Вирус Коксаки: симптомы, лечение, вирус в Украине
Фото: intermarium.com.ua
В Украине дети болеют вирусом Коксаки, который путают со стоматитом
Что такое вирус Коксаки: каковы симптомы заболевания и как лечить вирус, поражающий детей.
В Украине детей поражает вирус Коксаки — инфекционное заболевание ротовой полости, рук и ног. В частности, в Тернопольской области в детсаду им заразились 32 ребенка. Также о случаях заболевания сообщают в Днепре, Одессе и Львове.
Корреспондент.net разобрался, какие симптомы вируса и как от него вылечиться.
Что такое вирус Коксаки
Вирус Коксаки вызывают энтеровирусы в желудке и кишечнике человека. Свое название заболевание получило от одноименного города в США, где его впервые обнаружили в 1950-х годах. На данный момент известны до 30 видов заболевания.
Вирус подхватывают и взрослые, и дети возрастом до десяти лет. Он передается через общую посуду, грязные овощи и фрукты, немытые руки, а также неочищенную питьевую воду.
Как правило, осложенения после заболевания бывают редко, но очень тяжелые. В частности, они могут привести к энцефалиту, менингиту, параличу и заболеваниям сердца.
Вирус Коксаки в Украине
В Тернопольской и Львовской области дети болеют вирусом Коксаки, сообщают медики. В частности, в детсаде Хоросткова Тернопольской области 32 ребенка заразились вирусом Коксаки, передает ZIK.
По словам родителей, у детей кишечная инфекция, высыпания на коже и начали слазить ногти. При проверке медкомиссия установила, что дети заразились вирусом еще летом, а сейчас проявились его остаточные проявления. «Вовремя не установили диагноз, малыши посещали детсад и заражали друг друга», — сообщила завотдела эпиднадзора областного лабораторного центра Мария Павельева.
Также о вирусе сообщают пользователи соцсетей. «В Тернополе сейчас эпидемия вируса Коксака. Не лечится, нужно переболеть. Ошибочно могут ставить диагноз стоматит и его лечить. Очень заразное», — сообщил в Facebook пользователь Святослав Журовский. Он ссылается на данные медиков «скорой помощи» и педиатра.
«Мы переболели две недели назад в Одессе, ребенку четыре года, — сообщила в соцсети пользователь Светлана Максимюк. -Три дня ребенок был в язвах страшных, на четвертый день все стало сходить». Еще об одном случае энтеровирусной инфекции Корреспондент.net сообщила мать заболевшего из Днепра. Болеют вирусом и во Львове, написала в Facebook главный областной эпидемиолог Наталия Тимко.
Дети и вирус Коксаки
По словам медиков, вирус Коксаки сезонный, и его вспышки в основном случаются в теплое время года. Особенно часто он поражает детей в возрасте от трех до десяти лет. При этом заражение зачастую происходит в детсадах и детских коллективах.
Вирус передается воздушно-капельным путем и при тактильных контактах. При заболевании одного ребенка в семье чаще всего заразятся и другие.
Редко заболевание встречается у малышей в возрасте до года. В то же время младенцев до трех месяцев от вируса защищает врожденный иммунитет, переданный от матери. При этом подростки также редко заболевают вирусом. В случае заражения зачастую симптомы болезни у них не проявляются, а в результате приобретается иммунитет.
Симптомы вируса Коксаки
Как правило, заболевание сопровождается лихорадкой, высокой температурой, сыпью и плохим аппетитом. По словам медиков, высыпания на коже напоминают ветрянку, из-за чего их могут спутать с этим заболеванием.
Также на руках, ногах и во рту у детей появляются небольшие надрывы, похожие на язвы. Из-за них медики могут ошибочно ставить диагноз стоматит. Надрывы на несколько дней вызывают жар и усложняют питание ребенка. Из-за боли в горле младенцы отказываются глотать молоко, что грозит им обезвоживанием.
Как лечить Коксаки
Лечение вируса Коксаки предусматривает симптоматическую помощь. В частности, сбивают высокую температуру жаропонижающими средствами. Для этого младенцам в возрасте от двух месяцев дают детский парацетамол и ибупрофен. Перед применением обязательно нужно проконсультироваться с врачом.
Боль от надрывов во рту можно облегчить гелем для десен при прорезывании зубов, а для горла применять спреи. После каждого приема пищи больному нужно полоскать рот.
Пораженные участки на коже обрабатывают антисептиком, а также применяют антигистаминные средства. При этом медики советуют пить много воды, чтобы быстрее выводить из организма токсины и снижать температуру. Улучшение состояния начинается через три-пять дней, а высыпания исчезают через неделю. В течение восьми-десяти дней заболевание проходит.
Вакцинация от вируса Коксаки
Прививок от Коксаки не существует. Медики отмечают, что вирус нужно переболеть. В то же время лечить детей антибиотиками нельзя. Чтобы избежать заражения, следует следить за личной гигиеной и часто мыть руки. Также дома нужно тщательно убирать и поддерживать чистоту, а средства личной гигиены больного утилизировать сразу после использования.
Лечение половых инфекций
Венерические заболевания — это инфекционные болезни, которые чаще всего передаются от человека к человеку половым путём. Сегодня вместо термина «венерические болезни» обычно употребляют более широкое понятие этой группы недугов — инфекции или заболевания, передающиеся половым путём (ИППП, ЗППП).
Пути распространения инфекций передающихся половым путем (ИППП)
По степени распространенности инфекции, передающиеся половым путем, в современном обществе занимают второе место, уступая лишь простудным заболеваниям. Венерическими болезнями может быть инфицирован практически любой человек, и половая, национальная, возрастная принадлежность не играют никакой роли, как и социальный статус пациента.
Слизистые оболочки мочеиспускательного канала, половых органов, заднего прохода являются идеальной средой обитания для возбудителей половых инфекций: вирусов, грибков, бактерий, которые к тому же имеют высокую приспособляемость и способность к быстрому размножению. С лимфотоком и кровотоком болезнетворные микроорганизмы попадают к другим тканям и органам, поражая не только мочеполовую систему.
Венерические болезни: классификация и характер протекания
Современная венерология знает более 20 инфекций, передающихся половым путем, возбудителями которых являются: простейшие, вирусы, бактерии, членистоногие и дрожжевые грибы.
Классические венерические заболевания — гонорея, сифилис, венерическая лимфогранулема.
Данные ИППП являются примерами наиболее опасных классических венерических заболеваний. Они очень трудно поддаются лечению и могут иметь тяжелейшие последствия для организма. Несмотря на то, что культурное развитие общества шагнуло далеко вперед, именно заболевания, передающиеся половым путем, наиболее часто носят эпидемический характер.
Венерические болезни, поражающие мочеполовую систему — трихомониаз, уреаплазмоз, хламидиоз, гарднереллез, генитальный герпес, кандидоз и ряд других заболеваний, поражающих мочеполовую систему.
Всю эту группу объединяет скрытый характер протекания болезни. Кроме того, заболевания из этой группы имеют тенденцию к совместному существованию в организме одного пациента нескольких типов возбудителей. Такая специфика чревата развитием запущенной трудноизлечимой стадии, несмотря на кажущуюся легкость каждого отдельного заболевания. Именно поэтому венерические заболевания второй группы не менее опасны для здоровья, чем классические инфекции, передающиеся половым путем.
Венерические заболевания, поражающие другие органы человека — гепатиты различных групп, СПИД и цитомегаловирусная инфекция.
Несмотря на то, что эти инфекции преимущественно имеют половой путь распространения, поражают они в основном другие системы организма и его отдельные органы. Так СПИД разрушает иммунную систему, а гепатит поражает печень. Когда у пациентов обнаруживают эти опаснейшие заболевания, они в большинстве случаев впадают в отчаяние. Но делать этого нельзя ни в коем случае. Современная венерология достигла больших успехов и продолжает развиваться, и примеров долгой полноценной жизни людей даже с такими серьезными недугами на сегодняшний день очень и очень много.
Инфекции, передающиеся половым путем (ИППП): симптомы и осложнения
Специфика протекания большинства половых инфекций такова, что они не имеют ярко выраженной симптоматики и обостряются только в период снижения иммунитета.
Специалисты рекомендуют обязательно пройти обследование у венеролога на предмет выявления ИППП: если вы вступили в незащищенный случайный половой контакт, независимо от его характера — оральный, анальный, вагинальный; если у одного из половых партнеров выявлены урогенитальные инфекции, то второму непременно нужно пройти обследование.
Поводом для немедленного обращения к венерологу являются следующие симптомы:
— появление патологических выделений из мочеполовых путей;
— высыпания в области гениталий и на туловище;
— увеличение лимфатических узлов.
Помните, что большинство венерических болезней излечимы, если своевременно обратиться к специалисту. Попытки самолечения или несвоевременное обращение к врачу чреваты развитием запущенной формы венерических болезней, а порой могут привести и к общему поражению всего организма.
И у мужчин, и у женщин нередки осложнения после перенесенных венерических заболеваний, которые часто приводят к тяжелым последствиям:
— развитию хронических воспалений мочеполовой системы;
— расстройству половой функции;
— возникновению злокачественных новообразований.
К тому же, так как урогенитальные инфекции часто проявляются в воспалении слизистых оболочек, значительно возрастает вероятность передачи ВИЧ-инфекции от одного полового партнера к другому.
Современная венерология: методы диагностики и лечения ИППП
Современная венерология использует передовые методы диагностики и лечения инфекций, передающихся половым путем (ИППП). Так в лабораторной диагностике используются высокоэффективные и специфические методы: микроскопические и бактериологические исследования, ДНК и ПИФ-диагностика. Широко применяются диагностические процедуры: УЗИ, кольпоскопия, цистоскопия, уретроскопия.
Венерологи не одиноки в своей борьбе с ИППП — им активно помогают генетики, вирусологи, бактериологи, микробиологи, биохимики, которые щедро делятся своими последними разработками и новейшими методами лечения инфекций. Можно без ложной скромности сказать, что на сегодняшний день венерология добилась потрясающих результатов в лечении инфекций, передающихся половым путём.
Медики очень часто используют комплексное лечение венерических заболеваний, сочетающее физиотерапевтические, иммуноферментные и антибактериальные методы воздействия.
Своевременное обращение к врачу и грамотно назначенное лечение инфекций, передающихся половым путем (ИППП) поможет избежать осложнений и рецидивов заболевания, значительно сократит сроки излечения.
Гинекология, дерматология и урология являются смежными областями медицины с венерологией, и в свою очередь тоже занимаются диагностикой и лечением ИППП.
Психологический аспект в венерологии
Венерические болезни — это серьезная социальная и психологическая проблема. В сознании рядового члена общества они представляются как нечто постыдное. Но осуждать человека за то, что он болен, нельзя. Не существует «стыдных» болезней. Гораздо опаснее предрассудки, заставляющие людей прибегать к самолечению и тем самым обрекать себя на длительные мучения и пагубные последствия для всего организма. Поэтому если у вас или ваших близких возникли подозрения на наличие ИППП, необходимо незамедлительно обратиться к врачу. Только он назначит правильное лечение, которое поможет вернуть пациента к полноценной жизни.
Возврат к списку
Коронавирус оставляет искаженное послевкусие – Коммерсантъ FM – Коммерсантъ
Переболевшие коронавирусом столкнулись с неожиданным последствиями: спустя месяцы после выздоровления у них исказились запахи и вкусы. Те, кто перенес COVID-19, жалуются на странный привкус, настолько невыносимый, что из-за него приходится менять рацион в поисках подходящих продуктов. Некоторые пострадавшие считают, что это индивидуальная особенность организма и не догадываются, что речь идет о малоизученном последствии коронавируса. Что это? И как возникает этот симптом? С переболевшими и специалистами поговорил Иван Корякин.
«Не описывайте свои симптомы. Если вы здесь, значит, мы с вами испытываем одно и то же»,— говорится в описании чата о последствиях коронавируса. Его участники, а их уже 17 тыс., называют это запахом гари, жженого лука, чего-то протухшего, а то и сгнившего. И приходит он неожиданно: человек выздоравливает, прощается с коронавирусом, получает обратно свое утерянное обоняние и возвращается к нормальной жизни.
Но спустя несколько месяцев после отрицательного теста начинается странное. О своем опыте “Ъ FM” рассказала Екатерина из Одессы: «Это было, когда я сварила куриный бульон, он просто показался мне каким-то не таким, как я привыкла ощущать бульон. Прошла неделя, я снова приготовила эту курицу, и ее запах был очень резким. Прошло время, и я поняла, что проблемы у меня не только с курицей, у меня проблемы еще с яйцами, хлебом, шоколадом, кофе».
Блюда могут быть какими угодно. Корреспондент “Ъ FM”, например, больше не может завтракать молочной кашей, кто-то не переносит мандарины, кому-то неприятен и алкоголь, особенно почему-то пиво. Есть через силу не получается, запах и привкус в буквальном смысле тошнотворный. Попытки обобщить приводят к мысли, что реакцию провоцирует белковая пища или просто горячие блюда, по крайней мере, в большинстве случаев. Но самое неприятное, что эффект, бывает, усиливается, и привкус перекидывается на другие продукты. Доходит до того, что «мертвяком», как пишут в чате, пахнет все вокруг. С этим столкнулась Анастасия из Дальнегорска: «В кровати, в ванной — везде, есть ощущение, что этот же запах присутствует во рту. Воду обычную не могу пить, пью только газированную, «Ессентуки». Кажется, что воняет просто все».
И неважно, в какой форме протекал коронавирус, с эффектом могут столкнуться и те, кто переболел бессимптомно. Поэтому атакованные этим странным запахом нередко думают, что столкнулись, например, с онкологией. Многие жалуются на непонимание со стороны близких, что порой доводит даже до панических атак и срывов. Даже врачи толком не могут помочь, говорит Юлия, которая летом и создала группу «Запахи/вкусы после COVID-19». «Невролог не понял вообще, с чем я к нему пришла, и сказал, что у меня нет оснований для МРТ. Он сказал: попейте успокоительные, все у вас пройдет. Прошел месяц, я вернулась к нему, и он сказал, что за этот месяц, что меня не было, уже очень много людей к нему пришло с таким симптомом, и что он уже слышать про этот симптом не может. Соответственно, он с ним знаком»,— рассказала Юлия.
А врачам порой и нечего сказать — этот симптом малоизучен. Известно, что это последствие коронавируса, но как оно работает? Одни считают, что проблема с рецепторами, но есть мнение, что это связано со сбоем иммунной системы. Во всем виноваты антитела, но не те, что борются с коронавирусом, а «неправильные». Своими действиями они вводят организм в заблуждение, говорит врач-иммунолог Владимир Болибок: «COVID ведет себя, как отмычка, то есть он открывает себе дверь, а антитела — это как бы слепок с этой отмычки. И вот это вызывает аутоиммунное воспаление, то есть свое собственное антитело воспринимает поверхность клетки как антиген, на эту поверхность клетки садится, а дальше уже иммунная система снова это все атакует».
Такой эффект похож на бесконечное «отзеркаливание» — это все равно что делать дубликаты ключа, но всякий раз использовать не оригинал, а предыдущую копию, что в итоге приведет к созданию бесполезного изделия. Но это требует времени, потому искажение запахов и приходит спустя недели после выздоровления, продолжает Владимир Болибок: «На второй-третьей неделе появляются антитела против COVID, соответственно, через две-три недели появятся эти антиидиотипические антитела.
Еще через две-три недели появятся антиантиидиотипические антитела, то есть это как бы третий цикл этой итерации, рецидивируются симптомы».
Но уже не в том виде, как при коронавирусе. Вместо потери обоняния — искажение запахов — это как помехи вместо полного отсутствия сигнала. Но главное, что это, скорее всего, проходит. Спустя месяцы Coca-Cola со вкусом бензина вновь становится Coca-Cola. Правда, это не единственное последствие коронавируса. Некоторые еще не переносят собственный парфюм и жалуются на выпадение волос.
В чем коварство генитального герпеса?
Герпес – одна из самых распространенных вирусных инфекций человека. Мочеполовую систему могут поражать вирусы простого герпеса (ВПГ) 1-го и 2-го типов. Считается, что ВПГ-1 чаще вызывает поражение слизистых верхней половины тела (обычно это лицо), встречается у более 80% людей. ВПГ-2 или генитальный герпес выявляется у 20% людей. Надо сказать сразу, что препараты, которые уничтожили бы полностью все вирусы герпеса в организме, пока не существуют. Поэтому некоторые пациенты, да и врачи, сомневаются, зачем вообще лечить герпес? Проблема в том, что присутствие ВПГ в организме человека не всегда вызывает кокой-то патологический процесс. Сам вирус тихо сидит в ганглиях позвоночника и только изредка, чаще после переохлаждения и других стрессов, активируется. Тогда у больного появляются классические высыпания, пузырьки на коже и слизистых оболочках. Со временем они подсыхают и проходят даже без лечения. У одних людей такие обострения могут происходить один раз в году, у других – 3-4-5. Нередко у девушек и женщин генитальный герпес вызывает страдания каждый месяц перед менструацией. В таких случаях лечение назначается длительное: месяцы и годы.
Однако основное коварство герпеса заключается в том, что часто заболевание имеет нетипичные проявления. Вирус герпеса может поражать внутренние органы, когда никаких высыпаний на теле нет. Больной страдает и не понимает от чего. Обследоваться на вирусы ему не придет в голову, а врачи чаще всего ему такое обследование не назначают. Часто ВПГ поражает органы малого таза, мочевой пузырь, предстательную железу, семенные пузырьки, матку, толстый кишечник. Женщину в таких случаях беспокоят периодические боли внизу живота, пояснице, расстройство месячных, обострения цистита, аднексита. Пациентка длительно обследуется и лечится у невролога, гинеколога, уролога. Ей устанавливаются диагнозы: люмбалгия, цистит, колит, аднексит. У мужчин герпетическая инфекция может выявляться при простатите, бесплодии. Применяемые в таких случаях обезболивающие и антибиотики дают временный эффект и никак не действуют на причину заболевания. Гинекологи и урологи, конечно, проводят обследование мазков на ИППП, в том числе на герпес методом ПЦР. Проблема в том, что часто вирус в мазках не выявляется, его нет на коже и слизистых, он поражает внутренние органы. Только применение целенаправленной комплексной диагностики несколькими методами, в том числе иммуноферментным анализом (ИФА) поможет установить истинный диагноз. Особенностью многих урогенитальных инфекций, в том числе герпеса, является их сочетанное течение. ВПГ почти никогда не поражает мочеполовые органы в одиночку. Различные возбудители (хламидии, трихомонады) взаимодействуют между собой, поддерживают воспалительный процесс. Симбиоз бактерий, вирусов, грибов позволяет им совместно бороться с действием лекарственных препаратов. Не выявленная сразу смешанная инфекция приводит к неэффективности лечения заболвания.
В настоящее время существуют множество различных методов терапии и препаратов, которые могут остановить развитие вирусной инфекции, подавить возбудитель на длительное время, на месяцы, годы, может и на всю жизнь. Правильное применение методов диагностики и лечения избавит человека от страданий и осложнений, связанных с генитальным герпесом.
10 неожиданных способов применения кока-колы — Российская газета
Компания, производящая кока-колу, выступила недавно с заявлением, что из рецептуры своих газировок она убирает сомнительный вкусовой стабилизатор.
Этот компонент — бромированное растительное масло. Интересно, что главный конкурент коки — напиток пепси — тоже освобождается от плохо изученного вещества, его производитель принял такое же решение в начале года.
Пока от стабилизатора пообещали «очистить» фруктовый пунш и клубничный лимонад, которые популярны за океаном. Но до конца года должны «переписать» рецептуру и для газировок, популярных в России, — фанты и фреско.
В компании говорят, что единые стандарты для напитков будут введены на всех заводах, в какой бы стране они ни находились. Правда, когда именно это произойдет, уточнять никто не стал. Вместо бромированного масла в напитки станут добавлять другой пищевой стабилизатор, который уже много лет используют в жевательных резинках.
Это решение производители шипучек приняли не от хорошей жизни — несколько месяцев в соцсетях продолжалась активная кампания, организованная любителями газировки в США. Потребители составили две петиции к обоим лидерам рынка газированных напитков, потребовав, чтобы они перестали использовать сомнительный компонент. Дело в том, что бромированное растительное масло плохо изучено. А недавно достоянием общественности стала информация, что это вещество может вызывать зависимость. В общей сложности американцы, не желающие отказаться от любимого напитка, собрали более 260 тысяч подписей, и это в конце концов сработало. И Кока-кола, и ПепсиКо пошли на уступки.
Нынешний скандал — отнюдь не единственный. В прошлом году производителей шипучек вместе с другими гигантами пищевого рынка и крупными торговыми сетями обвинили в лоббировании своих интересов в FDA (Food and drug Administration) — они пытались притормозить введение федерального закона, который требует указывать на этикетках, что в состав продукта входят генно-модифицированные компоненты. В Европе, к слову, к ГМО относятся крайне жестко, их применение запрещено, и пищевые корпорации волей-неволей требования ЕС выполняют.
Еще раньше потребительская организация The Center for Science in The Public interest заявила, что для придания приятного коричневого цвета в газировку добавляют 4-метилимидазол. Который с недавних пор был включен в список канцерогенов. Впрочем, FDA поддержала производителей, заявив, что не имеет никаких оснований подозревать, что любители шипучки действительно подвергают свою жизнь опасности. Дескать, краситель находится в напитках в столь ничтожной концентрации, что нужно ежедневно выпивать сотни банок, чтобы «съесть» опасное количество.
