Зачем нужен электрофорез: что это за процедура? Показания и противопоказания к применению

Гальванизация и электрофорез (ионофорез) — что это, разница, применение

Электрофорез — это введение различных лекарственных и косметических препаратов с помощью электрического тока. Электрофорез можно проводить с помощью постоянного (гальванического) тока, а также с помощью некоторых видов импульсных токов.

Гальванический ток в современной косметологии применяется при гальванизации, ионофорезе, дезинкрустации и ионной мезотерапии. Ток, который используется для проведения процедур, имеет традиционные, устоявшиеся характеристики: постоянный непрерывный, напряжение 60-80 Вт, сила тока до 50 мА (такой ток называют гальваническим). Воздействие на организм таким током через различные электроды называют гальванизацией.

Около 200 лет назад итальянский физик А.Вольта создал генератор непрерывного тока. Луиджи Гальвани исследовал его действие для начала на лягушках. Очень скоро гальванический ток, как несомненный «хай тек» и новейшее слово в науке 19 века, стал применяться в медицине. И уже примерно 100 лет гальванический ток верно служит косметологам.

Электрофорез

В косметологии электрофорез лекарственных препаратов чаще называют ионофорезом. Термин не совсем точный, но уже привычный. Технически ионофорез отличается от гальванизации только наличием под электродом лекарственного вещества.

Электрофорез (ионофорез) омыляющих веществ в сочетании с действием отрицательного полюса гальванического тока применяется в косметологии для омыления комедонов. Процедура с использованием аппаратов для гальванизации и ионофореза носит название дезинкрустации, или гальванической чистки.

Способность гальванического тока доставлять лекарственные вещества вглубь кожи используется в процедуре ионной мезотерапии, или ионотерапии. По сути это электрофорез лекарственных веществ при помощи стационарных электродов. Процедура проводится без инъекций. Показания, лечебная тактика и рецептура составления коктейлей соответствуют принятым в мезотерапии схемам с поправкой на форетичность препаратов.

Основные понятия

1. Гальванизация = лечебное действие постоянного тока.
2. Ионофорез = гальванизация + лекарственное вещество.
3. Ионная мезотерапия = ионофорез стационарными электродами.
4. Дезинкрустация = ионофорез омыляющих веществ.

Механизм действия метода гальванизации

В основе действия постоянного тока — процесс электролиза. Вещества, находящиеся возле электродов, распадаются на ионы. Ионы перемещаются под действием тока. Молекулы воды распадаются на ионы H+ и OH-. Возле электродов ионы взаимодействуют с водой, образуя продукты электролиза: кислоту и щёлочь.

Продукты электролиза могут вызывать химические ожоги в месте наложения электродов: щелочной ожог под катодом и кислотный под анодом. Это особенно актуально для стационарного расположения электродов. Чтобы избежать этого, электрод отделяют от кожи гидрофильной прокладкой. После процедуры прокладку нужно промыть или сменить.

Изменение концентрации ионов ведёт к раздражению рецепторов кожи, при этом возникает лёгкое жжение и покалывание. Прохождение тока через ткани вызывает поляризацию — накопление ионов на биологических мембранах. При определённой концентрации ионов клетки переходят в возбуждённое (электрически активное) состояние. Меняются клеточный и тканевой обмен, возбудимость клетки.

При этом увеличивается пассивный транспорт крупных белковых молекул и других веществ, не несущих заряда (электродиффузия), и гидратированных ионов (электроосмос). Это означает ускорение клеточного и внутриклеточного обновления: быстрое поступление строительного материала, питательных и регулирующих веществ, а также своевременное выведение продуктов обмена из клетки.

Гальванизация

Гальванизация проводится стационарными, подвижными электродами или с помощью ванночек. Для проведения тока используется физраствор или проводящий гель. Выбор активного электрода зависит от показаний. Отрицательный и положительный электрод оказывают разное действие на ткани:

Показания для гальванизации: все виды себореи, сухая увядающая кожа, постугревые рубцы.

Как вещества проникают в кожу при помощи тока?

• Постоянный электрический ток вызывает перемещение ионов.
• При помощи постоянного тока можно вводить через кожу и слизистые как мелкие, так и более крупные частицы лекарственных веществ, несущие электрический заряд.
• Метод введения через кожу и слизистые лекарственных ионов при помощи тока называют электрофорезом (ионофорезом).
• Заряженные частицы отталкиваются от одноимённого электрода и уходят вглубь кожи.
• Таким образом, с отрицательного электрода вводятся отрицательно заряженные ионы.
• Наибольшая подвижность у лекарственных веществ, растворённых в воде.
• Вводимые лекарственные ионы проникают в эпидермис и накапливаются в верхних слоях дермы. При ионофорезе вещества уходят на глубину до 1,5 см.
• В зоне воздействия после процедуры образуется депо, из которого препарат проникает в клетки постепенно. Период действия лекарственного вещества составляет от 3 часов до 15-20 суток.

Видео: вебинар об электрофорезе и гальванизации

Вебинар провела Н. В. Баховец, кандидат медицинских наук, физиотерапевт, косметолог.

Термины и понятия, используемые при электрофорезе и гальванизации

• Для проведения процедуры всегда используют два электрода: положительный и отрицательный.
• Отрицательный электрод называют катодом. Обычно все провода и соединения от отрицательного полюса выполняют в чёрном цвете.
• Положительный электрод называют анодом. Он маркируется красным цветом.
• Электроды, которые используются в процедуре, могут быть разной площади. На меньшем электроде плотность тока выше и действие его более выражено. Меньший электрод называют активным.
• Активным электродом воздействуют на проблемную зону.
• Пассивный (индифферентный) — электрод большей площади. Обычно он находится в руке пациента или закрепляется на теле.
• Пассивный электрод тоже может нести лечебную нагрузку. Можно проводить двуполярный ионофорез — с отрицательного электрода будут впитываться отрицательно заряженные ионы, а с положительного, соответственно, положительно заряженные.
• Если электроды по площади равны, более выраженные ощущения возникают под отрицательным электродом.
• Полярность вещества — заряд его активных частиц. От электрода отталкиваются одноимённые ионы и уходят вглубь тканей. Поэтому отрицательные ионы вводятся с отрицательного электрода.

Виды электродов для электрофореза

Для проведения процедур используется три основных вида электродов: лабильные, стационарные и электроды для гальванических ванночек.

Лабильные электроды используют для скользящей обработки кожи лица, шеи, декольте. Это металлические электроды разной формы. Форма подбирается для удобства работы. Лабильные электроды обязательно должны скользить по гелю или водному раствору. Высыхание раствора снижает проводимость кожи и появляются неприятные покалывания. Конический электрод обычно используют для проработки зоны вокруг глаз. Сферический или электрод-валик — для щёк, шеи и декольте.

Стационарные электроды — токопроводящие пластины, которые закрепляют на коже. Стационарные электроды бывают металлическими (свинцовые или другие металлические пластины), резиновыми (из токопроводящего латекса) и графитовыми (одноразовые пластины графитизированной бумаги). Стационарный электрод находится на коже 10-30 мин. Поэтому под электродом обязательно должна быть прокладка из ткани или бумаги толщиной 0.5-1 см. Прокладку смачивают водой или физраствором.

При проведении ионофореза прокладку смачивают раствором лекарственного вещества. Назначение прокладки — улучшить проведение тока и защитить кожу от раздражающих веществ, которые вырабатываются на электродах. Прокладку нужно после каждой процедуры промыть или продезинфицировать. Удобно использовать разовые салфетки.

Электроды для гальванических ванночек представляют собой графитовые пластины, которые укладывают в ёмкость с водой. В этом случае вся вода или раствор ведут себя как электрод. Впитывание лекарственных веществ в кожу происходит из воды.

Противопоказания к гальванизации

Общие противопоказания для электротерапии: онкологические и преонкологические заболевания, лихорадочные состояния, гнойные процессы, обширные нарушения целостности кожи, системные заболевания кожи, хроническая сердечная и почечная недостаточность, беременность, наличие кардиостимулятора, индивидуальная непереносимость тока.

Специфические противопоказания (при работе на лице): сыпи, экзема, чувствительность зубов, зубные кисты, заболевания щитовидной железы, кисты и опухолевые заболевания груди.

Противопоказания к ионофорезу

Противопоказаниями к ионофорезу являются все противопоказания к проведению гальванизации плюс непереносимость вводимого вещества.

Подробнее о технике проведения ионофореза и гальванизации в косметологии, и о веществах, которые для этого применяются – в методическом пособии Гальванизация, ионофорез, дезинкрустация и в книге Н. Баховец Эстетика лица: методы аппаратной косметологии.

Оцените материал:

Средний рейтинг: 4.7 / 5

Наталия Баховец

Автор статьи: кандидат медицинских наук, физиотерапевт, косметолог, аспирант кафедры физиотерапии СПбГМА им. И.М. Мечникова, автор многочисленных книг и методических пособий по аппаратной косметологии, руководитель и методолог учебного центра АЮНА.

Физиотерапия

Методы диагностики и лечения

		Консультация врача физиотерапевта первичная		500,00
		Иглорефлексотерапия		700,00
		Гальванизация (1 поле)		200,00
		Электрофорез  лекарст.веществом  (препарат пациента) 1 зона		700,00
		Электрофорез  лекарст.веществом  (наш препарат)		700,00
		Электрофорез с  карипазимом		850,00
		Электрофорез с  грязевыми салфетками		700,00
		Дарсонвализация (АмД «Искра-4»)  (1 зона)		300,00
		Дарсонвализация (АмД «Искра-4»)  (2 зоны)		500,00
		Диадинамотерапия (BTLVac)  (1 зона)		500,00
		Диадинамотерапия (BTLVac)  (2 зоны)		800,00
		Диадинамотерапия (BTLVac)  с грязевыми салфетками		700,00
		СМТ-терапия  (1 зона)		300,00
		СМТ-терапия  (2 зоны)		500,00
		Интеференционные токи   (BTL -5000)  (1 зона)		500,00
		Электростимуляция   (1 зона)		300,00
		Электростимуляция   (2 зоны)		500,00
		Магнитотерапия    (ВТL-5000)  (1 зона)		500,00
		Магнитотерапия    (ВТL-5000)  (2 зоны)		850,00
		Магнитотерапия    (ВТL-5000)  (3-4 зоны)		1000,00
		Внутривенное введение    ОФР		500,00
		Подкожное обкалывание ОКС (периартикулярно, паравертебрально)    (1 зона)		500,00
		Целлюлолиполиз бедра ОКС  (поинъекционно)		1000,00
		Целлюлолиполиз боковых поверхностей тела ОКС (поинъекционно)		1000,00
		Целлюлолиполиз передней брюшной стенки ОКС (поинъекционно)		1000,00
		Инъекционная коррекция ягодиц   ОКС		1000,00
		Общая инъекционная коррекция лица		от 500,00
		Общая инъекционная коррекция лица и шеи		от 700,00

При каких заболеваниях используют физиотерапию?

Наиболее эффективна физиотерапия при лечении заболеваний:

• позвоночника и суставов;
• болевого синдрома;
• спаечного процесса;
• хронических гинекологических заболеваний;
• реабилитации после операций и травм.

У нас физиотерапия применяется в различных областях медицины:

• гинекологии;
• урологии;
• травматологии и ортопедии;
• дерматологи;
• педиатрии;
• ЛОР-заболеваниях;
• спортивной медицине;
• внутренних болезнях.

Назначаются физиотерапевтические процедуры чаще всего после стихания воспаления, острого процесса или с целью купирования боли.

Кабинет физиотерапии оснащен самой современной аппаратурой, что позволяет проводить следующие методы лечения:

Каковы преимущества использования физиотерапии?

Преимущества применения физиотерапии:

• безопасность;
• доступность лечение;
• комплексное воздействие на организм;
• длительный терапевтический эффект;
• благотворное влияние на нервную систему;
• естественное укрепление иммунитета.

С помощью лечебных физических факторов активизируются механизмы, повышающие устойчивость организма к неблагоприятному воздействию внешней среды, а также к различным заболеваниям. В результате применения физиотерапевтических процедур исчезают или уменьшаются болевые приступы, нормализуется секреторная и моторная функции органов, снижается активность воспалительных процессов, усиливается регенерация тканей.

