. 20 (10): 1585–91. Epub 2013/08/14. pmid: 23945157
30. 30. Де Смет Р., Демур Т., Вершуере С., Дуллаерс М., Острофф Г. Р., Леклерк Г. и др. Микрочастицы β-глюкана являются хорошими кандидатами для доставки антигена через слизистые оболочки при пероральной вакцинации. J Control Release. 2013. 172 (3): 671–8. Epub 2013/09/14. pmid: 24041710.
31. 31. Эрнандес-Сантос Н., Гаффен С.Л. Клетки Th27 в иммунитете к Candida albicans. Клеточный микроб-хозяин. 2012. 11 (5): 425–35. pmid: 22607796
32. 32.Рид Д.М., Гоу Н.А., Браун Г.Д. Распознавание образов: недавние открытия Dectin-1. Curr Opin Immunol. 2009. 21 (1): 30–7. Epub 2009/02/14. pmid: 162
33. 33. LeibundGut-Landmann S, Gross O, Robinson MJ, Osorio F, Slack EC, Tsoni SV и др. Syk- и CARD9-зависимая связь врожденного иммунитета с индукцией Т-хелперных клеток, продуцирующих интерлейкин 17. Nat Immunol. 2007. 8 (6): 630–8. Epub 2007/04/22. pmid: 17450144.
34. 34. Цони С.В., Керриган А.М., Маракалала М.Дж., Сринивасан Н., Даффилд М., Тейлор П.Р. и др.Комплемент C3 играет важную роль в борьбе с оппортунистическими грибковыми инфекциями. Заражение иммунной. 2009. 77 (9): 3679–85. Epub 2009/07/06. pmid: 19581397
35. 35. Ма Кью, Ли Д., Нуриева Р., Патения Р., Бассет Р., Цао В. и др. Уменьшение реакции трансплантат против хозяина у мышей с дефицитом C3 связано со снижением дифференцировки доноров Th2 / Th27. Пересадка костного мозга Biol. 2012. 18 (8): 1174–81. Epub 2012/06/01. pmid: 22664751
36. 36. Дункельбергер-младший, Песня WC. Роль и механизм действия комплемента в регуляции Т-клеточного иммунитета.Мол Иммунол. 2010. 47 (13): 2176–86. Epub 2010/06/18. pmid: 20603023
37. 37. Kemper C, Köhl J. Новые роли рецепторов комплемента в регуляции Т-клеток и за ее пределами. Мол Иммунол. 2013; 56 (3): 181–90. Epub 2013/06/22. pmid: 23796748.
38. 38. Тай Й., Ван К., Корнер Х., Чжан Л., Вэй В. Молекулярные механизмы активации Т-клеток дендритными клетками при аутоиммунных заболеваниях. Front Pharmacol. 2018; 9: 642. Epub 2018/06/26. pmid: 29997500
39. 39. Фаулер В.Г., Проктор Р.А.Где стоит вакцина против золотистого стафилококка? Clin Microbiol Infect. 2014; 20 Приложение 5: 66–75. pmid: 24476315
40. 40. Проктор Р.А. Есть ли будущее у вакцины против стафилококка? Вакцина. 2012. 30 (19): 2921–7. Epub 2011/11/21. pmid: 22115633.
41. 41. Стрейнджер-Джонс YK, Bae T, Schneewind O. Сборка вакцины из поверхностных белков Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103 (45): 16942–7. Epub 2006/10/30. pmid: 17075065
42. 42.Хокинс Дж., Кодали С., Мацука Ю.В., Макнил Л.К., Минини Т., Скалли И.Л. и др. Вакцина, содержащая рекомбинантный фактор комкования А, индуцирует функциональные антитела к Staphylococcus aureus, которые не наблюдаются после естественного воздействия. Clin Vaccine Immunol. 2012; 19 (10): 1641–50. Epub 2012/08/15. pmid: 22896688
43. 43. Josefsson E, Hartford O, O’Brien L, Patti JM, Foster T. Защита от экспериментального артрита Staphylococcus aureus путем вакцинации с помощью фактора слипания A, нового детерминанта вирулентности.J Infect Dis. 2001. 184 (12): 1572–80. Epub 2001/12/12. pmid: 11740733.