Впрочем, в 2008 году та же FDA довольно сурово отчитала производителя, выпустившего витаминизированную версию напитка, указав, что информация на этикетке не соответствует реальному содержимому банок и бутылок.
Одним словом, информация о вреде колы и пепси появляется то и дело. И этого не знает, кажется, только ленивый. Ну, и еще детвора и молодежь, которая с завидным упорством «подсаживается» на шипучку. При этом гастроэнтерологи дружно предостерегают пациентов от излишнего увлечения «химическими» напитками. В России такого рода газировки Роспотребнадзор запретил продавать в школах, а в нынешнем году «табу» распространил и на летние лагеря.
Так что пить или не пить, каждый решает сам. Зато сообщество противников колы радостно и с неистощимой изобретательностью ищет совсем другие, непищевые пути ее использования. И надо сказать, весьма успешно.
Некоторые из этих способов опробовал и корреспондент «РГ». Вот самые любопытные.
1. Кока-колой хорошо чистить ржавые и окисленные поверхности — от пожелтевших ванн до потускневших украшений. Просто опустить в стакан с жидкостью колечки и цепочки, а потом пройтись мягкой тряпочкой.
2. Кухонная утварь просто засверкает, если использовать колу, содержащую кислоту: можно удалить накипь на чайнике, справиться с пригоревшими остатками на дне. Нужно просто залить в емкость колу и нагреть для ускорения процесса.
3. Растворяется и известковый налет — краны можно обернуть на какое-то время пропитанной газировкой тряпкой. В унитаз заливается бутылка — через несколько часов известковые «залежи» размягчаются и удаляются обычным ершиком.
4. Хорошо отмывается органика — засиженные мухами окна и зеркала. Но липкие следы после надо отмыть чистой водой. «Профессиональные» стеклоочистители, надо признать, удобнее, но они довольно дороги. А еще можно прокипятить в коле засаленное кухонное полотенце. Все приятнее, чем применять хлорсодержащие отбеливатели.
5. В саду кола привлекает вредителей: если ее налить в широкие плошки, туда сползутся слизни. Если брызгать (с водой в пропорции 1:1) помидоры и комнатные цветы (например, фуксию), исчезнет белокрылка. Помогает кола и от колорадского жука, и от муравьев. Главное — брызгать, в отличие от ядов, можно даже при созревании плодов или зеленого салата.
6. Садоводы уверяют, что сильно разбавленную колу можно применять в качестве удобрения и даже ускорить созревание компоста, если полить ею кучу травы и садовых остатков. Это привлечет дождевых червей и ускорит процесс перепревания органики.
7. Изначально, говорят, кока придумывалась как лечебная микстура. И хотя больше чем за век существования напитка он изрядно «химизировался», блогеры уверяют, что он по-прежнему помогает от расстройства желудка.
8. Не имея ничего лучшего под рукой, колу можно использовать, чтобы прекратить зуд от укуса комара или пчелы.
9. Кола размягчает засохшую жевательную резинку, ее можно использовать, если жвачка нечаянно попала в волосы, чтобы не вырезать слипшийся клок ножницами.
10. Если закончился ополаскиватель, нет лимона и уксуса, можно после мытья придать блеск волосам с помощью колы. Напоследок как следует прополоскать чистой водой.
Клава Кока о предательстве бывшего парня Дмитрия Гордея
Певица призналась, что ее возлюбленный и до расставания все время порывался раскрыть тайну их отношений поклонникамФото: Иван МАКЕЕВПевица из Екатеринбурга Клава Кока впервые за полтора года дала интервью. Видео откровенного разговора со звездой появилось на YouTube -канале Fametime Tv в шоу «Надо обсудить» с Лаурой Джугелия.
Певица не любит рассказывать о личной жизни, но в этом интервью впервые поделилась подробностями отношений и расставания с 30-летним Дмитрием Гордеем. Ранее он опубликовал видео на своей странице в Instagram с Клавой Кокой, сообщив подписчикам о разрыве с певицей. Также он раскрыл, что они были в отношениях два года.
Для звезды этот пост стал настоящим шоком, ведь до этого Клава Кока тщательно скрывала отношения с Дмитрием. В интервью певица призналась, что ее возлюбленный, который активно ведет блог, и до расставания все время порывался раскрыть тайну поклонникам, но она просила его этого не делать.
Фото: instagram.com/dimagordey
— То, что он сделал, это его ответственность, его решение. Я правда не знаю, почему он его принял за нас обоих. Мне все это больно наблюдать, видеть в интернете. Мне очень хочется верить, что это не какой-то хайп, — рассказала певица. — Явную точку мы не ставили. И если мы поговорили, когда я приехала из Турции мы бы как-то по-другому это решили. Но он почему-то захотел поступить так. Я не стала его материть и писать какой он плохой. Я написала «окей, ты сам поставил точку». Но ты меня предал, ты должен это знать.
Все произошло, когда Клава Кока была в Турции с сестрой. Певица уехала туда, чтобы обдумать отношения с Дмитрием. Но мужчина не дал ей этого сделать. По словам звезды, он прилетел в Турцию к ней на второй день, они поговорили и он снова улетел. А затем, когда она собирала вещи, чтобы улететь домой, уверенная, что с Дмитрием все может наладиться, он опубликовал то самое видео, которое все разрушило. Артистка Black Star уверена, что Дмитрий не должен был демонстрировать подписчикам свои переживания по поводу их расставания. Она призналась, что эта ситуация ее очень ранила.
— Он мне всегда говорил, что для обычного человека горе — это горе, а для блогера — это контент. Наверное, только сейчас я поняла, что это значит. И сейчас я понимаю, что человек, который так сделал не смог бы пойти со мной дальше. Может быть даже хорошо, что это случилось именно сейчас. — рассказала Клава Кока. — Мы расставались не раз и медленно шли ко дну.
Фото: instagram.com/dimagordey
Певица отметила, что они расстались не из-за измен или ссор, но тем не менее на данном этапе возобновлять отношения с Дмитрием она не планирует, так как публикацию их совместных фотографий и показательные страдания об их расставании она расценивает как предательство.
— Фоткаясь с ним в лифте, я не думала, что это будет вынесено на многомиллионную аудиторию, — делится певица.
Также Клава Кока призналась, что ей и самой тяжело после расставания с Дмитрием, но она не привыкла показывать свои эмоции и не собирается этого делать на публику.
— Это грустно и больно. Если я не снимаю видео о том, как мне плохо, как я плачу и грущу, это не значит, что мне дается это легко. Я могла бы прийти на интервью без макияжа, заплаканная, набуханная и говорить, как мне плохо и я страдаю. Я не буду этого делать. Последнее, что мне хочется делать, это всем рассказывать об этом, — добавила певица.
ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ
Третий год не платит за капремонт: отец Клавы Коки оказался должником.
Вадим Высоков является собственником роскошной квартиры в центре Екатеринбурге, в которой когда-то жила многодетная семья певицы Black Star (подробнее)
Клава Кока засветила обнаженные снимки для Playboy. Певица Black Star выложила пост в Instagram (подробнее)
Британские школьники начали подделывать тесты на COVID-19 с помощью сока и колы, чтобы не ходить на занятия
Чтобы уйти на двухнедельный карантин, британские школьники начали подделывать экспресс-тесты на COVID-19 с помощью апельсинового сока и кока-колы. Эти напитки обладают высоким уровнем кислотности, которая разрушает содержащиеся в тесте белки антител и позволяет получить положительный результат, пишет BBC.
В TikTok набирают популярность видео с хештегом #fakecovidtest. На них британские подростки используют подручные средства, в том числе сок и кока-колу, чтобы обмануть экспресс-тест на COVID-19 и не ходить на занятия. Ролики набрали уже более 6,5 млн просмотров, отмечает издание.
Когда профессор Университета Халла Марк Лорч впервые услышал об этом трюке, он решил проверить его правдоподобность. Для этого он открыл две бутылки — с колой и апельсиновым соком — и капнул небольшое количество каждой жидкости на экспресс-тест. Через несколько минут система в обоих случаях показала положительный результат.
Чтобы понять, как это могло произойти, Лорч решил разобраться в принципах работы тестов. Если открыть устройство, то внутри будет полоска похожей на бумагу нитроцеллюлозы и маленькая красная подушечка, скрытая под пластиковым корпусом ниже Т-образной линии. Поглощенные красной подушечкой антитела связываются с вирусом. К ним также прикрепляются золотые наночастицы, которые позволяют увидеть, где находятся антитела на устройстве.
Во время проведения теста образец слюны смешивают с буферным раствором, чтобы в нем поддерживалась нужное значение pH. Только после этого его наносят на устройство. Образец впитывается в нитроцеллюлозную полоску, и золотые наночастицы связываются с антителами. Последние также связываются с вирусом, если он есть в организме. Рядом с буквой Т находятся белки антител, которые также связываются с вирусом. Они не могут свободно перемещаться, так как прилипают к нитроцеллюлозе.
Когда антитела с золотыми частицами проходят через неподвижные антитела, последние также захватывают вирус. Затем патоген связывается с обоими наборами антител, образуя комплекс, и остается на линии. Часть образца, которая не связалась с белками, движется дальше и связывается с другим набором антител, образуя контрольную линию. Если вируса в образце нет, он не задерживается на линии с неподвижными антителами, а остается только на контрольной.
Размышляя о том, как безалкогольный напиток может вызвать появление второй красной линии, Лорч предположил, что они содержат какое-то вещество, с которым антитела связываются так же, как с вирусом. Но это маловероятно.
Гораздо более правдоподобным объяснением является то, что какой-то компонент напитков влияет на функцию антител. Жидкости, используемые для подделки тестов, от фруктового сока до колы, имеют одну общую черту — они очень кислые. Лимонная кислота в апельсиновом соке и фосфорная кислота в коле придают этим напиткам рН от 2,5 до 4. Это довольно суровые условия для антител, которые работают при рН около 7,4.
Однако, по словам ученого, есть способ обнаружить поддельный положительный тест. Антитела способны восстанавливать свою функцию, когда возвращаются в более благоприятные условия. Поэтому если промыть тест, на который капнули колу, то все антитела на Т-линии восстановят нормальную функцию и выпустят частицы золота, показав истинный, отрицательный результат теста.
Zika Virus COCA Calls / Webinars Информация, резюме и наборы слайдов
Заголовок: Обновление по вирусу Зика: данные из реестра беременностей США по вирусу Зика и обновленное клиническое руководство
Дата: 4 мая 2016 г., четверг
CDC недавно опубликовал свои последние данные из реестра беременных женщин Зика (USZPR) в отношении вирусной инфекции Зика у беременных женщин и младенцев, которые подчеркивают важность профилактики и раннего ухода. Кроме того, CDC опубликовал дополнительные рекомендации по оценке и ведению младенцев с возможной врожденной инфекцией, вызванной вирусом Зика.Инфекция вирусом Зика во время беременности является причиной микроцефалии и других серьезных дефектов головного мозга; однако полный спектр потенциальных проблем со здоровьем, которые может вызвать вирусная инфекция Зика во время беременности, еще не известен. Медицинским работникам необходима информация для надлежащей оценки и ведения пациентов с возможной инфекцией вируса Зика. Во время этого звонка COCA врачи узнают о последних результатах USZPR и обновленных клинических руководствах CDC, которые помогут в уходе за этими пациентами на основе имеющихся в настоящее время данных.
Спикер: Соня Расмуссен, доктор медицины, MS
Директор, Отдел распространения информации общественного здравоохранения
Главный редактор, Еженедельный отчет о заболеваемости и смертности
Центр эпиднадзора, эпидемиологии и лабораторных служб
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер: Эмили Петерсен, доктор медицинских наук
Медицинский сотрудник
Отдел репродуктивного здоровья
Национальный центр профилактики хронических заболеваний и укрепления здоровья
Центры контроля и профилактики заболеваний
Название: Подготовка к сезону путешествий: как врачи могут гарантировать, что их пациенты обладают знаниями о профилактике вируса Зика
Дата: 8 декабря 2016 г., четверг
В течение этого курортного сезона многие врачи будут встречаться с пациентами, которые планируют путешествовать или недавно побывали в районах с активной передачей вируса Зика.Во время этого звонка COCA врачи узнают о текущих рекомендациях CDC о поездках, о том, как определить, какие пациенты должны пройти тестирование на Зика после поездки в район с вирусом Зика, а также о рекомендациях для пациентов до и после поездки, чтобы помочь им защитить себя и других от вируса Зика.
Спикер: Мэри Таннер, MD, FAAP
Сотрудник службы эпидемической разведки
Национальный центр профилактики ВИЧ / СПИДа, вирусных гепатитов, ЗППП и туберкулеза
Центры контроля и профилактики заболеваний
Спикер: Эллисон Тейлор Уокер, доктор философии, магистр здравоохранения
Старший эпидемиолог
Отделение здравоохранения путешественников
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Название: Обновленное руководство CDC по лабораторным испытаниям вируса Зика
Дата: 1 декабря 2016 г., четверг
Центр контроля заболеванийи несколько государственных и местных департаментов здравоохранения проводят тестирование на вирус Зика.Каждый день CDC узнает больше о вирусе Зика. CDC недавно выпустил пересмотренное руководство по лабораторному тестированию вируса Зика. Во время звонка COCA врачи узнают об обновленных рекомендациях Руководства CDC по тестированию лабораторий США на вирусную инфекцию Зика и поймут свою роль в тестировании образцов, взятых у пациентов. Кроме того, профильные эксперты из CDC, Американского общества микробиологии и Ассоциации лабораторий общественного здравоохранения обсудят изменения в разрешении на экстренное использование анализа CDC Trioplex RT-PCR (rRT-PCR), изучат возможность использования не -CDC разработал анализы и изучил рекомендации по тестированию нейтрализации уменьшения зубного налета в Пуэрто-Рико.
Спикер: Грейс Кубин, Ph.D.
Директор лаборатории
Департамент здравоохранения штата Техас
Ассоциация лабораторий общественного здравоохранения
Спикер: Мэтью Дж. Бинникер, доктор философии, доктор медицинских наук (ABMM)
Директор клинической вирусологии
Доцент кафедры лабораторной медицины и патологии
Клиника Мэйо
Американское общество микробиологов
Спикер: Кристи Оттендорфер, Ph.D.
Микробиолог
Руководитель группы рабочей группы по лаборатории Зика
Оперативный центр в чрезвычайных ситуациях
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Название: Зика в ED: Как персонал скорой помощи может принять меры
Дата: вторник, 1 ноября 2016 г.
Зика — это болезнь, переносимая комарами, которая в настоящее время распространяется во многих странах, на трех территориях США и в двух небольших районах Майами, Флорида, на континентальной части США.Больные вирусом Зика могут обращаться за помощью в различные медицинские учреждения, в том числе в отделения неотложной помощи. Во время этого звонка COCA поставщики неотложной помощи узнают важную информацию о вирусе Зика, например, как определить людей, подвергающихся риску заражения, в результате недавних поездок или полового акта с кем-то, инфицированным вирусом Зика, изучат важность протоколов скрининга и поймут вероятные симптомы, такие как как лихорадка, сыпь и конъюнктивит. Кроме того, специалисты по оказанию неотложной помощи узнают о ключевых медицинских оценках, клинических вмешательствах и общем процессе сообщения о случаях заболевания Зика.
Спикер (и): Моника Эскаланте Колбук, MSN, RN, CEN
, старший научный сотрудник, Институт качества, безопасности и предотвращения травм
Ассоциация медсестер скорой помощи
Спикер (и): Джон Марк Хиршон, доктор медицинских наук, магистр здравоохранения
Профессор, Департамент неотложной медицины и Департамент эпидемиологии и общественного здравоохранения
Школа медицины Университета Мэриленда
Американский колледж врачей неотложной помощи
Название: Обновление вируса Зика: Клинические лабораторные исследования и уход за младенцами с врожденной инфекцией, вызванной вирусом Зика
Дата: вторник, 23 августа 2016 г.
Инфекция вирусом Зика во время беременности является причиной микроцефалии и других серьезных дефектов головного мозга плода; однако полный спектр исходов у новорожденных еще не известен.CDC обновил свое временное руководство для поставщиков медицинских услуг в США, ухаживающих за младенцами, рожденными от матерей с возможной инфекцией вируса Зика во время беременности. Во время звонка COCA врачи узнают об этих обновленных временных клинических рекомендациях, которые включают рекомендации по оценке и лечению. Эта информация может помочь педиатрам лучше понять соответствующие тесты и клинические подходы для оценки и ведения младенцев, рожденных от матерей в Соединенных Штатах и их территориях, с лабораторными доказательствами вирусной инфекции Зика.
Спикер (и): Кейт Рассел, доктор медицинских наук, магистр здравоохранения
Сотрудник по эпидемиологической разведке
Отделение гриппа
Национальный центр иммунизации и респираторных заболеваний
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер (и): Сара Э. Оливер, доктор медицинских наук, MSPH
Сотрудник по эпидемиологической разведке
Отдел вирусных заболеваний
Национальный центр иммунизации и респираторных заболеваний
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Заголовок: Обновленное временное клиническое руководство по вирусу Зика для беременных женщин и данные по использованию противозачаточных средств для уменьшения числа беременностей, пораженных вирусом Зика
Дата: вторник, 9 августа 2016 г.
Главный приоритетCDC в борьбе с вирусом Зика — защита беременных женщин и их плодов от неблагоприятных последствий заражения вирусом Зика во время беременности.В результате CDC продолжает оценивать все имеющиеся доказательства и обновлять рекомендации по мере появления новой информации. CDC обновил свое временное руководство для поставщиков медицинских услуг в США, ухаживающих за беременными женщинами с возможным воздействием вируса Зика, на основе новых данных о лабораторных исследованиях для диагностики Зика. Основная стратегия уменьшения осложнений беременности, связанных с вирусом Зика, заключается в предотвращении беременности среди женщин, которые хотят отсрочить или избежать беременности. CDC опубликовал данные об использовании противозачаточных средств в штатах, где возможна передача вируса Зика через комары.Во время звонка COCA врачи узнают об обновленном временном руководстве CDC по уходу за беременными женщинами с возможным контактом с вирусом Зика, а также о стратегиях расширения доступа к методам и услугам контрацепции, чтобы свести к минимуму количество беременностей, затронутых вирусом Зика.
Спикер (и): Charlan D. Kroelinger, PhD, MA
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер (и): Эрин Берри-Биби, доктор медицины, магистр здравоохранения
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Университет Северной Каролины Чапел-Хилл
Спикер (и): Титилоп Одуйебо, доктор медицины, магистр здравоохранения
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Название: Обновленное временное клиническое руководство по вирусу Зика для женщин и мужчин репродуктивного возраста, передача вируса Зика половым путем и U.Регистр беременных S. Zika
Дата: вторник, 12 апреля 2016 г.
По мере того, как мы узнаем больше о том, как передается вирус Зика, медицинским работникам необходимы четкие инструкции, чтобы информировать своих пациентов о возможном контакте с вирусом Зика и о том, как предотвратить его передачу развивающимся плодам и половым партнерам.
Во время этого вебинара COCA врачи узнают о
- Обновленное временное руководство CDC по уходу за женщинами и мужчинами репродуктивного возраста с возможным заражением вирусом Зика
- Временное руководство CDC по профилактике передачи вируса Зика половым путем
- Профилактика передачи вируса Зика во время родов
- Устный перевод руководства по педиатрическому тестированию
- The U.Регистр беременных S. Zika
Спикер (и): Кристин К. Олсон, доктор медицины, магистр здравоохранения
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер (и): Джон Т. Брукс, доктор медицины
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер (и): Джефферсон Джонс, доктор медицины, магистр здравоохранения
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Название: Обновление CDC для клиницистов по вирусной болезни Зика внешний значок
Дата: 6 апреля 2016 г., среда
Вспышки вируса Зика произошли в Африке, Юго-Восточной Азии, на островах Тихого океана и в Северной и Южной Америке.Присоединяйтесь к нам в этом образовательном мероприятии, чтобы узнать самую свежую информацию о вирусе Зика и лучше понять роль клиницистов в раннем распознавании подозрительных случаев и сообщении о них.