При использовании физических методов очень редко возникают аллергические реакции и не наблюдается лекарственной зависимости. Современная физиотерапия усиливает действие большинства лекарственных препаратов, что сокращает сроки лечения пациентов. Физиотерапевтические процедуры безболезненны, не оказывают побочного воздействия на органы и ткани. Использование физиотерапии увеличивает период ремиссии хронических заболеваний, снижает частоту рецидивов.

Как получить направление на физиотерапию?

Направить на лечение могут врачи из нашего центра или из других лечебных учреждений. Доктор осматривает пациента, уточняет необходимость применения физиолечения, возможность его сочетания с другими методами и направляет на консультацию к физиотерапевту. В направлении обязательно указывается диагноз и прилагаются данные обследования больного.

Что происходит на приеме у врача-физиотерапевта?

Перед сеансом физиотерапии доктор собирает анамнез, осматривает пациента, знакомится с результатами предварительного обследования. Это нужно для того, чтобы исключить все возможные противопоказания, выбрать метод лечения, необходимый конкретному пациенту, подобрать правильные дозировки лечебных препаратов.

Какое обследование необходимо перед назначением физиотерапии?

Обязательно нужен клинический анализ крови, общий анализ мочи, ЭКГ (для пациентов старше 40 лет), для женщин — осмотр гинеколога. Некоторым больным могут понадобиться рентгеновские снимки, данные УЗИ, МРТ, консультативные заключения других специалистов. В клинике физиотерапия проводится только компетентными специалистами, с участием опытного врача-физиотерапевта и специально обученных медицинских сестер.

Существуют ли противопоказания для назначения физиотерапии?

Противопоказания к физиотерапии следующие:

• злокачественные новообразования в стадии, когда необходимо радикальное лечение (операция, химиотерапия, лучевая терапия) или имеются метастазы;
• выраженная сердечная, дыхательная, печеночная, почечная недостаточность;
• гипертоническая болезнь 3 стадии;
• склонность к кровотечениям;
• повышенная температура тела (выше 37,5 град.),
• резкое общее истощение больного,
• индивидуальная непереносимость физиопроцедур. 

Существуют ли возрастные ограничения для назначения физиотерапии?

Физиолечение может быть назначено с первых недель жизни ребенка, а в некоторых случаях с первых дней уже в роддоме. Существует мнение, что пожилым людям физиотерапевтические процедуры не показаны. Это не так. Если у людей пожилого и старческого возраста нет противопоказаний со стороны сердечно-сосудистой системы, физиолечение подбирается индивидуально под контролем ЭКГ и анализов крови.

Какие процедуры не сочетаются с физиотерапией?

От физиотерапии следует воздержаться в дни проведения сложных диагностических исследований (различные рентгеновские исследования, МРТ, пробы с физической нагрузкой. 

Физиопроцедуры в Челябинске — Цены и адреса ✓

Записаться на прием

Ваш телефон*

Мы вам перезвоним в ближайшее время.

Физиолечение – это лечение природными факторами. Физические факторы природы относятся к древнейшим способам борьбы человека с болезнями. Еще на заре своего развития человек инстинктивно искал в лучах солнца, воде и воздухе средства защиты от поражавших его недугов.

 

В Медицинском центре «ЛОТОС» открыто отделение физиотерапии и медицинской реабилитации. В его состав входят кабинеты физиотерапии, лечебной физкультуры и массажа.

В штате отделения врач физиотерапевт с опытом работы более 20 лет, врач ЛФК и спортивной медицины, медсестры по физиотерапии, инструктор – методист ЛФК и специалисты по лечебному массажу.

Кабинеты физиотерапии

Кабинеты массажа

Кабинет ЛФК

Физиопроцедуры выполняются всем возрастным группам от детей первых месяцев жизни до взрослых.азеротерапии, УВЧ, индуктотермии помогут за 3-5 сеансов избавиться от этих неприятных ощущений.

На первом этапе — приём врача-физиотерапевта

Будет выбран лечебный фактор, его параметры, описаны лечебные эффекты процедуры и методика выполнения. Так же произведен опрос на наличие противопоказаний для физиолечения и сопутствующих заболеваний,  которые учитываются при подборе физиотерапевтических факторов и их параметров.

На втором этапе — физиопроцедуры

Выполняются медсестрами по физиотерапии с опытом работы более 10 лет по специальности. Они легко найдут контакт,  как с взрослым, так и с ребенком.

Цены

Уважаемые пациенты!
Обращаем Ваше внимание, что стоимость визита к врачу не всегда совпадает с указанной ценой приёма. Окончательная стоимость приема может включать стоимость дополнительных услуг. Необходимость оказания таких услуг определяется врачом в зависимости от медицинских показаний непосредственно во время приёма.

Наименование

Стоимость

Применение физиотерапии в травматологии в Челябинске

Записаться на прием

Ваш телефон*

Мы вам перезвоним в ближайшее время.

В быту часто происходят мелкие травмы (растяжения связок, ушибы, гематомы мягких тканей). Они доставляют неудобство болевым синдромом, отеком тканей. Приходится ограничивать объём движений, повседневную трудовую активность.

Иногда проблема возникает в более серьезном варианте. Происходят переломы, разрывы связок. Помимо болевого синдрома и отека тканей появляется необходимость в жесткой фиксации (гипс, ортез).

Период неприятных последствий травмы при растяжении, ушибе тканей, гематоме можно сократить, если использовать такие физиотерапевтические факторы как:

Это факторы, которые быстро снимают отек тканей, уменьшают болевой синдром.

Магнитотерапия

Это лечение сокращает сроки исчезновения гематом (синяков). Иногда гематомы возникают на видных местах, например, на лице.  Более быстрое их исчезновение позволяет улучшить качество жизни.

Первые сутки после растяжения, разрыва связок, ушибов и гематом стандартное физиолечение не делается. Используется только криотерапия (холод). Но на вторые сутки физиолечение обязательно. Это и касается переломов.

Ошибочным является мнение, что раз наложили гипс или повязку – никакое физиолечение при переломе невозможно. Такие факторы как магнитотерапия, УВЧ – терапия относятся к группе факторов в основе которых лежат поля. Для полей нет преград. Их делают через гипс, одежду, повязки.

УВЧ-терапии

Лечение с помощью магнитотерапии осуществляет приток кальция к месту перелома, тем самым сокращая сроки нахождения в гипсе. Это касается и УВЧ-терапии. Этот фактор стимулирует репарацию регенерацию костной ткани, что приводит к сокращению нахождения пациента в обездвиженном состоянии.

Другие виды физиолечения

Когда снят гипс, возникает другая проблема. От длительной обездвиженности мышцы отвыкают нести обычную для них нагрузку.  В месте перелома, разрыва связок возникает соединительная ткань, которая мешает полному объему движений в суставе.

На помощь приходит:

Цены

Уважаемые пациенты!
Обращаем Ваше внимание, что стоимость визита к врачу не всегда совпадает с указанной ценой приёма. Окончательная стоимость приема может включать стоимость дополнительных услуг. Необходимость оказания таких услуг определяется врачом в зависимости от медицинских показаний непосредственно во время приёма.

Наименование

Стоимость

Электрофорез с Карипазимом

Основным (базисным) методом лечения в центре «ОДА» является электрофорез с папаином

Методика лечения папаином разработана доктором медицинских наук, профессором, заведующим отделением нейрореабилитации Найдиным В.Л. и применяется в Институте нейрохирургии более 20 лет. В ЛВЦ «ОДА» методика используется более 15 лет!  Эффективность метода при остеохондрозе и многих (даже сложных) грыжах диска достигает 85%.

В состав папаина входят биологически активные вещества растительного происхождения (папаин, химопапаин и др.), которые положительно влияют на коллагеновые хрящевые ткани. Из этих тканей состоят межпозвоночные диски и, соответственно, грыжа.

В определенной концентрации папаин, введенный методом электрофореза, влияет на саму грыжу. Она начинает постепенно уменьшаться, становится мягкой, затем полностью исчезает. Даже незначительного уменьшения грыжи бывает достаточно, чтобы освободить нервное окончание, которое она защемляет, и боли в позвоночнике постепенно проходят.   

В большей степени лекарство действует на весь межпозвоночный диск. Он разрыхляется, становится более эластичным, увеличивает высоту, как бы омолаживается. Препарат усиливает регенерацию тканей диска, который восстанавливает свою нормальную форму и свою функцию амортизатора. Также укрепляются соседние диски и связки.

Процедура занимает 20 минут, совместима с другими методами лечения применяемые в ЛВЦ ОДА.  Противопоказано лечение только тем пациентам, которым противопоказаны физиопроцедуры, в частности, электрофорез.

  

Папаин также может применяться при суставных контрактурах (посттравматических и постинсультных), при келлоидных рубцах различного происхождения, артрозо-артритах крупных суставов (в т.ч. при коксартрозе), плече-лопаточном периартрите, церебральном  и спинальном арахноидитах, некоторых формах невритов лицевого нерва, туннельных синдромах.

В некоторых случаях, в комплексе с электрофорезом применяется ультразвук (фонофорез) с мазью Папаин.

При сочетании остеопороза с остеохондорозом  для электрофореза используются два препарата — папаин и ксидифон. При наличие остеофитов очень эффективна комбинация для электрофореза Папаина и лития.

Курс лечения

Для лечения грыжи позвоночника, подтвержденной компьютерной томографией или магнитно-резонансной томографией, необходимо пройти 3 курса электрофореза с папаином по 30 процедур каждый курс. Между курсами перерыв от 2-х недель до 2-х  месяцев.

Контрольное обследование целесообразнее делать после всех трех курсов, так как в период 1-го курса под воздействием папаина грыжа меняется по структуре, становится более мягкой и в это время уже идет освобождение нервных корешков, зажатых грыжей, в результате исчезает боль, восстанавливается чувствительность. А на втором и третьем курсах идет уменьшение размеров грыжи.

Клинический пример

Больной А-в Н. В., 45 лет обратился в ЛВЦ «ОДА» 30.09.2003 г. с жалобами на боли в поясничном отделе, которые отдавали по боковой поверхности ноги до стопы, онемение стопы, особенно 1-2 пальцев, правая стопа «свисала».

Прошел 3 курса электрофореза с Папаином по 30 процедур, получал медикаментозную терапию Траумель С, Цель Т, ЛФК, мягкое вытяжение позвоночника аппаратом «Эртракт». Через 3 месяца на контрольной МРТ грыжа резко уменьшилась (фото), полностью восстановились движения в правой стопе, исчезло онемение.

ВЫВОДЫ

Зачем нужна прививка от пневмококка?

14 декабря 2020

В нашем медицинском центре можно пройти вакцинацию от пневмококковой инфекции. Рассказываем, кому и зачем это нужно, какую вакцину мы используем и может ли прививка от пневмококка защитить от COVID-19.

Пневмококк (Streptococcus pneumoniae) — возбудитель бактериальных инфекций, которые проявляются в виде пневмонии, среднего отита, менингита, синусита и др. Пневмококковая пневмония представляет наибольшую опасность для маленьких детей, пожилых людей и людей с определенными состояниями здоровья.

Известно, что от осложнений, вызванных Streptococcus pneumoniae, в год в мире умирает более 1,5 миллиона человек.

Streptococcus pneumoniae — грозная бактерия

С одной стороны, Streptococcus pneumoniae — представитель нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей человека. Носителями одного или нескольких типов пневмококков являются до 70 % людей. У «организованных» (проживающих или находящихся в коллективах) детей и взрослых уровень носительства максимален. Сейчас известно более 90 различных серотипов (иммунологических вариантов) пневмококков. С другой стороны — все пневмококки потенциально патогенны, а около 20 из них вызывают тяжелые инфекции.

Самое печальное, что пневмококки выработали устойчивость ко многим антибиотикам. В странах, где антибиотики применяются широко, уровень резистентности Streptococcus pneumoniae к пенициллину доходит до 50% от всех выделяющихся пневмококков, а к тетрациклину и левомицетину — примерно до 30 %.

Проблема усугубляется тем, что быстротечное развитие заболевания — 2-3 дня — как правило, не оставляет времени на специальное определение чувствительности патогенов к антибиотикам. Пациенты с тяжелым течением инфекции нередко умирают, несмотря на стандартную антибиотикотерапию.

Кто входит в группу риска по заболеваемости пневмококковой инфекцией?

• люди в возрасте 55 лет и старше;
• дети;
• взрослые с хроническими заболеваниями;
• так называемые «организованные контингенты» — дети, которые ходят в детсад, жители домов престарелых и домов инвалидов, военнослужащие и т.д.