44. 44. Kim HK, DeDent A, Cheng AG, McAdow M, Bagnoli F, Missiakas DM, et al. Антитела IsdA и IsdB защищают мышей от образования абсцесса Staphylococcus aureus и летального заражения. Вакцина. 2010. 28 (38): 6382–92. Epub 2010/03/10. pmid: 20226248
45. 45. Becherelli M, Prachi P, Viciani E, Biagini M, Fiaschi L, Chiarot E, et al. Защитная активность домена CnaBE3, консервативного среди белков Sdr Staphylococcus aureus.PLoS One. 2013; 8 (9): e74718. Epub 2013/09/17. pmid: 24069334
46. 46. Андерсон А.С., Скалли И.Л., Тимофеева Ю., Мерфи Е., Макнил Л.К., Мининни Т. и др. Транспортный белок С марганца Staphylococcus aureus представляет собой высококонсервативный белок клеточной поверхности, который вызывает защитный иммунитет против S. aureus и Staphylococcus epidermidis. J Infect Dis. 2012. 205 (11): 1688–96. Epub 2012/04/02. pmid: 22474033
47. 47. Zeng H, Yang F, Feng Q, Zhang J, Gu J, Jing H и др. Быстрая и широкая иммунная эффективность рекомбинантной пятиантигенной вакцины против инфекции Staphylococcus Aureus на животных моделях.Вакцины (Базель). 2020; 8 (1). Epub 2020/03/22. pmid: 32197534
48. 48. Циммерман Дж. У., Линдермут Дж., Фиш ПА, Палас ГП, Стивенсон Т. Т., ДеМонг, Делавэр. Новое углеводно-гликосфинголипидное взаимодействие между иммуномодулятором бета (1-3) -глюкана, PGG-глюканом и лактозилцерамидом лейкоцитов человека. J Biol Chem. 1998. 273 (34): 22014–20. pmid: 9705343
49. 49. Ветвицкая В. Глюкан-иммуностимулятор, адъювант, потенциальное лекарственное средство. Мир J Clin Oncol. 2011; 2 (2): 115–9. pmid: 21603320
50. 50.Jin Y, Li P, Wang F. β-глюканы как потенциальные иммуноадъюванты: обзор адъювантности, взаимосвязи структура-активность и свойств распознавания рецепторов. Вакцина. 2018; 36 (35): 5235–44. Epub 2018/07/23. pmid: 30049632.
51. 51. Сото Э.Р., Острофф ГР. Характеристика многослойных наночастиц, инкапсулированных в частицы клеточной стенки дрожжей для доставки ДНК. Bioconjug Chem. 2008. 19 (4): 840–8. Epub 2008/04/01. pmid: 18376856.
52. 52. Парра Д., Ригер А.М., Ли Дж., Чжан Я.А., Рэндалл Л.М., Хантер Калифорния и др.Важнейшее достижение: B-1 B-клетки брюшной полости обладают фагоцитарной и микробицидной способностью и представляют фагоцитированный антиген CD4 + T-клеткам. J Leukoc Biol. 2012. 91 (4): 525–36. Epub 2011/11/04. pmid: 22058420
53. 53. Якобсон А.С., Раунди К.М., Вайс Дж. Дж., Вайс Дж. Х. Регулирование экспрессии CR3 В-клеток селезенки мышей с помощью компонента 3 комплемента. J. Immunol. 2009. 183 (6): 3963–70. Epub 26.08.2009. pmid: 19710459.