Спикер (и): Джоан Коно, доктор медицины, доктор медицинских наук
Директор
Управление качества науки
Офис директора
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Название: Обновленная информация о временных клинических руководствах и рекомендациях по вирусу Зика
Дата: 25 февраля 2016 г., четверг
CDC продолжает оценку всех имеющихся данных для оценки воздействия болезни, вызванной вирусом Зика, во время беременности, а также у младенцев и детей с возможной инфекцией вирусом Зика.Обновленные временные руководящие принципы для медицинских работников, осуществляющих уход за беременными женщинами и женщинами репродуктивного возраста, включают новую рекомендацию предлагать серологическое тестирование бессимптомным беременным женщинам (женщинам, которые не сообщают о клинических заболеваниях, связанных с болезнью, вызванной вирусом Зика), которые путешествовали в районы с продолжающейся передачей инфекции. Вирус Зика. Обновленные рекомендации для медицинских работников, осуществляющих уход за младенцами и детьми с возможной инфекцией Зика, были расширены, чтобы охватить детей в возрасте до 18 лет, и содержат новую рекомендацию по оказанию рутинной помощи младенцам без отклонений от нормы при пренатальном или послеродовом УЗИ и нормальном физикальном обследовании. и чьи матери ранее не тестировались на вирусную инфекцию Зика.Руководство содержит новые рекомендации по уходу за младенцами и детьми с возможным острым заболеванием, вызванным вирусом Зика. Во время этой телеконференции COCA участники узнают, почему CDC обновил клинические рекомендации и как они могут использовать рекомендации для оценки и тестирования вируса Зика
. Спикер (и): Кэтрин Флеминг-Дутра, MD
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер (и): Эмили Петерсен, MD
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер (и): Алекса Остер, MD
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Название: Вирус Зика — что необходимо знать клиницистам
Дата: 26 января 2016 г., вторник
Вирус Зика — это переносимый комарами флавивирус, который передается в основном комарами Aedes aegypti , и примерно у 80% людей, инфицированных вирусом Зика, симптомы отсутствуют.Симптоматическое заболевание обычно легкое, с симптомами лихорадки, макулопапулезной сыпи, артралгии или негнойного конъюнктивита, которые обычно длятся от нескольких дней до одной недели. Спорадические случаи и вспышки болезни, вызванной вирусом Зика, имели место в странах Африки и Юго-Восточной Азии. В 2015 году первая местная передача вируса Зика в Северной и Южной Америке была зарегистрирована в Бразилии, а теперь местная передача зафиксирована в нескольких странах или территориях Северной и Южной Америки. Во время текущей вспышки в Бразилии было зарегистрировано заметное увеличение числа младенцев, рожденных с микроцефалией, и у некоторых младенцев с микроцефалией были подтверждены вирусные инфекции Зика.Однако неизвестно, сколько случаев микроцефалии связано с вирусной инфекцией Зика. Путешественники в районы, где продолжаются вспышки, рискуют заразиться и распространить вирус в новые районы, включая континентальную часть США. Во время этой телеконференции COCA участники узнают об эпидемиологии и клинических проявлениях болезни, вызванной вирусом Зика, и о том, как раннее выявление и сообщение о подозреваемых случаях могут снизить риск местной передачи.
Спикер (и): Ингрид Рабе, MBChB, MMed
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер (и): Дана Мини-Делман, MD, MPH, FACOG
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Спикер (и): Cynthia A.Мур, доктор медицинских наук,
Центры по контролю и профилактике заболеваний
2018 COCA Calls / Webinars Информация, резюме и наборы слайдов
Название: Вспышки гепатита А в нескольких государствах: Рекомендации и руководство CDC
Дата: 29 ноября 2018 г., четверг
Сапна Бамра Моррис, доктор медицины, магистр делового администрирования
Менеджер по инцидентам, Структура управления инцидентами Ответ на гепатит A
Отдел вирусного гепатита
Национальный центр профилактики ВИЧ / СПИДа, вирусных гепатитов, ЗППП и туберкулеза
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Моник Фостер, доктор медицины, магистр здравоохранения
Медицинский эпидемиолог
Отделение вирусных гепатитов
Национальный центр профилактики ВИЧ / СПИДа, вирусных гепатитов, ЗППП и туберкулеза
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Ноэль Нельсон, доктор медицинских наук, магистр здравоохранения
Медицинский сотрудник
Отделение вирусных гепатитов
Национальный центр профилактики ВИЧ / СПИДа, вирусных гепатитов, ЗППП и туберкулеза
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Заголовок: Острый вялый миелит (AFM): что необходимо знать поставщикам медицинских услуг
Дата: 13 ноября 2018 г., вторник
Спикеры:
Адриана Лопес, MPH
Эпидемиолог, группа по надзору за острым вялым миелитом
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Джанелл Раут, доктор медицины, MHS
Медицинский специалист, группа по лечению острого вялого миелита
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Manisha Patel, MD, MS
Руководитель группы по лечению острого вялого миелита
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Название: Рекомендации по применению вакцины против опоясывающего герпеса
Дата: 10 мая 2018 г., четверг
Спикеры:
Кэтлин Дулинг, доктор медицины, магистр здравоохранения
Медицинский сотрудник
Отделение вирусных заболеваний
Национальный центр иммунизации и респираторных заболеваний
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Название: Леопард без пятен: клиническая диагностика и лечение пятнистой лихорадки Скалистых гор
Дата: 12 апреля 2018 г., четверг
Спикеры:
Пейдж Армстронг, MD, MHS
Медицинский эпидемиолог
Национальный центр новых и зоонозных инфекционных заболеваний
Отдел трансмиссивных болезней
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Наоми Дрекслер, магистр здравоохранения
Эпидемиолог
Национальный центр новых и зоонозных инфекционных заболеваний
Отдел трансмиссивных болезней
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Заголовок: Совместный веб-семинар: Телеконференция в мэрии по жизненным показателям и звонок COCA — Координация клинических мер и ответных мер общественного здравоохранения на передозировки опиоидов в отделениях неотложной помощи
Дата: 13 марта 2018 г., вторник
Спикеры:
Контр-адмирал Энн Шухат, доктор медицины (USPHS)
Исполняющий обязанности директора CDC
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Вице-адмирал Джером М.Adams, MD, MPH (USPHS)
20 th Главный хирург США
Алана Виволо Кантор, доктор философии, магистр здравоохранения
Специалист по поведенческому здоровью
Отдел профилактики непреднамеренных травм
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Элизабет Сэмюэлс, доктор медицины, магистр здравоохранения
Научный сотрудник
Йельская национальная программа стипендий для клиницистов
Руководитель по внедрению
уровней помощи для отделений неотложной помощи и больниц Род-Айленда
для лечения передозировки и расстройства, связанного с употреблением опиоидов
Меган Маккормик, MPH
Эпидемиолог общественного здравоохранения, Программа профилактики передозировки наркотиков, Отдел общественного здравоохранения
и справедливости
Департамент здравоохранения штата Род-Айленд
Название: Не упускайте из виду оценку воздействия на окружающую среду — во время стихийных бедствий и каждый день
Дата: 13 февраля 2018 г., вторник
Спикеры:
Марья ГригорьевнаЗлатник, доктор медицины, MMS
Профессор, акушер / гинекология и медицина плода
Калифорнийский университет в Сан-Франциско
Дайан Э. Хиндман, MD PharmD, BScPhm
Сотрудник по медицинской токсикологии
ATSDR / CDC
Перри Шеффилд, доктор медицины, магистр здравоохранения
Доцент
Медицинская школа Икана на горе Синай
Брайан Тенча М. Эд.
Руководитель группы
Отделение экологической медицины / Отдел токсикологии и здравоохранения
ATSDR / CDC
Заголовок: Обновленная информация о сезоне гриппа 2017–2018 гг. Для клиницистов
Дата: 8 февраля 2018 г., четверг
Спикеры:
Алисия П.Budd, MPH
Эпидемиолог
Отделение гриппа
Национальный центр иммунизации и респираторных заболеваний
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Тим Уеки MD, MPH, MPP
Главный врач
Отделение гриппа
Национальный центр иммунизации и респираторных заболеваний
Центры по контролю и профилактике заболеваний
Весь коронавирус в мире может поместиться в банке из-под колы, и там будет достаточно места
Когда меня попросили подсчитать общий объем SARS-CoV-2 в мире для шоу BBC Radio 4 «Больше или меньше», я признаю, что понятия не имел, каким будет ответ.Моя жена предположила, что он будет размером с олимпийский бассейн. «Либо это, либо чайная ложка», — сказала она. «Обычно с такими вопросами возникает то или иное дело».
Итак, как приступить к расчету приблизительного общего объема? К счастью, у меня есть некоторая форма с такого рода крупномасштабными предварительными оценками, поскольку я выполнил ряд из них для моей книги «Математика жизни и смерти». Однако, прежде чем мы приступим к этому конкретному числовому путешествию, я должен уточнить, что это приближение, основанное на наиболее разумных предположениях, но я с радостью допущу, что есть места, где его можно улучшить.
Итак, с чего начать? Лучше сначала подсчитать, сколько в мире частиц SARS-CoV-2. Для этого нам нужно знать, сколько людей инфицировано. (Мы предполагаем, что люди, а не животные, являются наиболее значительным резервуаром вируса.)
Согласно статистическому сайту Our World in Data, полмиллиона человек ежедневно получают положительный результат теста на COVID. Тем не менее, мы знаем, что многие люди не будут включены в этот подсчет, потому что у них нет симптомов или они не хотят проходить тестирование, или потому, что широко распространенное тестирование недоступно в их стране.
Используя статистическое и эпидемиологическое моделирование, Институт показателей и оценок здоровья подсчитал, что истинное число людей, инфицированных каждый день, составляет около 3 миллионов.
Количество вируса, которое каждый из инфицированных в настоящее время людей будет носить с собой (их вирусная нагрузка), зависит от того, как давно они были инфицированы. Считается, что в среднем вирусная нагрузка повышается и достигает пика примерно через шесть дней после заражения, после чего постепенно снижается.
Из всех людей, инфицированных сейчас, те, кто заразился вчера, внесут небольшой вклад в общее количество.Те, кто был заражен пару дней назад, внесут немного больше. Зараженных три дня назад еще немного. В среднем у людей, инфицированных шесть дней назад, будет самая высокая вирусная нагрузка. Затем этот вклад будет снижен для людей, которые были инфицированы семь, восемь или девять дней назад, и так далее.
Последнее, что нам нужно знать, — это количество вирусных частиц, которые человек скрывает в любой момент во время заражения. Поскольку мы примерно знаем, как вирусная нагрузка меняется с течением времени, достаточно иметь оценку пиковой вирусной нагрузки.В неопубликованном исследовании были взяты данные о количестве вирусных частиц на грамм различных тканей у инфицированных обезьян и увеличен размер ткани, чтобы быть репрезентативным для человека. По их приблизительным оценкам пиковые вирусные нагрузки колеблются от 1 до 100 миллиардов вирусных частиц.
Давайте работать со значением в середине этого диапазона (среднее геометрическое) в 10 миллиардов. Если сложить все вклады в вирусную нагрузку каждого из 3 миллионов человек, заразившихся в каждый из предыдущих дней (при условии, что этот показатель в 3 миллиона примерно постоянный), то мы обнаружим, что существует примерно двести квадриллионов (2×10¹⁷ или двести миллионов миллиардов) вирусных частиц в мире одновременно.
Наглядная демонстрация того, как посчитать, сколько коронавируса в мире. Предоставлено: Вики Мартин.
Звучит как действительно большое число, и это так. Это примерно столько же, сколько песчинок на планете. Но при расчете общего объема мы должны помнить, что частицы SARS-CoV-2 чрезвычайно малы. Оценки диаметра колеблются от 80 до 120 нанометров. Один нанометр — это миллиардная часть метра. Для сравнения: SARS-CoV-2 примерно в 1000 раз тоньше человеческого волоса.Давайте использовать среднее значение диаметра 100 нанометров в нашем последующем вычислении.
Чтобы вычислить объем отдельной сферической вирусной частицы, нам нужно использовать формулу для объема сферы, которая, без сомнения, у всех на слуху:
V = 4 π r³ / 3
Если предположить, что SARS-CoV-2 имеет радиус 50 нанометров (в центре предполагаемого диапазона) для значения r , объем одной вирусной частицы составляет 523 000 нанометров³.
Умножение этого очень малого объема на количество частиц очень большого размера , которое мы вычислили ранее, и преобразование в значимые единицы дает нам общий объем около 120 миллилитров (мл). Если бы мы хотели собрать все эти вирусные частицы в одном месте, тогда нам нужно было бы помнить, что сферы не упаковываются идеально.
Упаковка с закрытой сферой
Если вы подумаете о пирамиде из апельсинов, которую вы можете увидеть в продуктовом магазине, вы вспомните, что значительная часть занимаемого ею места пуста.Фактически, лучшее, что вы можете сделать для минимизации пустого пространства, — это конфигурация, называемая «плотной сферической упаковкой», в которой пустое пространство занимает около 26% от общего объема. Это увеличивает общий собранный объем частиц SARS-CoV-2 примерно до 160 мл — достаточно маленького размера, чтобы поместиться примерно в шесть рюмок. Даже принимая верхний предел оценки диаметра и учитывая размер белков-шипов, SARS-CoV-2 все равно не заполнит банку кока-колы.
Около четверти этой пирамиды — пустое пространство.каттоз / ShutterstockОказывается, общий объем SARS-CoV-2 находился между приблизительными оценками моей жены чайной ложки и бассейна. Удивительно думать, что все проблемы, разрушения, лишения и человеческие жертвы, которые произошли за последний год, могут составить лишь несколько глотков того, что, несомненно, было бы худшим напитком в истории.
Поправка: оценка количества вирусных частиц — 2×10¹⁸ или два миллиарда миллиардов в мире одновременно — должна была составить 2×10¹⁷ или двести миллионов миллиардов.Это не меняет оценочного объема SARS-CoV-2 в мире, который по-прежнему составляет 160 мл.
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на цитокиновый профиль индивидуальных CD4 + и CD8 + Т-клеток селезенки
Clin Exp Immunol. 1999 Dec; 118 (3): 428–434.
P Di Francesco
* Департамент экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
R Gaziano
* Департамент экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
IA Casalinuovo
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
E Garaci
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
Институт Экспериментальной медицины, CNR, Римский университет, Рим, Италия
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
Для переписки: д-р Роберто Фальчетти, Институт экспериментальной медицины, C.N.R. Площадь Ricerca Roma Tor Vergata, Via Fosso del Cavaliere 00133, Рим, Италия. Электронная почта: [email protected] Эта статья цитируется другими статьями в PMC.Abstract
Мы проанализировали влияние кокаина, вводимого мышам во время дифференцировки in vivo эффекторных Т-клеток, стимулированных распознаванием антигена (вируса гриппа), на частоту IL-2-, IL-4- и интерферона. -gamma (IFN-γ) -экспрессирующие CD4 + и CD8 + Т-клетки.Каждому животному внутрибрюшинно вводили 10 мг / кг кокаина через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа A / PR8 (PR8). Это позволило определить фармакологические эффекты кокаина на Т-клетки на начальном этапе иммунного ответа, который характеризуется выработкой большого количества иммунорегуляторных цитокинов. Распределение Т-клеток CD4 + и CD8 + , продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, было проанализировано на неразделенных PR8-иммунных клетках селезенки, полученных от мышей, обработанных кокаином или носителем, и повторно стимулированных. in vitro с УФ-инактивированным вирусом PR8.Частоту Т-клеток, отдельно или совместно экспрессирующих три вышеуказанных цитокина, определяли на уровне отдельной клетки путем одновременного проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов. Параллельно с этим количественно определяли уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах с помощью ELISA. Результаты показали, что кокаин, вводимый во время индуцированной вирусом in vivo дифференцировки Т-клеток, вызывал увеличение как частот CD8 + Т-клеток по отдельности и коэкспрессии IL-2 и IFN-γ, так и уровней этих цитокинов в супернатантах культур клеток селезенки, рестимулированных вирусом, по сравнению с таковыми из необработанного контроля.Напротив, не было обнаружено никакого эффекта на IL-4-положительные Т-клетки CD8 + и на IL-2-, IFN-γ- и IL-4-положительные Т-клетки CD4 + . Наши результаты предполагают, что иммуномодулирующие эффекты кокаина могут быть связаны с повышающей регуляцией продукции IL-2 и IFN-γ Т-клетками CD8 + с профилем цитокинов 0 типа.
Ключевые слова: кокаин, Т-клетки, цитокин, in vivo , вирус гриппа
ВВЕДЕНИЕ
Доказательства взаимодействия между кокаином и иммунным ответом накапливались в течение последнего десятилетия.Исследования на людях и животных (обзор которых приведен в [1]) показали, что кокаин может влиять как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет, влияя на эффекторные функции различных иммунокомпетентных клеток, включая Т-клетки, естественные киллеры (NK), макрофаги и нейтрофилы.
В частности, было обнаружено, что кокаин модулирует выработку Т-клетками как in vitro, и in vivo, так и различных иммунорегуляторных цитокинов. В исследованиях in vitro было обнаружено, что кокаин ингибирует стимулированную конканавалином A (Con A) выработку клетками селезенки мышей IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 и гамма-интерферона (IFN-γ) в клетках селезенки. зависимым от концентрации способом [2, 3], а также для подавления продукции IFN-γ и IL-8 лимфоцитами периферической крови человека, стимулированными IL-2 [4].Таким образом, in vitro эффекты кокаина на продукцию цитокинов Т-клетками оказались в целом супрессивными [1]. Однако, используя разные методы стимуляции Т-клеток и определения продукции цитокинов, мы обнаружили некоторые расхождения. Фактически, в предыдущих исследованиях продукция цитокинов вызывалась поликлональной активацией и измерялась цитокин-специфическим ELISA в супернатантах клеточных культур. Иными словами, мы проанализировали влияние in vitro, кокаина на антиген-специфическую индуцированную продукцию цитокинов в ex vivo овальбумин (OVA) -иммунных спленоцитах мыши.Продукция цитокинов оценивалась как количественным анализом цитокинов в супернатантах культур с помощью ELISA, так и подсчетом одиночных цитокин-продуцирующих Т-клеток CD4 + , проводимого с помощью комбинированного проточного цитометрического анализа продукции внутрицитоплазматических цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов [5]. Результаты показали, что воздействие кокаина снижает уровни IL-2 и IFN-γ в супернатантах культур, не влияя на уровни IL-4 и IL-5, и увеличивает процент CD4 + T-клеток, положительных по IL-2 ( CD4 + / IL-2 + клеток), тогда как процентное содержание клеток CD4 + / IL-4 + не изменилось.Эти результаты предполагают, что кокаин оказывает различное влияние на продукцию различных цитокинов CD4 + Т-клетками после антиген-специфической стимуляции и что, по крайней мере in vitro , кокаин может действовать, препятствуя секреции, а не синтезу цитокины.
Меньше информации было собрано о in vivo эффектах кокаина на выработку цитокинов иммунными клетками. В одном исследовании [6] острый (1 мг / кг массы тела) или субхронический (1 мг / кг в день в течение 7 дней подряд) i.п. Было обнаружено, что введение кокаина самцам мышей BALB / c значительно снижает продукцию IL-2, IFN-γ и IL-4 клетками селезенки, стимулированными митогеном. Различные результаты были получены при изучении характера продукции цитокинов из клеток селезенки, стимулированных Con A, у самок мышей C57Bl / 6, которым внутрибрюшинно вводили увеличивающиеся дозы кокаина (с 10 до 40 мг / кг в день) в течение 6 недель [3]. Введение кокаина увеличивало продукцию IL-2 и IL-5, подавляло продукцию IL-4 и IL-10, но не влияло на IFN-γ.В недавнем исследовании [7] сообщалось, что острое введение кокаина (30 мг / кг) мышам за 1 день до сенсибилизации эритроцитами барана вызывало увеличение выработки IL-4 и IL-10 клетками селезенки, стимулированными анти-CD3, тогда как IL-2 и IFN-γ не были затронуты. Эти противоречивые результаты могут быть связаны с различными используемыми экспериментальными условиями (то есть уровнями доз кокаина, продолжительностью и частотой лечения, штаммом и полом использованной мыши), которые могут по-разному влиять на различные субпопуляции Т-клеток, продуцирующих цитокины.В настоящее время известно, что разные подмножества клеток CD4 + и CD8 + , определяемые профилем продукции цитокинов, участвуют в регуляции разных типов иммунитета [8–10]. Клетки типа 1 характеризуются секрецией IL-2, IFN-γ и лимфотоксинов; Клетки типа 2 характеризуются продуцированием ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 и ИЛ-13, тогда как третья популяция клеток, клетки типа 0, которые продуцируют цитокины как 1-го, так и 2-го типа, вероятно, составляет большинство циркулирующих Т-клеток [11].Считается, что продукция различных комбинаций цитокинов различными подгруппами CD4 + и CD8 + Т-клеток связана с различными иммунными функциями и что нарушение выработки и баланса цитокинов может привести к заболеванию [12]. . В настоящее время отсутствуют данные об эффектах in vivo кокаина на цитокиновые профили различных субпопуляций Т-клеток. Фактически, в вышеупомянутых исследованиях характер продукции цитокинов определялся исключительно путем измерения концентрации цитокинов в культуральных супернатантах неразделенных клеток селезенки, и поэтому прямое определение эффектов кокаина на продукцию цитокинов различными субпопуляциями Т-клеток было невозможно.
Настоящее исследование было разработано для оценки in vivo эффектов кокаина на цитокиновый профиль как антиген-специфических стимулированных Т-клеток CD4 + , так и CD8 + . Для этой цели мы использовали модельную систему [14], в которой неразделенные клетки селезенки, полученные от мышей, инъецированных внутрибрюшинно вирусом гриппа PR8, рестимулировали in vitro УФ-инактивированным вирусом PR8. Распределение Т-клеток CD4 + и CD8 + , продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, анализировали на уровне отдельных клеток путем одновременного проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов.Параллельно с этим количественно определяли уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах с помощью ELISA.
Результаты показывают, что введение кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, индуцировало увеличение количества отдельных CD8 + Т-клеток селезенки, по отдельности или совместно экспрессирующих IL-2 или IFN-γ, в то время как частота IL-4 -экспрессирующие CD8 + Т-клетки остались неизменными. Напротив, не было обнаружено никакого эффекта в частотах CD4 + Т-клеток, экспрессирующих любой из трех цитокинов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
Самцы мышей BALB / c (5-7 недель), приобретенные у Charles River Italia (Co., Италия) и подтвержденные как отрицательные по антителам к вирусу гепатита мышей, вирусу Сендай и микоплазме с помощью ELISA , были использованы.
Вирус и иммунизация
Вирус гриппа A / PR8 (h2N1) (PR8) выращивали в аллантоисных полостях 10-дневных куриных яиц с эмбрионами. УФ-инактивированный PR8 получали путем воздействия на вирус УФ-света (40 Вт, 254 нм, расстояние 8 см) в течение 5 мин.Иммунизируемым мышам внутрибрюшинно вводили 500 гемагглютинирующих единиц (HAU) / животное PR8.