Вакцинация от пневмококковой инфекции

В России вакцинировать от пневмококка начали с 2008 года с использованием вакцины Превенар 7. На сегодняшний момент в стране зарегистрированы:

• Превенар 7 и Превенар 13 (Pfizer),
• Пневмовакс 23 (Merck Sharp & Dohme Corp),
• Синфлорикс (GlaxoSmithKline).

В национальные календари прививок большинства развитых стран включена вакцина Превенар, она рекомендована Всемирной организацией здравоохранения. В медицинском центре «Альфа технологии» жители Новосибирска могут сделать прививку от пневмококка именно этим препаратом.

Эффективность подтверждена исследованиями! В США вакцина Превенар используется с 2000 года. Уже в первые 5 лет частота тяжелых форм инфекции у детей младше 4 лет снизилась в 40 раз. По данным американских исследователей, уменьшение числа носителей пневмококка, которое было достигнуто благодаря массовой вакцинацией Превенаром, привело к двукратному снижению обращаемости к врачам по поводу отитов любой этиологии.

Желая добиться большей эффективности препарата в отношении осложненных пневмоний, ученые создали новую 13-валентную вакцину. Она содержит дополнительные штаммы пневмококка, которые ответственны за развитие осложнений пневмонии.

По российскому календарю вакцинаций прививка от пневмококковой инфекции обязательна для всех детей до 5 лет. Взрослым вакцинация рекомендуется при наличии показаний. Она показана призывникам, людям старшего возраста с хроническими заболеваниями легких, пенсионерам, которые проживают в интернатах и домах престарелых.

Вообще, пройти вакцинацию можно порекомендовать всем людям старше 55 лет и взрослым с хроническими заболеваниями.

Схема вакцинации Превенаром

• При вакцинации детей до 2 лет по Национальному календарю — трехкратное введение вакцины (в 2 и 4,5 месяца и в 15 мес).
• При вакцинации после двухлетнего возраста — однократное введение внутримышечно в плечо.

Может ли прививка от пневмококка защитить от ковида?

В конце лета и осенью 2020 года появились сообщения, что вакцина от пневмококка может защитить от заражения Covid-19. На самом деле, нет — она предотвращает только пневмококковую инфекцию. С другой стороны, многие ученые и врачи полагают, что вакцина от пневмококка может обезопасить пациента от вторичных осложнений коронавирусной инфекции.

В любом случае, в условиях пандемии Covid-19 вакцинация против других респираторных заболеваний по-прежнему настоятельно рекомендуется.

Осложнений после вакцинации Превенаром не бывает. У пациента возможны повышение температуры и покраснения в месте введения препарата. Однако такая реакция, как правило, бывает у людей, уже переболевших пневмококком.

Чтобы сделать прививку, запишитесь, пожалуйста, к нашему врачу вакцинопрофилактики по телефону или в онлайн-чате на сайте.

Электрофорез в современном диагностическом процессе

Электрофорез в современном диагностическом процессе

Профессор Н.А. Сергеева.

Кафедра факультетской хирургии Российский государственный медицинский Университет, г. Москва

Современная диагностика в любой области медицины основана на высоком уровне технического обеспечения исследований, включаемых в сложный цикл клинического обследования.
В настоящее время к клиническим лабораториям все настойчивее предъявляются требования проведения наиболее информативных и экономичных исследований. Аналитические методы, основанные на предложенном Тиселиусом в 1937 году (11) принципе электрофореза представляют все увеличивающуюся область диагностических исследований, проводимых в клинических лабораториях. Однако, из-за недостаточной осведомленности врачей о современных возможностях данного метода его значимость в диагностическом процессе еще не полностью оценена.
Тиселиус за разработку метода электрофоретического разделения макромолекул был удостоен Нобелевской премии в 1948 году. Принципиальной основой всех электрофоретических методов является тот факт, что находящиеся в растворе молекулы, располагающие электрическим зарядом, под действием сил электрического поля смещаются в сторону противоположно заряженного электрода.
Скорость миграции вещества в среде с одной и той же силой электрического поля, зависит от размера частиц и их электрического заряда. В случае белковых молекул, благодаря их амфотерным свойствам, направление и скорость смещения во многом зависит от рН среды, в которой происходит миграция (3). Заряд различных белков в растворах с одинаковым рН зависит от аминокислотного состава, так как диссоциация белковых цепей приводит к образованию групп, имеющих положительный или отрицательный заряд. Под влиянием сил электрического поля компоненты разгоняемой системы распределяются согласно их заряду, приобретая соответствующую скорость движения, т.е. происходит электрофоретическое разделение. Внедрение электрофоретических «носителей» привело к улучшению технологий и одновременно к упрощению фракционирования. В качестве «носителей» используются фильтровальная бумага, целлюлоза, ацетат целлюлозы, различные гели (полиакриламид), агароза и др. При этом во время элекрофореза, наряду с разделением частиц согласно их зарядам, вступает в силу так называемый «молекулярно ситовой эффект», когда гелевая структура ведет себя по отношению к ионам как фильтр. Ионы, превышающие ее пористость не проходят или проходят очень медленно, а более мелкие ионы быстрее проникают через поры медиума. Таким образом, скорость передвижения зависит не только от заряда иона, но и от величины пор геля, формы пор, величины движущихся ионов, взаимодействия между матрицей геля и движущимися ионами (адсорбция и др.)

Электрофорез как биохимический метод — очень мощное приспособление для оценки широкого спектра жизненных процессов.
Наибольшая популярность до настоящего времени принадлежит электрофорезу белков как одному из наиболее информативных лабораторных тестов, используемых в настоящее время (4). Он предполагает огромную диагностическую информацию, особенно когда исследование дополняется такими высокоспецифичными тестами как иммуноэлектрофорез, количественной оценкой иммуноглобулинов и других специфических протеинов, Т- и В-лимфоцитов и стадий трансформации лимфобластов.
Электрофоретическое разделение протеинов позволяет изучать их биологические и физические характеристики, являясь индикатором заболеваний печени и почек, иммунной системы, злокачественной патологии, острых и хронических инфекций, генетических поломок, заболеваний центральной нервной системы и многих других видов патологии. Используя ацетат целлюлозу, можно разделить сывороточные белки на 5 фракций: альбумин и 4 глобулиновых группы
— альфа 1, альфа 2, бета (часто подразделяются на 2 различные группы
— бета 1 и бета 2) и гамма (7) (рис.1).

Рис.1 Нормальная электрофореграмма сывороточных протеинов

Альбумин — низкомолекулярный сывороточный белок (м.в. около 70000 дальтон), образующий комплексы с многими протеинами, гормонами, билиарными пигментами, кальцием и другими субстанциями, играет ключевую роль в поддержании осмотического давления.
Все 4 группы глобулинов характеризуются гораздо более высоким молекулярным весом, чем альбумин. Альфа- и бета-глобулины также являются транспортными формами протеинов, образуя комплексы с пигментами, металлами, углеводами и липидами. Эти белки очень гетерогенны, разброс их молекулярного веса от 40000 до 1000000 дальтон. Гамма глобулины, или иммуноноглобулины характеризуются молекулярным весом от 15000 дальтон до более чем 1000000 дальтон (для IgM).
Синтезируемые В-лимфоцитами антитела в виде JgG, JgA и JgE представляют собой один из компонентов иммунной защиты организма, которая включает кроме того Т-клеточный иммунитет, фагоцитоз и систему комплемента. Нарушение одного из компонентов иммунной системы приводит к изменению защиты организма и клинически выявляется как одна из форм иммунодефицитного состояния. Выявления и идентификация нозологических форм иммунодефицитных состояний — актуальнейшая проблема клинической медицины. Одним их наиболее информативных методов первичной диагностики иммунодефицитов является электрофоретическая протеинограмма сыворотки крови.

В последние годы все большую диагностическую значимость приобретает электрофорез высокого разрешения протеинов, который позволяет выделить около 15 фракций белков. Число фракций зависит от среды, на которой происходит разгонка, и техники окрашивания. Наряду с числом компонентов, их качественной и количественной характеристикой иногда возникает необходимость дальнейшего более подробного исследования. В 1976 году для изучения иммуноглобулинов был предложен метод иммунофиксации (11). Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) — это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута сыворотка крови, моча, спинномозговая или другая жидкость организма. На электрофоретически разделенные антигены наносят иммунные сыворотки, содержащие различные специфические антитела. При встрече соответствующих антигена и антитела в зоне оптимального их соотношения наблюдается реакция преципитации невооруженным глазом. Иммунный электрофорез объединяет преимущества электрофореза и иммунной реакции: высокая разрешающая способность метода, разделяющая компоненты анализируемой системы на основе электрофоретической мобильности и высокая специфичность иммунных антисывороток. Электрофорез с иммунофиксацией — один из современнейших методов в кинической лаборатории для получения характеристик моноклональных иммуноглобулинов. Моноклональная гаммопатия характеризуется неконтролируемой пролифирацией одного клона плазменных клеток за счет других клеток. Эта дисфункция часто приводит к синтезу большого количества одного иммуноглобулина или его субъединицы со снижением нормальных уровней иммуноглобулинов. При этом на электрофореграмме выявляется один резко увеличенный пик в бета-гамма-области (рис.2) .

Большинство моноклональных гаммопатий являюттся доброкачественными и не проявляют себя клинически. Однако, высокие уровни моноклонального протеина на фоне сниженных уровней других иммуноглобулинов могут быть ассоциированы с малигнизацией.
В последние годы участились парапротеинемические гемобластозы (миеломная болезнь, лимфоцитомия, лейкозы), когда на электрофореграмме может наблюдаться присутствие двух (и очень редко трех) моноклональных протеинов. Анализ протеинов абсолютно необходим в диагностике и мониторинге лимфопролиферативных заболеваний. При этом если иммуннохимический метод может выявить количественные отклонения протеиновой продукции, отмечая наличие расстройства в этой среде, то электрофорез в состоянии продемонстрировать моноклональную сущность этих нарушений. Однако, выявление того или иного варианта парапротеинемии на электрофоретической картине недостаточно для полной идентификации патологического процесса. В таких случаях необходимо использовать иммуноэлектрофорез.
Поликлональные гаммопатий в общих чертах характеризуются диффузным увеличением уровня протеина в гамма-регионе на электрофоретической пластине. Обычно концентрации трех главных иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) соответственно увеличены (рис.3).

Обычно поликлональная гаммопатия наиболее часто встречаемое в клинике отклонение после гипоальбуминемии.
Сохраняющаяся поликлональная гаммопатия имеет определенную прогностическую значимость при ряде заболеваний: хроническая патология печени, коллагенозы, хронические инфекции, метастатистическая карцинома, ожоговая болезнь.
Снижением большинства или даже всех иммуноглобулинов характеризуется гипогаммоглобулинемия и агаммоглобулинемия (Рис.4).

Рис.4 Гипогаммаглобулинемия и агаммаглобулинемия Чаще всего это связано с наследственной патологией и проявляется уже в раннем детстве (синдром Вискотт-Алдриха, болезнь Брутона, атаксия).

Приобретенная недостаточность иммуноглобулинов во взрослом возрасте может быть вторичной, в виде моноклональной гаммопатии или быть индуцированной иммуносупрессивной терапией. Остановимся на электрофоретических характеристиках сывороточных протеинов при некоторых клинических проявлениях.
1. Острое воспаление. характеризующееся локализованным биохимическим ответом (активация комплемента) и реакцией на клеточном уровне (мобилизация фагоцитов, увеличение синтеза протеинов), дает при электрофорезе белков сыворотки увеличение уровней альфа 1-й альфа 2-глобулинов, фибриногена (рис.5).

Рис.5 Острое воспаление

2.Хроническое воспаление ассоциируется с увеличением фракций белков, рассматриваемых как «белки хронической фазы». Электрофоретически это будет проявляться умеренным увеличением альфа 2-глобулинов и легким увеличением бета-глобулинов. Альбумин может быть слегка подавлен на фоне поликлонального увеличения гамма глобулинов (рис.6).

Рис.6 Хроническое воспаление

Такие отклонения, характеризующие хроническое воспаление, могут проявляться при хронических инфекциях (бруцеллез, туберкулез и др.), коллагенозах, аллергиях, аутоиммунных процессах, а также при малигнизации.
3. Заболевание печени. В связи с тем, что в печени синтезируются альбумин и альфа-глобулин, заболевания этого органа, затрагивающие белковосинтезирующую функцию могут сопровождаться снижением их уровней в крови, что соответственно отразится на электрофореграммах (рис.7).