54. 54. Бистони Ф, Веккьярелли А, Ченчи Э, Пуччетти П, Маркони П, Кассоне А.Доказательства опосредованной макрофагами защиты от летальной инфекции Candida albicans. Заражение иммунной. 1986. 51 (2): 668–74. pmid: 3943907
55. 55. Гарсия-Валтанен П., Гусман-Генуино Р.М., Уильямс Д.Л., Хейболл Д.Д., Динер К.Р. Оценка тренированного иммунитета с помощью β-1,3 (d) -глюкана на мышиных моноцитах in vitro и продолжительности ответа in vivo. Immunol Cell Biol. 2017; 95 (7): 601–10. Epub 2017/02/23. pmid: 28228641
56. 56. Netea MG, Joosten LA, Latz E, Mills KH, Natoli G, Stunnenberg HG и др.Тренированный иммунитет: программа врожденной иммунной памяти в отношении здоровья и болезней. Наука. 2016; 352 (6284): aaf1098. Epub 2016/04/23. pmid: 27102489
57. 57. Sha Z, Compans RW. Индукция CD4 (+) Т-клеточно-независимых иммуноглобулиновых ответов инактивированным вирусом гриппа. J Virol. 2000. 74 (11): 4999–5005. pmid: 10799573
58. 58. Begier E, Seiden DJ, Patton M, Zito E, Severs J, Cooper D и др. SA4Ag, вакцина против Staphylococcus aureus с 4 антигенами, быстро индуцирует высокие уровни антител, убивающих бактерии.Вакцина. 2017; 35 (8): 1132–9. Epub 2017/02/02. pmid: 28143674.
59. 59. Клоури Дж., Ирвин А.Д., Маклафлин Р.М. Вакцины против золотистого стафилококка нового поколения: новый потенциальный вариант лечения атопического дерматита? J Allergy Clin Immunol. 2019; 143 (1): 78–81. Epub 2018/09/16. pmid: 30218675.
60. 60. О’Брайен Е.К., Маклафлин Р.М. Рассмотрение «альтернатив» разработки вакцины против Staphylococcus aureus нового поколения. Тенденции Мол Мед. 2019; 25 (3): 171–84.Epub 2019/02/05. pmid: 30713007.
61. 61. Спеллберг Б., Ибрагим А.С., Йеман М.Р., Лин Л., Фу Й., Аванесян В. и др. Противогрибковая вакцина, полученная из рекомбинантного N-конца Als3p, защищает мышей от бактерии Staphylococcus aureus. Заражение иммунной. 2008. 76 (10): 4574–80. Epub 2008/07/21. pmid: 18644876
62. 62. Lin L, Ibrahim AS, Xu X, Farber JM, Avanesian V, Baquir B и др. Клетки Th2-Th27 обеспечивают защитный адаптивный иммунитет против Staphylococcus aureus и Candida albicans у мышей.PLoS Pathog. 2009; 5 (12): e1000703. Epub 2009/12/24. pmid: 20041174
63. 63. Йеман М.Р., Филлер С.Г., Чайли С., Барр К., Ван Х., Купфервассер Д. и др. Механизмы эффективности вакцины NDV-3 в коже MRSA по сравнению с инвазивной инфекцией. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111 (51): E5555–63. Epub 2014/12/10. pmid: 25489065
64. 64. Минегиси Ю., Сайто М., Нагасава М., Такада Х., Хара Т., Цучия С. и др. Молекулярное объяснение противоречия между системным дефектом Th27 и локальной бактериальной инфекцией при синдроме гипер-IgE.J Exp Med. 2009. 206 (6): 1291–301. Epub 2009/06/01. pmid: 19487419
65. 65. Монтгомери С.П., Дэниэлс М., Чжао Ф., Алегри М.Л., Чонг А.С., Даум Р.С. Защитный иммунитет против рецидивирующей кожной инфекции Staphylococcus aureus требует наличия антител и интерлейкина-17A. Заражение иммунной. 2014. 82 (5): 2125–34. Epub 2014/03/10. pmid: 24614654
66. 66. Misstear K, McNeela EA, Murphy AG, Geoghegan JA, O’Keeffe KM, Fox J и др. Направленная назальная вакцинация обеспечивает независимую от антител защиту от золотистого стафилококка.J Infect Dis. 2014. 209 (9): 1479–84. Epub 2013/11/22. pmid: 24273045
67. 67. Клемонс К.В., Дэниэлсон М.Э., Мишель К.С., Лю М., Оттосон Н.С., Леонардо С.М. и др. Цельные частицы глюкана как вакцина против мышиного аспергиллеза. J Med Microbiol. 2014; 63 (Pt 12): 1750–9. Epub 2014/10/06. pmid: 25288643.