Обработка кокаином
Гидрохлорид кокаина (SALARS, Комо, Италия) растворяли непосредственно перед использованием в 0,9% физиологическом растворе и разбавляли так, чтобы каждая мышь получала 0,2 мл раствора лекарственного средства. Контрольным мышам вводили 0,2 мл физиологического раствора. Каждому животному внутрибрюшинно вводили кокаин (10 мг / кг массы тела) или физиологический раствор через 6, 24, 48 и 72 ч после иммунизации PR8. Дозировка кокаина была выбрана на основании предыдущих экспериментальных работ [4,13], которые продемонстрировали, что кокаин, вводимый мышам в дозе 10 мг / кг в течение разных периодов времени, до 7 недель, оказывал значительное влияние на различные иммунологические реакции. параметры, не вызывая общетоксических эффектов.
Культуры клеток
Селезенки удаляли через 5 дней после иммунизации. Спленоциты помещали в 24-луночные планшеты (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) при 1 × 10 7 / мл (2 мл / лунку) в культуральной среде (RPMI 1640 плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% l-глутамин и 1% пенициллин-стрептомицин). Клетки культивировали отдельно или с 250 HAU / мл УФ-инактивированного PR8 в течение 24 часов при 37 ° C в увлажненном 5% CO 2 на воздухе.
Обнаружение цитокин-продуцирующих клеток с помощью внутриклеточного иммунофлуоресцентного окрашивания
Частоту цитокин-продуцирующих Т-клеток CD4 + и CD8 + определяли, как описано [14].Вкратце, культивированные клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 20 минут, ресуспендировали в PBS, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% NaN 3 , и разделяли на аликвоты для окрашивания в количестве 1 × 10 6 клеток. Затем добавляли MoAb крысы против CD4 мыши (клон RM4-5) или MoAb против CD8 мыши (клон 53-6.7), конъюгированные с Cy-хромом (30 мин при 4 ° C). Клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 0,5% BSA, 0,1% NaN 3 и 0,3% сапонина (Sigma, St Louis, MO), для окрашивания крысиным антимышиным цитокином MoAbs (0.25–1 мг MoAb / 10 6 клеток). Использовали следующие MoAb, все приобретенные у PharMingen (Сан-Диего, Калифорния): FITC анти-IL-2 (клон JES6-5h5), PE анти-IL4 (клон 11B11), PE анти-IFN-γ (клон XGM1. 2) и FITC анти-IFN-γ (клон XGM1.2). В качестве отрицательного контроля аликвоты клеточных суспензий инкубировали с нерелевантным совпадающим по изотипу MoAb, конъюгированным с тем же флуорохромом, что и образец. Цитофлуориметрический анализ проводили с использованием проточного цитометра FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).Десять тысяч клеток были вычислены в режиме списка и проанализированы с использованием программного обеспечения FACScan Research (Becton Dickinson). Файлы режима списка были проанализированы на предмет продукции цитокинов, сначала определив ворота анализа на анти-CD4 + или анти-CD8 + Т-клетках. Статистические маркеры были установлены с использованием нерелевантных согласованных по изотипу контролей в качестве эталона. Обычно допускается наличие 1% положительных клеток за пределами статистических маркеров в этих контролях. Более ранние результаты [14,15] показали отсутствие значительной иммунофлуоресценции цитокинов в фиксированных, но не проницаемых для сапонина клетках.
Количественное определение цитокинов в культуральных супернатантах
Концентрации IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах измеряли с помощью двустороннего сэндвич-ELISA, как описано ранее [5], с использованием коммерческих реагентов в условиях, рекомендованных производитель (PharMingen).
Статистический анализ
Статистическую значимость определяли с использованием критерия Стьюдента t .
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние кокаина на экспрессию IL-2, IL-4 и IFN-γ отдельными CD4
+ и CD8 + T-клеткамиМышам, иммунизированным PR8, давали кокаин (10 мг / кг вес тела) автора i.п. инъекция или физиологический раствор через 6, 24, 48 и 72 ч после иммунизации. Клетки селезенки от отдельных животных, получавших или не получавших кокаин, культивировали в течение 24 ч в присутствии УФ-инактивированного PR8. В качестве контроля были созданы культуры наивных клеток селезенки, стимулированных PR8, и иммунных клеток, лишенных инактивированного вируса. Эффект лечения исследовали путем оценки частот CD4 + и CD8 + Т-клеток, экспрессирующих IL-2, IL-4 или IFN-γ, как определено двухцветной проточной цитометрической процедурой, фиксированной и проницаемой для сапонина. клетки флуоресцентно окрашивали на поверхностную молекулу CD4 или CD8 и на один из трех внутрицитоплазматических цитокинов.Несмотря на отсутствие стадии амплификации, такой как присутствие брефельдина А или монензина во время рестимуляции in vitro , мы смогли обнаружить с помощью соответствующих изотипических контролей значительный процент цитокин-положительных клеток во всех PR8-стимулированных образцах. Точка отсечения между положительно и отрицательно окрашенными клетками была установлена на уровне 1% от изотипических контролей.
Как показано ранее [14], как CD4 + , так и CD8 + PR8-иммунные Т-клетки продуцировали IL-2, IL-4 и IFN-γ при рестимуляции in vitro вирусом ().Анализ частоты клеток, продуцирующих единственный цитокин, показал, что процент клеток, продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, в двух подгруппах клеток был по существу одинаковым. Лечение кокаином вызывало статистически значимое увеличение по сравнению с необработанными контролями количества отдельных CD8 + Т-клеток, экспрессирующих IL-2 () или IFN-γ (), в то время как частота экспрессирующих IL-4 CD8 + T ячейки остались без изменений (). Напротив, не было обнаружено статистически значимых различий в частотах CD4 + Т-клеток селезенки, экспрессирующих любой из трех цитокинов, у мышей, получавших и не получавших кокаин ().Никакого значительного количества цитокин-продуцирующих клеток не наблюдали в контрольных культурах наивных клеток селезенки, стимулированных PR8, и иммунных клеток, лишенных инактивированного вируса (данные не показаны).
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на частоту экспрессии IL-2-, IL-4- или IFN-γ CD8 + и CD4 + Т-клеток, как определено двухцветным потоком цитометрический анализ. Процент цитокин-продуцирующих клеток оценивали на in vitro PR8-рестимулированных клетках селезенки, полученных от PR8-иммунизированных животных, получавших (▪) или нет (□) кокаином.Все образцы анализировали на предмет экспрессии поверхностного антигена CD4 или CD8 по сравнению с внутриклеточной экспрессией IL-2 (a), IFN-γ (b) и IL-4 (c). Образцы анализировали путем первого стробирования в популяции CD4 + или CD8 + . Порог обнаружения положительных цитокин-продуцирующих клеток был установлен на 1% выше отрицательного контроля, состоящего из клеток, обработанных изотип-специфическим антителом. Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 19 и 20 мышей использовали для контрольной группы и группы, получавшей кокаин, соответственно.Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения. *** P <0,001. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на структуру коэкспрессии цитокинов отдельных CD8
+ Т-клетокПолученные данные показывают, что лечение кокаином влияет на индуцированную антиген-специфическую продукцию цитокинов исключительно в субпопуляции CD8 + Т-клеток. Для дальнейшего анализа эффектов in vivo кокаина на эту популяцию клеток мы определили коэкспрессию цитокинов в Т-клетках селезенки CD8 + , полученных от отдельных PR8-иммунных мышей, обработанных, как указано выше.Частоты CD8 + Т-клеток, индивидуально или совместно экспрессирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, определяли путем анализа с использованием трехцветной проточной цитометрии фиксированных и проницаемых для сапонина клеток, флуоресцентно окрашенных на поверхностную молекулу CD8. и для одной из следующих комбинаций двух внутрицитоплазматических цитокинов: IL-2 / IL-4, IL-2 / IFN-γ и IL-4 / IFN-γ. В соответствии с нашими предыдущими результатами [14] рестимуляция PR8 иммунных клеток селезенки приводила к активации различных субпопуляций Т-клеток CD8 + , экспрессирующих либо IL-2, IL-4 и IFN-γ, либо совместно экспрессирующие IL-4. / IL-2, IL-4 / IFN-γ и IL-2 / IFN-γ () Обработка кокаином индуцировала статистически значимое увеличение, по сравнению с необработанными контролями, субпопуляций CD8 + Т-клеток, индивидуально экспрессирующих IL-2 и IFN-γ, не затрагивая клетки, индивидуально экспрессирующие IL-4.Также мы обнаружили, что кокаин индуцировал значительное увеличение CD8 + T-клеток, коэкспрессирующих IL-2 и IFN-γ (), тогда как процент CD8 + T-клеток, дважды положительных по IL-2 / IL-4. и IFN-γ / IL-4 (соответственно) остались без изменений.
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на частоту CD8 + Т-клеток, экспрессирующих один или несколько цитокинов IL-4, IL-2 и IFN-γ, по данным трехцветного анализа проточной цитометрии .Процент цитокин-продуцирующих клеток оценивали на in vitro PR8-рестимулированных клетках селезенки, полученных от PR8-иммунизированных животных, получавших (▪) или нет (□) кокаином. Все образцы были проанализированы на предмет экспрессии одиночных и комбинаторных цитокинов (IFN-γ / IL-2 (a), IL-2 / IL-4 (b) и IFN-γ / IL-4 (c)). Образцы анализировали путем первого стробирования популяции CD8 + . Порог обнаружения положительных цитокин-продуцирующих клеток был установлен на 1% выше отрицательного контроля, состоящего из клеток, обработанных изотип-специфическим антителом.Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от шести и восьми отдельных мышей использовали для контрольной группы и группы, получавшей кокаин, соответственно. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения. * P <0,05; ** P <0,01. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на секрецию цитокинов клетками селезенки
Для оценки влияния введения кокаина in vivo на секрецию цитокинов, уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ были измерены с помощью ELISA в супернатантах те же образцы клеток селезенки, проверенные на внутриклеточные цитокины.Результаты () показали статистически значимое увеличение титров IL-2 и IFN-γ в супернатантах рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных от животных, получавших кокаин, по сравнению с необработанными животными. Напротив, титр IL-4 остался неизменным, что подтверждает результаты, полученные при определении фенотипов цитокинов отдельных клеток.
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на продукцию in vitro цитокинов клетками селезенки.Уровни IL-2 (a), IFN-γ (b) и IL-4 (c) определяли с помощью ELISA в супернатантах культур рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных от обработанных кокаином или необработанных PR8-иммунизированных животных. Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 12 отдельных мышей использовали для каждой группы. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с контрольными животными. * P <0,05. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на CD4
+ и CD8 + Частота Т-лимфоцитов селезенкиИммунофенотипический анализ Т-клеток селезенки не выявил значительных изменений в доле CD4 + или CD8 + Т-клеток между леченные кокаином и нелеченные мыши с иммунитетом к вирусу гриппа ().
Иммунофенотипический анализ Т-клеток селезенки, полученных от животных, иммунизированных PR8, получавших (▪) или нет (□) кокаин. Иммунофенотипы определяли с помощью анализа FACS и выражали в процентах от общего числа лимфоцитов. Все образцы были проанализированы на экспрессию CD4 + и CD8 + . Результаты представляют собой средние значения + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 12 отдельных мышей использовали для каждой группы. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения.NS, не имеет значения.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании мы проанализировали влияние повторного введения кокаина мышам через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа PR8 на частоту IL-2-, IL-4- и IFN. -γ-экспрессирующие CD4 + и CD8 + Т-клетки. Мы обнаружили, что в этих условиях воздействия кокаин индуцировал увеличение частоты рестимулированных вирусом иммунных CD8 + Т-клеток селезенки, однократно или совместно экспрессирующих IL-2 и IFN-γ, по сравнению с необработанными контролями, в то время как частота CD8 + Т-клеток, либо индивидуально экспрессирующих IL-4, либо коэкспрессирующих этот цитокин в комбинации с IL-2 или IFN-γ, не изменилась.Напротив, не было обнаружено никаких эффектов на частотах CD4 + Т-клеток, экспрессирующих любой из трех цитокинов. Мы также наблюдали значительное увеличение, по сравнению с необработанными животными, титров IL-2 и IFN-γ, но не IL-4, как определено с помощью ELISA в супернатантах рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных из обработанных кокаином. животные. Таким образом, наши данные показывают, что введение кокаина специфически повышает продукцию цитокинов типа 1 субпопуляцией Т-клеток CD8 + .
Наши результаты отличаются от предыдущих отчетов, некоторые из которых противоречивы. Фактически, ранее сообщалось, что острое (1 мг / кг) и субхроническое (1 мг / кг в день в течение 7 дней подряд) введение кокаина самцам мышей BALB / c снижает уровень IL-2, IFN-γ и IL-4. продуцирование митоген-стимулированными клетками селезенки [6], в то время как постоянное введение (40 мг / кг в день в течение 6 недель) самкам мышей C57Bl / 6 увеличивало выработку стимулированными Con A спленоцитами IL-2 и IL-5, и подавлял продукцию IL-4 и IL-10, тогда как IFN-γ не влиял [3].Наконец, острое введение кокаина (30 мг / кг) самкам мышей B6C3F 1 вызывало увеличение продукции IL-4 и IL-10 в клетках селезенки, стимулированных анти-CD3, в то время как продукция IL-2 и IFN-γ не влияла [ 7]. Остается определить, связаны ли различные эффекты с используемыми экспериментальными условиями или же отражают сложность фармакологического действия кокаина. Однако наша экспериментальная модель имеет по крайней мере три особенности, которые подтверждают «физиологическую» значимость полученных результатов.Во-первых, для генерации цитокин-продуцирующих Т-клеток мы использовали естественный вирус-специфический стимул, а не поликлональные стимулы, такие как Con A или анти-CD3, которые, как известно, вызывают различные паттерны продукции цитокинов [16,17]. Во-вторых, что касается схемы введения кокаина, каждому животному вводили препарат через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа. Это позволило определить эффекты in vivo кокаина на Т-клетки во время начальной стадии иммунного ответа, т.е.е. во время индуцированной антигеном (вирусом) дифференцировки наивных Т-клеток в «эффекторные» Т-клетки, которые характеризуются способностью продуцировать очень большие количества иммунорегуляторных цитокинов при рестимуляции антигена [18,19]. Кроме того, мы выбрали дозу кокаина (10 мг / кг), которая существенно не изменила процентное содержание как CD4 + , так и CD8 + Т-клеток, даже при введении в течение 30 дней подряд [13]. В-третьих, влияние кокаина на профили цитокинов одиночных CD4 + и CD8 + Т-клеток определяли в массовых культурах иммунных к вирусу клеток селезенки, рестимулированных PR8.Это обеспечивало условия для возможной перекрестной регуляторной активности различных субпопуляций Т-клеток посредством цитокинов, продуцируемых этими клетками.
Механизмы, с помощью которых кокаин может избирательно действовать на CD8 + Т-клетки, по крайней мере, в настоящей экспериментальной системе, остаются неясными. Однако ранее мы сообщали [14], что первичная иммунизация вирусом гриппа индуцирует гетерогенные паттерны цитокинового ответа как в CD4 + , так и в CD8 + Т-клетках, но со значительными различиями между этими двумя популяциями.Фактически, было обнаружено, что иммунные Т-клетки CD4 + экспрессируют почти исключительно один цитокин на клетку, тогда как иммунные Т-клетки CD8 + экспрессируют либо один цитокин, либо коэкспрессируют комбинации (т. Е. ИЛ-4 / ИЛ -2, IL-4 / IFN-γ и IL-2 / IFN-γ). Поскольку частоты CD8 + Т-клеток, коэкспрессирующих разные цитокины, статистически не различались, мы предположили, что эти клетки могут принадлежать к единственной подгруппе клеток типа 0, коэкспрессирующих все три цитокина; следовательно, иммунные к вирусу гриппа Т-клетки CD8 + могут экспрессировать, в отличие от Т-клеток CD4 + , фенотип типа 0 на одноклеточном уровне.Это может объяснить различные эффекты кокаина на две подгруппы Т-клеток. Фактически, клетки типа 0 представляют собой подмножество клеток, которые демонстрируют неограниченный цитокиновый профиль и которые, в отличие от клеток, уже преданных фенотипу 1 или 2 типа [9], могут быть индуцированы для приобретения определенного профиля цитокинов под влиянием различных иммунологические, гормональные и экологические факторы [9,20,21]. Обнаружение того, что кокаин увеличивает процент цитокин-положительных CD8 + Т-клеток, в то время как общий процент CD8 + Т-клеток в селезенке остается неизменным, подтверждает гипотезу о том, что кокаин может действовать, специфически изменяя характер продукции цитокинов в подмножество предшественников CD8 + Т-клеток, а не путем изменения их абсолютного количества или распределения.Кроме того, мы можем разумно исключить, что различия в действии кокаина на два подмножества Т-лимфоцитов могут зависеть от различий в экспериментальных условиях. Фактически, цитокиновые профили обеих популяций Т-клеток оценивали на клетках селезенки, полученных от одного и того же животного, в аналогичных условиях активации, в одно и то же время после рестимуляции вирусом гриппа, в присутствии одинаковой сложности иммунокомпетентных клеток и при сопоставимой чувствительности анализа.
Остается определить, может ли повышающая регуляция экспрессии IL-2 и IFN-γ Т-клетками CD8 + быть связана с иммунопатогенным механизмом, частично или полностью ответственным за индуцированные кокаином иммунные дисфункции.Однако недавние исследования [20–22] показали, что CD8 + Т-клетки можно разделить на две отдельные подгруппы, которые секретируют паттерны цитокинов 1-го или 2-го типа с разными физиологическими ролями. В частности, Т-клетки CD8 + типа 1, которые продуцируют IL-2 и IFN-γ, могут ингибировать ответы типа 2 (антитела) [20]. Таким образом, ингибирующие эффекты кокаина, например на ответ B-лимфоцитов на липополисахарид (LPS) и ответ антител на эритроциты барана [23–26], может быть вызван увеличением количества клеток CD8 + , экспрессирующих IL-2 и IFN-γ.
Наши результаты, демонстрирующие, что CD8 + Т-клетки являются мишенью (или одной из мишеней) иммунных эффектов кокаина, согласуются с более ранними данными, предполагающими, что кокаин может вызывать повышенную восприимчивость к инфекциям [1]. Действительно, CD8 + Т-клетки играют центральную роль либо в противовирусном иммунитете [27,28], либо во многих бактериальных и протозойных инфекциях [29]. Недавние исследования также четко установили, что эти клетки, в дополнение к их цитотоксической активности против инфицированных вирусом клеток, могут посредством дифференциальной продукции цитокинов играть регулирующую роль в дифференцировке и активации других иммунных клеток, участвующих в противовирусном ответе [10, 22,28,30].Таким образом, тот факт, что кокаин вызывает нарушение регуляции выработки CD8 + Т-клеточных цитокинов, предполагает, что с помощью этого механизма препарат может влиять на иммунный ответ на инфекции, а также может объяснять данные у людей, предполагающие повышенный риск заражения, включая ВИЧ. инфекция среди потребителей наркотиков [31–33].
В заключение мы продемонстрировали, что кокаин, вводимый во время дифференцировки in vivo эффекторных Т-клеток, стимулированных антигеном (вирусом гриппа), увеличивал как частоту CD8 + Т-клеток, отдельно или совместно экспрессирующих IL-2 и IFN- γ и титры этих цитокинов в супернатантах культур клеток селезенки, рестимулированных вирусом.Напротив, не было обнаружено никакого эффекта ни на IL-4-положительные Т-клетки CD8 + , ни на IL-2-, IFN-γ- и IL-4-положительные Т-клетки CD4 + . Наши результаты предполагают, что иммуномодулирующий эффект кокаина может быть связан с повышающей регуляцией продукции IL-2 и IFN-γ в CD8 + T-клетках цитокинового профиля типа 0.
Благодарности
Эта работа была поддержана Итальянским национальным исследовательским советом (CNR 97.02455, PS 04, 97.04808 ST74 и Target Project on Biotechnology 97.01093, PF49) и грантом от MURST 60%.
СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
1. Pellegrino T, Bayer MB. Влияние кокаина на функцию иммунных клеток in vivo. J Neuroimmunol. 1998. 83: 139–47. [PubMed] [Google Scholar] 2. Ватцл Б., Чен Дж., Скудери П., Пирожков С., Уотсон Р. Кокаин-индуцированное подавление секреции гамма-интерферона в лейкоцитах молодых и старых мышей C57BL / 6. Int J Immunopharmacol. 1992; 14: 1125–31. [PubMed] [Google Scholar] 3. Ван И, Хуанг Д.С., Уотсон Р.Р. Модуляция кокаина in vitro и in vivo на продукцию цитокинов у мышей C57BL / 6.Life Sci. 1994; 54: 401–11. [PubMed] [Google Scholar] 4. Мао Дж. Т., Хуанг М., Ван Дж., Шарма С., Ташкин Д. П., Дубинетт С. М.. Кокаин подавляет индуцированную IL2 продукцию IL8 и IFN-γ лимфоцитами периферической крови. Cell Immunol. 1996. 172: 217–23. [PubMed] [Google Scholar] 5. Фалчетти Р., Ди Франческо П., Ланзилли Г., Газиано Р., Казалинуово И. А., Раваньян Г., Гарачи Э. Эффекты кокаина in vitro на секрецию цитокинов, индуцированные в CD4 + Т-клетках селезенки мышей путем антиген-специфической стимуляции. Cell Immunol. 1995. 164: 57–64.[PubMed] [Google Scholar] 6. Ди Франческо П., Марини С., Пика Ф, Картезио Ф, Тубаро Е., Гарачи Е. Введение кокаина in vivo влияет на выработку лимфокинов и гуморальный иммунный ответ. Immunol Res. 1992; 11: 74–79. [PubMed] [Google Scholar] 7. Станулис Э.Д., Джордан С.Д., Роузкранс Дж. А., Холсэппл депутат. Нарушение баланса цитокинов Th2 / Th3 кокаином опосредуется кортикостероном. Иммунофармакология. 1997. 37: 25–33. [PubMed] [Google Scholar] 8. Мосманн Т.Р., Коффман Р.Л. Клетки Th2 и Th3: разные паттерны секреции лимфокинов приводят к различным функциональным свойствам.Анну Рев Иммунол. 1989; 7: 145–73. [PubMed] [Google Scholar] 9. Мосманн Т.Р., Сад С. Расширяющаяся вселенная подмножеств Т-клеток: Th2, Th3 и другие. Иммунол сегодня. 1996; 17: 138. [PubMed] [Google Scholar] 10. Картер Л.Л., Даттон Р.У. Тип 1 и тип 2: фундаментальная дихотомия для всех подмножеств Т-клеток. Curr Opin Immunol. 1996; 8: 336–42. [PubMed] [Google Scholar] 11. МакХью С., Дейтон Дж., Рифкин И., Юэн П. Кинетика и функциональные последствия продукции цитокинов Th2 и Th3 после активации мононуклеарных клеток периферической крови в первичной культуре.Eur J Immunol. 1996; 26: 1260–5. [PubMed] [Google Scholar] 12. Романьани С. Производство лимфокинов человеческими Т-клетками при болезненных состояниях. Анну Рев Иммунол. 1994; 12: 227–57. [PubMed] [Google Scholar] 13. Фалчетти Р., Ди Франческо П., Ланзилли Г., Газиано Р., Казалинуово И. А., Паламара А. Т., Раваньян Г., Гарачи Е. Определение коэкспрессии цитокинов в индивидуальных CD4 + и CD8 + Т-клетках селезенки от мышей, иммунных к вирусу гриппа. Иммунология. 1998. 95: 346–51. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Ди Франческо П., Фальчетти Р., Газиано Р., Ланцилли Дж., Белоги Л., Раваньян Дж., Гарачи Э.Дифференциальные эффекты кратковременного или длительного воздействия кокаина на клетки периферической крови мышей. Life Sci. 1994; 54: 2015–20. [PubMed] [Google Scholar] 15. Ассенмахер М., Шмитц Дж., Радбрук А. Проточно-цитометрическое определение цитокинов в активированных мышиных Т-хелперных лимфоцитах: экспрессия интерлейкина-10 в интерфероне-γ и в клетках, экспрессирующих интерлейкин-4. Eur J Immunol. 1994; 24: 1097–101. [PubMed] [Google Scholar] 16. Эль-Газали GEB, Поли С., Андерссон Г. и др. Количество интерлейкин-4- и интерферон-гамма-секретирующих Т-клеток человека, реагирующих с столбнячным анатоксином и микобактериальным антигеном PPD или фитогемагглютинином: различные профили ответа в зависимости от типа антигена, используемого для активации.Eur J Immunol. 1993; 11: 2740–5. [PubMed] [Google Scholar] 17. Сандер Б., Карделл С., Моллер Г., Моллер Е. Дифференциальная регуляция производства лимфокинов в митоген-стимулированных клетках селезенки мышей. Eur J Immunol. 1991; 8: 1887–92. [PubMed] [Google Scholar] 19. Суэйн С.Л., Крофт М., Дуби С., Хейнс Л., Роджерс П., Чжан Х, Брэдли Л.М. От наивных Т-клеток к памяти. Immunol Rev.1996; 150: 143–67. [PubMed] [Google Scholar] 20. Сад С., Маркотт Р., Мосманн Т. Цитокин индуцировал дифференцировку предшественников мышиных CD8 + Т-клеток в цитотоксические CD8 + Т-клетки, секретирующие цитокины Th2 или Th3.Иммунитет. 1995; 2: 271–9. [PubMed] [Google Scholar] 21. О’Гарра А. Цитокины вызывают развитие функционально гетерогенных субпопуляций Т-хелперных клеток. Иммунитет. 1998. 8: 275–83. [PubMed] [Google Scholar] 22. Крофт М., Картер Л., Суэйн С.Л., Даттон Р.В. Генерация поляризованных антигенспецифических эффекторных популяций CD8: реципрокное действие интерлейкина (IL) -4 и IL12 в стимулировании профилей цитокинов типа 2 по сравнению с типом 1. J Exp Med. 1994; 180: 1715–28. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23. Ватцель Б., Уотсон Р.Иммуномодуляция кокаином — нейроэндокринный ответ. Life Sci. 1990; 46: 1319–29. [PubMed] [Google Scholar] 24. Бирон CA. Цитокины в формировании иммунных ответов и разрешении вирусной инфекции. Curr Opin Immunol. 1994; 6: 530–8. [PubMed] [Google Scholar] 26. Скотт П., Кауфманн ОНА. Роль субпопуляций Т-клеток и цитокинов в регуляции инфекции. Иммунол сегодня. 1991; 10: 346–8. [PubMed] [Google Scholar] 27. Srikiatkhachorn A, Braciale TJ. Вирус-специфические CD8 + Т-лимфоциты подавляют секрецию цитокинов типа 2 Т-хелперами и легочную эозинофилию во время экспериментальной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции мышей.J Exp Med. 1997; 186: 421–32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Chaisson RE, Bacchetti P, Osmond P, Brodie B, Sande MA, Moss AR. Употребление кокаина и ВИЧ-инфекция среди потребителей инъекционных наркотиков в Сан-Франциско. ДЖАМА. 1989; 261: 561–5. [PubMed] [Google Scholar] 29. Энтони Дж. К., Влахов Д., Нельсон К. Э., Кон С., Астемборки Дж., Соломон Л. Новые данные о внутривенном употреблении кокаина и риске заражения вирусом иммунодефицита человека типа 1. Am J Epidemiol. 1991; 134: 1175–89. [PubMed] [Google Scholar] 30.Болдуин Г.К., Рот М.Д., Ташкин Д.П. Острые и хронические эффекты кокаина на иммунную систему и возможная связь со СПИДом. J Neuroimmunol. 1998. 83: 133–8. [PubMed] [Google Scholar]Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на профили цитокинов отдельных CD4 + и CD8 + Т-клеток селезенки
Clin Exp Immunol. 1999 Dec; 118 (3): 428–434.
P Di Francesco
* Департамент экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
R Gaziano
* Департамент экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
IA Casalinuovo
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
E Garaci
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
Институт Экспериментальной медицины, CNR, Римский университет, Рим, Италия
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
Для переписки: д-р Роберто Фальчетти, Институт экспериментальной медицины, C.N.R. Площадь Ricerca Roma Tor Vergata, Via Fosso del Cavaliere 00133, Рим, Италия. Электронная почта: [email protected] Эта статья цитируется другими статьями в PMC.Abstract
Мы проанализировали влияние кокаина, вводимого мышам во время дифференцировки in vivo эффекторных Т-клеток, стимулированных распознаванием антигена (вируса гриппа), на частоту IL-2-, IL-4- и интерферона. -gamma (IFN-γ) -экспрессирующие CD4 + и CD8 + Т-клетки.Каждому животному внутрибрюшинно вводили 10 мг / кг кокаина через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа A / PR8 (PR8). Это позволило определить фармакологические эффекты кокаина на Т-клетки на начальном этапе иммунного ответа, который характеризуется выработкой большого количества иммунорегуляторных цитокинов. Распределение Т-клеток CD4 + и CD8 + , продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, было проанализировано на неразделенных PR8-иммунных клетках селезенки, полученных от мышей, обработанных кокаином или носителем, и повторно стимулированных. in vitro с УФ-инактивированным вирусом PR8.Частоту Т-клеток, отдельно или совместно экспрессирующих три вышеуказанных цитокина, определяли на уровне отдельной клетки путем одновременного проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов. Параллельно с этим количественно определяли уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах с помощью ELISA. Результаты показали, что кокаин, вводимый во время индуцированной вирусом in vivo дифференцировки Т-клеток, вызывал увеличение как частот CD8 + Т-клеток по отдельности и коэкспрессии IL-2 и IFN-γ, так и уровней этих цитокинов в супернатантах культур клеток селезенки, рестимулированных вирусом, по сравнению с таковыми из необработанного контроля.Напротив, не было обнаружено никакого эффекта на IL-4-положительные Т-клетки CD8 + и на IL-2-, IFN-γ- и IL-4-положительные Т-клетки CD4 + . Наши результаты предполагают, что иммуномодулирующие эффекты кокаина могут быть связаны с повышающей регуляцией продукции IL-2 и IFN-γ Т-клетками CD8 + с профилем цитокинов 0 типа.
Ключевые слова: кокаин, Т-клетки, цитокин, in vivo , вирус гриппа
ВВЕДЕНИЕ
Доказательства взаимодействия между кокаином и иммунным ответом накапливались в течение последнего десятилетия.Исследования на людях и животных (обзор которых приведен в [1]) показали, что кокаин может влиять как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет, влияя на эффекторные функции различных иммунокомпетентных клеток, включая Т-клетки, естественные киллеры (NK), макрофаги и нейтрофилы.
В частности, было обнаружено, что кокаин модулирует выработку Т-клетками как in vitro, и in vivo, так и различных иммунорегуляторных цитокинов. В исследованиях in vitro было обнаружено, что кокаин ингибирует стимулированную конканавалином A (Con A) выработку клетками селезенки мышей IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 и гамма-интерферона (IFN-γ) в клетках селезенки. зависимым от концентрации способом [2, 3], а также для подавления продукции IFN-γ и IL-8 лимфоцитами периферической крови человека, стимулированными IL-2 [4].Таким образом, in vitro эффекты кокаина на продукцию цитокинов Т-клетками оказались в целом супрессивными [1]. Однако, используя разные методы стимуляции Т-клеток и определения продукции цитокинов, мы обнаружили некоторые расхождения. Фактически, в предыдущих исследованиях продукция цитокинов вызывалась поликлональной активацией и измерялась цитокин-специфическим ELISA в супернатантах клеточных культур. Иными словами, мы проанализировали влияние in vitro, кокаина на антиген-специфическую индуцированную продукцию цитокинов в ex vivo овальбумин (OVA) -иммунных спленоцитах мыши.Продукция цитокинов оценивалась как количественным анализом цитокинов в супернатантах культур с помощью ELISA, так и подсчетом одиночных цитокин-продуцирующих Т-клеток CD4 + , проводимого с помощью комбинированного проточного цитометрического анализа продукции внутрицитоплазматических цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов [5]. Результаты показали, что воздействие кокаина снижает уровни IL-2 и IFN-γ в супернатантах культур, не влияя на уровни IL-4 и IL-5, и увеличивает процент CD4 + T-клеток, положительных по IL-2 ( CD4 + / IL-2 + клеток), тогда как процентное содержание клеток CD4 + / IL-4 + не изменилось.Эти результаты предполагают, что кокаин оказывает различное влияние на продукцию различных цитокинов CD4 + Т-клетками после антиген-специфической стимуляции и что, по крайней мере in vitro , кокаин может действовать, препятствуя секреции, а не синтезу цитокины.
Меньше информации было собрано о in vivo эффектах кокаина на выработку цитокинов иммунными клетками. В одном исследовании [6] острый (1 мг / кг массы тела) или субхронический (1 мг / кг в день в течение 7 дней подряд) i.п. Было обнаружено, что введение кокаина самцам мышей BALB / c значительно снижает продукцию IL-2, IFN-γ и IL-4 клетками селезенки, стимулированными митогеном. Различные результаты были получены при изучении характера продукции цитокинов из клеток селезенки, стимулированных Con A, у самок мышей C57Bl / 6, которым внутрибрюшинно вводили увеличивающиеся дозы кокаина (с 10 до 40 мг / кг в день) в течение 6 недель [3]. Введение кокаина увеличивало продукцию IL-2 и IL-5, подавляло продукцию IL-4 и IL-10, но не влияло на IFN-γ.В недавнем исследовании [7] сообщалось, что острое введение кокаина (30 мг / кг) мышам за 1 день до сенсибилизации эритроцитами барана вызывало увеличение выработки IL-4 и IL-10 клетками селезенки, стимулированными анти-CD3, тогда как IL-2 и IFN-γ не были затронуты. Эти противоречивые результаты могут быть связаны с различными используемыми экспериментальными условиями (то есть уровнями доз кокаина, продолжительностью и частотой лечения, штаммом и полом использованной мыши), которые могут по-разному влиять на различные субпопуляции Т-клеток, продуцирующих цитокины.В настоящее время известно, что разные подмножества клеток CD4 + и CD8 + , определяемые профилем продукции цитокинов, участвуют в регуляции разных типов иммунитета [8–10]. Клетки типа 1 характеризуются секрецией IL-2, IFN-γ и лимфотоксинов; Клетки типа 2 характеризуются продуцированием ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 и ИЛ-13, тогда как третья популяция клеток, клетки типа 0, которые продуцируют цитокины как 1-го, так и 2-го типа, вероятно, составляет большинство циркулирующих Т-клеток [11].Считается, что продукция различных комбинаций цитокинов различными подгруппами CD4 + и CD8 + Т-клеток связана с различными иммунными функциями и что нарушение выработки и баланса цитокинов может привести к заболеванию [12]. . В настоящее время отсутствуют данные об эффектах in vivo кокаина на цитокиновые профили различных субпопуляций Т-клеток. Фактически, в вышеупомянутых исследованиях характер продукции цитокинов определялся исключительно путем измерения концентрации цитокинов в культуральных супернатантах неразделенных клеток селезенки, и поэтому прямое определение эффектов кокаина на продукцию цитокинов различными субпопуляциями Т-клеток было невозможно.
Настоящее исследование было разработано для оценки in vivo эффектов кокаина на цитокиновый профиль как антиген-специфических стимулированных Т-клеток CD4 + , так и CD8 + . Для этой цели мы использовали модельную систему [14], в которой неразделенные клетки селезенки, полученные от мышей, инъецированных внутрибрюшинно вирусом гриппа PR8, рестимулировали in vitro УФ-инактивированным вирусом PR8. Распределение Т-клеток CD4 + и CD8 + , продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, анализировали на уровне отдельных клеток путем одновременного проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов.Параллельно с этим количественно определяли уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах с помощью ELISA.
Результаты показывают, что введение кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, индуцировало увеличение количества отдельных CD8 + Т-клеток селезенки, по отдельности или совместно экспрессирующих IL-2 или IFN-γ, в то время как частота IL-4 -экспрессирующие CD8 + Т-клетки остались неизменными. Напротив, не было обнаружено никакого эффекта в частотах CD4 + Т-клеток, экспрессирующих любой из трех цитокинов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
Самцы мышей BALB / c (5-7 недель), приобретенные у Charles River Italia (Co., Италия) и подтвержденные как отрицательные по антителам к вирусу гепатита мышей, вирусу Сендай и микоплазме с помощью ELISA , были использованы.
Вирус и иммунизация
Вирус гриппа A / PR8 (h2N1) (PR8) выращивали в аллантоисных полостях 10-дневных куриных яиц с эмбрионами. УФ-инактивированный PR8 получали путем воздействия на вирус УФ-света (40 Вт, 254 нм, расстояние 8 см) в течение 5 мин.Иммунизируемым мышам внутрибрюшинно вводили 500 гемагглютинирующих единиц (HAU) / животное PR8.
Обработка кокаином
Гидрохлорид кокаина (SALARS, Комо, Италия) растворяли непосредственно перед использованием в 0,9% физиологическом растворе и разбавляли так, чтобы каждая мышь получала 0,2 мл раствора лекарственного средства. Контрольным мышам вводили 0,2 мл физиологического раствора. Каждому животному внутрибрюшинно вводили кокаин (10 мг / кг массы тела) или физиологический раствор через 6, 24, 48 и 72 ч после иммунизации PR8. Дозировка кокаина была выбрана на основании предыдущих экспериментальных работ [4,13], которые продемонстрировали, что кокаин, вводимый мышам в дозе 10 мг / кг в течение разных периодов времени, до 7 недель, оказывал значительное влияние на различные иммунологические реакции. параметры, не вызывая общетоксических эффектов.
Культуры клеток
Селезенки удаляли через 5 дней после иммунизации. Спленоциты помещали в 24-луночные планшеты (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) при 1 × 10 7 / мл (2 мл / лунку) в культуральной среде (RPMI 1640 плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% l-глутамин и 1% пенициллин-стрептомицин). Клетки культивировали отдельно или с 250 HAU / мл УФ-инактивированного PR8 в течение 24 часов при 37 ° C в увлажненном 5% CO 2 на воздухе.
Обнаружение цитокин-продуцирующих клеток с помощью внутриклеточного иммунофлуоресцентного окрашивания
Частоту цитокин-продуцирующих Т-клеток CD4 + и CD8 + определяли, как описано [14].Вкратце, культивированные клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 20 минут, ресуспендировали в PBS, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% NaN 3 , и разделяли на аликвоты для окрашивания в количестве 1 × 10 6 клеток. Затем добавляли MoAb крысы против CD4 мыши (клон RM4-5) или MoAb против CD8 мыши (клон 53-6.7), конъюгированные с Cy-хромом (30 мин при 4 ° C). Клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 0,5% BSA, 0,1% NaN 3 и 0,3% сапонина (Sigma, St Louis, MO), для окрашивания крысиным антимышиным цитокином MoAbs (0.25–1 мг MoAb / 10 6 клеток). Использовали следующие MoAb, все приобретенные у PharMingen (Сан-Диего, Калифорния): FITC анти-IL-2 (клон JES6-5h5), PE анти-IL4 (клон 11B11), PE анти-IFN-γ (клон XGM1. 2) и FITC анти-IFN-γ (клон XGM1.2). В качестве отрицательного контроля аликвоты клеточных суспензий инкубировали с нерелевантным совпадающим по изотипу MoAb, конъюгированным с тем же флуорохромом, что и образец. Цитофлуориметрический анализ проводили с использованием проточного цитометра FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).Десять тысяч клеток были вычислены в режиме списка и проанализированы с использованием программного обеспечения FACScan Research (Becton Dickinson). Файлы режима списка были проанализированы на предмет продукции цитокинов, сначала определив ворота анализа на анти-CD4 + или анти-CD8 + Т-клетках. Статистические маркеры были установлены с использованием нерелевантных согласованных по изотипу контролей в качестве эталона. Обычно допускается наличие 1% положительных клеток за пределами статистических маркеров в этих контролях. Более ранние результаты [14,15] показали отсутствие значительной иммунофлуоресценции цитокинов в фиксированных, но не проницаемых для сапонина клетках.
Количественное определение цитокинов в культуральных супернатантах
Концентрации IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах измеряли с помощью двустороннего сэндвич-ELISA, как описано ранее [5], с использованием коммерческих реагентов в условиях, рекомендованных производитель (PharMingen).
Статистический анализ
Статистическую значимость определяли с использованием критерия Стьюдента t .
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние кокаина на экспрессию IL-2, IL-4 и IFN-γ отдельными CD4
+ и CD8 + T-клеткамиМышам, иммунизированным PR8, давали кокаин (10 мг / кг вес тела) автора i.п. инъекция или физиологический раствор через 6, 24, 48 и 72 ч после иммунизации. Клетки селезенки от отдельных животных, получавших или не получавших кокаин, культивировали в течение 24 ч в присутствии УФ-инактивированного PR8. В качестве контроля были созданы культуры наивных клеток селезенки, стимулированных PR8, и иммунных клеток, лишенных инактивированного вируса. Эффект лечения исследовали путем оценки частот CD4 + и CD8 + Т-клеток, экспрессирующих IL-2, IL-4 или IFN-γ, как определено двухцветной проточной цитометрической процедурой, фиксированной и проницаемой для сапонина. клетки флуоресцентно окрашивали на поверхностную молекулу CD4 или CD8 и на один из трех внутрицитоплазматических цитокинов.Несмотря на отсутствие стадии амплификации, такой как присутствие брефельдина А или монензина во время рестимуляции in vitro , мы смогли обнаружить с помощью соответствующих изотипических контролей значительный процент цитокин-положительных клеток во всех PR8-стимулированных образцах. Точка отсечения между положительно и отрицательно окрашенными клетками была установлена на уровне 1% от изотипических контролей.
Как показано ранее [14], как CD4 + , так и CD8 + PR8-иммунные Т-клетки продуцировали IL-2, IL-4 и IFN-γ при рестимуляции in vitro вирусом ().Анализ частоты клеток, продуцирующих единственный цитокин, показал, что процент клеток, продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, в двух подгруппах клеток был по существу одинаковым. Лечение кокаином вызывало статистически значимое увеличение по сравнению с необработанными контролями количества отдельных CD8 + Т-клеток, экспрессирующих IL-2 () или IFN-γ (), в то время как частота экспрессирующих IL-4 CD8 + T ячейки остались без изменений (). Напротив, не было обнаружено статистически значимых различий в частотах CD4 + Т-клеток селезенки, экспрессирующих любой из трех цитокинов, у мышей, получавших и не получавших кокаин ().Никакого значительного количества цитокин-продуцирующих клеток не наблюдали в контрольных культурах наивных клеток селезенки, стимулированных PR8, и иммунных клеток, лишенных инактивированного вируса (данные не показаны).