Следует однако помнить, что печень обладает значительными резервами синтезирующей способности, поэтому выявление данных нарушений будет свидетельствовать о глубоких гепатоцеллюлярных нарушениях

4. Нефротический синдром может быть обусловлен различными патологическими процессами (диабет, заболевание соединительной ткани, гломерулонефриты и др.). Для данного синдрома характерна потеря большого количества альбумина в связи с нарушением фильтрационной способности почек. При этом альбумин и другие низкомолекулярные белки (трансферрин и альфа 1- антитрипсин) выходят через гломерулярные канальцы. Это сопровождается увеличением в крови уровней высокомолекулярных протеинов (макроглобулин, IgM, липопротеины). Электрофоретическая картина при этом выявляет существенное снижение пика альбумина и увеличение альфа 1- и альфа 2-глобулинов (рис.8).

5. Гастроэнтеропатическая гипопротеинемия.
Избыточная потеря альбумина и других протеинов может сопутствовать ряду заболеваний желудочно-кишечного тракта, причем клинические проявления зависят от глубины поражения и степени потери белков (рис.9).

Рис.9 Гастроэнтеропатическая гипопротеинемия

Выявляемый при обследований «протеиновый профиль» будет отражать основной патологический процесс.
Различные типы протеинурии могут быть дифференцированы с помощью электрофореза мочи (рис.10).

Рис.10 Нормальная электрофореграмма белков мочи

Выявление и дифференцировка плазменных белков в моче с помощью электрофореза является весьма информативным тестом в оценке почечной функции, нарушения которой могут быть обусловлены ослабленной канальцевой реабсорбцией, но в большинстве случаев являются результатом патологической проницаемости гломерулярных капилляров (8) (рис.11 и 12).

 

Следует подчеркнуть возможность электрофоретического обследования цереброспинальной жидкости.
Продуцируясь путем ультрафильтрации плазмы, спинномозговая жидкость «обновляется» примерно 4 раза в сутки благодаря экскреции и реабсорбции через гемато-энцефалический барьер. Несмотря на внедрение в клиники нейрозаболеваний таких современных методов диагностики как компьютерная томография и ЯМРТ, исследование спинномозговой жидкости остается одним из ведущих методов клинической диагностики при заболеваниях нервной системы, помогая уточнить характер патологического процесса, особенности течения заболевания, его прогноз, контролировать эффективность лечения (4). Соотношение концентраций белков плазмы и цереброспинальной жидкости может свидетельствовать о той или иной степени проницаемости гемато-энцефалического барьера. Поэтому изучение статуса белков в цереброспинальной жидкости должно обязательно сопровождаться параллельным обследованием плазмы (рис.13).

Такой электрофоретический профиль является важным диагностическим аргументом при диагностике иммунопатологических процессов с неврологической аффектацией. Выявление олигоклональных групп при электрофорезе цереброспинальной жидкости — лучший и единственный на настоящее время тест для диагностики рассеянного склероза (1) (рис.14).

Специфические картины дает электрофорез цереброспинальной жидкости при нейросифилисе (Рис.15), менингите цитомегаловирусной этиологии (Рис.16), церебральном токсоплазмозе (Рис.17) (10).

  

Определение фракций белков-маркеров спинномозговой жидкости в динамике лечения черепно-мозговой травмы имеет существенное значение для современной и более точной диагностики, а также для обоснованного прогноза (2).
Из других биологических сред организма, используемых для электрофоретических тестов с целью установления диагноза, следует упомянуть плевральную, перикардиальную, синовиальную и слезную жидкости. Что касается электрофореза слезной жидкости, то в данном случае это один из наиболее информативных биохимических методов в диагностике патологичесих процессов слезных желез, т.к. фракции быстро мигрирующих белков (RMP), лактотрансферрин (Ltt) и лизозим (Lys), синтезируемые слезными железами, образуют три основных пика на целлюлез-ацетатной электрофореграмме (Рис.18).

Дисфункция слезных желез приводит к снижению синтеза одного или нескольких из этих белков, что отчетливо проявляется в процессе электрофореза. Причем, изменение нормальных фракций или даже появление новых может проявляться у здоровых субъектов и объясняться использованием не достаточно качественных контактных лиз (Рис.19).

Другой областью широкого клинико-лабораторного использования электрофореза является изучение липидного профиля. Клиническая значимость данного теста возрастает в последнее время параллельно увеличивающейся статистике сердечно-сосудистых заболеваний. Точное определение фенотипа дислипопротеинемии абсолютно необходимо для обоснования патогенетического лечения и обоснованного прогноза, т.к. лечение гиперлипидемий зависит от фенотипа. Классическое исследование фенотипов связано в первую очередь с определением холестерина и триглицеридов в крови, однако, этого далеко не достаточно. Электрофорез разделяет липопротеины на альфа (HDL), пре-бета (VLDL), бета (LDL) и иногда хиломинроны. В добавление к 4 главным липидным фракциям при использовании агарозного или полиакрил амид ного геля могут быть определены: липопротеины промежуточной плотности (JDL), липопротеин(а), липопротеин-Х (абнормальный липопротеин, который появляется при холестазе или при обогащенном липидами парэнтеральном питании). Классификация и идентификация гиперлипидемий основаны на определении липидного спектра сыворотки крови.
Предложенные Фредриксоном классификации липидных фенотипов включает 5 типов, прекрасно дифференцируемых с помощью электрофореза (Рис.20).

Рис.20 Фенотипы гиперлипидемий

Электрофорез изоэнзимов.

Изоэнзимы, являющиеся молекулярными вариациями некоторых ферментов, имеют идентичную каталитическую активность, но различаются пространственной конфигурацией. Отличаясь электрофоретической мобильностью, эти молекулы разделяются, характеризуя специфическую ферментативную активность определенного органа. Наибольшую диагностическую значимость приобретает интерпретация электрофореза изоэнзимов креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и щелочной фосфатазы (ЩФ).

Креатинкиназа имеет три изоформы: СК-ММ (в скелетной мускулатуре), СК-ВВ (в мозгу) и СК-МВ (в миокарде).
В последнее время выделен еще митохондриальный изоэнзим (СКт), который характеризуется отсутствием М и В субъединиц, аффинностью к креатинфосфату и стабильностью при нагревании (5 минут при 56 С). Высокое содержание митохондриального изоэнзима обнаружено в сыворотке большинства больных с неопластическими процессами. СКт рассматривается как маркер корциномы в метастатической стадии развития, являясь настораживающим прогностическим индикатором. Выявление данного изоэнзима у новорожденных указывает на митохондриальную гиперактивность и тканевую гипоксию. Электрофорез креатинкиназы — референтный метод для определения кардиальных энзимов, являющийся быстрым и точным тестом для документации острого инфаркта миокарда (9). Увеличение активности СК-МВ (более чем 5% от тотальной) при ранних клинических проявлениях ишемий миокарда предполагает в дальнейшем мониторинг активности изоэнзима каждые 3 часа в течение суток, что наряду с уточнением диагноза указывает на эффективность терапии (Рис.21).

Рис.21 Массивный инфаркт миокарда

В последнее время СК-МВ разделяют на 2 изоформы: СК-МВ 1 и СК-МВ2.

СК-МВ2 — тканевая форма, которая попадая в кровоток, конвертируется в МВ1, поэтому изменение соотношения МВ2/МВ1 через 1-2 часа после начала болевого синдрома может документировать наличие инфаркта. Таким образом, высочайшая кардиоспецифичность изоформ дает максимально раннюю информацию о нарушениях миокарда и возможность своевременного применения тромболитической терапии.
Одной из наиболее удобных для этой цели систем является прелагаемая фирмой Helena France система Cardio Rep. В автоматическом режиме в течение 18 минут с высокой чувствительностью (96%) и специфичностью (94%) выдаются результаты определения 3 изоформ, являющихся дереватами СК-ММ и двух от СК-МВ: МВ2, соотношение МВ2 к MB 1, общая активность СК-МВ и %МВ.
Щелочная фосфатаза — фермент существующий фактически во всех органах и тканях, однако, печень, кости и кишечник имеют свои органоспецифические изоферменты. В связи с тем, что щелочная фосфатаза широко распространена в различных тканях, определение в крови тотальной активности данного фермента мало информативно. С этой точки зрения становится понятной значимость определения раздельных ихоэнзимов, активность которых в том или ином органе уникальна. Иоэнзимы щелочной фосфатазы отличается физико-химическими и электрофоретическими свойствами, что и создает возможности для их идентификации с помощью электрофореза, где наряду с разделением печеночных, костных, кишечных и плацентраных изоэнзимов в сыворотке могут быть выделены еще такие изоэнзимы, как : макрогепатические, ренальные, Nagao.
Таким образом, электрофоретическое разделение изоферментных форм позволяет идентифицировать патологию того или иного органа, активно включаясь в диагностический процесс.

Электрофорез гемоглобина
Гемоглобинопатии — генетически детерменированные аномалии, характеризующиеся количественными или качественными вариациями гемоглобина. К настоящему времени у человека идентифицированы более 200 анормальных гемоглобинов. Наибольшее клиническое значение из них имеют гемоглобины S (депраноциты), С, D и Е. Электрофорез как способ диагностики заболеваний, связанных с выявлением той или иной формы гемоглобинопатии на современном этапе является самым информативным методом. Так выявление на электрофореграмме депраноцитоза (Hb S) свидетельствует о наличии серпавидноклеточной анемии. Гетерозиготные формы гемоглобинопатии с НЬС и НЬЕ наиболее часто встречающиеся в Западной Африке и на Востоке чаще всего не имеют клинической манифистации. Группа гемоглобинопатии, при которых отсутствует или снижается продукция одной или более глобиновых цепей, называется талассемия. При этом нарушение происходит не в структуре цепи, а в дефиците синтеза цепи, как правило бетта-цепи реже альфа-цепи. Существует много вариантов талассемий, при чем иногда талассимия сочетается с другими гемоглобинопатиями, серповидноклеточная талассемия — наиболее частое сочетание.
Внедрение электрофореза в неонатальную скрининговую программу, а также обследование семейных пар на выявление риска генетических патологий гемоглобина у планируемого ребенка позволяет насторожить родителей о возможных проблемах до появления тяжелых симптомов, таких как серповидно-клеточная анемия и др. Нельзя не упомянуть о электрофоретическом количественном измерении гликированного гемоглобина.
Гликозилированный гемоглобин (HbAl) компонуется из 5 фракций (HbAla, HbAlb, HbAlc, HbAld и HbAle) и в норме составляет от 5 до 8 % тотального гемоглобина.
Наибольший интерес представляет HbAlc. В структуре которого N-терминал аминокислоты соединен с молекулой глюкозы и составляет 4-6 % тотального гемоглобина, т.е. основную часть гликированных форм гемоглобина (HbAla — 0,2%, HbAlb — 0,5 %, HbAld — 0,2%). Гликирование — это медленный, необратимый, неферментативный процесс, в результате которого гемоглобин теряет кислороднесущую функцию на период всей жизни эритроцитов (120 дней). В связи с этим пропорционально времени и концентрации глюкозы содержание гликированного гемоглобина в крови отражает гликемический статус за предыдущие тестированию 3 месяца, в то время, как измерение глюкозы в крови отражает гликемию в момент взятия крови.
Таким образом для выявления преддиабетических состояний и оценки антидиабетической терапии абсолютно необходимо определениеНЬА1с (рис. 22).

Рис.22 Нормальная электрофореграмма гликированного гемоглобина

Мощный технический прогресс последних десятилетий и развитие коммерционализации в медицине дали толчок для развития новейших технологий на базе известных принципов электрофореза. Диагностическая значимость данного метода подтверждается огромным разнообразием выпускаемых в настоящее время систем для электрофореза. Причем, наряду с такими мощными лидерами в производстве, как Helena Laboratories (Франция) или Beckman (США), где лишь перечень выпускаемого оборудования составляет десятки страниц предлагаются и небольшие автоматические денситометры простые в эксплуатации, предназначенные для рутинных исследований белковых фракций (Biosystems, Испания). Широкий спектр современных приборов основан на знании клинических потребностей в различных областях медицины, вплоть до самых узких диагностических задач и на современнейших технологиях, позволяющих создавать полностью автоматизированные системы для электрофореза (REP 3, Helena Laboratories, Франция; Biomek 2000, Beckman, США). Новинкой являются предлагаемые системы для капиллярного электрофореза (CES I, PrinCE, Helena Laboratories, Франция; Paragon CZE 2000, Beckman, США). Автоматические системы капиллярного электрофореза выполняют быстрое разделение биомолекул с высокой разрешающей способностью на фемтомолярном уровне (10 15 моля) из нанолитровых объемов (10 9 литра) образца. Электрофоретическое разделение макромолекул происходит внутри капилляра под воздействием высокого напряжения. Работа систем полностью контролируется компьютером.
Использование современных электрофоретических анализаторов позволяет с высокой точностью и минимальными трудозатратами исследовать широчайший спектр биохимических параметров с целью уточнения диагноза, мониторинга патологического процесса и обоснования патогенетической терапии.
Возможность упростить процесс обработки обширной и разносторонней информации, получаемой в результате электрофоретических и других исследований дает использование лабораторной компьютерной системы (Рис.23).