68. 68. Сантос Э., Левиц С.М. Грибковые вакцины и иммунотерапевтические средства. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014; 4 (11): a019711. Epub 2014/11/03. pmid: 25368016
69. 69.Lopes LC, Guimarães AJ, de Cerqueira MD, Gómez BL, Nosanchuk JD. Моноклональное антитело h2C, специфичное для histoplasma capsulatum изотипа IgG1, к белку клеточной поверхности массой 70 килодальтон не является защитным при гистоплазмозе мышей. Clin Vaccine Immunol. 2010. 17 (7): 1155–8. Epub 2010/05/19. pmid: 20484567
70. 70. Поджи А., Кателлани С., Муссо А., Зоччи МР. Гаммадельта Т-лимфоциты, продуцирующие IFNgamma и IL-17 в ответ на Candida albicans или микобактериальные антигены: возможные последствия для острого и хронического воспаления.Curr Med Chem. 2009. 16 (35): 4743–9. pmid: 196.
71. 71. Джуни Л.М., Джейкан II, Матрош Л., Пандреа С.Л. Молекулярная эпидемиология клонов метициллин-устойчивого стафилококка золотистого стафилококка, ассоциированных с сообществами: синтетический обзор. Clujul Med. 2018; 91 (1): 7–11. Epub 2018.01.15. pmid: 29440945
72. 72. Янке SJ, Олсон ME, Дэвис HD, Харт Д.А. Модель заражения мышей CD-1 Staphylococcus aureus: влияние пола на инфицирование изолятами MRSA и MSSA. Может J Microbiol.2000. 46 (10): 920–6. pmid: 11068679.
73. 73. Goodridge HS, Shimada T., Wolf AJ, Hsu YM, Becker CA, Lin X и др. Дифференциальное использование CARD9 дектином-1 в макрофагах и дендритных клетках. J Immunol. 2009. 182 (2): 1146–54. pmid: 1
74. 58
75. 74. Куа Б.Дж., Уоррен Х.С., округ ЧР. Мониторинг пролиферации лимфоцитов in vitro и in vivo с помощью внутриклеточного флуоресцентного красителя сукцинимидилового эфира диацетата карбоксифлуоресцеина. Nat Protoc. 2007. 2 (9): 2049–56. pmid: 17853860.
76. 75. Андерхилл DM. Распознавание макрофагами частиц зимозана. J Endotoxin Res. 2003. 9 (3): 176–80. pmid: 12831459.
77. 76. Диллен К.А., Пинскер Б.Л., Марусина А.И., Мерлеев А.А., Фарбер О.Н., Лю Х. и др. Клонально размноженные γδ Т-клетки защищают кожу от повторного инфицирования золотистым стафилококком. J Clin Invest. 2018; 128 (3): 1026–42. Epub 2018/02/05. pmid: 29400698

Шесть причин, по которым нам не хватает вакцины против S. aureus

14 февраля 2018

Читать 3 мин.

ДОБАВИТЬ ТЕМУ В СООБЩЕНИЯ ПО EMAIL

Получать электронное письмо, когда новые статьи публикуются на