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на частоту экспрессии IL-2-, IL-4- или IFN-γ CD8 + и CD4 + Т-клеток, как определено двухцветным потоком цитометрический анализ. Процент цитокин-продуцирующих клеток оценивали на in vitro PR8-рестимулированных клетках селезенки, полученных от PR8-иммунизированных животных, получавших (▪) или нет (□) кокаином.Все образцы анализировали на предмет экспрессии поверхностного антигена CD4 или CD8 по сравнению с внутриклеточной экспрессией IL-2 (a), IFN-γ (b) и IL-4 (c). Образцы анализировали путем первого стробирования в популяции CD4 + или CD8 + . Порог обнаружения положительных цитокин-продуцирующих клеток был установлен на 1% выше отрицательного контроля, состоящего из клеток, обработанных изотип-специфическим антителом. Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 19 и 20 мышей использовали для контрольной группы и группы, получавшей кокаин, соответственно.Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения. *** P <0,001. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на структуру коэкспрессии цитокинов отдельных CD8
+ Т-клетокПолученные данные показывают, что лечение кокаином влияет на индуцированную антиген-специфическую продукцию цитокинов исключительно в субпопуляции CD8 + Т-клеток. Для дальнейшего анализа эффектов in vivo кокаина на эту популяцию клеток мы определили коэкспрессию цитокинов в Т-клетках селезенки CD8 + , полученных от отдельных PR8-иммунных мышей, обработанных, как указано выше.Частоты CD8 + Т-клеток, индивидуально или совместно экспрессирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, определяли путем анализа с использованием трехцветной проточной цитометрии фиксированных и проницаемых для сапонина клеток, флуоресцентно окрашенных на поверхностную молекулу CD8. и для одной из следующих комбинаций двух внутрицитоплазматических цитокинов: IL-2 / IL-4, IL-2 / IFN-γ и IL-4 / IFN-γ. В соответствии с нашими предыдущими результатами [14] рестимуляция PR8 иммунных клеток селезенки приводила к активации различных субпопуляций Т-клеток CD8 + , экспрессирующих либо IL-2, IL-4 и IFN-γ, либо совместно экспрессирующие IL-4. / IL-2, IL-4 / IFN-γ и IL-2 / IFN-γ () Обработка кокаином индуцировала статистически значимое увеличение, по сравнению с необработанными контролями, субпопуляций CD8 + Т-клеток, индивидуально экспрессирующих IL-2 и IFN-γ, не затрагивая клетки, индивидуально экспрессирующие IL-4.Также мы обнаружили, что кокаин индуцировал значительное увеличение CD8 + T-клеток, коэкспрессирующих IL-2 и IFN-γ (), тогда как процент CD8 + T-клеток, дважды положительных по IL-2 / IL-4. и IFN-γ / IL-4 (соответственно) остались без изменений.
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на частоту CD8 + Т-клеток, экспрессирующих один или несколько цитокинов IL-4, IL-2 и IFN-γ, по данным трехцветного анализа проточной цитометрии .Процент цитокин-продуцирующих клеток оценивали на in vitro PR8-рестимулированных клетках селезенки, полученных от PR8-иммунизированных животных, получавших (▪) или нет (□) кокаином. Все образцы были проанализированы на предмет экспрессии одиночных и комбинаторных цитокинов (IFN-γ / IL-2 (a), IL-2 / IL-4 (b) и IFN-γ / IL-4 (c)). Образцы анализировали путем первого стробирования популяции CD8 + . Порог обнаружения положительных цитокин-продуцирующих клеток был установлен на 1% выше отрицательного контроля, состоящего из клеток, обработанных изотип-специфическим антителом.Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от шести и восьми отдельных мышей использовали для контрольной группы и группы, получавшей кокаин, соответственно. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения. * P <0,05; ** P <0,01. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на секрецию цитокинов клетками селезенки
Для оценки влияния введения кокаина in vivo на секрецию цитокинов, уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ были измерены с помощью ELISA в супернатантах те же образцы клеток селезенки, проверенные на внутриклеточные цитокины.Результаты () показали статистически значимое увеличение титров IL-2 и IFN-γ в супернатантах рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных от животных, получавших кокаин, по сравнению с необработанными животными. Напротив, титр IL-4 остался неизменным, что подтверждает результаты, полученные при определении фенотипов цитокинов отдельных клеток.
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на продукцию in vitro цитокинов клетками селезенки.Уровни IL-2 (a), IFN-γ (b) и IL-4 (c) определяли с помощью ELISA в супернатантах культур рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных от обработанных кокаином или необработанных PR8-иммунизированных животных. Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 12 отдельных мышей использовали для каждой группы. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с контрольными животными. * P <0,05. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на CD4
+ и CD8 + Частота Т-лимфоцитов селезенкиИммунофенотипический анализ Т-клеток селезенки не выявил значительных изменений в доле CD4 + или CD8 + Т-клеток между леченные кокаином и нелеченные мыши с иммунитетом к вирусу гриппа ().
Иммунофенотипический анализ Т-клеток селезенки, полученных от животных, иммунизированных PR8, получавших (▪) или нет (□) кокаин. Иммунофенотипы определяли с помощью анализа FACS и выражали в процентах от общего числа лимфоцитов. Все образцы были проанализированы на экспрессию CD4 + и CD8 + . Результаты представляют собой средние значения + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 12 отдельных мышей использовали для каждой группы. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения.NS, не имеет значения.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании мы проанализировали влияние повторного введения кокаина мышам через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа PR8 на частоту IL-2-, IL-4- и IFN. -γ-экспрессирующие CD4 + и CD8 + Т-клетки. Мы обнаружили, что в этих условиях воздействия кокаин индуцировал увеличение частоты рестимулированных вирусом иммунных CD8 + Т-клеток селезенки, однократно или совместно экспрессирующих IL-2 и IFN-γ, по сравнению с необработанными контролями, в то время как частота CD8 + Т-клеток, либо индивидуально экспрессирующих IL-4, либо коэкспрессирующих этот цитокин в комбинации с IL-2 или IFN-γ, не изменилась.Напротив, не было обнаружено никаких эффектов на частотах CD4 + Т-клеток, экспрессирующих любой из трех цитокинов. Мы также наблюдали значительное увеличение, по сравнению с необработанными животными, титров IL-2 и IFN-γ, но не IL-4, как определено с помощью ELISA в супернатантах рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных из обработанных кокаином. животные. Таким образом, наши данные показывают, что введение кокаина специфически повышает продукцию цитокинов типа 1 субпопуляцией Т-клеток CD8 + .
Наши результаты отличаются от предыдущих отчетов, некоторые из которых противоречивы. Фактически, ранее сообщалось, что острое (1 мг / кг) и субхроническое (1 мг / кг в день в течение 7 дней подряд) введение кокаина самцам мышей BALB / c снижает уровень IL-2, IFN-γ и IL-4. продуцирование митоген-стимулированными клетками селезенки [6], в то время как постоянное введение (40 мг / кг в день в течение 6 недель) самкам мышей C57Bl / 6 увеличивало выработку стимулированными Con A спленоцитами IL-2 и IL-5, и подавлял продукцию IL-4 и IL-10, тогда как IFN-γ не влиял [3].Наконец, острое введение кокаина (30 мг / кг) самкам мышей B6C3F 1 вызывало увеличение продукции IL-4 и IL-10 в клетках селезенки, стимулированных анти-CD3, в то время как продукция IL-2 и IFN-γ не влияла [ 7]. Остается определить, связаны ли различные эффекты с используемыми экспериментальными условиями или же отражают сложность фармакологического действия кокаина. Однако наша экспериментальная модель имеет по крайней мере три особенности, которые подтверждают «физиологическую» значимость полученных результатов.Во-первых, для генерации цитокин-продуцирующих Т-клеток мы использовали естественный вирус-специфический стимул, а не поликлональные стимулы, такие как Con A или анти-CD3, которые, как известно, вызывают различные паттерны продукции цитокинов [16,17]. Во-вторых, что касается схемы введения кокаина, каждому животному вводили препарат через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа. Это позволило определить эффекты in vivo кокаина на Т-клетки во время начальной стадии иммунного ответа, т.е.е. во время индуцированной антигеном (вирусом) дифференцировки наивных Т-клеток в «эффекторные» Т-клетки, которые характеризуются способностью продуцировать очень большие количества иммунорегуляторных цитокинов при рестимуляции антигена [18,19]. Кроме того, мы выбрали дозу кокаина (10 мг / кг), которая существенно не изменила процентное содержание как CD4 + , так и CD8 + Т-клеток, даже при введении в течение 30 дней подряд [13]. В-третьих, влияние кокаина на профили цитокинов одиночных CD4 + и CD8 + Т-клеток определяли в массовых культурах иммунных к вирусу клеток селезенки, рестимулированных PR8.Это обеспечивало условия для возможной перекрестной регуляторной активности различных субпопуляций Т-клеток посредством цитокинов, продуцируемых этими клетками.
Механизмы, с помощью которых кокаин может избирательно действовать на CD8 + Т-клетки, по крайней мере, в настоящей экспериментальной системе, остаются неясными. Однако ранее мы сообщали [14], что первичная иммунизация вирусом гриппа индуцирует гетерогенные паттерны цитокинового ответа как в CD4 + , так и в CD8 + Т-клетках, но со значительными различиями между этими двумя популяциями.Фактически, было обнаружено, что иммунные Т-клетки CD4 + экспрессируют почти исключительно один цитокин на клетку, тогда как иммунные Т-клетки CD8 + экспрессируют либо один цитокин, либо коэкспрессируют комбинации (т. Е. ИЛ-4 / ИЛ -2, IL-4 / IFN-γ и IL-2 / IFN-γ). Поскольку частоты CD8 + Т-клеток, коэкспрессирующих разные цитокины, статистически не различались, мы предположили, что эти клетки могут принадлежать к единственной подгруппе клеток типа 0, коэкспрессирующих все три цитокина; следовательно, иммунные к вирусу гриппа Т-клетки CD8 + могут экспрессировать, в отличие от Т-клеток CD4 + , фенотип типа 0 на одноклеточном уровне.Это может объяснить различные эффекты кокаина на две подгруппы Т-клеток. Фактически, клетки типа 0 представляют собой подмножество клеток, которые демонстрируют неограниченный цитокиновый профиль и которые, в отличие от клеток, уже преданных фенотипу 1 или 2 типа [9], могут быть индуцированы для приобретения определенного профиля цитокинов под влиянием различных иммунологические, гормональные и экологические факторы [9,20,21]. Обнаружение того, что кокаин увеличивает процент цитокин-положительных CD8 + Т-клеток, в то время как общий процент CD8 + Т-клеток в селезенке остается неизменным, подтверждает гипотезу о том, что кокаин может действовать, специфически изменяя характер продукции цитокинов в подмножество предшественников CD8 + Т-клеток, а не путем изменения их абсолютного количества или распределения.Кроме того, мы можем разумно исключить, что различия в действии кокаина на два подмножества Т-лимфоцитов могут зависеть от различий в экспериментальных условиях. Фактически, цитокиновые профили обеих популяций Т-клеток оценивали на клетках селезенки, полученных от одного и того же животного, в аналогичных условиях активации, в одно и то же время после рестимуляции вирусом гриппа, в присутствии одинаковой сложности иммунокомпетентных клеток и при сопоставимой чувствительности анализа.
Остается определить, может ли повышающая регуляция экспрессии IL-2 и IFN-γ Т-клетками CD8 + быть связана с иммунопатогенным механизмом, частично или полностью ответственным за индуцированные кокаином иммунные дисфункции.Однако недавние исследования [20–22] показали, что CD8 + Т-клетки можно разделить на две отдельные подгруппы, которые секретируют паттерны цитокинов 1-го или 2-го типа с разными физиологическими ролями. В частности, Т-клетки CD8 + типа 1, которые продуцируют IL-2 и IFN-γ, могут ингибировать ответы типа 2 (антитела) [20]. Таким образом, ингибирующие эффекты кокаина, например на ответ B-лимфоцитов на липополисахарид (LPS) и ответ антител на эритроциты барана [23–26], может быть вызван увеличением количества клеток CD8 + , экспрессирующих IL-2 и IFN-γ.
Наши результаты, демонстрирующие, что CD8 + Т-клетки являются мишенью (или одной из мишеней) иммунных эффектов кокаина, согласуются с более ранними данными, предполагающими, что кокаин может вызывать повышенную восприимчивость к инфекциям [1]. Действительно, CD8 + Т-клетки играют центральную роль либо в противовирусном иммунитете [27,28], либо во многих бактериальных и протозойных инфекциях [29]. Недавние исследования также четко установили, что эти клетки, в дополнение к их цитотоксической активности против инфицированных вирусом клеток, могут посредством дифференциальной продукции цитокинов играть регулирующую роль в дифференцировке и активации других иммунных клеток, участвующих в противовирусном ответе [10, 22,28,30].Таким образом, тот факт, что кокаин вызывает нарушение регуляции выработки CD8 + Т-клеточных цитокинов, предполагает, что с помощью этого механизма препарат может влиять на иммунный ответ на инфекции, а также может объяснять данные у людей, предполагающие повышенный риск заражения, включая ВИЧ. инфекция среди потребителей наркотиков [31–33].
В заключение мы продемонстрировали, что кокаин, вводимый во время дифференцировки in vivo эффекторных Т-клеток, стимулированных антигеном (вирусом гриппа), увеличивал как частоту CD8 + Т-клеток, отдельно или совместно экспрессирующих IL-2 и IFN- γ и титры этих цитокинов в супернатантах культур клеток селезенки, рестимулированных вирусом.Напротив, не было обнаружено никакого эффекта ни на IL-4-положительные Т-клетки CD8 + , ни на IL-2-, IFN-γ- и IL-4-положительные Т-клетки CD4 + . Наши результаты предполагают, что иммуномодулирующий эффект кокаина может быть связан с повышающей регуляцией продукции IL-2 и IFN-γ в CD8 + T-клетках цитокинового профиля типа 0.
Благодарности
Эта работа была поддержана Итальянским национальным исследовательским советом (CNR 97.02455, PS 04, 97.04808 ST74 и Target Project on Biotechnology 97.01093, PF49) и грантом от MURST 60%.
СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
1. Pellegrino T, Bayer MB. Влияние кокаина на функцию иммунных клеток in vivo. J Neuroimmunol. 1998. 83: 139–47. [PubMed] [Google Scholar] 2. Ватцл Б., Чен Дж., Скудери П., Пирожков С., Уотсон Р. Кокаин-индуцированное подавление секреции гамма-интерферона в лейкоцитах молодых и старых мышей C57BL / 6. Int J Immunopharmacol. 1992; 14: 1125–31. [PubMed] [Google Scholar] 3. Ван И, Хуанг Д.С., Уотсон Р.Р. Модуляция кокаина in vitro и in vivo на продукцию цитокинов у мышей C57BL / 6.Life Sci. 1994; 54: 401–11. [PubMed] [Google Scholar] 4. Мао Дж. Т., Хуанг М., Ван Дж., Шарма С., Ташкин Д. П., Дубинетт С. М.. Кокаин подавляет индуцированную IL2 продукцию IL8 и IFN-γ лимфоцитами периферической крови. Cell Immunol. 1996. 172: 217–23. [PubMed] [Google Scholar] 5. Фалчетти Р., Ди Франческо П., Ланзилли Г., Газиано Р., Казалинуово И. А., Раваньян Г., Гарачи Э. Эффекты кокаина in vitro на секрецию цитокинов, индуцированные в CD4 + Т-клетках селезенки мышей путем антиген-специфической стимуляции. Cell Immunol. 1995. 164: 57–64.[PubMed] [Google Scholar] 6. Ди Франческо П., Марини С., Пика Ф, Картезио Ф, Тубаро Е., Гарачи Е. Введение кокаина in vivo влияет на выработку лимфокинов и гуморальный иммунный ответ. Immunol Res. 1992; 11: 74–79. [PubMed] [Google Scholar] 7. Станулис Э.Д., Джордан С.Д., Роузкранс Дж. А., Холсэппл депутат. Нарушение баланса цитокинов Th2 / Th3 кокаином опосредуется кортикостероном. Иммунофармакология. 1997. 37: 25–33. [PubMed] [Google Scholar] 8. Мосманн Т.Р., Коффман Р.Л. Клетки Th2 и Th3: разные паттерны секреции лимфокинов приводят к различным функциональным свойствам.Анну Рев Иммунол. 1989; 7: 145–73. [PubMed] [Google Scholar] 9. Мосманн Т.Р., Сад С. Расширяющаяся вселенная подмножеств Т-клеток: Th2, Th3 и другие. Иммунол сегодня. 1996; 17: 138. [PubMed] [Google Scholar] 10. Картер Л.Л., Даттон Р.У. Тип 1 и тип 2: фундаментальная дихотомия для всех подмножеств Т-клеток. Curr Opin Immunol. 1996; 8: 336–42. [PubMed] [Google Scholar] 11. МакХью С., Дейтон Дж., Рифкин И., Юэн П. Кинетика и функциональные последствия продукции цитокинов Th2 и Th3 после активации мононуклеарных клеток периферической крови в первичной культуре.Eur J Immunol. 1996; 26: 1260–5. [PubMed] [Google Scholar] 12. Романьани С. Производство лимфокинов человеческими Т-клетками при болезненных состояниях. Анну Рев Иммунол. 1994; 12: 227–57. [PubMed] [Google Scholar] 13. Фалчетти Р., Ди Франческо П., Ланзилли Г., Газиано Р., Казалинуово И. А., Паламара А. Т., Раваньян Г., Гарачи Е. Определение коэкспрессии цитокинов в индивидуальных CD4 + и CD8 + Т-клетках селезенки от мышей, иммунных к вирусу гриппа. Иммунология. 1998. 95: 346–51. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Ди Франческо П., Фальчетти Р., Газиано Р., Ланцилли Дж., Белоги Л., Раваньян Дж., Гарачи Э.Дифференциальные эффекты кратковременного или длительного воздействия кокаина на клетки периферической крови мышей. Life Sci. 1994; 54: 2015–20. [PubMed] [Google Scholar] 15. Ассенмахер М., Шмитц Дж., Радбрук А. Проточно-цитометрическое определение цитокинов в активированных мышиных Т-хелперных лимфоцитах: экспрессия интерлейкина-10 в интерфероне-γ и в клетках, экспрессирующих интерлейкин-4. Eur J Immunol. 1994; 24: 1097–101. [PubMed] [Google Scholar] 16. Эль-Газали GEB, Поли С., Андерссон Г. и др. Количество интерлейкин-4- и интерферон-гамма-секретирующих Т-клеток человека, реагирующих с столбнячным анатоксином и микобактериальным антигеном PPD или фитогемагглютинином: различные профили ответа в зависимости от типа антигена, используемого для активации.Eur J Immunol. 1993; 11: 2740–5. [PubMed] [Google Scholar] 17. Сандер Б., Карделл С., Моллер Г., Моллер Е. Дифференциальная регуляция производства лимфокинов в митоген-стимулированных клетках селезенки мышей. Eur J Immunol. 1991; 8: 1887–92. [PubMed] [Google Scholar] 19. Суэйн С.Л., Крофт М., Дуби С., Хейнс Л., Роджерс П., Чжан Х, Брэдли Л.М. От наивных Т-клеток к памяти. Immunol Rev.1996; 150: 143–67. [PubMed] [Google Scholar] 20. Сад С., Маркотт Р., Мосманн Т. Цитокин индуцировал дифференцировку предшественников мышиных CD8 + Т-клеток в цитотоксические CD8 + Т-клетки, секретирующие цитокины Th2 или Th3.Иммунитет. 1995; 2: 271–9. [PubMed] [Google Scholar] 21. О’Гарра А. Цитокины вызывают развитие функционально гетерогенных субпопуляций Т-хелперных клеток. Иммунитет. 1998. 8: 275–83. [PubMed] [Google Scholar] 22. Крофт М., Картер Л., Суэйн С.Л., Даттон Р.В. Генерация поляризованных антигенспецифических эффекторных популяций CD8: реципрокное действие интерлейкина (IL) -4 и IL12 в стимулировании профилей цитокинов типа 2 по сравнению с типом 1. J Exp Med. 1994; 180: 1715–28. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23. Ватцель Б., Уотсон Р.Иммуномодуляция кокаином — нейроэндокринный ответ. Life Sci. 1990; 46: 1319–29. [PubMed] [Google Scholar] 24. Бирон CA. Цитокины в формировании иммунных ответов и разрешении вирусной инфекции. Curr Opin Immunol. 1994; 6: 530–8. [PubMed] [Google Scholar] 26. Скотт П., Кауфманн ОНА. Роль субпопуляций Т-клеток и цитокинов в регуляции инфекции. Иммунол сегодня. 1991; 10: 346–8. [PubMed] [Google Scholar] 27. Srikiatkhachorn A, Braciale TJ. Вирус-специфические CD8 + Т-лимфоциты подавляют секрецию цитокинов типа 2 Т-хелперами и легочную эозинофилию во время экспериментальной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции мышей.J Exp Med. 1997; 186: 421–32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Chaisson RE, Bacchetti P, Osmond P, Brodie B, Sande MA, Moss AR. Употребление кокаина и ВИЧ-инфекция среди потребителей инъекционных наркотиков в Сан-Франциско. ДЖАМА. 1989; 261: 561–5. [PubMed] [Google Scholar] 29. Энтони Дж. К., Влахов Д., Нельсон К. Э., Кон С., Астемборки Дж., Соломон Л. Новые данные о внутривенном употреблении кокаина и риске заражения вирусом иммунодефицита человека типа 1. Am J Epidemiol. 1991; 134: 1175–89. [PubMed] [Google Scholar] 30.Болдуин Г.К., Рот М.Д., Ташкин Д.П. Острые и хронические эффекты кокаина на иммунную систему и возможная связь со СПИДом. J Neuroimmunol. 1998. 83: 133–8. [PubMed] [Google Scholar]Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на профили цитокинов отдельных CD4 + и CD8 + Т-клеток селезенки
Clin Exp Immunol. 1999 Dec; 118 (3): 428–434.