Рис.23 Типичный экран лабораторной компьютерной системы при выборе электрофоретических исследований

Компьютера в лаборатории не надо бояться. Его намного быстрее и легче освоить, чем заполнять вручную многочисленные журналы, бланки, направления, отчеты и т.д. Кроме того, систематизация лабораторной информации, начиная с кодирования пробирок с образцами и кончая архивированием обработанных данных значительно увеличивает точность исследований, повышая производительность лаборатории в целом и эффективность ее взаимодействия с лечебными отделениями.
Таким образом, далеко не полный перечень возможностей клинического применения электрофореза, дает лишь общее представление о незаменимой роли данного метода для дифференцировки патологических отклонений в сложном процессе диагностических обследований.
Вопросы для самоконтроля.

1. Основной принцип электрофоретического разделения.
2. Фракционный состав типичной электрофореграммы протеинов.
3. Основная цель электрофореза с иммуннофиксацией.
4. Характеристика электрофореграмм при гиперлипидемиях.
5. Клиническое значение электрофореза изоферментов креатинфосфокиназы.
6. Основные точки приложения электрофореза в диагностике гемоглобинопатии.
7. Наиболее современные направления технологий электрофореза.

Список литературы

Иллюстративные и графические материалы любезно представлены компанией Helena Laboratories (Франция) и научно производственным объединением «АЛТЭЙ» (Москва).

1. Гусев Е.И., Демина Т.Л., Бойко А.Н.
   «Рассеянный склероз», г.Москва, 1997 г.
2. Куксинский В.А., Чурляев Ю.А., Никифорова Н.В. и др.
   «Содержание белков-маркеров спинномозговой жидкости при тяжелой черепно-мозговой травме» — Клиническая лабораторная диагностика, 1997 г., №11, стр.11-13
3. Джорджеску П., Пэунеску Е.
   «Биохимические методы диагноза и исследования»,
   Бухарест, 1963 г., стр. 84-106
4. Эйнштейн Э.Р.
   «Белки мозга и спинномозговой жидкости в норме и патологии; пер. с англ. — М., 1988 г.
5. Alper, С.A., Plasma Protein Measurements as a Diagnostics Aid, N.Eng.J.Med., 291:287, 1974
6. Alper, C.A., Johnson, A.M., Immunofixation Electrophoresis: a Technique for the Study of Protein Polymorphism. Vo Sang 17: 445-452, 1969
7. Killingsworth, L.M., Plasma Protein Natterns in Health and Lisease, CRC Crit. Rev. in Clin. Lab. Sci, August, 1979
8. Killingsworth, L.M. etal., «Protein Analysis, Diag. Med, 3-15, Jan/Feb, 1980
9. Marmor, A etal., The MB Isoenzyme of Creatine Kinase as an Indicator of Severity of Myocardialschemia, Lancet, Oct. 812-814, 1978
10. Pitzmann, S.E., Daniels, J.E., Serum Protein abnormalities: Diagnostic and Clinical aspects; Allen Less Co., 1982
11. Tiselius, A., A New apporoach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures, Trans Faraday Soc, 33:524, 1937

Основы гель-электрофореза — Виртуальный учебник Alaska BioPREP

Цель гель-электрофореза или «прогона геля» — визуализировать, действительно ли сработала ваша экстракция ДНК и / или последующая реакция ПЦР. Хотя предполагается, что ПЦР амплифицирует только один чистый продукт, в действительности вы получаете смесь димеров праймеров (праймеры, связывающиеся друг с другом вместо цепи матрицы) и неправильных фрагментов в дополнение к желаемому продукту. Гель-электрофорез используется для сортировки фрагментов ДНК по размеру (количеству пар оснований).Сравнивая продукты ПЦР с «лестницей» или набором известных длин стандартных пар оснований, вы можете оценить длину фрагментов из своей ПЦР и найти тот, который соответствует размеру продукта, который вы пытались амплифицировать.

Что вам потребуется
Для проведения гель-электрофореза вам понадобятся следующие предметы:

1. Гелевая установка: это специализированное оборудование для заливки геля и проведения электрофореза.
Продукт ПЦР
2. : это смесь фрагментов ДНК, которые нужно отсортировать.
3. ДНК-лестница: раствор молекул ДНК различной длины, который используется в качестве эталона размера.
4. Буфер: используется для создания геля, поддерживает pH и содержит ионы, необходимые для переноса электрического заряда.
5. Агарозный гель: это вид желатина из морских водорослей, который разделяет фрагменты ДНК.
6. Загрузка красителя: этот краситель добавляется в образец ДНК, чтобы с ним было легче работать.
Окрашивание ДНК
7. : этот краситель связывается с ДНК, поэтому полосы можно увидеть в трансиллюминаторе.Примеры включают SYBR Green, SYBR Safe, Ethidium Bromide и Fast Blast.
Трансиллюминатор
8. : этот аппарат излучает ультрафиолетовый, синий или белый свет, который заставляет пятно ДНК (и ДНК) светиться. Разным источникам света соответствуют разные пятна.

Как это работает?
Молекулы ДНК несут общий отрицательный заряд. Поскольку противоположности притягиваются, ДНК притягивается к положительным зарядам, в данном случае к (+) электроду гелевой установки. Чтобы добраться до (+) электрода, ДНК должна пройти через лист агарозного геля.Более мелкие кусочки проходят через гель быстрее, чем длинные. Фрагменты одинаковой длины движутся с одинаковой скоростью и образуют четкие полосы в геле.

Когда гель закончил работу, он пропитывается пятном ДНК, химическим веществом, которое выполняет две функции: 1) связывается с двухцепочечной ДНК и 2) светится в УФ, синем или белом свете.
Полученное изображение геля должно выглядеть примерно так:

Обратите внимание, что на этом геле 6 дорожек. Дорожки 1 и 6 содержат лестницу, которая служит ориентиром для измерения.Продукт ДНК или ПЦР находится на дорожках 2-5, в результате чего полосы на дорожках 2-4. Также обратите внимание, что поток электричества меняется с отрицательного на положительный.

Этапы и метод секвенирования по Сэнгеру

Каждый dNTP содержит фосфатную группу, сахарную группу и одно из четырех азотистых оснований [аденин (A), тимин (T), гуанин (G) или цитозин (C)]. DNTP связаны вместе линейным образом фосфодиэфирными ковалентными связями между сахаром одного dNTP и фосфатной группой следующего; этот повторяющийся сахарно-фосфатный паттерн составляет сахарно-фосфатный остов.

Азотистые основания двух отдельных цепей связаны водородными связями между комплементарными основаниями с образованием двухцепочечной спирали ДНК.

Как читать результаты секвенирования по Сэнгеру

Правильное считывание результатов секвенирования по Сэнгеру будет зависеть от того, какая из двух комплементарных цепей ДНК представляет интерес и какой праймер доступен. Если две цепи ДНК — это A и B, и цепь A представляет интерес, но праймер лучше для цепи B, выходные фрагменты будут идентичны цепи A.С другой стороны, если цепь A представляет интерес и праймер лучше подходит для цепи A, то выходной сигнал будет идентичен цепи B. Соответственно, выходной сигнал должен быть преобразован обратно в цепь A.

Итак, если интересующая последовательность читается как «TACG» и праймер лучше всего подходит для этой цепи, вывод будет «ATGC» и, следовательно, должен быть преобразован обратно в «TACG». Однако, если праймер лучше подходит для комплементарной цепи («ATGC»), то на выходе будет «TACG», что является правильной последовательностью.

Короче говоря, прежде чем начать, вам нужно знать, на что вы нацеливаетесь и как вы собираетесь этого достичь! Имея это в виду, вот пример предыдущего примера (TACG -> ATGC -> TACG). Если метки дидезоксинуклеотидов T = желтый, A = розовый, C = темно-синий и G = светло-синий, вы получите короткие последовательности праймер-A, праймер-AT, праймер-ATG и праймер-ATGC. После разделения фрагментов с помощью электрофореза лазер считывает фрагменты в порядке их длины (розовый, желтый, голубой и темно-синий) и создает хроматограмму.Компьютер преобразует буквы, так что последняя последовательность будет правильной TACG.

Секвенирование по Сэнгеру в сравнении с ПЦР

Для секвенирования

по Сэнгеру и ПЦР используются аналогичные исходные материалы, и их можно использовать в сочетании друг с другом, но ни один из них не может заменить другой.

ПЦР используется для полной амплификации ДНК. Хотя фрагменты различной длины могут быть получены случайно (например, ДНК-полимераза может отвалиться), цель состоит в том, чтобы продублировать всю последовательность ДНК. С этой целью «ингредиентами» являются целевая ДНК, нуклеотиды, ДНК-праймер и ДНК-полимераза (в частности, полимераза Taq, которая может выдерживать высокие температуры, необходимые для ПЦР).

Напротив, целью секвенирования по Сэнгеру является создание ДНК любой возможной длины вплоть до полной длины целевой ДНК. Вот почему, помимо исходных материалов для ПЦР, необходимы дидезоксинуклеотиды.

Секвенирование по Сэнгеру и ПЦР могут быть объединены при создании исходного материала для протокола секвенирования по Сэнгеру. ПЦР можно использовать для создания множества копий ДНК, подлежащих секвенированию.

Наличие более одного шаблона для работы делает протокол Сэнгера более эффективным.Если целевая последовательность имеет длину 1000 нуклеотидов и имеется только одна копия шаблона, потребуется больше времени для создания 1000 помеченных фрагментов. Однако при наличии нескольких копий шаблона теоретически потребуется меньше времени для создания всех 1000 помеченных фрагментов.

Что вам нужно знать

Всякий раз, когда вы изучаете белки и нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) в лаборатории, есть большая вероятность, что вы будете анализировать образцы с помощью гель-электрофореза.В конце концов, это один из самых эффективных методов, которые вы можете использовать для отделения интересующего вас белка, ДНК и РНК от смеси. В результате гель-электрофорез широко используется во многих областях наук о жизни, горнодобывающей промышленности и пищевой промышленности.

Гель-электрофорез: как это работает?

Если вы хотите разделить представляющие интерес белки или нуклеиновые кислоты с помощью этого метода, вам необходимо пропустить ваши образцы через гелевый аппарат, который содержит катод на одном конце, анод на другом и платформу, которая удерживает пористую гелевая матрица в середине (обычно агарозный или акриламидный гель).Соответствующий буфер добавляется для создания градиента заряда при приложении электрического тока. А поскольку гель может нагреваться при нанесении заряда, буфер помогает сохранять гель в прохладном состоянии и предотвращает его перегрев.

Поскольку белки и нуклеиновые кислоты имеют однородный общий отрицательный заряд, эти молекулы будут естественным образом перемещаться к положительному электроду при приложении электрического тока. Поскольку более мелкие молекулы могут легко перемещаться через поры гелевой матрицы, можно ожидать, что они будут перемещаться через гелевую матрицу быстрее, чем более крупные молекулы.Когда процесс будет завершен, вы увидите несколько отличных, красивых полос белков и нуклеиновых кислот, разделенных на основе их молекулярных масс.

Горизонтальный и вертикальный электрофорез: понимание их различий

По сути, существует два основных типа гель-электрофореза, которые вы можете использовать для своих целей: горизонтальный гель-электрофорез и вертикальный гель-электрофорез. Хотя обе системы следуют схожей теории гель-электрофореза, между ними есть некоторые ключевые различия.Чем отличаются эти системы и когда следует выбирать одну из них? Давайте взглянем.

Ориентация и буферная система. Одно из ключевых различий между двумя системами — их ориентация. При горизонтальном гель-электрофорезе гелевую матрицу отливают горизонтально и погружают в непрерывно работающий буфер, в то время как при вертикальном гель-электрофорезе гель ориентирован вертикально, а буферная система является прерывистой.

Кроме того, в вертикальной гелевой системе используются две камеры — верхняя камера с катодом и нижняя камера с анодом.Обе камеры содержат электроды, создающие необходимое электрическое поле. Затем немного геля заливается между двумя установленными стеклянными пластинами, так что нижняя часть геля погружается в буфер в одной камере, а верхняя часть погружается в буфер в другой камере. При приложении электрического тока небольшое количество буфера перемещается вниз по камере через гель. Поскольку буфер протекает исключительно через гель, вы можете полностью контролировать градиенты напряжения на протяжении всего процесса разделения.Это означает, что вы можете рассчитывать на более эффективное разделение и большее разрешение при использовании системы вертикального электрофореза.

Лари. Горизонтальный гель-электрофорез использует агарозный гель, а вертикальный гель-электрофорез — акриламидный гель. Гели агарозы имеют более крупные поры (от 100 до 500 нм в диаметре), в то время как акриламидные гели имеют более мелкие поры (от 10 до 200 нм в диаметре). Акриламид нельзя использовать для горизонтального гель-электрофореза, поскольку в этом методе гель подвергается воздействию атмосферного кислорода.Как вы, возможно, знаете, присутствие кислорода ингибирует полимеризацию акриламида и препятствует образованию геля. Однако вы можете использовать акриламидный гель для вертикального гель-электрофореза, поскольку буфер протекает только через гель, а отдельные отсеки не подвергаются воздействию кислорода воздуха.

Когда использовать тот или иной метод. Горизонтальный гель-электрофорез в основном используется для разделения смесей, содержащих молекулы ДНК и РНК, а вертикальный гель-электрофорез идеально подходит для разделения белков.

Связанные блоги

Как проводить гель-электрофорез — GenoSensor Education

Гель-электрофорез — это простой, но эффективный метод, необходимый для любой биотехнологической лаборатории. Ученые используют гель-электрофорез для разделения макромолекул, таких как ДНК, РНК и белки, в зависимости от размера и заряда. Клинические химики используют гель-электрофорез, чтобы сосредоточиться на белках, а молекулярные биологи и биотехнологи больше интересуются ДНК и РНК. Этот протокол посвящен гель-электрофорезу с ДНК.

ДНК имеет отрицательный заряд, поэтому, если она проходит через электрический ток, она будет двигаться к положительному заряду и прочь от отрицательного заряда. Ученые используют это преимущество в гель-электрофорезе, суспендируя ДНК в геле и пропуская ток через гелевый аппарат, заставляя ДНК двигаться. ДНК проходит через матрицу геля агарозы, и чем длиннее и сложнее ДНК, тем медленнее она проходит. Используя этот метод, биологи могут определить размер и длину пары оснований образцов ДНК.ДНК также можно очистить для других лабораторий, таких как ПЦР, секвенирование ДНК или Саузерн-блоттинг.

Эта лабораторная работа является хорошей практикой для овладения математикой, микропипеткой и навыками принятия решений. Ее можно разделить на два лабораторных занятия, если время не позволяет провести весь эксперимент за одно занятие.

Материалы:

· Порошок агарозы

· Лестница ДНК

· Образцы ДНК

· Буфер для электрофореза 50X (TAE или TBE)

· Окрашивание геля ДНК (SYBR Safe или другие красители)

· Нанесение электрофореза 6X

Принадлежности:

· 1.Микроцентрифужные пробирки 5 мл

· Градуированный цилиндр 100 мл

· Колба Эрленмейера 250 мл

· Стакан 500 мл

· Аппарат для горизонтального гель-электрофореза

o Гель-лоток

o Гель для отливки

o Гель Камера для электрофореза с крышкой

· Источник питания для гель-электрофореза

· Весы и весы бумаги или лодочки

· УФ-свет или УФ-осветитель

Протокол:

1.Поместите лоток для геля в камеру для гель-электрофореза так, чтобы выемки на обеих сторонах совпали. Вставьте литейные ворота в прорези на противоположных концах лотка для геля.

2. Поместите гребешок для геля в паз лотка для геля, ближайший к черному катоду. Он должен скользить в выемках лотка и камеры.

3. Подготовьте буфер для электрофореза. Для этого протокола требуется 500 мл буфера TAE, поэтому используйте градуированный цилиндр на 100 мл, чтобы отмерить 10 мл исходного раствора 50X TAE и добавить его в стакан на 500 мл.Добавьте 490 мл дистиллированной воды. См. Подробности в разделе расчетов ниже.

4. Подготовьте 40 мл 1,0% агарозы в 1X буфере TAE. См. Подробности в разделе расчетов ниже.

а. Взвесьте 0,40 г агарозы и добавьте ее в колбу Эрленмейера.

г. Добавьте 40 мл 1X TAE Buffer, приготовленного на шаге 3, и встряхните, чтобы перемешать.

г. Ваша агароза не растворяется при комнатной температуре, поэтому ее необходимо нагреть. Разогрейте агарозу в микроволновой печи с шагом 30 секунд, осторожно покачивая колбу между каждым нагревом.

г. Продолжайте нагревать, пока вся агароза не растворится.

ВНИМАНИЕ:

· Колба Эрленмейера будет очень горячей! Используйте средства индивидуальной защиты, такие как очки и толстые перчатки или рукавицы для духовки, так как агароза может перегреться и закипеть.

· Перелив агарозы может вызвать ожоги.

· Подождите, пока агароза перестанет кипеть, прежде чем вынимать ее из микроволновой печи.

5. Подождите, пока раствор агарозы остынет до 55 ° C.

6. Добавьте краситель ДНК.Мы будем использовать 10 000-кратное окрашивание ДНК SYBR Safe. Используя микропипетку на 10 мкл, добавьте 4 мкл SYBR Safe в колбу Эрленмейера и осторожно встряхните, чтобы перемешать. См. Подробности в разделе расчетов ниже.

7. Вылейте гель агарозы в лоток для геля, созданный на шаге 1, до тех пор, пока агароза не окажется на расстоянии 2–4 мм от вершины зубцов гребня.

8. Дайте гелю остыть и затвердеть. Это займет около 20 минут. Он изменится с прозрачного на непрозрачный, а после застывания будет покачиваться, как желатин.

9. Снимите гребешок, осторожно потянув его вверх и вынув из лунок.

10. Снимите литниковые ворота, потянув их вверх.

ПРИМЕЧАНИЕ:

· Если ваш лабораторный период короткий, вы можете здесь остановиться. Оберните лоток с гелем влажным бумажным полотенцем, закройте полиэтиленовый пакет и поместите в холодильник до следующего лабораторного периода.

11. Добавьте 1X буфер TAE в камеру для гель-электрофореза. Заполните оба резервуара на каждом конце камеры и покройте гель примерно на 2 мм.На этом этапе камера для гель-электрофореза будет очень заполнена, поэтому будьте осторожны, чтобы не пролить жидкость!

12. Вам нужно покрасить образцы ДНК, чтобы вы могли видеть, как ДНК перемещается по гелю.

а. В чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавьте 10 мкл образца ДНК.

г. Добавьте 2 мкл красителя 6X в ту же пробирку для микроцентрифуги. Аккуратно перемешайте пипеткой вверх и вниз.

13. Теперь, наконец, пора загрузить образцы.

а. В первую лунку добавьте от 5 до 10 мкл лестницы ДНК.

г. В следующие несколько лунок добавьте до 12 мкл образцов окрашенной ДНК из шага 12. Количество, которое вы добавляете, может варьироваться, так как размер образца зависит от размера гребня, который вы использовали на шаге 2.

14. Закройте крышку. верх камеры с крышкой для гель-электрофореза, убедившись, что красный контакт взаимодействует с красным электродом, а черный контакт взаимодействует с черным электродом.

15. Подключите камеру для электрофореза к источнику питания, подключив провода к портам с цветовой кодировкой на передней панели источника питания: красный с красным и черный с черным.

16. Используя источник питания, установите его на 15–30 минут работы при 100 В и нажмите кнопку работы. Как только на камеру для гель-электрофореза будет подано питание, вы должны увидеть завесу из пузырьков на черном электроде. Вы также можете увидеть гораздо более тонкую завесу пузырьков на красном электроде.

17. Следите за своим гелем, когда он течет. Возможно, вам придется преждевременно завершить цикл, если кажется, что полосы приближаются к концу геля. Если они упадут с геля, они исчезнут навсегда.Вы можете проверить гель в УФ-свете. Если они плохо разделились, поместите гель обратно в камеру и продолжайте работать.

18. Как только гель перестанет течь, выключите источник питания, выньте электроды из источника питания и осторожно снимите крышку.

19. Извлеките гель и лоток для геля из камеры для гель-электрофореза. Не вынимайте его из лотка для геля. Это будет очень скользко из-за буфера TAE, поэтому будьте осторожны. Если он сломается или разорвется, проявите терпение — это может быть трудная техника, и вы учитесь!

20.Сдвиньте гель с лотка для геля на сухое бумажное полотенце или большую лодку для взвешивания. Поздравляю! Вы только что нанесли гель из агарозы!

21. Чтобы полосы были четко видны, направьте УФ-лучи на гель. Вы должны увидеть полосы лестницы и образцы ДНК, как только УФ-свет попадет на ДНК.

Результат:

Теперь, когда у вас есть гель в руке, пора выяснить, что означают эти полосы. В первую дорожку вы добавили лестницу ДНК размером 1 т.п.н. Каждая полоса на лестнице — это отрезок ДНК.По мере того, как гель растекается, разные длины проходят быстрее или медленнее в зависимости от того, насколько велики нити ДНК. Чем больше ДНК, тем медленнее они будут работать. Посмотрите на документы производителя, которые вы получили при заказе лестницы ДНК — в этих документах будут указаны размеры каждой полосы на лестнице. Если вы не можете найти его или выбросили, он должен быть доступен на веб-сайте производителя — просто введите в Google название своей ДНК-лестницы.

Сопоставьте свои неизвестные ДНК с «ступенькой» на лестнице, и это покажет вам, насколько велика цепь ДНК.Например, если ваша цепь ДНК совпадает с «ступенькой» из 200 пар оснований на лестнице, то длина вашей цепи ДНК составляет около 200 пар оснований. Используя эту технику, теперь вы можете оценить длину ваших цепей ДНК и создать лаборатории, основанные на этой концепции! (Многие старшеклассники и студенты колледжей любят проводить лабораторию CSI Murder Mystery.)

Устранение неполадок:

· Моя агароза протекает, когда я пытаюсь вылить ее в лоток для геля.

o Поместите литниковые заслонки в морозильную камеру и добавьте их в камеру непосредственно перед добавлением раствора агарозы.

o Еще немного надавите на литниковые ворота.

o Замените кастинговые ворота на другой набор.

o Используйте ленту или парафильм вместо литниковых ворот. Не забудьте удалить ее перед бегом, иначе лента расплавится, что испортит ваши результаты.

o Проверьте места утечек, добавив воду из-под крана в центр камеры и посмотрев, откуда она выходит.

· Я не могу покрыть свой гель буфером TAE.

o Ваш гель слишком высок.Вам придется выбросить старый гель и попробовать еще раз, используя немного меньше раствора агарозы. Вам не нужно использовать все это. Буфер TAE не испортится, если вы дотронетесь до него (даже если вы не в перчатках), поэтому вы можете использовать его повторно, пока не включили питание камеры.

· Сложно достать пробы в лунки.

o Наберитесь терпения, изучая эту технику. Эта часть может быть сложной для опытных лабораторных работников. Тревога и неопытность сделают руки дрожащими, поэтому дышите и относитесь к себе с пониманием, когда вы учитесь.Со временем станет легче.

o Доступны специальные длинные наконечники, которые могут помочь вам легче загружать образцы. Найдите «Наконечники для микропипеток с загрузкой геля».

o Держите правое запястье неподвижно левым при дозировании образцов. (Или наоборот, если вы левша.)

o Действуйте очень медленно. По мере того, как вы добавляете ее в гель, ДНК погружается, поэтому вам не нужно вводить всю лунку. Пока самый кончик наконечника находится в лунке, вы можете добавить образец ДНК.

o Практика, практика, практика!