P Di Francesco
* Департамент экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
R Gaziano
* Департамент экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
IA Casalinuovo
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
E Garaci
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
Институт Экспериментальной медицины, CNR, Римский университет, Рим, Италия
* Кафедра экспериментальной медицины и биохимических наук, Римский университет, Рим, Италия
Для переписки: д-р Роберто Фальчетти, Институт экспериментальной медицины, C.Н.Р. Площадь Ricerca Roma Tor Vergata, Via Fosso del Cavaliere 00133, Рим, Италия. Электронная почта: [email protected] Эта статья цитируется другими статьями в PMC.Abstract
Мы проанализировали влияние кокаина, вводимого мышам во время дифференцировки in vivo эффекторных Т-клеток, стимулированных распознаванием антигена (вируса гриппа), на частоту IL-2-, IL-4- и интерферона. -gamma (IFN-γ) -экспрессирующие CD4 + и CD8 + Т-клетки.Каждому животному внутрибрюшинно вводили 10 мг / кг кокаина через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа A / PR8 (PR8). Это позволило определить фармакологические эффекты кокаина на Т-клетки на начальном этапе иммунного ответа, который характеризуется выработкой большого количества иммунорегуляторных цитокинов. Распределение Т-клеток CD4 + и CD8 + , продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, было проанализировано на неразделенных PR8-иммунных клетках селезенки, полученных от мышей, обработанных кокаином или носителем, и повторно стимулированных. in vitro с УФ-инактивированным вирусом PR8.Частоту Т-клеток, отдельно или совместно экспрессирующих три вышеуказанных цитокина, определяли на уровне отдельной клетки путем одновременного проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов. Параллельно с этим количественно определяли уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах с помощью ELISA. Результаты показали, что кокаин, вводимый во время индуцированной вирусом in vivo дифференцировки Т-клеток, вызывал увеличение как частот CD8 + Т-клеток по отдельности и коэкспрессии IL-2 и IFN-γ, так и уровней этих цитокинов в супернатантах культур клеток селезенки, рестимулированных вирусом, по сравнению с таковыми из необработанного контроля.Напротив, не было обнаружено никакого эффекта на IL-4-положительные Т-клетки CD8 + и на IL-2-, IFN-γ- и IL-4-положительные Т-клетки CD4 + . Наши результаты предполагают, что иммуномодулирующие эффекты кокаина могут быть связаны с повышающей регуляцией продукции IL-2 и IFN-γ Т-клетками CD8 + с профилем цитокинов 0 типа.
Ключевые слова: кокаин, Т-клетки, цитокин, in vivo , вирус гриппа
ВВЕДЕНИЕ
Доказательства взаимодействия между кокаином и иммунным ответом накапливались в течение последнего десятилетия.Исследования на людях и животных (обзор которых приведен в [1]) показали, что кокаин может влиять как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет, влияя на эффекторные функции различных иммунокомпетентных клеток, включая Т-клетки, естественные киллеры (NK), макрофаги и нейтрофилы.
В частности, было обнаружено, что кокаин модулирует выработку Т-клетками как in vitro, и in vivo, так и различных иммунорегуляторных цитокинов. В исследованиях in vitro было обнаружено, что кокаин ингибирует стимулированную конканавалином A (Con A) выработку клетками селезенки мышей IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 и гамма-интерферона (IFN-γ) в клетках селезенки. зависимым от концентрации способом [2, 3], а также для подавления продукции IFN-γ и IL-8 лимфоцитами периферической крови человека, стимулированными IL-2 [4].Таким образом, in vitro эффекты кокаина на продукцию цитокинов Т-клетками оказались в целом супрессивными [1]. Однако, используя разные методы стимуляции Т-клеток и определения продукции цитокинов, мы обнаружили некоторые расхождения. Фактически, в предыдущих исследованиях продукция цитокинов вызывалась поликлональной активацией и измерялась цитокин-специфическим ELISA в супернатантах клеточных культур. Иными словами, мы проанализировали влияние in vitro, кокаина на антиген-специфическую индуцированную продукцию цитокинов в ex vivo овальбумин (OVA) -иммунных спленоцитах мыши.Продукция цитокинов оценивалась как количественным анализом цитокинов в супернатантах культур с помощью ELISA, так и подсчетом одиночных цитокин-продуцирующих Т-клеток CD4 + , проводимого с помощью комбинированного проточного цитометрического анализа продукции внутрицитоплазматических цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов [5]. Результаты показали, что воздействие кокаина снижает уровни IL-2 и IFN-γ в супернатантах культур, не влияя на уровни IL-4 и IL-5, и увеличивает процент CD4 + T-клеток, положительных по IL-2 ( CD4 + / IL-2 + клеток), тогда как процентное содержание клеток CD4 + / IL-4 + не изменилось.Эти результаты предполагают, что кокаин оказывает различное влияние на продукцию различных цитокинов CD4 + Т-клетками после антиген-специфической стимуляции и что, по крайней мере in vitro , кокаин может действовать, препятствуя секреции, а не синтезу цитокины.
Меньше информации было собрано о in vivo эффектах кокаина на выработку цитокинов иммунными клетками. В одном исследовании [6] острый (1 мг / кг массы тела) или субхронический (1 мг / кг в день в течение 7 дней подряд) i.п. Было обнаружено, что введение кокаина самцам мышей BALB / c значительно снижает продукцию IL-2, IFN-γ и IL-4 клетками селезенки, стимулированными митогеном. Различные результаты были получены при изучении характера продукции цитокинов из клеток селезенки, стимулированных Con A, у самок мышей C57Bl / 6, которым внутрибрюшинно вводили увеличивающиеся дозы кокаина (с 10 до 40 мг / кг в день) в течение 6 недель [3]. Введение кокаина увеличивало продукцию IL-2 и IL-5, подавляло продукцию IL-4 и IL-10, но не влияло на IFN-γ.В недавнем исследовании [7] сообщалось, что острое введение кокаина (30 мг / кг) мышам за 1 день до сенсибилизации эритроцитами барана вызывало увеличение выработки IL-4 и IL-10 клетками селезенки, стимулированными анти-CD3, тогда как IL-2 и IFN-γ не были затронуты. Эти противоречивые результаты могут быть связаны с различными используемыми экспериментальными условиями (то есть уровнями доз кокаина, продолжительностью и частотой лечения, штаммом и полом использованной мыши), которые могут по-разному влиять на различные субпопуляции Т-клеток, продуцирующих цитокины.В настоящее время известно, что разные подмножества клеток CD4 + и CD8 + , определяемые профилем продукции цитокинов, участвуют в регуляции разных типов иммунитета [8–10]. Клетки типа 1 характеризуются секрецией IL-2, IFN-γ и лимфотоксинов; Клетки типа 2 характеризуются продуцированием ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 и ИЛ-13, тогда как третья популяция клеток, клетки типа 0, которые продуцируют цитокины как 1-го, так и 2-го типа, вероятно, составляет большинство циркулирующих Т-клеток [11].Считается, что продукция различных комбинаций цитокинов различными подгруппами CD4 + и CD8 + Т-клеток связана с различными иммунными функциями и что нарушение выработки и баланса цитокинов может привести к заболеванию [12]. . В настоящее время отсутствуют данные об эффектах in vivo кокаина на цитокиновые профили различных субпопуляций Т-клеток. Фактически, в вышеупомянутых исследованиях характер продукции цитокинов определялся исключительно путем измерения концентрации цитокинов в культуральных супернатантах неразделенных клеток селезенки, и поэтому прямое определение эффектов кокаина на продукцию цитокинов различными субпопуляциями Т-клеток было невозможно.
Настоящее исследование было разработано для оценки in vivo эффектов кокаина на цитокиновый профиль как антиген-специфических стимулированных Т-клеток CD4 + , так и CD8 + . Для этой цели мы использовали модельную систему [14], в которой неразделенные клетки селезенки, полученные от мышей, инъецированных внутрибрюшинно вирусом гриппа PR8, рестимулировали in vitro УФ-инактивированным вирусом PR8. Распределение Т-клеток CD4 + и CD8 + , продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, анализировали на уровне отдельных клеток путем одновременного проточного цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов и экспрессии поверхностных антигенов.Параллельно с этим количественно определяли уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах с помощью ELISA.
Результаты показывают, что введение кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, индуцировало увеличение количества отдельных CD8 + Т-клеток селезенки, по отдельности или совместно экспрессирующих IL-2 или IFN-γ, в то время как частота IL-4 -экспрессирующие CD8 + Т-клетки остались неизменными. Напротив, не было обнаружено никакого эффекта в частотах CD4 + Т-клеток, экспрессирующих любой из трех цитокинов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
Самцы мышей BALB / c (5-7 недель), приобретенные у Charles River Italia (Co., Италия) и подтвержденные как отрицательные по антителам к вирусу гепатита мышей, вирусу Сендай и микоплазме с помощью ELISA , были использованы.
Вирус и иммунизация
Вирус гриппа A / PR8 (h2N1) (PR8) выращивали в аллантоисных полостях 10-дневных куриных яиц с эмбрионами. УФ-инактивированный PR8 получали путем воздействия на вирус УФ-света (40 Вт, 254 нм, расстояние 8 см) в течение 5 мин.Иммунизируемым мышам внутрибрюшинно вводили 500 гемагглютинирующих единиц (HAU) / животное PR8.
Обработка кокаином
Гидрохлорид кокаина (SALARS, Комо, Италия) растворяли непосредственно перед использованием в 0,9% физиологическом растворе и разбавляли так, чтобы каждая мышь получала 0,2 мл раствора лекарственного средства. Контрольным мышам вводили 0,2 мл физиологического раствора. Каждому животному внутрибрюшинно вводили кокаин (10 мг / кг массы тела) или физиологический раствор через 6, 24, 48 и 72 ч после иммунизации PR8. Дозировка кокаина была выбрана на основании предыдущих экспериментальных работ [4,13], которые продемонстрировали, что кокаин, вводимый мышам в дозе 10 мг / кг в течение разных периодов времени, до 7 недель, оказывал значительное влияние на различные иммунологические реакции. параметры, не вызывая общетоксических эффектов.
Культуры клеток
Селезенки удаляли через 5 дней после иммунизации. Спленоциты помещали в 24-луночные планшеты (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) при 1 × 10 7 / мл (2 мл / лунку) в культуральной среде (RPMI 1640 плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% l-глутамин и 1% пенициллин-стрептомицин). Клетки культивировали отдельно или с 250 HAU / мл УФ-инактивированного PR8 в течение 24 часов при 37 ° C в увлажненном 5% CO 2 на воздухе.
Обнаружение цитокин-продуцирующих клеток с помощью внутриклеточного иммунофлуоресцентного окрашивания
Частоту цитокин-продуцирующих Т-клеток CD4 + и CD8 + определяли, как описано [14].Вкратце, культивированные клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 20 минут, ресуспендировали в PBS, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% NaN 3 , и разделяли на аликвоты для окрашивания в количестве 1 × 10 6 клеток. Затем добавляли MoAb крысы против CD4 мыши (клон RM4-5) или MoAb против CD8 мыши (клон 53-6.7), конъюгированные с Cy-хромом (30 мин при 4 ° C). Клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 0,5% BSA, 0,1% NaN 3 и 0,3% сапонина (Sigma, St Louis, MO), для окрашивания крысиным антимышиным цитокином MoAbs (0.25–1 мг MoAb / 10 6 клеток). Использовали следующие MoAb, все приобретенные у PharMingen (Сан-Диего, Калифорния): FITC анти-IL-2 (клон JES6-5h5), PE анти-IL4 (клон 11B11), PE анти-IFN-γ (клон XGM1. 2) и FITC анти-IFN-γ (клон XGM1.2). В качестве отрицательного контроля аликвоты клеточных суспензий инкубировали с нерелевантным совпадающим по изотипу MoAb, конъюгированным с тем же флуорохромом, что и образец. Цитофлуориметрический анализ проводили с использованием проточного цитометра FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).Десять тысяч клеток были вычислены в режиме списка и проанализированы с использованием программного обеспечения FACScan Research (Becton Dickinson). Файлы режима списка были проанализированы на предмет продукции цитокинов, сначала определив ворота анализа на анти-CD4 + или анти-CD8 + Т-клетках. Статистические маркеры были установлены с использованием нерелевантных согласованных по изотипу контролей в качестве эталона. Обычно допускается наличие 1% положительных клеток за пределами статистических маркеров в этих контролях. Более ранние результаты [14,15] показали отсутствие значительной иммунофлуоресценции цитокинов в фиксированных, но не проницаемых для сапонина клетках.
Количественное определение цитокинов в культуральных супернатантах
Концентрации IL-2, IL-4 и IFN-γ в культуральных супернатантах измеряли с помощью двустороннего сэндвич-ELISA, как описано ранее [5], с использованием коммерческих реагентов в условиях, рекомендованных производитель (PharMingen).
Статистический анализ
Статистическую значимость определяли с использованием критерия Стьюдента t .
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние кокаина на экспрессию IL-2, IL-4 и IFN-γ отдельными CD4
+ и CD8 + T-клеткамиМышам, иммунизированным PR8, давали кокаин (10 мг / кг вес тела) автора i.п. инъекция или физиологический раствор через 6, 24, 48 и 72 ч после иммунизации. Клетки селезенки от отдельных животных, получавших или не получавших кокаин, культивировали в течение 24 ч в присутствии УФ-инактивированного PR8. В качестве контроля были созданы культуры наивных клеток селезенки, стимулированных PR8, и иммунных клеток, лишенных инактивированного вируса. Эффект лечения исследовали путем оценки частот CD4 + и CD8 + Т-клеток, экспрессирующих IL-2, IL-4 или IFN-γ, как определено двухцветной проточной цитометрической процедурой, фиксированной и проницаемой для сапонина. клетки флуоресцентно окрашивали на поверхностную молекулу CD4 или CD8 и на один из трех внутрицитоплазматических цитокинов.Несмотря на отсутствие стадии амплификации, такой как присутствие брефельдина А или монензина во время рестимуляции in vitro , мы смогли обнаружить с помощью соответствующих изотипических контролей значительный процент цитокин-положительных клеток во всех PR8-стимулированных образцах. Точка отсечения между положительно и отрицательно окрашенными клетками была установлена на уровне 1% от изотипических контролей.
Как показано ранее [14], как CD4 + , так и CD8 + PR8-иммунные Т-клетки продуцировали IL-2, IL-4 и IFN-γ при рестимуляции in vitro вирусом ().Анализ частоты клеток, продуцирующих единственный цитокин, показал, что процент клеток, продуцирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, в двух подгруппах клеток был по существу одинаковым. Лечение кокаином вызывало статистически значимое увеличение по сравнению с необработанными контролями количества отдельных CD8 + Т-клеток, экспрессирующих IL-2 () или IFN-γ (), в то время как частота экспрессирующих IL-4 CD8 + T ячейки остались без изменений (). Напротив, не было обнаружено статистически значимых различий в частотах CD4 + Т-клеток селезенки, экспрессирующих любой из трех цитокинов, у мышей, получавших и не получавших кокаин ().Никакого значительного количества цитокин-продуцирующих клеток не наблюдали в контрольных культурах наивных клеток селезенки, стимулированных PR8, и иммунных клеток, лишенных инактивированного вируса (данные не показаны).
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на частоту экспрессии IL-2-, IL-4- или IFN-γ CD8 + и CD4 + Т-клеток, как определено двухцветным потоком цитометрический анализ. Процент цитокин-продуцирующих клеток оценивали на in vitro PR8-рестимулированных клетках селезенки, полученных от PR8-иммунизированных животных, получавших (▪) или нет (□) кокаином.Все образцы анализировали на предмет экспрессии поверхностного антигена CD4 или CD8 по сравнению с внутриклеточной экспрессией IL-2 (a), IFN-γ (b) и IL-4 (c). Образцы анализировали путем первого стробирования в популяции CD4 + или CD8 + . Порог обнаружения положительных цитокин-продуцирующих клеток был установлен на 1% выше отрицательного контроля, состоящего из клеток, обработанных изотип-специфическим антителом. Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 19 и 20 мышей использовали для контрольной группы и группы, получавшей кокаин, соответственно.Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения. *** P <0,001. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на структуру коэкспрессии цитокинов отдельных CD8
+ Т-клетокПолученные данные показывают, что лечение кокаином влияет на индуцированную антиген-специфическую продукцию цитокинов исключительно в субпопуляции CD8 + Т-клеток. Для дальнейшего анализа эффектов in vivo кокаина на эту популяцию клеток мы определили коэкспрессию цитокинов в Т-клетках селезенки CD8 + , полученных от отдельных PR8-иммунных мышей, обработанных, как указано выше.Частоты CD8 + Т-клеток, индивидуально или совместно экспрессирующих IL-2, IL-4 и IFN-γ, определяли путем анализа с использованием трехцветной проточной цитометрии фиксированных и проницаемых для сапонина клеток, флуоресцентно окрашенных на поверхностную молекулу CD8. и для одной из следующих комбинаций двух внутрицитоплазматических цитокинов: IL-2 / IL-4, IL-2 / IFN-γ и IL-4 / IFN-γ. В соответствии с нашими предыдущими результатами [14] рестимуляция PR8 иммунных клеток селезенки приводила к активации различных субпопуляций Т-клеток CD8 + , экспрессирующих либо IL-2, IL-4 и IFN-γ, либо совместно экспрессирующие IL-4. / IL-2, IL-4 / IFN-γ и IL-2 / IFN-γ () Обработка кокаином индуцировала статистически значимое увеличение, по сравнению с необработанными контролями, субпопуляций CD8 + Т-клеток, индивидуально экспрессирующих IL-2 и IFN-γ, не затрагивая клетки, индивидуально экспрессирующие IL-4.Также мы обнаружили, что кокаин индуцировал значительное увеличение CD8 + T-клеток, коэкспрессирующих IL-2 и IFN-γ (), тогда как процент CD8 + T-клеток, дважды положительных по IL-2 / IL-4. и IFN-γ / IL-4 (соответственно) остались без изменений.
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на частоту CD8 + Т-клеток, экспрессирующих один или несколько цитокинов IL-4, IL-2 и IFN-γ, по данным трехцветного анализа проточной цитометрии .Процент цитокин-продуцирующих клеток оценивали на in vitro PR8-рестимулированных клетках селезенки, полученных от PR8-иммунизированных животных, получавших (▪) или нет (□) кокаином. Все образцы были проанализированы на предмет экспрессии одиночных и комбинаторных цитокинов (IFN-γ / IL-2 (a), IL-2 / IL-4 (b) и IFN-γ / IL-4 (c)). Образцы анализировали путем первого стробирования популяции CD8 + . Порог обнаружения положительных цитокин-продуцирующих клеток был установлен на 1% выше отрицательного контроля, состоящего из клеток, обработанных изотип-специфическим антителом.Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от шести и восьми отдельных мышей использовали для контрольной группы и группы, получавшей кокаин, соответственно. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения. * P <0,05; ** P <0,01. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на секрецию цитокинов клетками селезенки
Для оценки влияния введения кокаина in vivo на секрецию цитокинов, уровни IL-2, IL-4 и IFN-γ были измерены с помощью ELISA в супернатантах те же образцы клеток селезенки, проверенные на внутриклеточные цитокины.Результаты () показали статистически значимое увеличение титров IL-2 и IFN-γ в супернатантах рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных от животных, получавших кокаин, по сравнению с необработанными животными. Напротив, титр IL-4 остался неизменным, что подтверждает результаты, полученные при определении фенотипов цитокинов отдельных клеток.
Влияние введения кокаина мышам, иммунизированным вирусом гриппа, на продукцию in vitro цитокинов клетками селезенки.Уровни IL-2 (a), IFN-γ (b) и IL-4 (c) определяли с помощью ELISA в супернатантах культур рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных от обработанных кокаином или необработанных PR8-иммунизированных животных. Результаты представляют собой среднее значение + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 12 отдельных мышей использовали для каждой группы. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с контрольными животными. * P <0,05. NS, не имеет значения.
Влияние кокаина на CD4
+ и CD8 + Частота Т-лимфоцитов селезенкиИммунофенотипический анализ Т-клеток селезенки не выявил значительных изменений в доле CD4 + или CD8 + Т-клеток между леченные кокаином и нелеченные мыши с иммунитетом к вирусу гриппа ().
Иммунофенотипический анализ Т-клеток селезенки, полученных от животных, иммунизированных PR8, получавших (▪) или нет (□) кокаин. Иммунофенотипы определяли с помощью анализа FACS и выражали в процентах от общего числа лимфоцитов. Все образцы были проанализированы на экспрессию CD4 + и CD8 + . Результаты представляют собой средние значения + стандартное отклонение. для каждой группы. Клетки селезенки от 12 отдельных мышей использовали для каждой группы. Статистический анализ (критерий Стьюдента t ) проводили, сравнивая животных, получавших кокаин, с животными, не получавшими лечения.NS, не имеет значения.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании мы проанализировали влияние повторного введения кокаина мышам через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа PR8 на частоту IL-2-, IL-4- и IFN. -γ-экспрессирующие CD4 + и CD8 + Т-клетки. Мы обнаружили, что в этих условиях воздействия кокаин индуцировал увеличение частоты рестимулированных вирусом иммунных CD8 + Т-клеток селезенки, однократно или совместно экспрессирующих IL-2 и IFN-γ, по сравнению с необработанными контролями, в то время как частота CD8 + Т-клеток, либо индивидуально экспрессирующих IL-4, либо коэкспрессирующих этот цитокин в комбинации с IL-2 или IFN-γ, не изменилась.Напротив, не было обнаружено никаких эффектов на частотах CD4 + Т-клеток, экспрессирующих любой из трех цитокинов. Мы также наблюдали значительное увеличение, по сравнению с необработанными животными, титров IL-2 и IFN-γ, но не IL-4, как определено с помощью ELISA в супернатантах рестимулированных PR8 клеток селезенки, полученных из обработанных кокаином. животные. Таким образом, наши данные показывают, что введение кокаина специфически повышает продукцию цитокинов типа 1 субпопуляцией Т-клеток CD8 + .
Наши результаты отличаются от предыдущих отчетов, некоторые из которых противоречивы. Фактически, ранее сообщалось, что острое (1 мг / кг) и субхроническое (1 мг / кг в день в течение 7 дней подряд) введение кокаина самцам мышей BALB / c снижает уровень IL-2, IFN-γ и IL-4. продуцирование митоген-стимулированными клетками селезенки [6], в то время как постоянное введение (40 мг / кг в день в течение 6 недель) самкам мышей C57Bl / 6 увеличивало выработку стимулированными Con A спленоцитами IL-2 и IL-5, и подавлял продукцию IL-4 и IL-10, тогда как IFN-γ не влиял [3].Наконец, острое введение кокаина (30 мг / кг) самкам мышей B6C3F 1 вызывало увеличение продукции IL-4 и IL-10 в клетках селезенки, стимулированных анти-CD3, в то время как продукция IL-2 и IFN-γ не влияла [ 7]. Остается определить, связаны ли различные эффекты с используемыми экспериментальными условиями или же отражают сложность фармакологического действия кокаина. Однако наша экспериментальная модель имеет по крайней мере три особенности, которые подтверждают «физиологическую» значимость полученных результатов.Во-первых, для генерации цитокин-продуцирующих Т-клеток мы использовали естественный вирус-специфический стимул, а не поликлональные стимулы, такие как Con A или анти-CD3, которые, как известно, вызывают различные паттерны продукции цитокинов [16,17]. Во-вторых, что касается схемы введения кокаина, каждому животному вводили препарат через 6, 24, 48 и 72 часа после иммунизации вирусом гриппа. Это позволило определить эффекты in vivo кокаина на Т-клетки во время начальной стадии иммунного ответа, т.е.е. во время индуцированной антигеном (вирусом) дифференцировки наивных Т-клеток в «эффекторные» Т-клетки, которые характеризуются способностью продуцировать очень большие количества иммунорегуляторных цитокинов при рестимуляции антигена [18,19]. Кроме того, мы выбрали дозу кокаина (10 мг / кг), которая существенно не изменила процентное содержание как CD4 + , так и CD8 + Т-клеток, даже при введении в течение 30 дней подряд [13]. В-третьих, влияние кокаина на профили цитокинов одиночных CD4 + и CD8 + Т-клеток определяли в массовых культурах иммунных к вирусу клеток селезенки, рестимулированных PR8.Это обеспечивало условия для возможной перекрестной регуляторной активности различных субпопуляций Т-клеток посредством цитокинов, продуцируемых этими клетками.
Механизмы, с помощью которых кокаин может избирательно действовать на CD8 + Т-клетки, по крайней мере, в настоящей экспериментальной системе, остаются неясными. Однако ранее мы сообщали [14], что первичная иммунизация вирусом гриппа индуцирует гетерогенные паттерны цитокинового ответа как в CD4 + , так и в CD8 + Т-клетках, но со значительными различиями между этими двумя популяциями.Фактически, было обнаружено, что иммунные Т-клетки CD4 + экспрессируют почти исключительно один цитокин на клетку, тогда как иммунные Т-клетки CD8 + экспрессируют либо один цитокин, либо коэкспрессируют комбинации (т. Е. ИЛ-4 / ИЛ -2, IL-4 / IFN-γ и IL-2 / IFN-γ). Поскольку частоты CD8 + Т-клеток, коэкспрессирующих разные цитокины, статистически не различались, мы предположили, что эти клетки могут принадлежать к единственной подгруппе клеток типа 0, коэкспрессирующих все три цитокина; следовательно, иммунные к вирусу гриппа Т-клетки CD8 + могут экспрессировать, в отличие от Т-клеток CD4 + , фенотип типа 0 на одноклеточном уровне.Это может объяснить различные эффекты кокаина на две подгруппы Т-клеток. Фактически, клетки типа 0 представляют собой подмножество клеток, которые демонстрируют неограниченный цитокиновый профиль и которые, в отличие от клеток, уже преданных фенотипу 1 или 2 типа [9], могут быть индуцированы для приобретения определенного профиля цитокинов под влиянием различных иммунологические, гормональные и экологические факторы [9,20,21]. Обнаружение того, что кокаин увеличивает процент цитокин-положительных CD8 + Т-клеток, в то время как общий процент CD8 + Т-клеток в селезенке остается неизменным, подтверждает гипотезу о том, что кокаин может действовать, специфически изменяя характер продукции цитокинов в подмножество предшественников CD8 + Т-клеток, а не путем изменения их абсолютного количества или распределения.Кроме того, мы можем разумно исключить, что различия в действии кокаина на два подмножества Т-лимфоцитов могут зависеть от различий в экспериментальных условиях. Фактически, цитокиновые профили обеих популяций Т-клеток оценивали на клетках селезенки, полученных от одного и того же животного, в аналогичных условиях активации, в одно и то же время после рестимуляции вирусом гриппа, в присутствии одинаковой сложности иммунокомпетентных клеток и при сопоставимой чувствительности анализа.
Остается определить, может ли повышающая регуляция экспрессии IL-2 и IFN-γ Т-клетками CD8 + быть связана с иммунопатогенным механизмом, частично или полностью ответственным за индуцированные кокаином иммунные дисфункции.Однако недавние исследования [20–22] показали, что CD8 + Т-клетки можно разделить на две отдельные подгруппы, которые секретируют паттерны цитокинов 1-го или 2-го типа с разными физиологическими ролями. В частности, Т-клетки CD8 + типа 1, которые продуцируют IL-2 и IFN-γ, могут ингибировать ответы типа 2 (антитела) [20]. Таким образом, ингибирующие эффекты кокаина, например на ответ B-лимфоцитов на липополисахарид (LPS) и ответ антител на эритроциты барана [23–26], может быть вызван увеличением количества клеток CD8 + , экспрессирующих IL-2 и IFN-γ.
Наши результаты, демонстрирующие, что CD8 + Т-клетки являются мишенью (или одной из мишеней) иммунных эффектов кокаина, согласуются с более ранними данными, предполагающими, что кокаин может вызывать повышенную восприимчивость к инфекциям [1]. Действительно, CD8 + Т-клетки играют центральную роль либо в противовирусном иммунитете [27,28], либо во многих бактериальных и протозойных инфекциях [29]. Недавние исследования также четко установили, что эти клетки, в дополнение к их цитотоксической активности против инфицированных вирусом клеток, могут посредством дифференциальной продукции цитокинов играть регулирующую роль в дифференцировке и активации других иммунных клеток, участвующих в противовирусном ответе [10, 22,28,30].Таким образом, тот факт, что кокаин вызывает нарушение регуляции выработки CD8 + Т-клеточных цитокинов, предполагает, что с помощью этого механизма препарат может влиять на иммунный ответ на инфекции, а также может объяснять данные у людей, предполагающие повышенный риск заражения, включая ВИЧ. инфекция среди потребителей наркотиков [31–33].
В заключение мы продемонстрировали, что кокаин, вводимый во время дифференцировки in vivo эффекторных Т-клеток, стимулированных антигеном (вирусом гриппа), увеличивал как частоту CD8 + Т-клеток, отдельно или совместно экспрессирующих IL-2 и IFN- γ и титры этих цитокинов в супернатантах культур клеток селезенки, рестимулированных вирусом.Напротив, не было обнаружено никакого эффекта ни на IL-4-положительные Т-клетки CD8 + , ни на IL-2-, IFN-γ- и IL-4-положительные Т-клетки CD4 + . Наши результаты предполагают, что иммуномодулирующий эффект кокаина может быть связан с повышающей регуляцией продукции IL-2 и IFN-γ в CD8 + T-клетках цитокинового профиля типа 0.
Благодарности
Эта работа была поддержана Итальянским национальным исследовательским советом (CNR 97.02455, PS 04, 97.04808 ST74 и Target Project on Biotechnology 97.01093, PF49) и грантом от MURST 60%.
СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
1. Pellegrino T, Bayer MB. Влияние кокаина на функцию иммунных клеток in vivo. J Neuroimmunol. 1998. 83: 139–47. [PubMed] [Google Scholar] 2. Ватцл Б., Чен Дж., Скудери П., Пирожков С., Уотсон Р. Кокаин-индуцированное подавление секреции гамма-интерферона в лейкоцитах молодых и старых мышей C57BL / 6. Int J Immunopharmacol. 1992; 14: 1125–31. [PubMed] [Google Scholar] 3. Ван И, Хуанг Д.С., Уотсон Р.Р. Модуляция кокаина in vitro и in vivo на продукцию цитокинов у мышей C57BL / 6.Life Sci. 1994; 54: 401–11. [PubMed] [Google Scholar] 4. Мао Дж. Т., Хуанг М., Ван Дж., Шарма С., Ташкин Д. П., Дубинетт С. М.. Кокаин подавляет индуцированную IL2 продукцию IL8 и IFN-γ лимфоцитами периферической крови. Cell Immunol. 1996. 172: 217–23. [PubMed] [Google Scholar] 5. Фалчетти Р., Ди Франческо П., Ланзилли Г., Газиано Р., Казалинуово И. А., Раваньян Г., Гарачи Э. Эффекты кокаина in vitro на секрецию цитокинов, индуцированные в CD4 + Т-клетках селезенки мышей путем антиген-специфической стимуляции. Cell Immunol. 1995. 164: 57–64.[PubMed] [Google Scholar] 6. Ди Франческо П., Марини С., Пика Ф, Картезио Ф, Тубаро Е., Гарачи Е. Введение кокаина in vivo влияет на выработку лимфокинов и гуморальный иммунный ответ. Immunol Res. 1992; 11: 74–79. [PubMed] [Google Scholar] 7. Станулис Э.Д., Джордан С.Д., Роузкранс Дж. А., Холсэппл депутат. Нарушение баланса цитокинов Th2 / Th3 кокаином опосредуется кортикостероном. Иммунофармакология. 1997. 37: 25–33. [PubMed] [Google Scholar] 8. Мосманн Т.Р., Коффман Р.Л. Клетки Th2 и Th3: разные паттерны секреции лимфокинов приводят к различным функциональным свойствам.Анну Рев Иммунол. 1989; 7: 145–73. [PubMed] [Google Scholar] 9. Мосманн Т.Р., Сад С. Расширяющаяся вселенная подмножеств Т-клеток: Th2, Th3 и другие. Иммунол сегодня. 1996; 17: 138. [PubMed] [Google Scholar] 10. Картер Л.Л., Даттон Р.У. Тип 1 и тип 2: фундаментальная дихотомия для всех подмножеств Т-клеток. Curr Opin Immunol. 1996; 8: 336–42. [PubMed] [Google Scholar] 11. МакХью С., Дейтон Дж., Рифкин И., Юэн П. Кинетика и функциональные последствия продукции цитокинов Th2 и Th3 после активации мононуклеарных клеток периферической крови в первичной культуре.Eur J Immunol. 1996; 26: 1260–5. [PubMed] [Google Scholar] 12. Романьани С. Производство лимфокинов человеческими Т-клетками при болезненных состояниях. Анну Рев Иммунол. 1994; 12: 227–57. [PubMed] [Google Scholar] 13. Фалчетти Р., Ди Франческо П., Ланзилли Г., Газиано Р., Казалинуово И. А., Паламара А. Т., Раваньян Г., Гарачи Е. Определение коэкспрессии цитокинов в индивидуальных CD4 + и CD8 + Т-клетках селезенки от мышей, иммунных к вирусу гриппа. Иммунология. 1998. 95: 346–51. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Ди Франческо П., Фальчетти Р., Газиано Р., Ланцилли Дж., Белоги Л., Раваньян Дж., Гарачи Э.Дифференциальные эффекты кратковременного или длительного воздействия кокаина на клетки периферической крови мышей. Life Sci. 1994; 54: 2015–20. [PubMed] [Google Scholar] 15. Ассенмахер М., Шмитц Дж., Радбрук А. Проточно-цитометрическое определение цитокинов в активированных мышиных Т-хелперных лимфоцитах: экспрессия интерлейкина-10 в интерфероне-γ и в клетках, экспрессирующих интерлейкин-4. Eur J Immunol. 1994; 24: 1097–101. [PubMed] [Google Scholar] 16. Эль-Газали GEB, Поли С., Андерссон Г. и др. Количество интерлейкин-4- и интерферон-гамма-секретирующих Т-клеток человека, реагирующих с столбнячным анатоксином и микобактериальным антигеном PPD или фитогемагглютинином: различные профили ответа в зависимости от типа антигена, используемого для активации.Eur J Immunol. 1993; 11: 2740–5. [PubMed] [Google Scholar] 17. Сандер Б., Карделл С., Моллер Г., Моллер Е. Дифференциальная регуляция производства лимфокинов в митоген-стимулированных клетках селезенки мышей. Eur J Immunol. 1991; 8: 1887–92. [PubMed] [Google Scholar] 19. Суэйн С.Л., Крофт М., Дуби С., Хейнс Л., Роджерс П., Чжан Х, Брэдли Л.М. От наивных Т-клеток к памяти. Immunol Rev.1996; 150: 143–67. [PubMed] [Google Scholar] 20. Сад С., Маркотт Р., Мосманн Т. Цитокин индуцировал дифференцировку предшественников мышиных CD8 + Т-клеток в цитотоксические CD8 + Т-клетки, секретирующие цитокины Th2 или Th3.Иммунитет. 1995; 2: 271–9. [PubMed] [Google Scholar] 21. О’Гарра А. Цитокины вызывают развитие функционально гетерогенных субпопуляций Т-хелперных клеток. Иммунитет. 1998. 8: 275–83. [PubMed] [Google Scholar] 22. Крофт М., Картер Л., Суэйн С.Л., Даттон Р.В. Генерация поляризованных антигенспецифических эффекторных популяций CD8: реципрокное действие интерлейкина (IL) -4 и IL12 в стимулировании профилей цитокинов типа 2 по сравнению с типом 1. J Exp Med. 1994; 180: 1715–28. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23. Ватцель Б., Уотсон Р.Иммуномодуляция кокаином — нейроэндокринный ответ. Life Sci. 1990; 46: 1319–29. [PubMed] [Google Scholar] 24. Бирон CA. Цитокины в формировании иммунных ответов и разрешении вирусной инфекции. Curr Opin Immunol. 1994; 6: 530–8. [PubMed] [Google Scholar] 26. Скотт П., Кауфманн ОНА. Роль субпопуляций Т-клеток и цитокинов в регуляции инфекции. Иммунол сегодня. 1991; 10: 346–8. [PubMed] [Google Scholar] 27. Srikiatkhachorn A, Braciale TJ. Вирус-специфические CD8 + Т-лимфоциты подавляют секрецию цитокинов типа 2 Т-хелперами и легочную эозинофилию во время экспериментальной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции мышей.J Exp Med. 1997; 186: 421–32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Chaisson RE, Bacchetti P, Osmond P, Brodie B, Sande MA, Moss AR. Употребление кокаина и ВИЧ-инфекция среди потребителей инъекционных наркотиков в Сан-Франциско. ДЖАМА. 1989; 261: 561–5. [PubMed] [Google Scholar] 29. Энтони Дж. К., Влахов Д., Нельсон К. Э., Кон С., Астемборки Дж., Соломон Л. Новые данные о внутривенном употреблении кокаина и риске заражения вирусом иммунодефицита человека типа 1. Am J Epidemiol. 1991; 134: 1175–89. [PubMed] [Google Scholar] 30.Болдуин Г.К., Рот М.Д., Ташкин Д.П. Острые и хронические эффекты кокаина на иммунную систему и возможная связь со СПИДом. J Neuroimmunol. 1998. 83: 133–8. [PubMed] [Google Scholar]Как компания Coca-Cola реагирует на вспышку коронавируса
человек во всем мире пострадали от пандемии коронавируса. В Coca-Cola мы вносим свой вклад в предотвращение дальнейшего распространения вируса, а также поддерживаем потребности наших клиентов, потребителей, сотрудников и сообществ.
Мы ставим — и всегда будем — ставить здоровье, безопасность людей на первое место. Наш подход основан на цели нашей компании, которая гарантирует, что мы постоянно стремимся изменить ситуацию к лучшему для людей в наших сообществах и на наших рабочих местах.
Мы постоянно следим за развитием ситуации и адаптируем наши усилия и ответы.
Вот некоторые из способов, которыми мы защищаем наших сотрудников и обслуживаем наши сообщества и клиентов в это трудное время.
Защита здоровья и благополучия сотрудниковБезопасность сотрудников системы Coca-Cola — наш главный приоритет. Во всем мире местные команды внимательно следят за рекомендациями органов здравоохранения по защите здоровья и безопасности сотрудников в офисах, на производстве, на объектах распределения и розничной торговли.
Приоритет безопасности на производственных и торговых объектахЧтобы гарантировать, что мы можем продолжать производить напитки, в которых нуждаются наши сообщества, наши производственные и распределительные предприятия продолжают работать, но изменили свои методы работы, чтобы защитить безопасность и благополучие каждого.
С момента начала вспышки коронавируса мы внедрили дополнительные процедуры очистки и дезинфекции, уделяя особое внимание поверхностям, подверженным сильному касанию, и предприняли шаги, чтобы ограничить посещение наших объектов посетителями.
В некоторых местах водители службы доставки не покидают свои грузовики, что сокращает личное общение. Некоторые производственные предприятия внедрили раздельные смены, чтобы избежать контакта между сменами.
Мы усилили правила гигиены и воздействия на наших сотрудников.Если нам станет известно, что сотрудник болен или имел прямой или косвенный контакт с кем-то, кто инфицирован COVID-19, мы незамедлительно внедрим наши протоколы изоляции и санитарной обработки и начнем все необходимые карантины в соответствии с указаниями местных органов здравоохранения.
Поощрение удаленной работыВ соответствии с рекомендациями по сокращению массовых собраний и усилению социального дистанцирования, The Coca-Cola Company попросила большинство офисных сотрудников работать удаленно.Сюда входят сотрудники, базирующиеся в глобальной штаб-квартире компании в Атланте, а также в других местах по всему миру.
Ограничение проездаНа данный момент мы приостановили большинство поездок. Это касается как международных, так и внутренних поездок.
Обслуживание клиентов и потребителейС момента начала вспышки коронавируса мы были сосредоточены на обеспечении безопасной доставки наших продуктов в магазины и сообщества, которые в них нуждаются, принимая все меры предосторожности для защиты благополучия наших сотрудников.
Местные продуктовые магазины, розничные торговцы и рестораны прилагают все усилия, чтобы семьи могли получить продукты, напитки и товары, в которых они нуждаются в это трудное время. Мы делаем все возможное, чтобы поддержать эти предприятия и всех, кого они обслуживают.
Обеспечение безопасности и доступности продукцииБезопасность и качество нашей продукции являются для нас главными приоритетами, и мы можем с уверенностью сказать, что наша продукция безопасна.По данным Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, передачи коронавируса через пищевые продукты или их упаковку не известно.
Тем не менее, мы принимаем дополнительные меры предосторожности, чтобы гарантировать гигиеническое обращение с продуктами на каждом этапе, от производственных помещений до точек продаж. Это включает обеспечение сотрудников спиртовыми салфетками и дезинфицирующими средствами для рук; установка температурного экрана в некоторых офисах и производственных помещениях; и создание механизмов мониторинга здоровья в пострадавших регионах.Эти меры не только защищают наших клиентов и потребителей, они также защищают наших сотрудников.
Чтобы гарантировать доступность наших продуктов, мы разрабатываем планы обеспечения непрерывности бизнеса для решения любых проблем цепочки поставок, которые могут возникнуть.
Поддержка наших сообществСистема Coca-Cola и Фонд Coca-Cola, благотворительное подразделение компании Coca-Cola, вносят вклад в поддержку усилий по оказанию помощи по всему миру.Мы также перенаправляем большую часть наших маркетинговых расходов на программы помощи населению, медицинские принадлежности и оборудование на этапе вспышки, а также разрабатываем другие меры для фаз восстановления и возврата к нормальному состоянию на рынках, наиболее пострадавших от пандемии.
Эти взносы, добавленные к другим программам, которые в настоящее время находятся на стадии разработки, увеличат общую поддержку нашего сообщества до уровня более 100 миллионов долларов. Компания и Фонд продолжают оценивать возможности получения грантов, пожертвований и другой поддержки по всему миру по мере развития кризиса.Потребности оцениваются на местном уровне. Узнайте больше о действиях, предпринимаемых командами Coca-Cola по всему миру для поддержки сотрудников, клиентов и сообществ.
Больше материалов о COVID-19Последнее обновление: 20.05.2020 16:00
.