· Я включил блок питания и запустил его, но пузырей не вижу.

o Похоже, ваш блок питания сломан или поврежден. Посоветуйтесь с коллегой, видят ли они пузыри. Подождите несколько минут, чтобы увидеть, мигрируют ли полосы ДНК. Если это не так, обратитесь к производителю за дополнительной помощью.

· Мой блок питания не включается.

o Вы его подключили? Он не работает от аккумулятора, и для работы его необходимо подключить к розетке.

· Камера нагревается после начала работы.

o Немного тепла — это нормально, но если становится жарко, у тебя проблемы.Немедленно завершите цикл, дождитесь, пока буфер немного остынет, и снова запустите его при более низком напряжении. Оставайтесь ниже 200 вольт и уменьшите на 25 вольт, если он все еще нагревается.

· Гель наносится слишком долго.

o Попробуйте уменьшить количество агарозы, добавляемой на шаге 4. Сделайте 0,8% или 0,6% гель вместо 1,0% геля.

o Попробуйте увеличить напряжение на шаге 15 до 125 или 150 вольт. Будьте очень осторожны, так как повышенное напряжение может привести к расплавлению геля и нагреванию камеры.

o Оба этих приема повлияют на конечный результат, создав более размытую линию на геле.

· Мои результаты слишком расплывчаты.

o Попробуйте увеличить количество агарозы, добавляемой на шаге 4. Сделайте 1,2% или 1,4% гель вместо 1,0% геля. Это означает, что гель растекется дольше, но линия будет более четкой.

· Моя ДНК бегала в обратном направлении и от геля.

o Вы перепутали электроды на крышке или на источнике питания. Помните, что красный всегда сочетается с красным, а черный всегда сочетается с черным.

· Моя ДНК очень быстро переместилась вперед и вышла из геля.

o Вы добавили 1X TAE Buffer в камеру или дистиллированную воду? Добавление дистиллированной воды заставит гель растекаться очень и очень быстро и смазывать все оставшиеся полосы.

· Я остановил пробежку слишком рано, и полосы расположены слишком близко друг к другу.

o Поместите лоток с гелем обратно в камеру и дайте ей поработать еще 15 минут. Не забывайте следить за своим гелем, чтобы резинки не упали с конца!

· Я остановил пробежку слишком поздно, и полосы отвалились от конца геля.

o Перезапустите лабораторию с шага 1. Иногда вы можете получить несколько полос, которые еще не отвалились, но если все полосы исчезли, вы не можете их вернуть.

· Я не вижу полос на геле.

o Вы забыли добавить краситель ДНК на шаге 6 или не дождались, пока агароза остынет достаточно долго, и окраска ДНК была разрушена нагреванием.

· Я вижу лестницу ДНК, но не свои образцы ДНК.

o Образцы ДНК слишком малы, чтобы их можно было увидеть на геле. Попробуйте еще раз с более высокой концентрацией ДНК или большим количеством образцов ДНК, чтобы увидеть, поможет ли это.

· Я попытался устранить неполадки, но проблема не исчезла.

o Вы можете либо обратиться к производителю и попросить о помощи, либо зайти в Интернет и погуглить свою проблему. ResearchGate — это онлайн-форум, наполненный профессионалами, которые способны ответить на любые ваши вопросы или проблемы, которые могут возникнуть.

Видео:

Приготовление геля из агарозы — https://www.youtube.com/watch?v=wXiiTW3pflM

Запуск геля из агарозы — https://www.youtube.com/watch?v=U2-5ukpKg_Q

Расчеты:

Шаг 3 — Создание буфера 1X TAE с помощью уравнения разбавления C1V1 = C2V2

Мы хотим, чтобы наш буфер переходил от большой концентрации к концентрации 1x.Мы будем использовать запасы в 50 раз, поэтому измените переменные, если ваша концентрация запасов или окончательный объем отличаются.

C1 = 50X C2 = 1X

V1 =? мл V2 = 500 мл

1. 50X • x мл = 1X • 500 мл

2. (x мл = 500 X • мл) / 50X

3. x мл = 10 мл 50X TAE

4. 500 мл — 10 мл 50X TAE = 490 мл дистиллированной воды

Итак, раствор представляет собой 10 мл 50X TAE и 490 мл дистиллированной воды.

Шаг 4 — Приготовление 40 мл 1,0% агарозного геля.

Этот гель имеет вес 1,0% по объему. Измените переменные, если ваша целевая концентрация или конечный объем отличаются.

1. (1,0 г агарозы / 100 мл раствора) = (xg агарозы / 40 мл раствора)

2. Перемножьте крест-накрест, чтобы получить:

(1,0 г x 40 мл) / 100 мл = 0,40 г агарозы

Итак, мы ‘ повторно отвешиваем 0,40 г агарозы для нашего геля.

Шаг 6 — Разведение 10,000X SYBR Safe до 1X с помощью уравнения разведения C1V1 = C2V2

Для того, чтобы окраска ДНК SYBR Safe работала правильно, его необходимо разбавить до 1X.Другое окрашивание ДНК может иметь другую начальную концентрацию, и если вы не готовите 40 мл раствора агарозы, эти переменные будут другими.

C1 = 10,000X C2 = 1X

V1 =? мл V2 = 40 мл

1. 10 000X • x мл = 1X • 40 мл

2. x мл = (40 X • мл / 10 000 X)

3. x мл = 0,004 мл SYBR Safe

4. 0,004 мл • (1000 мкл / 1 мл) = 4 мкл SYBR Safe

Итак, мы добавляем 4 мкл SYBR Safe к 40 мл раствора агарозы

Электрофорез — Брайан МакКоли

Эта страница является частью лаборатории SDS-PAGE, которая включает следующие страницы:

Весь эксперимент будет растянут на три лабораторных дня.Электрофорез также будет использоваться в нескольких других лабораториях в этом квартале.

В молекулярной биологии электрофорез — это метод разделения макромолекул, таких как ДНК или белок. В Bio 6B вы будете использовать электрофорез, чтобы узнать результаты многих ваших экспериментов.

Техника разделения

В клетке много разных молекул. Если вы хотите изучить функцию определенной молекулы — например, белка — вам нужно отделить эту молекулу от всех остальных.По этой причине молекулярные биологи и биохимики должны владеть рядом методов разделения, чтобы изолировать конкретные молекулы, которые их интересуют. Электрофорез — один из самых важных методов разделения ДНК и белка, и вы будете использовать его несколько раз в этом квартале. Сначала вы сделаете электрофорез белков, поэтому я сначала расскажу об этом на этом сайте.

Существуют также различные другие методы разделения, обычно используемые в молекулярной биологии, включая хроматографию, которую мы будем использовать в следующей лаборатории.

Как работает электрофорез

В электрофорезе белков вы заставляете белки перемещаться через гель, применяя электрическое поле, которое притягивает заряженные белки. Положительно заряженные молекулы будут двигаться к отрицательному полюсу, а отрицательно заряженные молекулы будут двигаться к положительно заряженному полюсу. Незаряженные молекулы вообще не двигаются. Гель может быть любым твердым материалом, но имеет достаточно большие поры, через которые проходят протеины. Если поры плотно прилегают к белкам, более крупные белки будут двигаться медленно, а более мелкие белки будут двигаться быстрее.

Скорость движения белка через гель будет контролироваться:

• Молекулярная масса. Более крупные и массивные молекулы движутся медленнее, потому что они не проходят через поры легко.
• Заряд. Сила и полярность заряда влияют на скорость и направление движения молекулы. Некоторые белки заряжены положительно, а некоторые — отрицательно; в большинстве случаев заряд будет зависеть от pH и других характеристик раствора.Используя SDS-PAGE, как описано ниже, вы сможете контролировать заряд ваших белков.
• Форма. Плотно свернутый протеин будет казаться меньше по размеру и будет проходить через гель быстрее, чем протеин со слабой складкой.
• Размер пор. Более крупные поры = более быстрое движение. Меньшие поры могут позволить более точное разделение. Размер пор варьируется от геля к гелю, но в одном геле каждая полоса имеет одинаковый размер пор.
• Напряжение. Чем больше напряжения вы приложите к гелю, тем быстрее будут двигаться предметы. В одном геле напряжение постоянно.

Ключевой момент: Используя соответствующие методы, мы можем разделить нашу ДНК или молекулы белка исключительно на основе размера (другими словами, молекулярной массы), сохраняя все другие переменные постоянными. Это верно как для ДНК-электрофореза, так и для белкового электрофореза.

В Bio 6B вы будете использовать два разных метода электрофореза: SDS-PAGE для белков и агарозный гель для ДНК.

SDS-PAGE

В SDS-PAGE белки разделяются исключительно на основе молекулярной массы. Все остальные переменные находятся под контролем. Чтобы понять, как это работает, вы должны понимать, что означает SDS-PAGE.

SDS означает додецилсульфат натрия , но не беспокойтесь об этом; просто назовите это SDS. SDS является детергентом, и он входит в состав буферов, используемых в SDS-PAGE. Это позволяет выполнить несколько важных задач для электрофореза:

• SDS помогает белкам растворяться, поэтому их можно наносить на гель (не все белки растворимы в простой воде).
• SDS помогает денатурировать или раскрывать белки. Это означает, что относительно слабые водородные связи, гидрофобные взаимодействия и ионные связи, которые поддерживают третичную форму белков, будут разрушены, но первичная структура полипептидов не будет изменена. (Не волнуйтесь, если вы еще не понимаете первичную и третичную структуру; эти концепции будут рассмотрены в первой лекции.) Конечным результатом использования SDS является то, что форма белков не влияет на скорость их миграции в геле. .
• SDS прилипает к белкам и делает их отрицательно заряженными. Поскольку SDS прилипает ко всему белку, каждый белок имеет одинаковую плотность заряда.
• Для того, чтобы это сработало, вам необходимо предварительно обработать образцы белка с помощью SDS и добавить его в гель. [В сегодняшней лаборатории вы можете использовать додецилсульфат лития вместо SDS; он по-прежнему называется SDS-PAGE.]

PAGE обозначает электрофорез в полиакриламидном геле . Вы, наверное, должны это запомнить.Полиакриламидные гели получают, начиная с раствора акриламида и добавляя полимеризующий агент, а затем заливая раствор между двумя пластиковыми пластинами. Акриламид полимеризуется и образует поперечные связи, создавая сеть из крупных полимеров с заполненными водой порами, которые имеют размер молекулы белка. Когда вы помещаете белки в гель и протягиваете их электрическим полем, они выдавливаются через поры.

Полиакриламид используется, потому что он создает прочные гели с предсказуемым размером пор, что позволяет нам использовать тонкие гели и получить четко определенное разделение наших белков.

В SDS-PAGE все белки имеют одинаковую плотность заряда и одинаковую развернутую форму. В одном геле размер пор и напряжение постоянны. Следовательно, в SDS-PAGE скорость миграции белка через гель определяется исключительно размером (молекулярной массой) . SDS-PAGE — это наиболее часто используемый метод электрофореза белков. Это тот, который вы будете использовать в лаборатории 6B.

Подготовка образцов для SDS-PAGE

Образец белка для SDS-PAGE начинается с лизата.Инструкции по приготовлению лизата из бактериальной культуры см. На странице «Подготовка образца белка». Получив очищенный лизат, вы смешаете его с буфером для образцов SDS (или буфером для образцов LDS, который является тем же, за исключением использования лития вместо ионов натрия). Буфер для образцов включает несколько важных ингредиентов:

• SDS денатурирует белки и делает их отрицательно заряженными.
• Глицерин , чтобы образец был достаточно плотным, чтобы он опустился на дно лунки.
• Синий краситель , например бромфенол, чтобы вы могли видеть образец при его загрузке. Синий краситель также будет проходить через гель немного быстрее, чем ваши мельчайшие белки. Если вы пропустите гель до тех пор, пока краситель не достигнет нижней части геля, вы узнаете, что ваши белки распространились снизу вверх. Однако краситель в буфере для образцов не окрашивает белки; вам все равно нужно будет красить гель после бега, чтобы вы могли видеть свои протеиновые полосы.

В дополнение к буферу для образцов необходимо добавить еще один ингредиент:

• Восстановитель для разрыва дисульфидных (S-S) связей, которые образуются между сульфгидрильными боковыми цепями цистеиновых аминокислот, образующих часть третичных структур белков.Восстановитель (например, дитиотреитол) разрывает дисульфидную связь за счет восстановления атомов серы. Дисульфидная связь потенциально может переформироваться в результате окисления во время электрофореза, поэтому мы обычно добавляем антиоксидант в рабочий буфер.

После того, как вы объедините образцы белка с буфером для образцов и восстанавливающим агентом, важно тщательно перемешать и нагреть образец, чтобы эти ингредиенты могли выполнять свою работу.

Агарозные гели для ДНК-электрофореза

В Bio 6B вы будете использовать электрофорез в агарозном геле для разделения молекул ДНК по размеру; это будет конечной точкой всех ваших экспериментов с ДНК.Ваш ДНК-гель скажет вам, есть ли у вас ДНК, которую вы ищете.

Методы, которые вы используете для электрофореза ДНК и электрофореза белков, различаются, поскольку ДНК отличается от белка в нескольких важных отношениях:

• ДНК в растворе всегда заряжена отрицательно. Что касается белков, вам нужно было использовать SDS, чтобы гарантировать, что все белки имеют одинаковую плотность отрицательного заряда, но вам не нужно использовать SDS с вашей ДНК.
ДНК
• обычно не имеет третичной структуры.В случае с белками вы использовали SDS, восстановитель образца, и нагревание, чтобы раскрыть третичную структуру белков; с ДНК этого делать не нужно. ДНК обычно имеет вторичную структуру (двойную спираль), но не третичную. Циркулярные молекулы ДНК, такие как плазмиды, являются исключением; они будут рассмотрены в следующей лаборатории.
• В наших экспериментах с ДНК обычно будет небольшое количество полос на каждой дорожке — в отличие от белковых гелей, у которых полос больше. Следовательно, вам не понадобится разрешающая способность более тонких и прочных полиакриамидных гелей, используемых для получения белка.

Из-за этих различий в молекулах и экспериментах ваши процедуры будут другими. Подготовка проб для гелей ДНК проще; Вам не нужно нагревать образец или использовать SDS или восстановитель.

Приготовление геля немного сложнее, просто потому, что вы будете делать свои собственные гели ДНК, вместо того, чтобы использовать готовые гели, как мы делали с SDS-PAGE.

См. Методы электрофореза ДНК.

Агароза против полиакриламида: подробнее

Гели агарозы обычно имеют гораздо более крупные поры, чем полиакриламидные гели, что делает их пригодными для более крупных молекул.В лаборатории Bio 6B наши молекулы ДНК в наших агарозных гелях обычно будут намного больше, чем белки, которые мы изучаем в SDS-PAGE. Например, один зеленый флуоресцентный белок (GFP), который мы будем искать в лаборатории pGLO, имеет молекулярную массу около 27 килодальтон. В отличие от этого плазмидная ДНК pGLO имеет молекулярную массу около 3300 кДа (длина pGLO составляет 5371 пара оснований, а одна п.н. ДНК имеет молекулярную массу 618 дальтон). Даже небольшой ПЦР-продукт ДНК из 900 пар оснований имел бы 581 кДа. Это основная причина, по которой мы будем использовать агарозные гели для ДНК.

Гели агарозы также недороги и просты в приготовлении по сравнению с полиакриламидными гелями. С другой стороны, полиакриламид делает гели намного прочнее, поэтому можно делать очень тонкие гели для разделения с высоким разрешением.

Вы можете использовать полиакриламидный гель для ДНК, и люди иногда это делают, особенно если им нужно разделить очень маленькие молекулы ДНК почти одинакового размера. Вы также можете использовать гель агарозы вместо полиакриламида для белков. Это сработает, и когда-то это была стандартная процедура, но гели агарозы дают менее точные результаты.

Обзор

Термины и понятия

• Электрофорез
• СТРАНИЦА (Электрофорез в полиакриламидном геле)
• SDS (додецилсульфат натрия)
• Техника разделения

Контрольные вопросы

1. При электрофорезе ДНК молекулы ДНК обычно разделяются на основе различий в ________.
2. В SDS-PAGE белковые молекулы обычно разделяют на основе различий в ________.
3. Что заставляет макромолекулы двигаться через гель при электрофорезе?
4. Что определяет скорость, с которой макромолекулы перемещаются через гель при электрофорезе? Почему в одном геле одни движутся быстрее, чем другие?
5. Что контролирует заряд на молекулах ДНК при электрофорезе ДНК и на молекулах белка при SDS-PAGE?
6. Почему мы используем разные процедуры для электрофореза ДНК и белков?
7. Почему мы обычно используем агарозу для ДНК и полиакриламид для белков?
8. Сравните и сопоставьте образцы буферов для электрофореза ДНК и белков.
9. Сравните и сопоставьте работающие буферы для электрофореза ДНК и белков.

См. Также обзорные вопросы по методу электрофореза ДНК и SDS-PAGE.

Ссылки и дополнительная литература

Обзор

Как работает SDS-PAGE на Bitesize Bio.

Руководство по электрофорезу и обнаружению в полиакриламидном геле от Bio-Rad. Этот PDF-файл представляет собой как объяснение задействованных принципов, так и каталог сопутствующих товаров, продаваемых Bio-Rad.

Подробнее

Гели агарозы не полимеризуются! на Bitesize Bio.

Для более подробного объяснения агарозы и полиакриламида (гораздо больше, чем вам нужно знать для этой лаборатории!), Попробуйте эту статью: Электрофорез ДНК в агарозных гелях, полиакриламидных гелях и в свободном растворе Электрофорез Нэнси С. Стеллваген. 2009 июнь; 30 (Дополнение 1): S188 – S195.

Введение в анализ ПЦР | Bio-Rad Laboratories

ПЦР и ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) являются обычно используемыми методами для обнаружения видов ДНК и РНК соответственно.Однако количественное применение этих методов было ограничено. Теоретически ПЦР усиливает матричную ДНК экспоненциально, удваивая матрицу в каждом цикле, так что относительные различия между образцами могут быть измерены как интенсивность полос на геле.

Ограничение состоит в том, что на более поздних этапах ПЦР эффективность снижается, а усиление выходит на плато. Это означает, что количество продукта в реакции больше не пропорционально количеству исходного материала и не может быть определено количественно.Относительные количества амплифицированной ДНК в различных реакциях ПЦР можно сравнивать только тогда, когда реакции все еще находятся в экспоненциальной фазе амплификаций. По этим причинам кПЦР является наиболее часто используемым методом количественного анализа.

Если приняты надлежащие меры для обеспечения того, чтобы насыщение не было достигнуто, ПЦР по конечной точке может успешно использоваться в качестве полуколичественной меры относительных различий во вводимых шаблонах между образцами (см. Бюллетень Bio-Rad 2915). в экспоненциальной фазе амплификации образцы можно амплифицировать с увеличивающимся числом циклов, проводить гель-электрофорез и проводить количественный анализ с помощью гелевого имидж-сканера и программного обеспечения.Конкретные методы полуколичественной ПЦР включают относительную ОТ-ПЦР и конкурентную ОТ-ПЦР.

В относительной ОТ-ПЦР для мультиплексной реакции ПЦР конструируются две пары праймеров — одна для интересующего гена, а другая для гена домашнего хозяйства (Marone et al. 2001). Пары праймеров должны быть сконструированы так, чтобы они не образовывали димеры, а образовывали продукты достаточно разной длины, чтобы их можно было различить с помощью гель-электрофореза. Необходимо провести пилотные эксперименты, чтобы проверить продукт после разного количества циклов и определить экспоненциальную фазу реакции для обоих наборов праймеров.Используя программное обеспечение для визуализации геля для определения интенсивности полосы, затем можно рассчитать относительное кратное изменение между образцами, нормализованными по гену домашнего хозяйства. Проблема с этим подходом заключается в том, что гены домашнего хозяйства, необходимые для нормализации, обычно имеют гораздо более высокую экспрессию, чем интересующий ген. Один из подходов к этой проблеме заключается в использовании генов домашнего хозяйства с низкой экспрессией и использовании более высоких концентраций праймеров для интересующего гена и более низких концентраций праймеров для гена домашнего хозяйства, чтобы способствовать образованию продукта с меньшей экспрессией.

При конкурентной ОТ-ПЦР синтезируется экзогенная РНК или ДНК-контроль и добавляется в образцы (Francesco et al. 1993). Контроль должен быть разработан таким образом, чтобы он содержал связывающие праймеры последовательности в качестве мишени, но давал продукт другой длины. Затем контроль разбавляют до стандартной кривой известной концентрации и добавляют в копии образца. Экзогенный контроль и образец конкурируют за праймеры и другие компоненты реакции и амплифицируются в две отдельные полосы.Сравнение интенсивности полосы для образца с контролем известного количества дает полуколичественную меру количества транскрипта в образце.

Окраска для электрофореза

гелей: что использовать?

Электрофорез — это обычная лабораторная процедура для идентификации и разделения макромолекул. Впервые он был замечен в начале 1800-х годов ученым из московского университета. Как и многие другие открытия, это было случайно, но оказалось полезным для многих исследовательских сценариев. Применяя электричество, техники используют отрицательные или положительные заряды частиц, чтобы заставить их мигрировать через пористую матрицу, такую ​​как гель агарозы.Когда в образце присутствуют положительно заряженные молекулы, они будут ползать к отрицательному току (катоду), в то время как отрицательно заряженные молекулы будут перемещаться к положительному току (анод).

Помимо источника электричества и геля, для этого кинетического теста требуется буфер для предотвращения экстремальных значений температуры и pH. Тип используемого геля зависит от образца и области применения. Гели «твердые», но пористые. Внутри геля более крупные молекулы будут двигаться медленнее, а более мелкие — быстро.Следовательно, размер молекул — это еще один способ разделения образца и идентификации молекул.

Система гель-визуализации; работает со смартфоном для съемки фотографий. Фото: Accuris

Итак, теперь, когда мы понимаем кинетику электрофореза, как мы можем увидеть, куда движутся эти частицы? Молекулы могут быть «макро», но они все еще слишком малы, чтобы их можно было наблюдать невооруженным глазом. Последний необходимый ингредиент для нашего эксперимента — это пятно. Группа красителей позволяет нам визуализировать пути, по которым движутся частицы.Оттуда мы можем захватывать изображения для документирования результатов.

Окрашивание геля ДНК

Существует несколько вариантов окрашивания нуклеиновых кислот во время гель-электрофореза. Бромид этидия (EtBr) — наиболее известный и широко используемый краситель для ДНК. Это интеркалирующий агент, который связывает ДНК и имеет 20-кратное увеличение флуоресценции при воздействии ультрафиолетового света. EtBr — самое дешевое средство для окрашивания ДНК, что делает его идеальным выбором для многих исследовательских лабораторий. Однако EtBr следует использовать с осторожностью, поскольку это известный мутаген.Кроме того, EtBr требует воздействия ультрафиолетового света для визуализации, но при этом происходит молекулярное повреждение. Это представляет проблему, когда ДНК должна использоваться для последующих приложений, таких как клонирование.

Окрашивание нуклеиновой кислоты в УФ-свете. Фото: Accuris

Были разработаны альтернативные красители для ДНК, такие как SYBR Safe, которые не обладают такими же мутагенными свойствами, как EtBR. SYBR Safe не считается опасным и может быть утилизирован через обычную канализационную систему лаборатории. Кроме того, он флуоресцирует в синем свете, что предотвращает повреждение ДНК, которое происходит при использовании ультрафиолетового света.

Было показано, что многие пятна ДНК ингибируют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Когда требуется высокая эффективность ПЦР, например количественная ПЦР в реальном времени, жизнеспособным окрашивателем ДНК будет Ева Грин. По сравнению с другими распространенными красителями для электрофореза, он в меньшей степени ограничивает ПЦР. Eva Green также безопаснее традиционных красителей, таких как EtBr.

Окрашивание белкового геля

Подобно гелям ДНК, существует несколько вариантов окрашивания белковых гелей. Два самых распространенных пятна — это кумасси бриллиантовый синий и серебристый.Кумасси — это анионный краситель, неспецифически связывающийся с белками. Полосы белка визуализируются как синие полосы после удаления лишнего пятна. Окрашивание кумасси является наиболее распространенным методом окрашивания белков благодаря простоте использования и доступной стоимости.

Краситель добавляется к образцам перед введением в гель для электрофореза. Фото: Accuris

И наоборот, окрашивание серебром более чувствительно, чем кумасси, для обнаружения белков в относительно небольшом количестве. Однако чувствительность имеет свою цену, поскольку окрашивание серебром также может связываться с полисахаридами и нуклеиновыми кислотами, образуя ложные полосы на геле, окрашенном серебром.